Extraccin, medicin de actividad caseinoltica y fraccionamiento en Sepacore de

de la enzima papana presente en el babaco caseinoltica.

Benalcazar C, Quishpe J, Tupiza M
jmtupiza1@espe.edu.ec
jpquishpe@espe.edu.ec
crbenalcazar@espe.edu.ec

Resumen

La papana es una cistena proteasa (EC 3.4.22.2) que se extrae del fruto de Carica papaya L. (papaya), y tiene la capacidad de
hidrolizar enlaces peptdicos del grupo carbonilo de residuos de aminocidos aromticos y de arginina, lisina o glutamina [5] . La
familia Caricaceae agrupa muchas especies dentro de las cuales est el babaco (Vasconcellea heilbornii var. babaco), una
planta arbustiva de tallo semileoso, caracterstico del noreste de Suramrica, probablemente de la provincia de Loja, Ecuador
[7]. Nuestro objetivo del presente trabajo fue la extraccin, purificacin y caracterizacin de la enzima paina a partir del fruto
inmaduro del babco (Vasconcellea heilbornii var. babaco), se extraj el ltex del babaco (Vasconcellea heilbornii var.
babaco), se la sec por tres semanas para obtener un polvo, al cual se le aadi el preparado de un extracto acuoso, con una
solucin tampn fosfato de sodio 50 mM y pH 7,5. A continuacin, se realiz una purificacin mediante la adicion de etanol al 96%
se evalu la actividad enzimtica del extracto semipurificados obtenido con un error del 2,97 % respecto al terico, a las 6 semana
de realizar la extraccin se procedi a el fraccionamiento de la enzima con Sepacore el cual mostro que la enzima se degrado.

Palabras Clave: Vasconcellea heilbornii var. babaco, papaina, actividad enzimtica.

Abstract

Papain is a cysteine protease (EC 3.4.22.2) which is extracted from the fruit of Carica papaya L. (papaya), and has the ability to
hydrolyze peptide bonds of the carbonyl group of aromatic amino acid residues and arginine, lysine or glutamine residues [5]. The
Caricaceae family groups many species within which is the babco (Vasconcellea heilbornii var. Babaco), a shrub plant with a
semi-sedimentary stem, characteristic of northeastern South America, probably from the province of Loja, Ecuador [7]. Our
objective of the present work was the extraction, purification and characterization of the enzyme paina from the babco immature
fruit (Vasconcellea heilbornii var. Babaco), the babaco latex (Vasconcellea heilbornii var. Babaco) was extracted, dried For
three weeks to obtain a powder, to which was added the preparation of an aqueous extract, with a 50 mM sodium phosphate buffer
solution and pH 7.5. Then, a purification was carried out by the addition of 96% ethanol. The enzymatic activity of the semi-purified
extract obtained was evaluated with an error of 2.97% with respect to the theoretical one. After 6 weeks of extraction, The enzyme
with Sepacore which showed that the enzyme was degraded.

Key words: Vasconcellea heilbornii var. Babaco, papain, enzymatic activity.

1. Introduccin Todas estas bondades nutricionales

En los ltimos aos, las materias primas de
origen vegetal estn adquiriendo cada vez mayor
importancia en la fabricacin de alimentos para
animales. El presente trabajo trata de contribuir
con el conocimiento sobre la extraccin,
concentracin y la actividad enzimtica de la
papana, la cual es una enzima que se encuentra
y se extrae del fruto de la papaya (Carica
papaya), as como el babaco (Vasconcellea
heilbornii var. babaco), que tambin pertenece a
la familia Caricaea, la cual resaltan su alto
contenido de vitamina C y papana, la enzima
digestiva por excelencia, que facilita el
desdoblamiento de la protena animal., existe una
problemtica que es el desconocimiento sobre
extraccin de enzimas naturales y su tratamiento
[7].
hacen que el babaco y sus derivados
sean muy apetecidos en los mercados
internacionales [10]. En Ecuador no
existe este tipo de informacin por lo
cual es de importancia investigar y
obtener resultados veraces los cuales
ayuden a prximas investigaciones [10],
adems de abrir nuevos campos dentro
de la Biotecnologa que pueden ser
aplicados dentro de la carrera en
enzimologa.
Entre los componentes enzimticos
que posee el babaco (Vasconcellea
heilbornii var. babaco) estn las
enzimas proteolcas como la papana,
que tiene la capacidad de digerir las
protenas de los alimentos ver figura1.1,
 que se obtiene a partir del ltex de la cristalinas una ortorrmbica y otra monoclnica
fruta verde del babaco (Vasconcellea [5].
heilbornii) antes que comience su
maduracin [2].
La papana, se caracteriza por ser un polvo
amorfo, granuloso de color blanco, grisceo o
parduzco; ligeramente higroscpico e insoluble
en agua y en la mayora de solventes orgnicos.
Es soluble en alcohol etlico y metlico [4].
La papana bruta, contiene un poco de agua,
glcidos, cidos orgnicos y una mezcla de
enzimas, dnde destacan las denominadas
proteasas que actan rompiendo los enlaces
peptdicos en cualquier lugar de la cadena
peptdica en la que se hallen situados
(endopeptidasas).Tambin contiene pequeas
cantidades de otros enzimas: papaya peptidasa
A, lipasa y lisozima (enzima que rompe las
paredes de las clulas bacterianas) [1].
Es una protena de 212 aminocidos, que se
encuentran enrollados en 2 partes separadas por
un puente que tiene un lugar activo con un grupo
tiol (SH) libre.
Es una enzima de baja especificidad que
hidroliza tanto las protenas como los pptidos
de pequeo tamao, amidas y steres [6].
Preferentemente acta sobre los
aminocidos bsicos, Leu, Gly, Arg, Lis y Phe;
su ecuacin es (EC 3.4.22.2) [4].
La papana que se extrae de la papaya es una
enzima proteoltica, es decir, con capacidad para
digerir las protenas de los alimentos. Similar a
la pepsina, una enzima que est en nuestro jugo
gstrico [4].
Figura 1.1 Estructura de la enzima Papana.
Fuente: Enzimas Proteolticas, 2009.
La papana es clasificada como una enzima,
hidrolasa y proteasa tilica. Existe como un
monmero, consistente de 212 residuos. Es una
protena simple que contiene aminocidos y est
desprovista de carbohidratos [5]. La estructura
cristalina se determin por difraccin de rayos X
su dimensin celular es 65.7 x 50.7 x 31.5
Amstrongs, desarrolladas en dos estructuras
La interaccin entre enzima y
substrato se da en la superficie de la
molcula de papana en un surco el cual
est situado entre las dos partes de la
molcula. La cadena lateral de Cistena
25 se encuentra en la ranura, pero si el
SH de la Cistena, no se encuentra libre
por un bloqueo de metales pesados, por
agentes alquilantes o por formacin
disulftica la actividad de la enzima
desaparece completamente [3]. Cercano
al grupo sulfhdrico se encuentra el
anillo imidazlico de la Histidina 159,
el cual se encuentra unido a su vez, a
travs de puentes de hidrgeno, con la
cadena lateral de Asparagina 175,
dndole forma a la trada cataltica que
forma el sitio activo de la papana.(Ver
figura 1.1)
En ausencia de una adicin de
activadores, existe una correlacin
lineal entre la actividad cataltica de la
papana y su contenido tilico [9].
La papana es activada por una gran
variedad de compuestos tilicos tales
como la cistena y el glutatin, as como
por agentes reductores los cuales
pueden actuar tambin como quelantes
[9].
Las enzimas se inyectan antes del
sacrificio al animal o se trata la carne
con las enzimas antes de cocerla, con lo
que se logra un franco ablandamiento
sin provocar una protelisis importante
[6].
La papana acta atacando por
protelisis las fibras musculares y los
compuestos del tejido conectivo tales
como el colgeno y la elastina, logrando
as un relajamiento en los enlaces
peptdicos de las protenas [3].
La enzima es muy apreciada en la
industria cosmtica se aprovecha su
poder desmanchador y cicatrizante.
