TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA 43

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3 Fisiologa y
metabolismo
bacteriano
G. Varela, G. Grotiuz

Las bacterias son los organismos ms pequeos que tienen la maquinaria requerida para el
crecimiento y la replicacin. Estn compuestas, como las clulas eucariotas, por protenas,
polisacridos, lpidos, cidos nucleicos, entre otros. Estas macro-molculas pueden formar
parte de estructuras celulares ms complejas, como la pared celular y la membrana plasmtica.
El crecimiento bacteriano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes
qumicos de la clula. Es un proceso complejo que supone la replicacin de todas las estruc-
turas y componentes celulares a partir de nutrientes exgenos.
El conocimiento de la fisiologa y del metabolismo bacteriano tiene algunas aplicaciones
prcticas. En principio permite conocer el modo de vida y el hbitat de diferentes especies
bacterianas. El ser humano actuando como husped, ofrece una variedad de nichos ecolgicos
que se diferencian entre s por aspectos fsicos y qumicos (temperatura, concentracin de
oxgeno, pH, presin osmtica, etc.), en los cuales pueden crecer y multiplicarse distintas
especies bacterianas segn sus requerimientos nutricionales, ambientales y atmosfricos.
Adems, permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificacin de los pat-
genos participantes. Desde un enfoque teraputico, nos permite conocer y entender el modo
de accin de algunos antibiticos que bloquean una va metablica o la sntesis de alguna
macromolcula esencial para la bacteria.
El trmino metabolismo se refiere al conjunto de reacciones qumicas que se producen en
la clula y tiene tres funciones especficas. La primera es obtener energa qumica del entorno
y almacenarla, para luego usarla en diferentes funciones celulares. La segunda es convertir
los nutrientes exgenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la
clula bacteriana. Y la tercer funcin es formar y degradar molculas necesarias para cumplir
funciones celulares especficas, por ejemplo: movilidad y captacin de nutrientes.
El metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas enzimticamente y
se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la clula bacteriana sintetiza
sus propios componentes se conoce como anabolismo y resulta en la produccin de nuevo
material celular; tambin se denomina biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere
energa, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer
y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones degradativas de los nutrientes
para obtener energa o para convertirlos en unidades precursoras de la biosntesis, se conoce
como catabolismo.
As, hemos visto dos tipos de transformaciones qumicas que ocurren simultneamente
en la bacteria, por lo tanto el metabolismo es el resultado colectivo de ambas reacciones.
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Las catablicas resultan en la liberacin de la energa qumica contenida en los nutrientes,

mientras que las anablicas la consumen. Por lo tanto, la energa liberada como resultado de
las reacciones de oxidacin reduccin del catabolismo, debe ser almacenada y transportada
de alguna manera. Una de ellas es como compuestos con uniones fosfato de alta energa;
dichos compuestos luego se usan como intermediarios en la conversin de la energa conser-
vada en trabajo til. El compuesto fosfato de alta energa ms importante en los seres vivos
es el trifosfato de adenosina (ATP). ste se genera en la clula bacteriana por dos procesos
diferentes: fosforilacin a nivel del substrato y fosforilacin oxidativa.

Metabolismo productor de energa

En los seres vivos, la utilizacin de la energa potencial contenida en los nutrientes se pro-
duce por reacciones de oxidacin reduccin. Qumicamente la oxidacin esta definida por
la prdida de electrones y, la reduccin por la ganancia de los mismos. En bioqumica, estas
reacciones frecuentemente incluyen tambin la transferencia de tomos enteros de hidrgeno,
por lo tanto se conocen con el nombre de reacciones de deshidrogenacin. En las reacciones
de este tipo hay sustancias que ceden electrones (dadoras) y otras que los aceptan (acepto-
ras). En las bacterias de inters mdico los sistemas de oxidacin reduccin transforman la
energa qumica de los nutrientes en una forma biolgicamente til; dichos procesos incluyen
la fermentacin y la respiracin. En la primera, tanto la molcula dadora como la aceptora
de electrones, son compuestos orgnicos. En cambio, en la respiracin hay un aceptor final
exgeno, que cuando es el oxgeno se denomina respiracin aerobia y cuando es un compuesto
inorgnico, respiracin anaerobia.

FERMENTACIN
En sta los electrones pasan del dador, un intermediario formado durante la degradacin
del substrato, hacia un aceptor constituido por algn otro intermediario orgnico tambin
generado durante el catabolismo del substrato inicial. Por lo tanto, este proceso de oxidacin
reduccin no requiere el aporte exgeno de un aceptor final de electrones.
Aunque hay distintos tipos de fermentaciones, todas llevan a una oxidacin parcial de
los tomos de carbono del substrato inicial y liberan, por lo tanto una pequea parte de la
energa potencial contenida (Ver figura 1). El rendimiento energtico de este proceso es
menor que el de la respiracin.
En las bacterias se encuentran las tres vas centrales del metabolismo intermediario de
los hidratos de carbono: la glucoltica o de Embden Meyerhof Parnas, la de pentosa fosfato o
shunt de las pentosas y la de Entner-Doudoroff.
La va glucoltica que degrada la glucosa se divide en tres etapas principales. La primera
es preparativa, con reacciones que no son de oxidacin reduccin, sin liberacin de energa
y con formacin de dos intermediarios de tres tomos de carbono cada uno. En la segunda
etapa, s ocurren reacciones de oxidacin reduccin con liberacin de energa, formacin de
ATP por fosforilacin a nivel del substrato (el ATP se genera en un paso enzimtico espe-
cfico) y produccin de dos molculas de piruvato. En la tercer etapa, nuevamente ocurren
reacciones de oxidacin reduccin y se generan los productos finales de la fermentacin, que
varan segn la bacteria en cuestin. Solo una pequea parte de la energa libre que poten-
cialmente puede derivar de la degradacin de una molcula de glucosa queda disponible por
esta va, dado que los productos finales son compuestos en los que el carbono se encuentra
todava en estado reducido.
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Figura 1. Rol central del piruvato en las fermentaciones

