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ANALISIS INSTRUMENTAL DE PRODUCTOS

AGROINDUSTRIALES

CROMATOGRAFIA

Dr. GILBERT RODRIGUEZ PAUCAR


INTRODUCCION
INTRODUCCIN
CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)

Eter Chromatografa Mikhail Tswett


1906

Clorofila
Colores

CaCO3

Separar molculas:
protenas
pptidos
aminocidos
lpidos
Azucares
ADN/ARN, etc.
TIPOS DE
CROMATOGRAFIA

1. Cromatografa de capa fina (TLC)


2. Cromatografa de capa fina de alta performance
(HPTLC)
3. Cromatografa de Columna.
4. Cromatografa de Gases (GC)
5. Cromatografa Liq. de Alta Performance (HPLC)
6. Cromatografa de Fluidos Supercriticos (SFC)
7. Electroforesis Capilar (CE)
Tres Estados de la Materia y
tipos de Cromatografa
Mobile phase

Gas Liquid Solid

Gas

Stationary
phase Liquid
Gas Liquid
chromatography chromatography
Solid

5
TIPOS DE CROMATOGRAFIA:
1.TLC y 2. HPTLC

1. TLC -- usado como instrumento


cualitativo para la separacin de
mezclas simples donde la
velocidad, bajo costo y la
simplicidad son requeridas.

2. HPTLC -- para el anlisis


cuantitativo con alta carga
de muestra.

Equipo : Placas revestidas de


varios tamaos dependiendo de
la aplicacin.
Tanque de desarrollo.
Accesorios Opcionales para
deteccin.
CROMATOGRAFA EN SUPERFICIE PLANA
CMARA
F. ESTACIONARIA
CROMATOGRFICA
(polar)

FLUJO
propiciado por
MUESTRA
CAPILARIDAD

FASE MVIL
FRENTE de avance del solvente (apolar)

distancia avanzada por la molcula


hidrofbica Rf=
distancia avanzada por el frente

Rf es caracterstico para cada soluto para


hidroflica una composicin dada de fase mvil y un
determinado tipo de superficie
CROMATOGRAFA EN PAPEL
CLASE: Reparto
PROPIEDAD: Solubilidad
NOMBRE: Fase Normal

SOPORTE celulosa de papel de filtro

F. ESTACIONARIA (LQUIDA) H2O absorbida en la


celulosa.
F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

H2O H2O
H2O H2O
H2O H- H2O
H-
H2O H- H2O
H2O
H2O H2O

Molec. Hidroflica LENTA Molec. Hidrofbica RPIDA


Retenida por f.estacionaria Disuelta en f. mvil
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Hidrofbica
NOMBRE: Interaccin Hidrofbica

SOPORTE plancha de metal o vidrio

F. ESTACIONARIA (SLIDA) slido pulverizado sobre


plancha de metal o vidrio. El ms usado es el gel de slica.

F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH -Si-OH
-Si-OH -Si-OH

Molec. Hidroflica LENTA Molec. Hidrofbica RPIDA


Retenida por f.estacionaria Disuelta en f. mvil
TIPOS DE CROMATOGRAFIA

3. Cromatografa de Columna
Normalmente se corre muestras que eluyen
bajo gravedad.
-- proceso lento que requiere grandes cantidades de
solventes.
-- Tiempo y esfuerzo se gasta para empacar la
columna.

packing

cotton wool/sintered glass


CROMATOGRAFA EN COLUMNA
EMPAQUETADO APLICACIN
ELUCIN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
COLUMNA MUESTRA

RESERVORIO
f. mvil
LECHO
CROMATOGRFICO
f. estacionaria

COLUMNA MUESTRA

FLUJO
gravedad

DIFUSIN
llave

SEPARACIN
CROMATOGRAFA EN COLUMNA

PERFIL DE ELUCIN

FRACCIONES Molc. distribuida


en f.mvil
Molc. distribuida
en f.estacionaria

respuesta del detector


1 2 3 4 5 6 7 8 9 ANLISIS DEL
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES

Espectrofotomtrico

Abs 280nm Protenas


Otras Abs - Colorantes 1 2 3 4 5 6 7 8 9

fraccin
CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN
CLASE: Reparto
PROPIEDAD: Tamao (y forma)
NOMBRE: Exclusin

SOPORTE Resina de micropartculas esfricas formadas por


polmeros hidroflicos (dextrano, agarosa poliacrilamida o
FASE MVIL
mezcla de ellos).

