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AGROINDUSTRIALES
CROMATOGRAFIA
Clorofila
Colores
CaCO3
Separar molculas:
protenas
pptidos
aminocidos
lpidos
Azucares
ADN/ARN, etc.
TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
Gas
Stationary
phase Liquid
Gas Liquid
chromatography chromatography
Solid
5
TIPOS DE CROMATOGRAFIA:
1.TLC y 2. HPTLC
FLUJO
propiciado por
MUESTRA
CAPILARIDAD
FASE MVIL
FRENTE de avance del solvente (apolar)
H2O H2O
H2O H2O
H2O H- H2O
H-
H2O H- H2O
H2O
H2O H2O
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH -Si-OH
-Si-OH -Si-OH
3. Cromatografa de Columna
Normalmente se corre muestras que eluyen
bajo gravedad.
-- proceso lento que requiere grandes cantidades de
solventes.
-- Tiempo y esfuerzo se gasta para empacar la
columna.
packing
RESERVORIO
f. mvil
LECHO
CROMATOGRFICO
f. estacionaria
COLUMNA MUESTRA
FLUJO
gravedad
DIFUSIN
llave
SEPARACIN
CROMATOGRAFA EN COLUMNA
PERFIL DE ELUCIN
Espectrofotomtrico
fraccin
CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN
CLASE: Reparto
PROPIEDAD: Tamao (y forma)
NOMBRE: Exclusin
PERFIL DE ELUCIN
APLICACIN grande
MUESTRA
pequea
respuesta del detector
ELUCIN
1 2 3 4 5 6 7 8 9
fraccin
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Electrosttica
NOMBRE: Intercambio inico (aninico o catinico)
PERFIL DE ELUCIN
q+
APLICACIN Q+
MUESTRA
respuesta del detector
+
Na+
ELUCIN
-
1 2 3 4 5 6 7 8 9
fraccin
CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
CLASE: Interaccin
PROPIEDAD: Interacciones especficas entre dos molculas
P.e. hormona-receptor
protena-metal o cofactores como ATP
antgeno-anticuerpo
NOMBRE: Afinidad biolgica
FASE MVIL
SOPORTE Matriz de micropartculas hidroflicas sin carga,
con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrlica).
PERFIL DE ELUCIN
ELUCIN
LAVADO ESPECFICA
APLICACIN
MUESTRA
LAVADO
ELUCIN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ESPECFICA fraccin
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
4. Cromatografa de Gases
Area sombreada :
solid Rango Supercritico.
liquid
gas
1. Anlisis simultaneo
2. Alta resolucion
Carbohidratos
1. fructosa
2. Glucosa
3. Sacarosa
4. Palatinosa
5. Trehalosa
6. isomaltosa 5
time
27
OBJETOS EN EL RIO
Mixer
Pump
s
Solvents
Columna
Detector
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
30
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
31
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
32
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
33
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
34
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
37
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
38
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
39
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
40
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
41
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
42
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
43
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
44
Separacin
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
45
El Cromatograma
to - elution time of unretained peak
tR- retention time - determines sample identity
tR
tR
mAU Area or height is proportional
to the quantity of analyte.
to
Injection time
46
Parametros de analisis del HPLC
Mobile Phases
Flow Rate
Composition
Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant
47
EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS
EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS
t0
w1 w2
tR1
Inyeccion de Muestra tR2
COMO MEJORAR LA SEPARACION
EN CROMATOGRAFIA
Fase Estacionaria
-- solido, poroso, material surperficie-activa en
en forma de particula pequea o una soporte
solido con una pelicula de liquido delgado.
Factor de Capacidad
Selectividad
Numero de Platos Teoricos
Altura Equivalente de Platos Teoricos
Selectividad
Resolucion
FACTORES DE CAPACIDAD (k)
Vr - V0
Vr k' =
V0
V0 Vr = volumen de retencion de un
pico de soluto
V0 = volumen muerto
pico solvente (pico no retenido)
Tiempos de Retencion
pueden ser usados en vez de
volumen.