Por cada molcula de glucosa que entra a esta va, se forman cuatro molculas de ATP
y como se consumen dos en la primer etapa, el balance neto es de dos molculas de ATP
por cada molcula de glucosa fermentada. El destino final del metabolito clave, el piruvato,
depende de los procesos empleados para la regeneracin del dinucletido de nicotinamida
adenina (NAD) a partir del dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADH) y as
mantener el equilibrio de oxidacin reduccin.
Aunque la va glucoltica es la ms importante en las clulas eucariotas y procariotas, no
es la nica. La va de las pentosas es una ruta multifuncional para la degradacin de hexosas,
pentosas y otros hidratos de carbono. Para los fermentadores heterolcticos es la principal
fuente productora de energa, aunque la mayora de las bacterias usan esta va como fuente
de dinucletido de nicotinamida adenina fosfato reducido (NADPH) y de pentosas para la
sntesis de nucletidos.
La va de Entner-Doudoroff es la ruta principal para la degradacin de la glucosa en las
bacterias aerobias estrictas como Neisseria y Pseudomonas. Como sucede en la va de las pen-
tosas, aqu solo se produce una molcula de ATP por molcula de glucosa degradada.
El cido pirvico derivado de la glucosa, es un compuesto clave en el metabolismo fer-
mentador de los hidratos de carbono. En su formacin, el NAD es reducido a NADH y ste
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debe oxidarse nuevamente a NAD para alcanzar el equilibrio final de oxidacin reduccin.
Las bacterias se diferencian de las clulas eucariotas por la forma en que eliminan el piruvato;
en las bacterias la oxidacin incompleta es la regla y se acumula gran cantidad de metabolitos
finales de la fermentacin. El estudio y el conocimiento de las fermentaciones bacterianas
tiene importancia prctica, porque proporciona productos industriales que son tiles en el
laboratorio para identificar las diferentes especies. Entonces, segn los productos finales,
tenemos diferentes tipos de fermentacin: alcohlica, homolctica, heterolctica, del cido
propinico, cido mixta, de butanodiol y del cido butrico.

Fermentacin alcohlica
Es el tipo de fermentacin ms antigua que se conoce. Produce etanol a partir de glucosa.
Aunque ciertas bacterias producen alcohol, ste es elaborado por otras vas.

Fermentacin homolctica
Todos los miembros del gnero Streptococcus, Pediococcus y muchas especies de Lactobacillus
fermentan la glucosa fundamentalmente a cido lctico con poca acumulacin de otros
productos finales. En esta reaccin el piruvato se reduce a cido lctico por accin de la
enzima lctico deshidrogenasa, actuando el NADH como dador de electrones. Esto ocurre
en la tercer etapa de la va glucoltica.

Fermentacin heterolctica
En este tipo de fermentacin solo la mitad de la glucosa se convierte en cido lctico, el resto
se transforma en una mezcla de anhdrido carbnico (CO2), cido frmico, cido actico, etc.
En esta fermentacin se emplea fundamentalmente la va de las pentosas y se produce en las
bacterias del gnero Leuconostoc y Lactobacillus.

Fermentacin del cido propinico

Es caracterstica de algunas bacterias anaerobias como el Propionibacterium (bacilo gramposi-
tivo, no esporulado). Este tipo de fermentacin tiene la ventaja de que genera una molcula
ms de ATP.

Fermentacin cido mixta

Es caracterstica de la mayora de las enterobacterias. Bacterias como Shigella, Salmonella y E.
coli fermentan las hexosas a travs del piruvato a cido lctico, cido actico, cido succnico
y cido frmico.

Fermentacin de butanodiol
Varias bacterias como Enterobacter, Serratia y Bacillus producen 2,3-butanodiol durante la
fermentacin de la glucosa. Este deriva de la condensacin de dos molculas de piruvato en
una molcula neutra de acetona que luego es reducida a 2,3-butanodiol.