En la industria farmacutica resalta
su ltima utilizacin en medicinas para
la digestin, disolver membranas en
difteria y reducir la hinchazn, fiebre y
adhesiones post ciruga. [8].
 2. Materiales y mtodos
Para el desarrollo de la presente
investigacin se utilizaron los siguientes
materiales e insumos del laboratorio
necesarios: frutos verdes del babaco
(Vasconcellea heilbornii var.
babaco); agua destilada; celdas de
cuarzo para espectrofometria;
micropipetas ajustables de 5 a 50 ul y de
200 a 1000 ul.
2.1 Reactivos
Fosfato dicido de sodio dihidratado,
99,8% de pureza
Fosfato monobsico de sodio
Casena al 10%
cido Tricloroactico
2.1.1 Equipos.
Balanza analtica de 110g x 0,0001 g
(2) (OHAUS)
Balanza(ADAM modelo
PGW250221)
Centrifuga 200 E swing out rotor
(Hettich modelo micro 200)
Estufa (FANEM modelo 502)
Espectrofotometro UV-visible
(Thermo scientific modelo universal
30 R)
pHmetro (Thermo scientific modelo 3
start )
Sepacore (BUTCHI C-660)
Refrigeradora(GE)
Bao Mara(memmert)
2.2 Mtodos Experimentales
2.2.1 Extraccin del Ltex de la fruta
Para obtener el extracto enzimtico a
partir de la muestra vegetal del babaco
se realiz el siguiendo el protocolo:
Se Pes las diferentes muestras de
frutos inmaduros. Posteriormente se
Lav y se sec los frutos.
Se cort longitudinales de 3 a 5 cortes
con un espesor de 1 a 2 mm en la
superficie de los frutos.
Se recolecto el latex en una caja Petri y
se pes. Nuevamente se pas los frutos
para determinar el rendimiento del ltex
extrado.
Se sec el latex en la ambiente durante
7 das, hasta que tuvo una consistencia
cristalizada, se la coloco la muestra en
un tubo Eppendorf para su
almacenamiento a 10 C.o
Figura 2.1. Extraccin del ltex
del babaco
2.2.2 Preparacin del extracto
acuoso:
Se colocaron 55 mg de ltex seco en un
mortero y pulverizar lentamente.
Se coloc 50 mg del polvo de ltex en
un matraz de 10 ml y se aadir un
tampn fosfato 5 mM y pH 7.5 hasta
aforarlo.
Se puso el matraz en refrigeracin
durante 24 horas, para la solubilizacin
de las protenas.
Se centrifugo la suspensin a 2700 x g,
durante 10 minutos. Se tom el
sobrenadante con una pipeta y se coloc
en un tubo de vidrio.
2.2.3 Determinacin de Actividad
Enzimtica de la enzima
papana.
Para la determinacin de la actividad
enzimtica, se detallaran a continuacin
el mtodo, utilizado para comprobar la
existencia de la enzima papana y su
efectividad.
 quimopapana, glicil endopeptidasa y
Se coloc 0,1 mL de extracto acuoso en caricatura ( Biochemical Corp, 2017).
un tubo de ensayo. El tiempo de secado consista en
Se aadi 1,1 mL de solucin de eliminar todo lquido que se encontrara
casena al 10%. en el ltex extrado, para as obtener la
Se repar un tubo correspondiente al enzima papana en forma de un polvo
blanco: Verter 1,8 mL de solucin al blanquesino, la muestra mantuvo una
5% de cido tricloroactico y 1,1 mL de hidratacin voluminosa con 11.25 g
casena al 10%. pesados antes del secado y despus el
Se incubo todos los tubos a 37C polvo de latex pes 5.07g, debido a la
durante 20 minutos. deshidratacin que sufri.
Se detuvo la reaccin del tubo con la
muestra, adicionando 1,8 mL de cido 3.3. Anlisis de Actividad Enzimtica de
tricloroactico. la papana del babaco (Vasconcellea
Se centrifugo a 3500 x g, por 20 heilbornii var. babaco)
minutos y recuperar el sobrenadante.
Medir la densidad ptica a 280nm. En los anlisis de actividad enzimtica,
se obtuvo con diferentes tiempos y
3. Resultados. concentraciones de enzima papana,
observando que a medida que aumenta
3.1. Caractersticas de la materia la concentracin de papana diluida en
Prima. cido y agregada en la casena, el
tiempo de la actividad enzimtica
Las caractersticas fsico-qumicas del disminuye en todos los anlisis
Babaco fue Slidos y las realizados.
especificaciones organolpticas fueron Los datos obtenidos en estas pruebas en
color verde aroma caracterstico de la el laboratorio, al igual que los clculos
Muestra Absorbancia Actividad Actividad se encuentran en las siguientes tabla2.
(nm) (U=mol/min) (U/ml)
1 3,55 355 35,5
2
Tabla 2: Actividad caseinoltica en el
3,556 355,6 35,56
3 3,555 355,5 35,55 extracto acuoso de ltex del fruto de
4 3,555 355,5 35,55 babaco (Vasconcellea heilbornii var.
Prom. 3,5525 355,25 35,525 babaco), despus de tres semanas.
fruta.
La actividad promedio caseinolitica del
3.2. Extraccin de Papana. extracto acuoso del latex de babaco
En el proceso de extraccin de la (Vasconcellea heilbornii var. babaco)
enzima del fruto del babaco se obtuvo despus de 3 das con una temperatura
un polvo blanco que se presenta en la de 10C fue de 35,525 este valor se
siguiente tabla1. asemeja al obtenido por (Sinche, 2009)
Tabla 1: datos obtenidos de la de 36,33 U/ml con un error de 2,97%.
extraccin de latex de babaco Cabe destacar que
(Vasconcellea heilborni).