FACTORES DE CAPACIDAD (k)
La Selectividad es una
V indicacion del grado de
0
V1 separacion entre dos
V2 picos.
k'2 V2 - V0
Selectivity= =
k'1 V1 - V0
SELECTIVIDAD, a
Rt Ecuacion :
N = 16 x ( Rt / W )2
N=15000 N=3000
Velocidad Lineal
ALTURA EQUIVALENTE A
PLATO TEORICO, HETP
(w2)1/2 H1/2
(w1)1/2 H
v2-v1
Rs = 1.18
(w1)1/2 +(w2)1/2
RESOLUCION
a - k'
1
R = 4
a
1
N
k '-1
N : promedio de N1 y N2
k' : promedio de k'1 y k'2
RESOLUCION
R = 0.8
R = 1.0
R = 1.25
RESOLUCION
es una funcion de
Selectividad
Eficiencia de Columna
Factor de Capacidad
RESOLUCION
RESOLUCION
Initial
Uso de una columna mas
larga o de mejor performance
aumento N
Disminuir contenido de sol-
Vente organico para columna
aumento k*
ODS column.
Cambiar contenido organico,
pH, temperatura de la
cambio a
columna.
RESOLUCION
dp = diametro de particula
Dm = coeficiente de difusion
= 7.4 x 10-12 YM T
h x Vs0.6
FACTORES QUE CAUSAN
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
4. Transferencia de Masa entre la fase movil, movil
estancado y la fase estacionaria
-- Para prevenir esto,
a. Particulas pequeas o estas con la pelicula, superficie porosa
debe ser usada como fase estacionaria.
b. Solventes de baja-viscosidad deben ser usados.
c. Alta velocidad de analisis se mejora a expensa de la resolucion
y vice-versa.
Estructura de Poro de
una particula de fase estacionaria
INSTRUMENTAL
HPLC
INSTRUMENTACION
INSTRUMENTACION
SISTEMA ISOCRATICO
detector
columna
inyector
bomba horno
Bad Separation
MeOH / H2O = 8 / 2
Metanol / agua = 6 / 4
Largo tiempo analisis
Metanol / agua = 8 / 2
Pobre separacion
Concentracion de Metanol
en fase movil
30%
Corto tiempo analisis
&
Excelente separacion
SISTEMA GRADIENTE
DE BAJA PRESION
Valvula de gradiente
Baja presion detector
columna
inyector
bomba Horno
bomba
mezclador
columna detector
bomba inyector
horno
bomba
COMPARACION ENTRE SISTEMAS
GRADIENTE DE BAJA Y ALTA
Inyector Horno
Detector
Columna
Degasificador
Bomba
Reservorio Waste
Procesador de
Datos
Detectores
Detector Ultravioleta / Visible (UV/VIS)
Detector de Arreglo de Diodos (PDA)
Detector de Fluorescencia (RF)
Detector de Conductividad (CDD)
Detector de Indice de Refraccion (RID)
Detector Electroquimico (ECD)
Detector Espectrometro de Masas
Detector Evaporative Light Scattering
UV/UV-VIS detector
(SPD-10AVP / SPD-10AVVP)
Celda C : Concentracion
Ein Eout
D2 / W Lamps
l
A
A = eCl = log (Eout / Ein)
(A : Absorbancia)
C
DETECTOR UV VISIBLE
Celda de Muestra
Grating
l Ein Eout Fotodiodo
Celda de Referencia
Lampara D2 / W
BAJO NIVEL RUIDO
4 2
dA=0.021AU
A1=-log(2/(4+0.1))=0.311
A=-log(2/4)=0.3 A2=-log(2/(4-0.1))=0.290
dA=A1-A2=0.021
2 1 dA=0.044AU
A1=-log(1/(2+0.1))=0.322
A2=-log(1/(2-0.1))=0.278
A=-log(1/2)=0.3
dA=A1-A2=0.044
DETECTOR UV VISIBLE
1 Rango lineal
Concentracion
DETECTOR UV VISIBLE
275 nm
208 nm
275 nm
208 nm
Detector PDA (SPD-M10AVP)
Celda
Grating
D2 / W Lamparas
1 nm / elemento
512 fotodiodos
Detector PDA (SPD-M10AVP)
Espectro
Cromatograma
Absorbancia
Tiempo de Retencion
Detector PDA (SPD-M10AVP)
+ hn1 *
* hn2 +
Long. De Onda de Emision
Estado Excitado
Estado de Quasi-excitacion
hn1
hn2
Fluorescencia
Ground state
Detector Fluorescencia (RF-10AXL)
Reactivos de Derivatizacion
OPA reactivo para aminas primarias
A
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO A
o-phthalaldhyde
(OPA)
ADAM reactivo para acidos grasos
+ R-COOH
CHN2 CH2OCOR
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
Detector Fluorescencia (RF-10AXL)
Lampara : Xenon
Volumen de Celda: 12 ml
Max. Presion de tolerancia : 20 kgf/cm2
Monitorea la vida de lampara y la energia.