Fermentacin del cido butrico

Se ve en bacterias del gnero Clostridium (bacilo grampositivo, anaerobio y esporulado).
Si bien hasta ahora nos hemos referido solo a la fermentacin de hidratos de carbono como
procedimiento para obtener energa, debemos destacar que otros compuestos orgnicos pueden
ser fermentados, por ejemplo: aminocidos (alanina, glicina). En Clostridium proteolticos, la
fermentacin de aminocidos ms caracterstica es la reaccin de Stickland.
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Anteriormente hemos discutido el metabolismo de los hidratos de carbono en ausencia

de un aceptor externo de electrones y hemos visto que solo una pequea parte de la energa
potencial contenida en el substrato es liberada. Esto se debe a que la diferencia entre los po-
tenciales de oxidacin reduccin entre la molcula dadora inicial y la aceptora final es muy
pequea. Otras bacterias tienen la capacidad de oxidar completamente el substrato inicial a
CO2 por el proceso conocido como respiracin.

RESPIRACIN
Es el proceso por el cual un substrato es oxidado completamente a CO2 y agua, con participa-
cin de una cadena de electrones ubicada en la membrana plasmtica, en la cual el aceptor
final es el oxgeno molecular u otro compuesto inorgnico (nitratos, sulfatos, anhidrido
carbnico, etc.)anaerobia. Los primeros pasos en la respiracin de la glucosa son idnticos
a los de la gluclisis, pero mientras en esta ltima el piruvato es convertido en productos
finales de la fermentacin (cido lctico, cido propinico, etc.), en la respiracin es oxidado
completamente a CO2 mediante el ciclo de Krebs (ver figura 2). Por cada molcula de piruvato
oxidada en este ciclo, se generan tres molculas de CO2. Al igual que en la fermentacin, los
electrones generados en el ciclo de Krebs, pasan a coenzimas que tienen NAD. Sin embargo,
en la respiracin aerobia, los electrones del NADH son transferidos al oxgeno para regenerar
NAD a travs de un sistema transportador, en lugar de cederlos al piruvato.

SISTEMAS TRANSPORTADORES DE ELECTRONES Y GENERACIN DE TRIFOSFATO DE

ADENOSINA
Estos sistemas estn compuestos por transportadores (carriers) de electrones, asociados a la
membrana plasmtica y tienen dos funciones bsicas: aceptar electrones de un donador y
cederlos a un aceptor y conservar energa liberada durante ese transporte en forma de ATP
por fosforilacin oxidativa.
Existen varios tipos de enzimas de oxidacin reduccin y protenas transportadoras de
electrones, entre los que se destacan las NAD-deshidrogenasas, las flavoprotenas y los ci-
tocromos. Las flavoprotenas contienen un derivado de la riboflavina como grupo prosttico
que se reduce y se oxida alternativamente. La riboflavina, conocida como vitamina B2, es
necesaria como factor de crecimiento por algunas bacterias. Los citocromos son protenas
que tienen anillos porfirnicos con hierro y tambin se oxidan y se reducen alternativamente.
Hay diferentes tipos de citocromos que se distinguen por sus potenciales de reduccin. Se los
designa con letras a, b, c, etc. Tambin estn las quinonas, sustancias liposolubles relacionadas
con la vitamina K, que participan en el transporte de electrones.
Para entender como se genera el ATP durante el transporte de electrones, debemos recodar
su orientacin con respecto a la membrana plasmtica de la clula bacteriana. La cadena est
ubicada como ya dijimos en la membrana plasmtica, de tal modo que durante el proceso de
transporte hay una separacin fsica entre protones y electrones. Los protones quedan fuera
de la clula, mientras que los electrones quedan dentro de sta; en consecuencia se genera
un gradiente de pH y un potencial elctrico a travs de la membrana plasmtica, estando el
lado externo cido y cargado positivamente y el interno alcalino y cargado negativamente. A
pesar de su tamao pequeo, ni los hidrogeniones, ni los hidrxidos atraviesan libremente la
membrana; por lo tanto, el equilibrio no puede establecerse espontneamente. Dicho estado
energtico de la membrana plasmtica, similar a una batera, puede ser usado por la clula
para realizar un trabajo til, por ejemplo, movilidad o sntesis de ATP. Para la sntesis de ATP
un componente fundamental del proceso es una ATPasa de membrana; enzima que cataliza
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Figura 2. Ciclo de Krebs

la reaccin reversible entre difosfato de adenosina (ADP) y ATP. Operando en una direccin
y usando el gradiente de protones generado durante el transporte, dicha enzima cataliza la
formacin de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico. Existe una variedad de agentes
qumicos llamados desacopladores que inhiben la sntesis de ATP durante el transporte de
electrones sin alterar el propio proceso de transporte. Ejemplos de estos agentes son el dicu-
marol y el dinitrofenol. Son sustancias liposolubles que impiden la formacin del gradiente
de pH y el elctrico, favoreciendo el pasaje de protones a travs de la membrana; de este
modo inhiben la sntesis de ATP. La polimixina B (un antibitico) se adhiere especficamente
a la superficie externa de la membrana, alterando su estructura y propiedades osmticas. Se
produce entonces la prdida de metabolitos y la inhibicin de algunos procesos bioqumicos
que tienen lugar a ese nivel, como el transporte de electrones y la sntesis de ATP, entre
otros. Otras sustancias, por ejemplo: cianuro o azida de sodio, bloquean el propio sistema de
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transporte y se denominan inhibidores. Tanto los desacopladores como los inhibidores son
venenos celulares que actan en clulas eucariotas y procariotas.