Cantid Peso g de Tiemp

ad de (g) ltex o de
Babaco aprox seco secado
15 11.25 5.07 7 das

El ltex de Carica papaya es una fuente

rica de cuatro endopeptidasas de
cistena, incluyendo papana,

Figura 3.1.Grfica resultante del
colector de fracciones C-660 Sepa-
core que mide la Actividad
Enzimtica
La actividad enzimtica se determina
midiendo la cantidad de producto que se
forma cuando una enzima acta sobre
un sustrato especfico (Jorge, 2011).
Los factores que influyen en la
velocidad que una enzima puede
trabajar sobre un sustrato incluyen el
sustrato especfico que se utiliza en el
reactivo, la concentracin del sustrato,
el pH del reactivo que contiene el
sustrato y la presencia o ausencia de
ciertos compuestos en el reactivo que
modula la velocidad que puede
funcionar la enzima (Vzquez, 2003).En
nuestro caso uno de los factores que
alter la medicin de la actividad
enzimtica de la papana extrada del
babaco, fue el tiempo de vida til a
causa del dao mecnico del Colector
de Fracciones C-660 (Sepa-Core) del
laboratorio de Biotecnologa por lo que
en el grfico anterior no se ilustra el
hecho de que las actividades
enzimticas medidas varen
considerablemente debido al uso de
diferentes sustratos o diferentes
condiciones de reaccin. A seis semanas
de haber extrado la enzima, la papana
se mantuvo en un ambiente seco y fro
(4C), sin que llegue a congelarse la
suspensin, debido a que el tiempo de
vida til de la papana es corto,
(Bermudez, 2005) adems , las
soluciones acuosas son estables por
tiempo limitado, por lo que se puede
observar reduccin o prdida de la
actividad enzimtica (Kazmierczak,
2010), si se excede el tiempo de
almacenamiento de la enzima, debido a
la desestabilizacin y perdida de las
cadenas laterales por los puentes
disulfuro, podra hacer decrecer la
extensin del "enredo" e incrementar el
factor de deslizamiento para las cadenas
polipeptdicas (Mejia , 2010).
4. Conclusiones
Se logr obtener la enzima papana
concentrada y evaluar su actividad
enzimtica. Para este estudio se
consider como variable el grado de
madurez del babaco verde.
El grado de maduracin de la papaya
permiti que acte la enzima papana de
mejor manera al ser extrado el ltex de
babacos.
Se efectu la extraccin de 15 frutos de
babaco frescos obteniendo un promedio
de 3.13 g de ltex por babaco.
Se realiz el proceso de extraccin de la
enzima (Papana) utilizando el ltex del
babaco determinando una actividad
enzimtica de la papana de 35.525
U/ml.
Los factores como el tiempo de vida til
de la enzima en una solucin acuosa,
influyen directamente en la actividad
de la enzima, debido a que mientras
menos tiempo pase almacenada, mayor
ser la medicin de la actividad
enzimtica.
5. Recomendaciones
Almacenar la enzima papana en lugares
previamente esterilizados y almacenarlo
en refrigeracin para que la enzima
conserve un mayor tiempo de actividad.
Se recomienda que en la operacin de
secado se utilice un liofilizador; este
tipo de secado permitir mantener la
calidad del enzima por purificar y
alargar el tiempo de vida til del
enzima.
Estudio de la purificacin de la papana
obtenida a condiciones de ptima y
comparar las caractersticas fsicas y
qumicas de la enzima purificada con
las enzimas sin purificar.
Estudiar con mayor profundidad el
mecanismo de accin de las enzimas
proteolticas encontradas, con el fin de
determinar qu familia pertenecen,
dentro de las proteasas.
Investigar los usos potenciales de