Tamaos de poro intrvalo o rango de fraccionamiento.

P.e. Sephadex G25: 1000 5000 Da


Sephadex G200: 5000 250000 Da
F. ESTACIONARIA
F. ESTACIONARIA (LQUIDA) solvente acuoso (el mismo
que el de la fase mvil) que se encuentra dentro de MICROPARTCULAS
micropartculas.

F. MVIL (LQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la


columna por los espacios intersticiales (entre las
micropartculas).
CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN
Molec. GRANDES RPIDAS

* Avanzan con mayor velocidad a travs de los


espacios intersticiales (con F. mvil)

Molec. PEQUEAS LENTAS

* Son retenidas por las fibras de las


micropartculas y avanzan con menos velocidad
(con F. estacionaria).

PERFIL DE ELUCIN
APLICACIN grande
MUESTRA
pequea
respuesta del detector
ELUCIN

1 2 3 4 5 6 7 8 9
fraccin
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Electrosttica
NOMBRE: Intercambio inico (aninico o catinico)

SOPORTE Resina de micropartculas formadas por


polmeros sintticos (poliestireno entrecruzado con
divinilbenceno o DowexR) o matrices de polmeros naturales
(dextranos, celulosas, agarosa). FASE MVIL

F. ESTACIONARIA (SLIDA) Grupos con cargas inicas


unidos al soporte.

Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-).


Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+).
F. ESTACIONARIA

F. MOVIL (LQUIDA) Solvente que anula la interaccin MICROPARTCULAS


electrosttica.

2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga


de las molculas de la muestra.
Gradientes inicos competencia por
grupos electrfilos.
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
Gradiente de pH
Gradiente salino Molec. MENOR CARGA (+) RPIDAS

* Son desplazadas ms fcilmente por la


f.mvil.

Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS

* Son retenidas por los grupos cargados


inicamente de la f. estacionaria.

PERFIL DE ELUCIN
q+
APLICACIN Q+
MUESTRA
respuesta del detector
+

Na+
ELUCIN

-
1 2 3 4 5 6 7 8 9
fraccin
CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Interacciones especficas entre dos molculas
P.e. hormona-receptor
protena-metal o cofactores como ATP
antgeno-anticuerpo
NOMBRE: Afinidad biolgica
FASE MVIL
SOPORTE Matriz de micropartculas hidroflicas sin carga,
con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrlica).

F. ESTACIONARIA (SLIDA) Ligando especfico unido a


la matriz.

-- Comerciales: Concavalina A une glicoprotenas


Protena A une IgG (anticuerpos)
F. ESTACIONARIA
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz
MICROPARTCULAS
F. MVIL (LQUIDA) Solucin que anula o disminuye la
afinidad con el ligando de la fase estacionaria.

-- Solucin con el propio ligando Molcula + ligando libre


-- Solucin con algo que interacciona con el ligando - Molcula
CROMATOGRAFA
DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIN RPIDAS

* No se unen al ligando de la fase estacionaria.

Molec. INTERACCIN LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria.


Elucin especfica.

PERFIL DE ELUCIN
ELUCIN
LAVADO ESPECFICA

respuesta del detector


molcula

APLICACIN
MUESTRA

LAVADO
ELUCIN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ESPECFICA fraccin
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
4. Cromatografa de Gases

-- Usado para compuestos voltiles o aquellos


que pueden ser vaporizados sin
descomposicin.
-- Fase Mvil es gaseosa (normalmente helio).
TIPOS DE CROMATOGRAFIA

5. Cromatografa Liquida de Alta Performance


TIPOS DE CROMATOGRAFIA
6. Cromatografa de Fluidos Supercriticos (SFC)

-- Usa un fluido supercrtico como eluyente.


-- La fase mvil mas comn es dixido de carbono
-- La gradiente de elucion es controlada por
cambio de presion de la fase movil.

