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Equilibrio de la unión de ligandos a macromoléculas

Si un ligando L se une a una macromolécula M según la reacción:

ligando L se une a una macromolécula M según la reacción: La Keq para la reacción

La Keq para la reacción de asociación (Ka) será:

Mientras que Keq para la reacción de disociación es:

Ka = [ML] / [M][L] Kd = [M][L] / [ML] = 1/Ka

(1)

Si conocemos Kd (o Ka) ¿Cómo podríamos calcular la concentración del complejo ([ML]) para una determinada concentración total de macromolécula ([M]t) y de ligando ([L]t)?

Sabemos que:

[M]t = [M] + [ML]

(2),

y que [L]t = [L] + [ML]

(3)

Despejando [M] de la ecuación (1):

[M] = Kd [ML]/[L]

y

sustituyendo en (2):

[M]t = Kd [ML]/[L] + [ML]

(4)

Ahora, despejando [L] de (4):

 

[L] = (Kd [ML])/([M]t–[ML])

y

sustituyendo en (3):

[L]t = ((Kd[ML])/([M]t–[ML])) + [ML]

(5)

Multiplicando por ([M]t–[ML])

y reagrupando:

expandiendo y reagrupando

[L]t ([M]t–[ML]) = Kd[ML] + [ML] ([M]t–[ML]) 0 = Kd[ML] + [ML] ([M]t–[ML]) – [L]t ([M]t–[ML]) 0 = Kd[ML] + [ML] [M]t – [ML] 2 – [L]t [M]t + [L]t [ML] 0= – [ML] 2 + (Kd + [M]t + [L]t) [ML] – [L]t [M]t 0= [ML] 2 – (Kd + [M]t + [L]t) [ML] + [L]t [M]t

[ML] = (-b ± (b 2 -4ac) 1/2 )/2a donde: a = 1; b = – (Kd + [M]t + [L]t); y c = [L]t [M]t (sólo una de las dos soluciones es la real y constituye la solución exacta al problema)

Equilibrio en la unión de ligandos a macromoléculas (continuación)

Frecuentemente, [L] es muy superior a [ML] (o [M]t), por lo que [L] se puede considerar igual a [L]t.

Si en la ecuación (4):

 

[M]t = Kd [ML]/[L] + [ML]

(4)

substituímos [L] por [L]t, tenemos que:

 

[M]t = Kd [ML]/[L]t + [ML]

(6)

Multiplicando por [L]t:

[M]t [L]t = Kd [ML] + [L]t [ML]

y despejando [ML]:

[ML] = ([M]t [L]t) / (Kd + [L]t)

(7)

Esta es una hipérbola donde vemos claramente que:

-Cuando [L]t es << Kd, la [ML] aumenta linealmente con [L]t ([ML]~[M]t [L]t / Kd) -Cuando [L]t = Kd, la [ML] es la mitad de la concentración total de macromolécula (1/2 [M]t) -Cuando [L]t >> Kd, la [ML] se aproxima a [M]t.

La solución hiperbólica sólo es una buena aproximación cuando [ML] << [L]

Simulación de la unión de un ligando (L) a diferentes concentraciones de una macromolécula (M) usando la solución cuadrática exacta y la aproximación hiperbolica. (Kd = 50 µM).

1.0 0.8 0.6 solución hiperbólica (todas las [M]t) 0.4 Soluciones cuadráticas exactas para: 0.2 [M]t
1.0
0.8
0.6
solución hiperbólica
(todas las [M]t)
0.4
Soluciones cuadráticas
exactas para:
0.2
[M]t = 5 µM
[M]t = 25 µM
[M]t = 100 µM
[M]t = 500 µM
0.0
0
200
400
600
800
1000
[ML]/[M]total

[L]total (µM)

Note el error que cometería si la situación real fuera la de la curva azul y usara la aproximación hiperbólica para calcular la Kd (estimaría una Kd de ~300 µM cuando la real es de 50 µM)

Linealización de la ecuación de binding

a) Tomando la inversa:

[ML] = ([M]t [L]) / (Kd + [L])

[L]=[L]t si [L]t >> [M]t

1/[ML] = (Kd + [L])/ ([M]t [L]) = (Kd/[M]t) (1/[L]) + (1/[M]t)

graficando 1/[ML] vs 1/[L] se obtiene una recta de pendiente (Kd/[M]t) y ordenada de origen (1/[M]t)

y para 1/[ML] = 0;

1/[L] = -1/Kd

b) Gráficos de Scatchard

Kd + [L] = ([M]t [L])/[ML]

Kd = (([M]t [L])/[ML]) – [L] = ([M]t [L] – [ML] [L]) / [ML]

= (([M]t – [ML]) [L]) / [ML] [ML]/[L] = 1/Kd ([M]t –[ML]) = [M]t/Kd – [ML]/Kd

[ML]/[L] = n [M]t/Kd – [ML]/Kd (para una macromolécula M con n sitios)

o

graficando [ML]/[L] vs [ML] da una recta de pendiente –1/Kd (o –Ka) e intersección n [M]t/Kd

M con n sitios) o graficando [ML]/[L] vs [ML] da una recta de pendiente –1/Kd (o

NOCIONES DE CINETICA QUIMICA Velocidad de reacción:

Para una reacción donde el reactivo (R) se convierte en producto (P) R P

la velocidad de la reacción es:

v = d[P]/dt = - d[R]/dt v ~ [P]/t = - [R]/t

Para una reacción general:

a R1 + b R2

c P1 + d P2

v = 1/c [P1]/t = 1/d [P2]/t = - 1/a [R1]/t = - 1/b [R2]/t

Unidades de velocidad:

Unidades de concentración (mM, µM, g/l, etc.) sobre tiempo (min, seg, hr, etc.). Como generalmente el volumen es constante, también puede expresarse en unidades de cantidad (moles, mmoles, µmoles, g, µg, etc.) sobre tiempo.

Orden de reacción:

Se refiere a cómo depende la velocidad de la concentración del/los reactivos.

v = k [R] n donde n es el orden de la reacción

- En reacciones que tienen más de un reactivo, habrá un orden para cada uno de ellos.

- El orden no necesariamente se corresponde con el coeficiente estequiométrico

- Puede ser un número fraccionario (1/2, o 3/2)

- Debe ser determinado experimentalmente

- Depende del mecanismo de la reacción

- En especial en reacciones enzimáticas, la influencia de la

concentración de reactivos (o sustratos) puede ser muy compleja (el

orden cambia con la concentración de reactivos)

Reacciones de orden 0:

V

v = d[P]/dt = - d[R]/dt = k

la integración conduce a:

[R] = [R]o - k t

ó

[P] = [P]o + k t

donde [R]o y [P]o son las concentraciones iniciales de R o P.

[R] y [P] variarán linealmente con el tiempo. Unidades de k: (c t -1 )

v = k [R] = [R]o - k t [P] = [P]o + k t
v = k
[R]
= [R]o - k t
[P]
= [P]o + k t
[R]
tiempo
[R] o [P]

V

Reacciones de orden 1:

la integración conduce a:

por lo que la representación de ln [R] vs t dará una recta de pendiente -k

v = d[P]/dt = - d[R]/dt = k [R] ln [R] = - k t + ln [R]o

[R] = [R]o e - k t

[P]

= [P]o + ([R]o - [R])

[P]

= [P]o + [R]o (1- e - k t )

[R] y [P] variarán exponencialmente con el tiempo. Unidades de k (t -1 )

Tiempo de vida media (t 1/2 ): tiempo en que la cantidad de reactivo se reduce a la mitad

[R]o/2 = [R]o e - k t1/2

v = k [R] [R]
v = k [R]
[R]

t 1/2 = ln 2 / k

[R] [P] = [R]o e -kt = [P]o + [R]o (1 - e -kt )
[R]
[P]
= [R]o e -kt
= [P]o + [R]o (1 - e -kt )
[R] o [P]

tiempo

Reacciones de orden 2:

v = d[P]/dt = - d[R]/dt = k [R] 2 1/[R] = k t + 1/[R]o

[R] = [R]o / (1 + [R]o k t)

la integración conduce a:

por lo que la representación de 1/[R] vs t dará una recta de pendiente k

reordenando:

[P]

= [P]o + ([R]o - [R])

[P]

= [P]o + [R]o 2 k t / (1 + [R]o k t)

El tiempo de vida media será:

t1/2 = 1/([R]o k)

Unidades de k (c -1 t -1 ) v = k [R] 2 V
Unidades de k (c -1 t -1 )
v = k [R] 2
V

[R]

[R] [P] = [R]o / (1 + [R]o k t = [P]o + [R]o -
[R]
[P]
= [R]o / (1 + [R]o k t
= [P]o + [R]o - [R]
[R] o [P]

tiempo

Reacciones que involucran más de un reactivo:

A + R P Si la reacción es de orden 1 con respecto a A y a R:

v = d[P]/dt = - d[A]/dt = - d[R]/dt = k [A] [R]

Si [A]o = [R]o, [A] = [R], y

v = k [R] 2 (idéntico al caso de segundo orden)

Si uno de los reactivos está en un gran exceso con respecto al otro, su concentración puede suponerse constante en el tiempo.

Si [A]o >> [R]o

v = k' [R]

donde k' = k [A]o (reacción de pseudo primer orden)

Si [A]o [R]o, y x es la concentración de A (o de R) que ha reaccionado en el tiempo t , la ley de velocidad integrada será:

1

[R]o ([A]o - x)

------------- ln ------------------ = -k t [A]o - [R]o [A]o ([R]o - x)

[A]o [R]o (e k t ([A]o - [R]o) - 1)

x = [A]o - [A] = [R]o - [R] = [P]o + [P] = -----------------------------------

[A]o e k t ([A]o - [R]o) - [R]o

Para una reacción reversible:

Para una reacción reversible: si [P]o = 0, d[P]/dt = -d[R]/dt = k1 [R] – k-1

si [P]o = 0,

d[P]/dt = -d[R]/dt = k1 [R] – k-1 [P] [P]=[R]o-[R]

-d[R]/dt = k1 [R] – k-1 ([R]o-[R]) Cuya integración resulta en:

[R] = ([R]o/(k1+k2)) (k1 e (k1-k2)t + k2)

Velocidad inicial = Vo = k1 [R]o (d[P]/dt ó -d[R]/dt para t=0) (note que ésta sólo depende de k1 cuando [P]o = 0)

k2) Velocidad inicial = Vo = k1 [R]o (d[P]/dt ó -d[R]/dt para t=0) (note que ésta

Reacciones consecutivas: Etapa limitante y estado estacionario

d[A]/dt = -k1 [A] d[B]/dt = k1 [A] – k2 [B]

k1

k2

A

integrando, [A] = [A]o e k1 t = k1 [A]o e k1 t k2 [B]

B

C

integrando para [B]o=[C]o=0

[B]

= ([A]o k1/(k2 – k1)) (e k1 t – e k2 t )

y como [C] = [A]o – [A] – [B]

[C]

= ([A]o / (k2 – k1)) (k2 (1 – e k1 t ) – k1 (1 – e k2 t ))

k 1 t ) – k1 (1 – e – k 2 t )) La más

La más lenta es la etapa limitante. Si k1 >> k2:

[C]=[A]o (1 – e k2 t ) (solo depende de k2)

Si k2 >> k1:

[C]=[A]o (1 – e k2 t ) (sólo depende de k1)

En este caso, la [B] alcanzará un estado estacionario en el que la producción de C es lineal en el tiempo

Velocidad y equilibrio:

Supongamos la siguiente reacción reversible:

En el equilibrio:

la siguiente reacción reversible: En el equilibrio: V ( R → P ) = V (

V (RP) = V (PR) = k1 [R]eq = k-1 [P]eq [P]eq/[R]eq = Keq = k1/k-1 = e- G o /RT

- Así, otra definición de Keq es la relación entre las constantes de velocidad directa e inversa.

- G 0 sólo nos informa sobre la relación de velocidades, no sobre las velocidades individuales

- Keq (y G) son independientes del camino. G* (y la velocidad) dependen del camino

- La velocidad depende de la diferencia de energía libre entre el estado de transición (R*) y el estado inicial (R), definida como energía libre de activación (G*).

v = cte [R*]

donde k1 = cte e- G * /RT

[R*]/[R] = e- G * /RT

v= cte e- G * /RT [R] = k1 [R]

e- ∆ G * /RT v= cte e- ∆ G * /RT [R] = k1 [R]

G* puede calcularse de mediciones de velocidad a diferentes temperaturas

ln v = cte - ∆G*/RT Pendiente = -∆G*/R ln V
ln v = cte - ∆G*/RT
Pendiente = -∆G*/R
ln V

1/T

Catálisis

Catálisis Un catalizador crea un nuevo ca mino para la reacción con menor energía libre de

Un catalizador crea un nuevo camino para la reacción con menor energía libre de activación