BALANCE ENERGTICO DE LA RESPIRACIN

El resultado neto de las reacciones del ciclo de Krebs es la oxidacin completa del piruvato a
CO2 con formacin de cuatro molculas de NADH y una de dinucletido de flavinadenina
(FADH). El NADH y el FADH pueden ser oxidados nuevamente por el sistema transportador
de electrones. Un total de 15 molculas de ATP son sintetizadas en cada vuelta del ciclo,

Figura 3. Gluclisis
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por lo tanto, dado que cada molcula de glucosa rinde dos de piruvato, 30 molculas de ATP
son sintetizadas por cada molcula de glucosa que entra al ciclo de Krebs (ver figura 3). Esto,
sumado a las seis molculas de la reoxidacin del NADH y las dos del va glucoltica, da un
total de 38 molculas de ATP por molcula de glucosa respirada. Adems de sus funciones
como mecanismo generador de energa, el ciclo de Krebs sirve como productor de metabolitos
claves para la biosntesis.
La reduccin del oxgeno forma radicales libres que son muy txicos para la bacteria. Entre
los ms importantes se encuentra el superxido. ste es eliminado por las bacterias aerobias
y tolerantes del oxgeno, por la enzima superoxidodismutasa que cataliza la formacin de
perxido de hidrgeno, tambin txico. El perxido de hidrogeno es degradado por enzimas
como catalasa y la peroxidasa, a oxgeno molecular y agua. Estas enzimas estn ausentes en las
bacterias anaerobias estrictas, explicando en parte la susceptibilidad que tienen al oxgeno.
En las bacterias aerobias obligadas, el oxgeno es el aceptor final de electrones. Sin
embargo, las bacterias anaerobias facultativas pueden usar, en ausencia de oxgeno, otros
compuestos inorgnicos como aceptores finales de electrones, por ejemplo: nitrato, fumarato,
sulfato, etc.

REGULACIN DEL METABOLISMO

Cada reaccin metablica est regulada no solo con respecto a otras reacciones, sino tambin
con respecto a la concentracin de nutrientes en el medio. La regulacin se realiza a diferentes
niveles: en la actividad enzimtica y en la sntesis de las enzimas. En la primera, regulacin de
la actividad enzimtica, se produce: activacin de enzimas alostricas, inhibicin por retroa-
limentacin, activacin alostrica y cooperatividad. La induccin enzimtica y la represin
por productos finales, son mecanismos de regulacin de la sntesis de enzimas.
En las bacterias anaerobias facultativas la fermentacin (como nica va de produccin
de energa) es bloqueada en presencia de oxgeno, asegurando que el suministro de energa
se produzca por respiracin, que consume menos glucosa y acumula menos lactato. En este
fenmeno denominado efecto Pasteur, la enzima fosfofructoquinasa es activada o inhibida
segn la relacin entre el ATP y el ADP, regulando as el consumo de glucosa. Este es un
ejemplo de regulacin de la actividad enzimtica por una enzima alostrica. El ejemplo clsico
de regulacin de la sntesis de enzimas lo constituye el opern lactosa. Hay tres enzimas que
participan en la utilizacin de la lactosa (-galactosidasa, galactsido permeasa y galactsido
transacetilasa), las cuales tienen un promotor nico. En ausencia de lactosa, la transcripcin
para estas enzimas est bloqueada por un represor que se une al promotor inhibiendo la accin
de la ARNpolimerasa. Cuando se agrega lactosa al medio, sta se une al represor, bloqueando
de este modo su unin al promotor y permitiendo la accin de la ARNpolimerasa y la sntesis
de las tres enzimas anteriormente mencionadas.

Crecimiento bacteriano
Puede ser definido como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de la
clula. Las condiciones fsicas y qumicas del medio donde el microorganismo se encuentra
afectan marcadamente sus actividades. La comprensin de como influye el ambiente sobre
el crecimiento nos ayuda a explicar la distribucin de los microorganismos en la naturaleza y
hace posible disear estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo.
Las bacterias como grupo, son extremadamente verstiles y tienen gran capacidad para utilizar
una amplia gama de nutrientes que van desde compuestos inorgnicos simples, a compuestos
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orgnicos ms complejos. Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: esenciales, sin los
cuales la clula no puede crecer y no esenciales, se usan cuando estn presentes pero no son
indispensables. Algunos nutrientes son usados solo como precursores de macromolculas
celulares, otros solo como fuente de energa sin ser incorporados directamente al material
celular y otros cumplen las dos funciones al mismo tiempo. Tambin se pueden clasificar como
macro y micronutrientes segn la cantidad requerida.