Area sombreada :
solid Rango Supercritico.
liquid

gas

Diagrama de Fase de un compuesto puro


VENTAJAS DE LA
CROMATOGRAFIA

1. Anlisis simultaneo

2. Alta resolucion

3. Alta sensibilidad (ppm - ppb)

4. Volumen de inyeccion pequeo (1- 100ml)


Diferentes formas de Cromatografa
Figure 1.2 Rapid LC separation of aromatic hydrocarbons. Peaks 1, 2 are CH2C12 and
CHCl3, peak 3 is benzene, and peaks 4-15 are polycyclic aromatic hydrocarbons, ending
with dibenzanthracene (peak 15). Column, 6.5 0.4 cm of porous silica (4.4 ,m); mobile
phase, n-pentance; ambient; velocity 0.93 cm/sec, P = 1060 psi; UV, 254 nm; 3-50 g
each compound. Reprinted from (8) with permission.
Figure: LC separation of
acidified urine extract by
reverse-phase small-
particle column.
Column, 25 0.46 cm
LiChrosorb ODS (bonded-
phase porous silica) (5 m);
mobile phase, gradient
elution from 0.1 M phosphate
in water (pH = 2.1) to 40 %v
acetonitrile; temp.,70;
flowrate, 2.0 ml/min; detector,
UV, 280 nm; sample, 10 l
injection from a 10-x
concentrated urine extract.
BASES DE LA
SEPARACION
Como se analiza la muestra?

Carbohidratos
1. fructosa
2. Glucosa
3. Sacarosa
4. Palatinosa
5. Trehalosa
6. isomaltosa 5

Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm)


2
3
mAU
70/30 Acetonitrile/Water
4
1
1 mL/min Detect=Refractive Index
6

time

27
OBJETOS EN EL RIO

Objeto ligero Flujo de agua


Objeto pesado

Base (lecho de rio)


Injector

Mixer

Pump
s

Solvents

Columna
Detector
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

30
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

31
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

32
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

33
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

34
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

37
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

38
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

39
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

40
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

41
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

42
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

43
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

44
Separacin
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

45
El Cromatograma
to - elution time of unretained peak
tR- retention time - determines sample identity
tR

tR
mAU Area or height is proportional
to the quantity of analyte.

to

Injection time
46
Parametros de analisis del HPLC

Mobile Phases

Flow Rate
Composition

Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant
47
EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS
EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS

Los compuestos eluidos pasan a traves de los


detectores donde ellos son registrados como picos
y todo eso se llama cromatograma.
Compuesto 1 Compuesto 2
Seal
tR2
tR1

t0

w1 w2
tR1
Inyeccion de Muestra tR2
COMO MEJORAR LA SEPARACION
EN CROMATOGRAFIA

Dos fases estan involucradas en un proceso


cromatografico :

Fase Estacionaria
-- solido, poroso, material surperficie-activa en
en forma de particula pequea o una soporte
solido con una pelicula de liquido delgado.

Fase Movil -- gas o liquido.


COMO MEJORAR LA SEPARACION
EN CROMATOGRAFIA
m = fase movil
s = fase estacionaria

Ref. V.R. Meyer


Practical High-
Performance Liquid
Chromatography

Representacion de una separacion cromatografica


COMO MEJORAR LA SEPARACION
EN CROMATOGRAFIA

-- La separacion es mejorada como resultado de las


diferencias de las interacciones entre las diferentes
compuestos con la fase estacionaria.

-- Para una buena forma de pico, un numero de


factores deben ser controlados, de otra manera,
un ensanchamiento de la banda podria ocurrir.
Nomenclatura

Factor de Capacidad
Selectividad
Numero de Platos Teoricos
Altura Equivalente de Platos Teoricos
Selectividad
Resolucion
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

Vr - V0
Vr k' =
V0
V0 Vr = volumen de retencion de un
pico de soluto
V0 = volumen muerto
pico solvente (pico no retenido)
Tiempos de Retencion
pueden ser usados en vez de
volumen.
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

El tiempo de retencion es dependiente del flujo


y las dimensiones de la columna, por lo tanto no
es adecuado comparar los cromatogramas.

Factores de Capacidad es independiente de estos


factores y por lo tanto es preferido.

Valores de k entre 1 y 5 son preferidos.