Rango long. de onda : 200 - 650 nm(std)
expandible a 750 o 900 nm con fotomultiplicador
opcional.
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)
Fotodiodo
Referencia
Lampara W
Muestra
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)
Sistema Optico
Detector Indice Refraccion
(RID-10A)
Chromatograma de azucares
Condiciones Analiticas
Columna : Shim-pack CLC-
NH2
Fase Movil: Acetonitrilo /
agua = 7 / 3
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : Ambiente
Picos
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
COLECTOR DE FRACCIONES
Sistema de Procesamiento de Datos
MODOS DE
TRABAJO EN HPLC
MODOS DE HPLC
Clorofila Color
CaCO3
Desarrollado por
M.S. Tswett.
MODO FASE NORMAL
Enlace Hidrogeno
No-polar
Si la muestra tiene
-COOH : grupo carboxyl
-NH2 : grupo Amino
-OH : grupo Hidroxyl
Enlace puente hidrogeno llega ser fuerte.
SiOH
Debil
OH
AUMENTO DE
POLARIDAD DEL SOLVENTE
0% 2% 5% / MeOH
1 : Dioctyl phthalate
2 : Dibutyl phthalate Solvente:Hexano
3 : Diethyl phthalate
4 : Dimethyl phthalate
COLUMNAS HPLC
DE FASE REVERSA
Interaccion
Hidrofobica Solvente polar
No-polar
HIDROFOBICIDAD
Si la muestra tiene
CH3CH2CH2--- : Cadena carbonada Hidrofobicidad
: Grupo Aromatico
es fuerte.
Si la muestra tiene
-COOH : grupo Carboxyl
-NH2 : grupo Amino Hidrofobicidad
-OH : grupo Hydroxyl es debil.
TIEMPO DE RETENCION Y
HIDROFOBICIDAD
OH
C18 (ODS)
Weak
Strong
OH
AUMENTANDO LA
POLARIDAD DEL SOLVENTE
20 % 30 % 40% / H2O
1 : p-Hydoxymethylbenzoate
2 : p-Hydoxyethylbenzoate Solvente : MeOH
3 : p-Hydoxypropylbenzoate
4 : p-Hydoxybutylbenzoate
EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA
C8
Fase Normal
Buenaseparacion de estereo isomeros
(Vitamina E etc..)
Tiempo de retencion cambiante
Fase Reversa
Buena repetibilidad del tiempo retencion
Fase estacionaria robusta
CUANTIFICACION
METODOS CALIBRACION
Compuestos
A2
Peak area
A3
C2
A2
A3
C3
A1
A4
C4 C1 C2 C3 C4
138 Concentracin
CALIBRACION CON ESTANDAR
EXTERNO
CALCULO CON METODO DE ESTANDAR
EXTERNO
[Concentraction]
Y = aX + b
a : Pendiente
125 ppm b : Y intercepto
2500
2500
[Area de Pico]
CALIBRACION CON ESTANDAR
INTERNO
PREPARACION DE ESTANDARES
Estandar
Compuestos Interno
A2 AIS A3 /AIS
C2 CIS
A2 /AIS
A3 AIS
C3 CIS
A1/AIS
A4 AIS
C4 CIS C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS
143 Concentration of target substance /
Concentration of internal standard
CALIBRACION ESTANDAR INTERNO
ANALISIS DE VAINILLA
CALIBRACION DE ESTANDAR INTERNO
CALCULO DE RESULTADOS
[Conc. Comp. / Conc. EI]
Y = aX + b
a : Pendiente
1.67 b : Y intercepto
C 2500
5.0
500
[Area Comp / Area EI] ES
Y = Conc.Comp. / Conc. EI
1.67 = Conc. Comp./ 100 ppm
Conc. Comp. = 167 ppm
VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR EXTERNO
Solo los compuestos a analizar son
separados.
Target Target
DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR EXTERNO
Los errores en la inyeccion de muestra influyen
directamente en el analisis cuantitativo.
Inyeccion de 10 uL Inyeccion de 11 uL
Inyeccion de 10 uL Inyeccion de 11 uL
2200
2000 1100
1000 T
IS
IS T
Same area
ratio
IS
X
9 L
inyectado
CX / CIS
149
VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO
AX / AIS
100%
recovery
rate
Same area
ratio
IS
90% X
recovery
rate
CX / CIS
151
DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO
T
IS
DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO