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Cuando se realiza la hidrlisis completa de los cidos nucleicos, se obtienen tres tipos de
componentes principales:
cido fosfrico.
Las bases nitrogenadas que forman parte de los cidos nucleicos son de dos tipos, pricas y
pirimidnicas. Las bases pricas derivadas de la purina (fusin de un anillo pirimidnico y uno de
imidazol) son la Adenina (6-aminopurina) y la Guanina (2-amino-6-hidroxipurina). Las bases
pirimidnicas (derivadas de la pirimidina) son la Timina (2,6-dihidroxi-5-metilpirimidina o tambin
llamada 5-metiluracilo), Citosina (2-hidroxi-6-aminopirimidina) y Uracilo (2,6-dihidroxipirimidina).
Las bases nitrogenadas que forman normalmente parte del ADN son: Adenina (A), Guanina (G),
Citosina y Timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte de el ARN son: Adenina (A),
Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U). Por tanto, la Timina es especfica del ADN y el Uracilo es
especfico del ARN.
Bases Pricas Bases Pirimidnicas
Adems de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases
nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Ejemplos
de algunas de estas bases pricas poco corrientes son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6-
metil-aminopurina. Entre las bases pirimidnicas podramos citar la 5-metilcitosina (propia del
ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares.
Nucletido
Tanto los nucletidos como los nuclesidos pueden contener como azcar la D-ribosa
(ribonucletidos y ribonuclesidos) o la pentosa 2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucletidos y
desoxirribonuclesidos).
Adems, los nucletidos pueden tener 1, 2 3 grupos fosfato unidos al carbono 5 de la pentosa,
existiendo por tanto, nucletidos 5 monofosfato, nucletidos 5 difosfato y nucletidos 5 trifosfato.
En algunos casos el cido fosfrico se une a la pentosa por el carbono 3, existiendo nucletidos
3 monofosfato, difosfato o trifosfato segn el nmero de grupos fosfato que posea.
Los nucletidos se unen entre si para formar largas cadenas de polinucletidos, esta unin entre
monmeros nucletidos se realiza mediante enlaces fosfodister entre los carbonos de las
posiciones 3 de un nucletido con la 5 del siguiente.
Polinucletido
PROPORCIONES DE LAS BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF
Al principio se pensaba que los cidos nucleicos eran la repeticin montona de un
tetranucletido, de forma que no tenan variabilidad suficiente para ser la molcula biolgica que
almacenara la informacin. Sin embargo, Chargaff (1950) demostr que las proporciones de las
bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguan algunas reglas.
Estas reglas de Chargaff se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de
doble hlice y son las siguientes:
Todos los ADN estudiados cumplen la relacin A=T y G=C, excepto el ADN del bacteriofago
X174. El ADN de este virus es de una sola hlice.
En los virus ARN no se cumple la equimolaridad de las bases excepto en el caso del virus
del Tumor de las heridas y de los Reovirus que tienen ARN de doble hlice. En estos virus
se cumple que A=U y G=C, adems se cumple que A+G/U+C=1.
El fago T2 y los otros fagos T-pares (T4 y T6) en vez de citosina tienen hidroximetil-citosina
(HMC).
Por un lado, utilizaron los datos obtenidos varios aos antes por Chargaff (1950), relativos a
la composicin de bases nitrogenadas en el ADN de diferentes organismos.
El otro tipo de datos eran los procedentes de estudios de difraccin de rayos X sobre fibras
de ADN. Para determinar la estructura tridimensional o disposicin espacial de las
molculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se recoge la
difraccin de los rayos sobre una pelcula fotogrfica. La pelcula se impresiona en aquellos
puntos donde inciden los rayos X, produciendo al revelarse manchas. El ngulo de
difraccin presentado por cada una de las manchas en la pelcula suministra informacin
sobre la posicin en la molcula de ADN de cada tomo o grupo de tomos.
Las bases pricas y pirimidnicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje
del polinucletido a una distancia de 3,4 . Las bases son estructuras planas orientadas de
forma perpendicular al eje (Astbury, 1947).
El ADN es una doble hlice enrollada helicoidalmente a derechas (sentido dextrorso). Algo
parecido a dos muelles entrelazados.
Enrollamiento de tipo plectonmico: para separar las dos hlices es necesario girarlas como
si fuera un sacacorchos.
Cada hlice es una serie de nucletidos unidos por enlaces fosfodister en los que un grupo
fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azcares sucesivos (posiciones 3 de un
azcar y 5 del siguiente).
Las dos hlices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos
entre las bases nitrogenadas de cada hlice. Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la
Adenina de una hlice aparea con la Timina de la hlice complementaria mediante dos
puentes de hidrgeno. Igualmente, la Guanina de una hlice aparea con la Citosina de la
complementaria mediante tres puentes de hidrgeno.
Las dos hlices por razones de complementaridad de las bases nitrogenadas son
antiparalelas, teniendo secuencias de tomos inversas. Una hlice lleva la secuencia 5P
3 OH , mientras que la hlice complementaria sigue la secuencia de tomos 3OH 5P.
Las bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble hlice y
estn apiladas unas sobre otras a una distancia de 3,4 . Cada 10 bases, cada 34 se
produce una vuelta completa de la doble hlice (360).
Adems, la estructura en doble hlice propuesta por Watson y Crick (1953) sugera varas
propiedades importantes del material hereditario:
Las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas A-T y G-C sugieren un forma
sencilla de replicacin del material hereditario. Esta forma sencilla de replicacin se
denomina mtodo Semiconservativo. Cuando el ADN se replica sus dos hlices se separan
y cada una de ellas sirve de molde para sintetizar una nueva hlice siguiendo las reglas de
apareamiento de las bases nitrogenadas.
Adems, esta estructura sugera la existencia de algn cdigo que permitiera pasar de la
secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN a la secuencia lineal de aminocidos en
las protenas.
ADN-B: ADN en disolucin, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja
fuerza inica se corresponde con el modelo de la Doble Hlice.
ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11
pares de bases por giro completo y 23 de dimetro. Es interesante por presentar una
estructura parecida a la de los hbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento
ARN-ARN.
ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3
pares de bases por giro completo y 19 de dimetro.
ADN-Z: doble hlice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro
completo, 18 de dimetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de
bases pricas y pirimidnicas (GCGCGC), debido a la conformacin alternante de los
residuos azcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. Requiere una concentracin de cationes
superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las protenas que interaccionan con el
ADN tienen gran cantidad de residuos bsicos sera posible que algunas convirtieran
segmentos de ADN-B en ADN-Z. Las posiciones N7 y C8 de la Guanina son ms
accesibles.
ADN-A ADN-B ADN-Z ADN-A ADN-Z ADN-B
ADN con enrollamiento paranmico: Las dos hlices se pueden separar por traslacin,
cada hlice tiene segmentos alternantes dextrorsos y sinistrorsos de unas cinco bases. Uno
de los principales problemas del modelo de la doble hlice (ADN-B) es el enrollamiento
plectonmico, para separar las dos hlices es necesario girarlas como un sacacorchos,
siendo necesario un gran aporte energtico.
ADN triple hlice o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hlice intercalando
oligonucletidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el
surco mayor de una doble hlice. Este oligonucletido se une a pares de bases A-T y G-C
mediante enlaces de hidrgeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del
oligonucletido y los pares A-T y G-C de la doble hlice. No se sabe la funcin biolgica del
ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucariticos.
ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo)
unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucletidos que solamente
contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariticos (telmeros) tienen
una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que
se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN
cuadruplexo telomrico servira para proteger los extremos cromosmicos de la
degradacin enzimtica. Ejemplo de secuencia telomrica rica en guaninas (G): 5P
TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH
Cuartetos de Guanina
Adems, de las alternativas anteriormente citadas es necesario tener en cuenta que no todos los
organismos vivos tienen como material hereditario ADN de doble hlice, algunos virus tienen
ADN de hlice sencilla, ARN de una y de doble hlice.