FACTORES DE CAPACIDAD (k)

4.6 mmID x 250 mmL. (1.2 mL/min)

6 min (t1) k' = 2


2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)


12 min (t1) k' = 2
4 min (t0)
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

6.0 mmID x 150 mmL. (1 mL/min)

6 min (t1) k' = 2


2 min (t0)

6.0 mmID x 300 mmL. (1 mL/min)

12 min (t1) k' = 2


4 min (t0)
FACTORES DE CAPACIDAD (k)

6.0 mmID x 150 mmL. (1.0 mL/min)


10 min (t1)
k' = 4
2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)


12 min (t1) k' = 2
4 min (t0)
SELECTIVIDAD, a

La Selectividad es una
V indicacion del grado de
0
V1 separacion entre dos
V2 picos.

k'2 V2 - V0
Selectivity= =
k'1 V1 - V0
SELECTIVIDAD, a

Dos compuestos no pueden ser separados si k


es exactamente el mismo.
Debe existir diferencia de selectividad, sino
ninguna separacion es posible (a =1).
Es afectada por la seleccin fase estacionaria y
fase movil.
NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N

Rt Ecuacion :
N = 16 x ( Rt / W )2

Area Ecuacion Modificada para


mediciones actuales :
H N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2
W1/2
H1/2 Ecuacion Modificada para
integrador :
W
N = 6.28 x (Rt x H / Area)2
NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N

Las tres ecuaciones son adecuadas solo si el


pico es de forma Gaussiana.
Para picos asimetricos :
(tR/W0.1)2
N = 41.7 T + 1.25

donde W0.1 = ancho de pico a 10% de altura


y T = factor de cola
NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N

N indica eficiencia de columna.

N=15000 N=3000

Columna con buena eficiencia Columna con mala eficiencia


ALTURA EQUIVALENTE A
PLATO TEORICO, HETP

HETP = Longitud de Columna / N


Ecuacion de Van Deemter
HETP

Flujo optimo Cada columna tiene


Un flujo optimo.

Velocidad Lineal
ALTURA EQUIVALENTE A
PLATO TEORICO, HETP

Paraobtener una buena eficiencia de


columna,
Estos ajustes son preferibles :

4.0 mmID 0.6 mL/min


4.6 mmID 0.8 mL/min
6.0 mmID 1.0 mL/min
RESOLUCION

La calidad de una separacion es medida por la resolucion :


RESOLUCION

Cuando los picos se superponen, la determinacion del


ancho de la base no es facil, por lo que la ecuacion se
modifica usando el ancho de pico a la mitad de altura :

(w2)1/2 H1/2
(w1)1/2 H

v2-v1
Rs = 1.18
(w1)1/2 +(w2)1/2
RESOLUCION

a - k'
1
R = 4
a
1
N
k '-1

N : promedio de N1 y N2
k' : promedio de k'1 y k'2
RESOLUCION

La resolucion minima requerida para


cuantificacion es 1.25.
Separacion de linea base es mejorada con Rs = 1.5.
1:1 1:4 1:16 razon Pico-altura

R = 0.8

R = 1.0

R = 1.25
RESOLUCION

es una funcion de
Selectividad
Eficiencia de Columna
Factor de Capacidad
RESOLUCION
RESOLUCION

Rs = 0.8 Rs = 1.0?? Rs = 1.25


Si los picos son triangulos, entonces pueden separarse a una Rs= 1.
Pero son de forma de distribucion Gauseana.
RESOLUCION

Relacion Pico area


Rs 1:1 1:3 1:10 1:30 1:100

0.8 5.9% 5.0% (*)% (*)% (*)%


1.0 2.3 2.6 22.7 2.9 (*)
1.2 0.83 1.1 1.4 1.6 1.8
1.4 0.26 0.41 0.49 0.71 0.92
1.6 0.069 0.1 0.16 0.22 0.33
1.8 0.016 0.022 0.032 0.050 0.086
2.0 0.003 0.005 0.009 0.013 0.021
2.2 0.001 0.001 0.001 0.003 0.003
(*) un pequeo pico aparede solo como un hombro
RESOLUCION

Initial
Uso de una columna mas
larga o de mejor performance
aumento N
Disminuir contenido de sol-
Vente organico para columna
aumento k*
ODS column.
Cambiar contenido organico,
pH, temperatura de la
cambio a
columna.
RESOLUCION

Una mejora en resolucion puede ser realizado


ajustando el nivel optimo de flujo;

O por ajuste de temperatura pero acorta la vida


de la columna.
FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
1. Difusion de Eddy
-- causa ensanchamiento de
banda.
2. Distribucion de Flujo
-- el flujo es mas rapido en el canal
Difusion de Eddy
central que en el area de la
particula.