proteasas aisladas y purificadas del
latex de fruto inmaduro del babaco, que
nos permita abrir nuevos campos dentro
de la Biotecnologa que pueden ser
aplicados dentro de nuestra carrera.
6. Bibliografa
[1]Biochemical Corp. (2017). Reaccin
enzimtica. Obtenido de
http://www.worthington-
biochem.com/pap/
[2]Aguirre, P. C. (12 de 07 de 2016).
Extraccin y Estudio Comparativo
de las Enzimas Proteolticas del
Fruto Toronche (Carica-Stipulata)
y de la Papaya (Carica-Papaya) y
su Aplicacin en la Industria
Alimenticia. Obtenido de
https://www.dspace.espol.edu.ec/bit
stream/123456789/7532/1/Extracci
on%20y%20Estudio%20Comparati
vo%20de%20las%20Enzimas%20P
roteol%C3%ADticas.pdf
[3]Arciniegas A., G. X. (7 de 7 de 2005).
MANEJO INTEGRADO DE
PLAGAS Y ENFERMEDADES EN
LA PROPAGACIN Y EL
CULTIVO DEL BABACO
(Vasconcellea heilbornii) BAJO
CUBIERTA. Obtenido de
http://cdjbv.ucuenca.edu.ec/ebooks/
mag117.pdf
[4]Bermdez Molina, F. D. (2005). Estudio
preliminar de la actividad
proteoltica de la enzima papana
sobre cicatrices de tipo queloides y
estras (Doctoral dissertation,
Universidad de El Salvador).
Obtenido de
http://ri.ues.edu.sv/5158/1/1012929
0.pdf
[5]Bermudez, F. (2005). ESTUDIO
PRELIMINAR DE LA ACTIVIDAD
PROTEOLITICA . Obtenido de
http://ri.ues.edu.sv/5158/1/1012929
0.pdf
[6]CRUZ, J. (17 de 05 de 2014). ENZIMAS
VEGETALES PROTEASAS,
APLICADAS PARA EL
ABLANDAMIENTO DE CARNE
(bromelina ficina y papaina).
Obtenido de
http://repositorio.uaaan.mx:8080/x
mlui/bitstream/handle/123456789/4
15/60974s.pdf?sequence=1
[7]Garca Flores, V. A. (2005). Ensayo de
actividad de la enzima papaina
inmovilizada y su aplicacin en
aguas residuales de la industria
alimenticia (Doctoral dissertation,
Universidad de El Salvador).
Obtenido de
http://ri.ues.edu.sv/5208/
[8]Gutirrez, A. (17 de 07 de 2017).
ACTIVITY OF PAPAIN FROM
LATEX OF VASCONCELLEA
CANDICANS (A. GRAY) A.
Obtenido de
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevist
as/biologist/v14_n2/pdf/a12v14n2.
pdf
[9]Jorge, Y. (2011). Obtenido de
http://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/
123456789/9619/168.pdf?sequence
=1
[10]Kazmierczak, S. (2010). Evaluation of
Enzyme Activities Measured with
Different Instruments . Obtenido de
https://www.abaxis.com/sites/defau
lt/files/resource-
papers/Evaluation%20of%20Enzy
 me%20Activities%20Measured%2
0with%20Different%20Instruments
.pdf
[11]Lassoudiere. (1969). La papana
(produccin, propiedades y
utilizacin). Frutas.
[12]Mejia , R. (2010). MEDICION DE LA
ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE
LA ENZIMA PAPAINA . Obtenido
de
http://ri.ues.edu.sv/2516/1/1610205
0.pdf
[13]Montenegro, F. R. (22 de 01 de 2009).
Cultivo De Babaco (Carica
pentagona H.) Bajo Invernadero.
Obtenido de
https://www.engormix.com/agricult
ura/articulos/cultivo-babaco-carica-
pentagona-t27813.htm
[14]Moya, T. F. (2001). Incremento de la
disponibilidad intestinal de
proteina y almidn mediante la
manipulacin de su degradabilidad
en el rumen . Universidad Almera.
[15]Proao, E. (17 de marzo de 2015). Mi
lindo Ecuador, el Babaco.
Obtenido de
http://milindoecuador.com.ec/blog/
1994/babaco
[16]Sinche, V. (2009). Aislamiento,
purificacin parcial y
caracterizacin cintica de las
proteasas presente en el latyex de
los frutos de una planta del babaco
(vasconcella sp). Quito.
[17]Vzquez, E. (2003). Degradacin de
Protenas . Obtenido de
http://laguna.fmedic.unam.mx/~eva
zquez/0403/degradacion%20protein
as.html