MACRONUTRIENTES
El carbono es el mayor constituyente de la clula bacteriana, por lo tanto no llama la atencin
que requiera ms carbono que cualquier otro nutriente. Segn la forma en que lo usa, existen
fundamentalmente dos tipos de bacterias: auttrofas y hetertrofas. Las primeras son capaces
de sintetizar todos sus componentes orgnicos a partir de compuestos inorgnicos como el
CO2. Como ejemplo de este grupo citamos las bacterias del suelo, que carecen de inters
mdico. En cambio, las hetertrofas usan sustancias orgnicas como fuente de carbono. En
este grupo se encuentran todas las bacterias de inters mdico.
La glucosa, por ejemplo, es usada como fuente de carbono y de energa. Tambin existen
bacterias que pueden usar otras sustancias orgnicas como fuente parcial o exclusiva de car-
bono. Entre las bacterias ms verstiles se encuentran las del gnero Pseudomonas, muchas
de las cuales pueden usar ms de cien compuestos orgnicos.
Despus del carbono, el elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno que repre-
senta entre el 12 y el 15% del peso seco. Es el constituyente principal de las protenas y los
cidos nucleicos. La mayora de las bacterias son capaces de usar el amonio como fuente de
nitrgeno, mientras que otras pueden usar los nitratos. La reduccin de nitratos, se puede
lograr por dos mecanismos diferentes: reduccin asimiladora, en la cual se reduce por la va
del nitrito y reduccin desasimiladora, donde el nitrato sirve como aceptor final de electrones.
La primera est bastante extendida entre las bacterias, mientras que la segunda solo es comn
en bacterias anaerobias y anaerobias facultativas.
El fsforo es usado para la sntesis de cidos nucleicos y de fosfolpidos. La mayora de las
bacterias lo usan en forma inorgnica como fosfato (PO4=). Los fosfatos orgnicos si bien
estn distribuidos ampliamente en la naturaleza, para ser usados deben ser atacados primero
por fosfatasas, enzimas que clivan estos compuestos liberando el fsforo inorgnico.

MICRONUTRIENTES
Aunque requeridos en cantidades muy pequeas, los micronutrientes son importantes para
la nutricin de la bacteria. Entre estos destacamos el cobalto, el cobre y el manganeso.

FACTORES DE CRECIMIENTO
Son sustancias que deben ser aportadas preformadas, porque la bacteria que los requieren no
pueden sintetizarlos a partir de los nutrientes ya sea por falla o ausencia de una va metablica
determinada. Estas sustancias incluyen vitaminas del complejo B, aminocidos, purinas y piri-
midinas. Las bacterias que no necesitan factores de crecimiento, se denominan prototrficas
y, las que s los requieren, auxotrficas para ese factor.

REQUERIMIENTOS ATMOSFRICOS Y AMBIENTALES

Oxgeno
Las exigencias de oxgeno de una bacteria en particular, reflejan el tipo de metabolismo pro-
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ductor de energa. Segn su relacin con el oxgeno, existen bacterias: anaerobias obligadas,
anaerobias facultativas, aerobias obligadas y microaerfilas.
De las primeras (anaerobias obligadas), existen las estrictas y las aerotolerantes. Las bac-
terias anaerobias obligadas estrictas, crecen en ausencia de oxgeno, el cual es muy txico e
incluso letal cuando la exposicin es breve. Las segundas (aerotolerantes) tambin crecen solo
en ausencia de oxgeno, pero toleran su presencia un poco ms que las anteriores; por ejemplo:
Clostridium sp. Las bacterias anaerobias facultativas, son capaces de crecer en presencia o en
ausencia de oxgeno. Ejemplo de stas son las bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Las
aerobias obligadas, requieren oxgeno para su desarrollo. Dentro de este grupo se encuentran
la Pseudomonas. Por ltimo, las microaerfilas crecen mejor con presiones de oxgeno bajas
(3 a 5%); las concentraciones altas (21%) inhiben su crecimiento.
En las bacterias aerobias, anaerobias facultativas y anaerobias aerotolerantes, la enzima
superoxidodismutasa impide la acumulacin del radical superxido; esta enzima est ausente en
los anaerobios estrictos. El perxido de hidrgeno formado por la accin de la superoxidodis-
mutasa es destruido con rapidez por la enzima catalasa o peroxidasa, como ya se mencion.
En el laboratorio de microbiologa los requerimientos atmosfricos de oxgeno, pueden
determinarse cultivando la cepa en caldo tioglicolato. Este medio contiene muchos nutrientes,
siendo un caldo de enriquecimiento apropiado para casi todas las bacterias de inters mdico.
El cido tiogliclico acta como agente reductor que disminuye el potencial redox del medio,
generando un gradiente de concentracin de oxgeno a lo largo del tubo. En la superficie del
medio, la concentracin es similar a la atmosfrica y va disminuyendo gradualmente hasta
que en el fondo del tubo no existe oxgeno disuelto. Las bacterias aerobias estrictas podrn
crecer en la superficie del caldo, las microaerfilas crecern en la franja inmediata que est
debajo de la superficie. Las anaerobias facultativas crecern en todo el tubo, mientras que
las anaerobias lo harn en el fondo del mismo.

Anhdrido carbnico
Algunas bacterias como Neisseria y la Brucella, tienen muchas enzimas con baja afinidad
por el CO2 y requieren una concentracin ms elevada (10%) de la que habitualmente est
presente en la atmsfera (0.03%).
Estos requerimientos atmosfricos mencionados deben ser tenidos en cuenta cuando se
realiza el cultivo de estas bacterias.

Potencial de oxidacin reduccin

Es un requerimiento fsico del medio de cultivo. ste es un factor crtico para determinar si
se desarrollar o no el inoculo sembrado en dicho medio. Para la mayora de los medios de
cultivo en contacto con el aire, el potencial de oxidacin reduccin es de +0,2 a +0,4V, a
pH 7. Las bacterias anaerobias obligadas son incapaces de crecer a menos que el potencial
sea tan bajo como -0,2V. Para establecer dichas condiciones en un medio de cultivo se puede
eliminar el oxgeno, recurriendo a sistemas de cultivo anaerobio o agregando al propio medio
compuestos que contengan sulfidrilo, por ejemplo el tioglicolato de sodio.

Temperatura
Es uno de los factores ambientales ms importantes que influyen en la proliferacin y mante-
nimiento de la vitalidad de los microorganismos. Cada bacteria tiene su propia temperatura
mnima por debajo de la cual no puede proliferar, temperatura ptima en la cual el crecimiento
es mas rpido y temperatura mxima por encima de la cual no puede multiplicarse. As, es
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posible distinguir tres grupos de microorganismos segn el rango de temperatura en el que es

posible su multiplicacin: psicrfilas, crecen entre -5 y 30C, temperatura ptimo de 15C;
mesfilas, crece entre 10 y 45C, con el ptimo a los 30C y termfilas, que crecen entre 25
y 80C, con el ptimo en 55C.
En el laboratorio se puede determinar la temperatura ptima de crecimiento, sembrando
el microorganismo en estudio en un medio de cultivo adecuado e incubndolo a diferentes
temperaturas, para despus evaluar los rendimientos obtenidos en las distintas condiciones.
Si bien la mayora de los microorganismos de inters medico son mesfilos, pueden existir
diferencias entre las temperaturas de crecimiento ptimas de los mismos, siendo para la
mayora de 35 a 37C.

Concentraciones de hidrgeno
Cada microorganismo tiene un rango de pH en cual puede crecer y un pH ptimo bien
definido. Segn en el pH que se obtenga mayor rendimiento, encontramos microorganismos
acidfilos, neutrfilos (la mayora de inters mdico) y alcalfilos, que crecen bien en pH
cidos, neutros y alcalinos respectivamente.
Para la mayora de las bacterias de inters mdico, el pH ptimo es de 7,2 a 7,6. Sin em-
bargo, hay microorganismos humanos como M. tuberculosis que resisten valores muy bajos
de pH.
Como los microorganismos al multiplicarse y realizar sus funciones metablicas, suelen
modificar el pH del medio, ste puede prepararse con amortiguadores de pH (buffer), los
cuales mantiene el pH relativamente constante.

Condiciones osmticas y disponibilidad de agua

El agua es un requerimiento esencial para todo ser vivo y la disponibilidad de sta es un factor
importante que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales. Esta
disponibilidad no depende solamente del contenido de agua que haya en el ambiente, porque
algunas sustancias y superficies pueden absorber molculas de agua y por consiguiente reducir
la disponibilidad en el ambiente. Las sales y los azcares disueltos en agua, condicionan la
disponibilidad de la misma porque las molculas de agua se asocian y no quedan disponibles
para ser usadas por los microorganismos. La disponibilidad de agua se expresa generalmente
como actividad acuosa o potencial de agua.
Generalmente los microorganismos se encuentran en ambientes con menor cantidad de
solutos que en el interior celular, por lo tanto el agua tiende a entrar a la clula por osmosis.
Por el contrario, si se encuentran en medios de baja actividad acuosa, el agua tender a
salir de la clula, por lo tanto perder agua. As, encontramos microorganismos que pueden
crecer en altas concentraciones salinas (halfilos) como las que estn en el agua de mar, en
altas concentraciones de azcar (osmfilos) como las que hay en una jalea o en ambientes
muy secos (xerfilos). Estos generalmente captan agua de dichos ambientes, gracias a las
altas concentraciones de solutos en su interior. La concentracin de solutos con actividad
osmtica dentro de la clula bacteriana es superior a la concentracin del exterior celular.
Con excepcin de las bacterias del gnero Mycoplasma y de las formas lister (L) que no tienen
pared celular, la mayora de las bacterias tienen tolerancia osmtica que les permite soportar
grandes cambios de osmolaridad.

Captacin de nutrientes
La concentracin de solutos en el interior de una clula bacteriana es mayor que en el medio
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extracelular. Esto es aplicable tanto al medio natural como a la mayora de los medios de
cultivo usados en el laboratorio. La principal barrera para el paso de solutos entre la clula y
el medio externo es la membrana celular. Las bacterias estn rodeadas de membranas semi-
permeables, compuestas por una mezcla compleja de protenas, lpidos y glucoprotenas, que
restringen el ingreso de la mayora de los solutos. Sin embargo, tienen sistemas que permiten
el transporte de sustancias pequeas a travs de dichas membranas. Las molculas de mayor
tamao primero deben ser degradadas a molculas ms pequeas por enzimas (exoenzimas)
producidas por la propia bacteria y secretadas al exterior celular. En las bacterias gramnega-
tivas estas exoenzimas se encuentran fundamentalmente en el espacio periplsmico (espacio
virtual ubicado entre la membrana externa y la membrana plasmtica), mientras que en
las bacterias grampositivas estn ancladas en la membrana plasmtica. Dichas enzimas son
activas sobre: protenas, polisacridos, lpidos y cidos nucleicos, entre otros. Bacterias como
S. aureus, S. pyogenes, y C. perfringens, elaboran algunas de estas enzimas que contribuyen
a la virulencia, destruyendo los componentes vitales de los tejidos del husped infectado.
Pueden ser constitutivas (se sintetizan siempre) o inducibles (se sintetizan solo cuando est
presente su substrato).
Con excepcin del agua y el amonio que ingresan a la clula por difusin pasiva en respuesta
a un gradiente de concentracin a ambos lados de la membrana, el resto de los metabolitos
lo hacen por sistemas de transporte ms especficos.
Tanto las porinas, como los canales de maltosa, no requieren consumo de energa. Los
primeros son sistemas inespecficos que permiten el ingreso de molculas pequeas (peso
molecular menor o igual a seis mil dalton). Las porinas son protenas ubicadas en la membrana
externa de las bacterias gramnegativas, que forman canales o poros permitiendo el pasaje de
las molculas pequeas e hidroflicas.
En la difusin facilitada, una protena asociada a la membrana celular facilita el equilibrio
a ambos lados de la misma, actuando en conjunto con una quinasa citoplasmtica dependiente
de ATP. Estas protenas de membrana se denominan permeasas y muchas son inducidas por
el substrato a ser transportado. Cuando la sustancia es fosforilada por la quinasa citoplasm-
tica, queda atrapada dentro de la clula. La difusin facilitada se parece a la difusin simple,
porque el substrato se mueve por un gradiente de concentracin (de mayor a menor), por
lo tanto el propio proceso de transporte no requiere energa. La diferencia que tiene con la
difusin pasiva, es que est mediada por una protena transportadora, es ms rpida y tiene
mayor especificidad de substrato.
El transporte activo permite que los solutos ingresen a la clula en contra de un gradiente
de concentracin, consumiendo energa metablica.
Como ejemplo citaremos al sistema de la -galactsido permeasa, mediante el cual la
lactosa (disacrido) es concentrado dentro de una bacteria como E. coli. El transporte de la
lactosa se produce por una permeasa especfica (protena M); dicha reaccin implica gasto de
energa. La energa se usa para disminuir la afinidad de la permeasa por la lactosa en la parte
interna de la membrana celular, favoreciendo su rpida liberacin dentro del citoplasma. Si la
generacin de energa es bloqueada por el agregado de azida de sodio al sistema, la permeasa
cataliza la difusin facilitada de la lactosa, cesando el transporte cuando la concentracin
del disacrido sea la misma a ambos lados de la membrana.
En medios aerobios y a pH neutro, la baja concentracin de hierro no permite alcanzar
un desarrollo ptimo. Las bacterias han desarrollado varios sistemas para obtener cantidades
adecuadas de dicho elemento. Los siderforos son ligandos de bajo peso molecular cuya funcin
es suministrar hierro a la clula. Aunque existe una variacin importante en la estructura de
TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA 55

los distintos tipos de siderforos conocidos, la mayora son de dos tipos: catecoles: la entero-
bactina es la ms estudiada; e hidroximatos: producidos por algunos hongos. La enterobactina
es un poderoso quelante que E. coli produce rpidamente cuando existe dficit de hierro y
la secreta al medio externo.

Crecimiento de las poblaciones bacterianas

El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana, es el cultivo. Este paso es
importante para proveer de una poblacin de bacterias que puedan ser analizadas mediante
pruebas bioqumicas, serolgicas, genticas y de susceptibilidad a los antibiticos. El cultivo
es el proceso de propagacin de los microorganismos en el laboratorio, que se obtiene apor-
tando las condiciones ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento
bacteriano. Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres
humanos no son capaces de crecer en medios artificiales inertes.
Es necesario conocer cuales son los requisitos bsicos de la bacteria en cuestin para su
cultivo en el laboratorio (nutrientes, requerimientos atmosfricos y ambientales), as como
los requisitos del o de los tipos bacterianos que se necesite recuperar.
La siembra de un material que contiene bacterias en un medio slido adecuado con la
tcnica de aislamiento permite, luego de un perodo adecuado de incubacin, la recuperacin
de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. stas pueden ser aisladas nuevamente
en un nuevo medio para obtener un cultivo puro.
El crecimiento se define como el aumento del nmero de bacterias en una poblacin
determinada (ver figura 4). Es importante diferenciar entre el crecimiento de una clula
individual y el de una poblacin. Dicho crecimiento celular es el resultado del aumento del
tamao de la clula, seguido de su divisin. El crecimiento de una poblacin, en cambio, es el
resultado del aumento del nmero total de clulas, que puede ser cuantificado directamente
(contando el nmero de clulas) o indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular).
El recuento de clulas totales puede determinarse por recuento microscpico en una cmara
con reas de volumen conocido, contando las clulas por unidades. Este recuento, considera
la totalidad de las clulas presentes en la muestra (viables y no viables). Para realizar un
recuento de las clulas viables, es necesario hacer un cultivo en medio slido para contar el
nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un volumen conocido de la

Figura 4. Curva de crecimiento bacteriano

56 TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

muestra. Dicha tcnica puede realizarse por siembra en la superficie de un medio apropiado
o por siembra incorporada en agar.
El crecimiento de las poblaciones bacterianas en un sistema de cultivo cerrado (sin entrada
ni salida de los componentes del sistema), est limitado por el agotamiento de los nutrientes
o bien por la acumulacin de productos txicos del metabolismo. Cuando las bacterias se
siembran en el laboratorio en un medio lquido (por ejemplo en un tubo de ensayo), se trata
de un sistema cerrado de cultivo. Si se toman muestras a intervalos regulares en diferentes
tiempos de incubacin y se realiza un recuento del nmero de clulas viables por mililitro
de cultivo, la representacin grfica de los datos (conteo de clulas viables en funcin del
tiempo) dar la curva de crecimiento caracterstica que consta de cuatro fases: latencia,
exponencial, estacionaria y muerte.