Para reducir el ensanchamiento de


Banda estos dos factores, empaque
Distribucion de Flujo en lecho
de columna,debe tener una estrecha cromatografico
distribucion como sea posible.
FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA

3. Difusion Molecular de la Muestra en la Fase Movil


Es importante si :
a. Fase estacionaria pequea ( < 10 mm)
b. Velocidad lenta de la fase movil

-- La velocidad de flujo de la fase movil debe ser


seleccionado de forma que la difusion longitudinal
sea evitado.
FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA

Esto ocurre cuando u > 2Dm/dp


donde u = velocidad lineal

dp = diametro de particula

Dm = coeficiente de difusion
= 7.4 x 10-12 YM T
h x Vs0.6
FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
4. Transferencia de Masa entre la fase movil, movil
estancado y la fase estacionaria
-- Para prevenir esto,
a. Particulas pequeas o estas con la pelicula, superficie porosa
debe ser usada como fase estacionaria.
b. Solventes de baja-viscosidad deben ser usados.
c. Alta velocidad de analisis se mejora a expensa de la resolucion
y vice-versa.

Estructura de Poro de
una particula de fase estacionaria
INSTRUMENTAL
HPLC
INSTRUMENTACION
INSTRUMENTACION

Tres tipos de configuracion son posible :

SISTEMA ISOCRATICO

SISTEMA GRADIENTE BAJA PRESION

SISTEMA GRADIENTE ALTA PRESION


SISTEMA ISOCRATICO

detector

columna
inyector
bomba horno

Sistema simple con 1 bomba y un


reservorio de 1 solvente. data
processor
Si mas de un solvente es usado, los solventes
son premezclados.
SISTEMA ISOCRATICO

Sin embargo, el sistema isocratico alguna veces no da una


buena separacion y en estos casos, los sistemas de
gradientes son requeridos.
MeOH / H2O = 6 / 4 Long Analysis Time

Bad Separation
MeOH / H2O = 8 / 2

( column : ODS type )


SISTEMA DE GRADIENTE
Sistema Isocratico
Razon de Mezclado Fijo (no cambia) durante
el analisis
Sistema de Gradiente
Razon de Mezclado Cambiante durante el
analisis
HPGE (Gradiente Alta Presion)
LPGE (Gradiente Baja Presion)
Objetivo de la Gradiente
- Problemas en modo
isocratico-
En modo isocratico

Metanol / agua = 6 / 4
Largo tiempo analisis

Metanol / agua = 8 / 2
Pobre separacion

(Columna : tipo ODS)


OBJETIVO DE LA GRADIENTE
- SOLUCION -

Cambio Gradual de la razon de mezclado durante


el analisis
95%

Concentracion de Metanol
en fase movil

30%
Corto tiempo analisis
&
Excelente separacion
SISTEMA GRADIENTE
DE BAJA PRESION

Valvula de gradiente
Baja presion detector

columna
inyector
bomba Horno

Una bomba es usada


para controlar 4
reservorios; mezclado Procesador
es hecho antes de la De datos
bomba.
MODULO GRADIENTE LPGE
SISTEMA GRADIENTE
DE ALTA PRESION
Procesador
datos

bomba
mezclador

columna detector
bomba inyector
horno

bomba
COMPARACION ENTRE SISTEMAS
GRADIENTE DE BAJA Y ALTA

SISTEMA DE BAJA PRESION


Es el mas sencillo, solo una bomba es requerida
Desgasificador en-linea es obligatorio.

SISTEMA DE ALTA PRESION


Excelente precision de la gradiente
Sistema complicado (dos o tres bombas
requeridas) -- una bomba por solvente es usada.
Dependiendo de la sensibilidad requerida y el
detector usado, desgasificador en-linea puede no
ser un factor critico.
DIAGRAMA DE UN HPLC

Inyector Horno
Detector
Columna
Degasificador

Bomba

Reservorio Waste
Procesador de
Datos
Detectores
Detector Ultravioleta / Visible (UV/VIS)
Detector de Arreglo de Diodos (PDA)
Detector de Fluorescencia (RF)
Detector de Conductividad (CDD)
Detector de Indice de Refraccion (RID)
Detector Electroquimico (ECD)
Detector Espectrometro de Masas
Detector Evaporative Light Scattering
UV/UV-VIS detector
(SPD-10AVP / SPD-10AVVP)
Celda C : Concentracion

Ein Eout

D2 / W Lamps
l

A
A = eCl = log (Eout / Ein)
(A : Absorbancia)
C
DETECTOR UV VISIBLE

Celda de Muestra
Grating
l Ein Eout Fotodiodo

Ein Ein Fotodiodo

Celda de Referencia
Lampara D2 / W
BAJO NIVEL RUIDO

4 2
dA=0.021AU
A1=-log(2/(4+0.1))=0.311
A=-log(2/4)=0.3 A2=-log(2/(4-0.1))=0.290
dA=A1-A2=0.021

2 1 dA=0.044AU

A1=-log(1/(2+0.1))=0.322
A2=-log(1/(2-0.1))=0.278
A=-log(1/2)=0.3
dA=A1-A2=0.044
DETECTOR UV VISIBLE

A= eCl = - log (Eout / Ein)


Absorbancia

1 Rango lineal

Concentracion
DETECTOR UV VISIBLE

Seleccion de longitud de onda

275 nm
208 nm

275 nm
208 nm
Detector PDA (SPD-M10AVP)

Celda
Grating

D2 / W Lamparas
1 nm / elemento

512 fotodiodos
Detector PDA (SPD-M10AVP)

Detetcor de Arreglo de Diodos: Especificaciones

Fuente de Luz : Deuterio y tungsteno


Rango de Long. Onda : 190 - 800 nm.
Capacidad de celda: 10 ml, longitud: 10 mm
Max. Presion de celda : 50 kgf/cm2
Reemplazo de lampara y celda por la parte frontal
Monitorea a tiempo real y cuantificacion hasta en
8 longitudes de onda.
Datos obtenidos PDA

Espectro

Cromatograma
Absorbancia

Tiempo de Retencion
Detector PDA (SPD-M10AVP)

Detector de Arreglo de Diodos


El pico puede ser identificado usando el espectro UV.
El chequeo de pureza de pico puede ser hecho.
-- superposicion de 3 espectros
-- ratio cromatogramas
-- comparasion del threshold y el indice de
similaridad.
Detector de Arreglo de
Diodos
Detector Fluorescencia (RF-
10AXL)
Long. De Onda de Excitacion

+ hn1 *

* hn2 +
Long. De Onda de Emision
Estado Excitado

Estado de Quasi-excitacion
hn1
hn2
Fluorescencia
Ground state
Detector Fluorescencia (RF-10AXL)

Reactivos de Derivatizacion
OPA reactivo para aminas primarias
A
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO A
o-phthalaldhyde
(OPA)
ADAM reactivo para acidos grasos
+ R-COOH
CHN2 CH2OCOR
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
Detector Fluorescencia (RF-10AXL)

ALGUNAS ESPECIFICACIONES DE RF-10AXL

Lampara : Xenon
Volumen de Celda: 12 ml
Max. Presion de tolerancia : 20 kgf/cm2
Monitorea la vida de lampara y la energia.
Rango long. de onda : 200 - 650 nm(std)
expandible a 750 o 900 nm con fotomultiplicador
opcional.
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

Fotodiodo
Referencia

Lampara W
Muestra
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

Sistema Optico
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

ALGUNAS ESPECIFICACIONES DE RID-10A

Fuente Luz: lampara tungsteno (20,000 h vida)


Flujo Max. seteable 20 ml/min
(150 ml/min con opcion)
Max presion: celda (20 kgf/cm2), valvula (4 kgf/cm2)
Temperatura Celda : 30-60oC
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)

Chromatograma de azucares
Condiciones Analiticas
Columna : Shim-pack CLC-
NH2
Fase Movil: Acetonitrilo /
agua = 7 / 3
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : Ambiente
Picos
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
COLECTOR DE FRACCIONES
Sistema de Procesamiento de Datos
MODOS DE
TRABAJO EN HPLC
MODOS DE HPLC