ANEXOS

Tabla a. Datos experimentales de las masas determinadas del fruto de babaco

fresco antes y despus del proceso de extraccin del ltex.

N Babaco Antes (g) Despus (g) Total (g)

1 313,3 310 3,3
2 261,68 254,11 7,57
3 529,4 527,25 2,15
4 202,59 199,91 2,68
5 231,24 228,68 2,56
6 290,05 287,48 2,57
7 372,57 370,04 2,53
8 321,2 318 3,2
9 201,65 199,43 2,22
10 303,53 300,01 3,52
11 255,68 252,8 2,88
12 382,03 380,07 1,96
13 191,37 189,02 2,35
14 91,6 90,26 1,34
 15 214,76 208,63 6,13

Total 46,96
g 3,13
latex/babaco

Clculos de la actividad del extracto del fruto del babaco (Vasconcellea heilbornii
var) acontinuacion ec 1

=
(0,1)2
Ac - es la actividad caseinoltica, en unidades enzimticas por mL de solucin de
enzima (U/mL).
h - es la densidad ptica obtenida al medir a 280nM.

El dato de la muestra 1 de la tabla 2 sustituyo en la ec 1

3,55
= = 3,55
(0,1)2

Y as para las dems muestras, para el clculo de Ac por cada ml se multiplica por 0,1
ml de extracto
Para la muestra 2 es 3,55*0,1=35,5 U/ml y as con los dems datos de la tabla 2
Clculos para realizar el tapn fosfato

[]

[ ]
= ,
Para un pH 7,5 tenemos

[]
= ( )
[ ]

, = , ( )


( ) = .

[ ] = . [ ]


= . [ ]
Para 5Mm=0.005M
[
] + [ ] = .

[
] = .
= . .
= [ ] = .
[
] = .

[ ] = . /
[ ] = , /

= .
= .
Se procedi aforar a 1L
[ ] = . /
[ ] = . /
[ = .
= .

Para el Blanco
1,8 ml = 1800 ul 1000 ul + 800 ul Ac. Tricloro
1,1ml = 1100ul. 1000ul + 100ul casena

Concentracin
Absorbancia 3.55 3.556 3.552 3.555

Evidencias Fotogrficas

Img.1: Extraccin del ltex de la papaya.

 Img.2: Aplicando Tricloroactico al analito enzimtico.

Img.3: Medicin de absorbancias del extracto, para medir la actividad enzimtica.

Img.4. Programacin del Sepa-core