FASE DE LATENCIA
Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco, sufren un cambio
en su composicin qumica antes de ser capaces de iniciar la multiplicacin. Hay aumento
de los componentes macromoleculares y de la actividad metablica, casi sin divisin celular,
asociado a un incremento de la susceptibilidad a los agentes fsicos y qumicos. Por lo tanto,
la mal llamada fase de latencia implica intensa actividad metablica.

FASE EXPONENCIAL
Las clulas se dividen a velocidad constante, determinada por la naturaleza intrnseca de la
bacteria y por las condiciones del medio. Existe gran aumento del nmero total de clulas
viables, que puede ser expresado en forma exponencial. Prximo al final de esta fase, se
produce la liberacin de exotoxinas por las bacterias que las producen.

FASE ESTACIONARIA
Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulacin de productos txicos
determina el cese del crecimiento. Hay prdida de clulas por muerte, la cual es balanceada
por la formacin de nuevas clulas. Cuando esto ocurre, el conteo total de clulas aumenta
levemente aunque el de las bacterias viables permanece constante. Hacia el final de esta
etapa, puede ocurrir la esporulacin en aquellas bacterias que poseen este mecanismo de
resistencia.

FASE DE MUERTE
Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el nmero de bacterias viables
disminuye rpidamente y, por lo tanto la curva de crecimiento declina.
Las caractersticas de la curva de crecimiento pueden variar, dependiendo de las caracte-
rsticas propias del microorganismo, del estado metablico del inoculo, del medio de cultivo
y de las condiciones de incubacin. Las condiciones fsicas y qumicas del medio donde el
microorganismo crece afectan las actividades de stos. La comprensin de cmo influye el
ambiente en el crecimiento, nos ayuda a explicar la distribucin de los microorganismos en
la naturaleza y hace posible disear mtodos que permitan estudiar y controlar el crecimiento
bacteriano.
Adems, existen sistemas de cultivo abiertos que son poco usados en el laboratorio de
microbiologa clnica. El cultivo continuo (con aporte y salida de nutrientes y requerimientos
a una tasa constante), permite mantener a las bacterias en una misma fase de crecimiento
TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA 57

durante un largo perodo de tiempo (por ejemplo en la fase estacionaria o en la exponencial).

Dicha tcnica es interesante por ejemplo para los procesos productivos.

Medios de cultivo
Son una mezcla equilibrada de nutrientes requeridos a concentraciones que permiten el
crecimiento de los microorganismos. Deben contener todos los nutrientes necesarios en
cantidades apropiadas a los requerimientos de los microorganismos y en condiciones de pH,
presin osmtica, oxgeno disuelto, etc., adecuados para el crecimiento. Aunque los diferentes
microorganismos tienen distintas propiedades fisiolgicas y requerimientos nutricionales, la
composicin qumica de las clulas es constante en todo el mundo vivo.
Los medios ms simples estn compuestos por una base mineral se puede suplementar
con una fuente de carbono, de energa, de nitrgeno y con algn factor de crecimiento re-
querido. Los medios deben esterilizarse antes de ser usados. Esta esterilizacin generalmente
se realiza con calor hmedo, pero algunos medios con componentes sensibles al calor pueden
filtrarse.
Existen muchos medios con diferentes utilidades que pueden ser clasificados de la siguiente
manera. Segn su consistencia en: lquidos, semislidos y slidos. Los medios slidos son usados
para el aislamiento bacteriano, mientras que los lquidos son tiles para el enriquecimiento
de una poblacin bacteriana de inters. Segn su composicin: definidos (de composicin
qumica conocida, medios simples) y complejos (con agregados de sustancias no definidas,
por ejemplo extracto de levadura). Segn la cantidad de nutrientes: pobres (por ejemplo el
agar simple) y ricos (por ejemplo el agar sangre). Tambin pueden clasificarse en medios:
diferenciales, que permiten diferenciar algunas propiedades distintivas del grupo bacteriano
(por ejemplo el uso de lactosa en agar CLED); y selectivos, que permiten el desarrollo de
algunos microorganismos pero no de otros (por ejemplo el Mac Conckey para la seleccin de
bacterias gramnegativas). Tambin existen los medios especiales para el transporte de muestras
o cepas, o aquellos especficos para identificar alguna va metablica determinada.

Bibliografa
Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. editors. Bailey & Scotts. Diagnostic Microbiology. 11th. ed. St. Louis,
Missouri. Mosby. 2002.
Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiologa. 20 ed. BsAs. Panamericana;
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