Modo Fase Normal


Modo Fase Reversa
Modo Fase Reversa Apariamiento
Ionico
Modo Intercambio Ionico
Modo SEC ( GPC / GFC )
Modo separacion Quiral
MODO FASE NORMAL

Eter Petroleo Cromatograma

Clorofila Color

CaCO3

Desarrollado por
M.S. Tswett.
MODO FASE NORMAL

Se uso la primera vez


CaCO3 para Columna de Separacion
Eter de Petroleo como Solvente
Esta combinacion se define como
Modo Fase Normal
Columna : propiedad polar
Solvente : propiedad no polar
COLUMNAS DE HPLC
DE FASE NORMAL

Tipo Silica gel : uso general


Tipo Ciano : uso general
Tipo Amino : analisis de azucar
Tipo Diol : analisis de proteina
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
Si -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Si
Silica gel Si Modificado
QUE INTERACCION?

Enlace Hidrogeno
No-polar

Silica gel (polar)


ENLACE PUENTE HIDROGENO

Si la muestra tiene
-COOH : grupo carboxyl
-NH2 : grupo Amino
-OH : grupo Hidroxyl
Enlace puente hidrogeno llega ser fuerte.

Si la muestra tiene grupos voluminosos,


debido a impedimento esterico
Enlace puente hidrogeno llega ser debil.
TIEMPO DE RETENCION Y
ENLACE PUENTE HIDROGENO
Fuerte
HO
SiOH

SiOH

Debil
OH
AUMENTO DE
POLARIDAD DEL SOLVENTE

0% 2% 5% / MeOH

1 : Dioctyl phthalate
2 : Dibutyl phthalate Solvente:Hexano
3 : Diethyl phthalate
4 : Dimethyl phthalate
COLUMNAS HPLC
DE FASE REVERSA

Tipo C18 (ODS)


Tipo C8 (octyl) Propiedad No-polar
Tipo C4 (butyl)
-Si-C18H35
Tipo Fenil
Tipo TMS Si
Tipo Ciano
MODO FASE REVERSA

Columna : Propiedad No-polar


Solvente : Propiedad Polar

Agua / Metanol / Acetonitrilo


QUE INTERACCION?

Interaccion
Hidrofobica Solvente polar

No-polar
HIDROFOBICIDAD

Si la muestra tiene
CH3CH2CH2--- : Cadena carbonada Hidrofobicidad
: Grupo Aromatico
es fuerte.

Si la muestra tiene
-COOH : grupo Carboxyl
-NH2 : grupo Amino Hidrofobicidad
-OH : grupo Hydroxyl es debil.
TIEMPO DE RETENCION Y
HIDROFOBICIDAD
OH

C18 (ODS)
Weak

Strong
OH
AUMENTANDO LA
POLARIDAD DEL SOLVENTE

20 % 30 % 40% / H2O

1 : p-Hydoxymethylbenzoate
2 : p-Hydoxyethylbenzoate Solvente : MeOH
3 : p-Hydoxypropylbenzoate
4 : p-Hydoxybutylbenzoate
EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA

C8

C18 (ODS) Mediana


muestra
Fuerte C4
muestra
Debil
muestra
EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA
Condiciones analiticas
ODS C8 TMS Columna : Shim-pack CLC-ODS
Fase mobil : MeOH : H2O = 7 :3
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : 40 C
Volumen de Injeccion : 10 uL
Deteccion : UV-254 nm
Picos
1. Methyl benzoate
2. Ethyl benzoate
3. n-Propyl benzoate
4. n- Butyl benzoate
FASE NORMAL VS REVERSA

Param etro Fase Norm al Fase R eversa

Polaridad de Colum na Alta Baja

Polaridad de Solvente Baja Alta

Secuencia de Elucion 1ero baja polaridad 1ero alta polaridad

Aum ento Polaridad Solvente Elucion rapida Elucion lenta


FASE NORMAL VS REVERSA

Fase Normal
Buenaseparacion de estereo isomeros
(Vitamina E etc..)
Tiempo de retencion cambiante
Fase Reversa
Buena repetibilidad del tiempo retencion
Fase estacionaria robusta
CUANTIFICACION
METODOS CALIBRACION

Calibracion con Estandar Externo


Calibracion con Estandar Interno
Adicion Estandar
Normalizacion Corregida
METODOS DE CALIBRACION
Estandar Externo
La separation no es dificil
Los errores de inyeccion influyen en el resultado
cuantitativo
Estandar Interno
Los errores de inyeccion pueden ser eliminados
La recuperacion en proceso de pretratamientpo
puede ser estimado
La separacion es ligeramente mas dificil
Dificil encontrar compuestos como Estandar Interno.
PRECISION EN LA CUANTIFICACION
RANGO SELECCIONABLE DE
TRABAJO
[ Respuesta del Detector ]

[ Concentracion del soluto ]


CALIBRACION CON ESTANDAR
EXTERNO

Compuestos

Dilucion Dilucion Dilucion Dilucion


CALIBRACION CON ESTANDAR
EXTERNO
CALIBRACION CON
ESTANDAR EXTERNO
Area
Concentracin
A1 Curva de Calibracin
C1
A4

A2

Peak area
A3
C2

A2
A3
C3
A1

A4
C4 C1 C2 C3 C4
138 Concentracin
CALIBRACION CON ESTANDAR
EXTERNO
CALCULO CON METODO DE ESTANDAR
EXTERNO
[Concentraction]

Y = aX + b
a : Pendiente
125 ppm b : Y intercepto

2500
2500
[Area de Pico]
CALIBRACION CON ESTANDAR
INTERNO
PREPARACION DE ESTANDARES

Estandar
Compuestos Interno

Dilucion Dilucion Dilucion Dilucion


CALIBRACION ESTANDAR INTERNO
ANALISIS DE VAINILLA
Curva de Calibracin por Metodo de
estandar interno
Concentracin Area

Area for target substance / Area for internal standard


Target Internal
substance standard A1 AIS Curva de Calibracion
C1 CIS A4 /AIS

A2 AIS A3 /AIS
C2 CIS

A2 /AIS
A3 AIS
C3 CIS
A1/AIS

A4 AIS
C4 CIS C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS
143 Concentration of target substance /
Concentration of internal standard
CALIBRACION ESTANDAR INTERNO
ANALISIS DE VAINILLA
CALIBRACION DE ESTANDAR INTERNO
CALCULO DE RESULTADOS
[Conc. Comp. / Conc. EI]

Y = aX + b
a : Pendiente
1.67 b : Y intercepto

C 2500
5.0
500
[Area Comp / Area EI] ES
Y = Conc.Comp. / Conc. EI
1.67 = Conc. Comp./ 100 ppm
Conc. Comp. = 167 ppm
VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR EXTERNO
Solo los compuestos a analizar son
separados.

Target Target
DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR EXTERNO
Los errores en la inyeccion de muestra influyen
directamente en el analisis cuantitativo.

Inyeccion de 10 uL Inyeccion de 11 uL

100 ppm 110 ppm


VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO
Los errores de inyeccion pueden ser eliminados.

Inyeccion de 10 uL Inyeccion de 11 uL
2200
2000 1100
1000 T
IS
IS T

2000 / 1000 = 2 2200 / 1100 = 2


VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO
No es afectado por las inconsistencias en el
volumen de inyeccin.
IS
X AX / AIS
10 L
inyectado

Same area
ratio
IS
X
9 L
inyectado
CX / CIS
149
VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO

La recuperacion en el proceso de pretratamiento


puede ser estimado.
Adicion de EI (100 ppm)
Estandar I (100 ppm) a la muestra
IS T
IS T
1000 950

Recuperacion = (950/1000)x100 = 95%


VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO
No es afectado por la tasa de recuperacin en el
pretratamiento
IS
X

AX / AIS
100%
recovery
rate

Same area
ratio
IS
90% X
recovery
rate
CX / CIS
151
DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO

La separation es ligeramente dificil.


IS T IS T

T
IS
DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO

Es dificil obtener compuesto EI.


La estructura quimica de EI es similar al
del compuesto a analizar.
En la muestra no debe existir el
compuesto que se utiliza como estandar
interno.
Criterios de seleccin del estandar interno

It must have similar chemical properties to the


target substance.
Its peak must appear relatively near that of the
target substance.
It must not already be contained in the actual
samples.
Its peak must be completely separated from those
of other sample components.
It must be chemically stable.
154
GRACIAS