Existen algunos virus cuyos cidos nucleicos son de una sola hlice: el ADN de los
fagos X174 y M13 es circular de hlice sencilla, sin embargo, se ha comprobado que una
pequea parte resiste la accin de enzimas que digieren especficamente ADN de hlice
sencilla. Por tanto, estas regiones resistentes de ADN presentan complementaridad interna
o autoapareamiento, formando ADN duplex o doble hlice, teniendo secuencias
palndrmicas. Una situacin semejante se ha observado en el ARN de hlice sencilla del
bacteriofago MS2 (3569 ribonucleotidos y tres genes). En este caso, el gen de la protena
de la cubierta del virus presenta segmentos que tienen complementaridad interna
(autoapareamiento) que se pliegan sobre si mismos formando horquillas (regiones de ARN
de doble hlice).
El ARN transferente (ARN-t) que transporta los aminocidos y el ARN ribosmico (ARN-
r) que intervienen en el proceso de traduccin, son cidos ribonucleicos de una sola hlice y
tambin presentan autoapareamiento.
Esquema ARN-transferente Esquema ARN-ribosmico de Tetrahymena
ABSORBANCIA A 260 nm
Absorbancia a 2.600 : El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su
capacidad de absorcin de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se
produce en estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin
pasando a estado de hlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por
ltimo, si degradamos este ADN de hlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevo
aumenta la absorbancia.
No es difcil imaginar que la velocidad de renaturalizacin del ADN (paso de dos hlices sencillas
a una doble hlice) este relacionada con el nmero de veces que esta repetida una determinada
secuencia.
Supongamos que tenemos dos organismos hipotticos distintos, ambos con la misma cantidad de
ADN (1.000.000 de pares de nucletidos). El organismo A posee 1.000 secuencias nicas
diferentes, cada una con una longitud media de 1.000 nucletidos. El organismo B tiene una
secuencia de 100 nucletidos de longitud que est repetida 10.000 veces. Si extraemos el ADN
de estos dos organismos por separado, lo desnaturalizamos y las piezas de ADN desnaturalizado
de cada organismo se ponen en condiciones de renaturalizar (tamao uniforme de los fragmentos
de ADN, entre 250 y 450 pb, temperatura, condiciones inicas, etc), es evidente que el ADN del
organismo B renaturalizar mucho antes, ms rpidamente, que el del organismo A, ya que es
mucho ms probable que la secuencia que est repetida 10.000 veces encuentre otra
complementaria en el medio de reaccin para formar la doble hlice.
Las curvas de renaturalizacin o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas
como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen un slo punto de inflexin o punto medio de la
reaccin. Todas las secuencias son nicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su
complementaria para formar la doble hlice.
Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios
puntos de inflexin. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (nicas,
moderadamente repetidas, y altamente repetidas).
Como en el caso de las curvas de fusin, tambin se utiliza como medida el punto medio de la
reaccin de renaturalizacin, es decir, el Cot o tiempo al que se ha reasociado la mitad del
ADN. El Cot es directamente proporcional a la complejidad del ADN del organismo. Valores de
Cot bajos (10-4 a 10-1) corresponden a secuencias altamente repetidas, valores de Cot
comprendidos entre 10 y 102 corresponden a secuencias moderadamente repetidas y las
secuencias nicas o de bajo nmero de copias dan lugar a valores de Cot altos (mayores de
103) .
Las endonucleasas de restriccin de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de
ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrmico y cortan por el interior de la secuencia diana
a la misma altura en las dos hlices de ADN (corte simtrico) o a distinto nivel en cada hlice
(corte asimtrico).
Dichas endonucleasas de restriccin fueron descubiertas por Werner Arber, Hamilton O. Smith y
Daniel Nathans en la bacteria E.coli , trabajos por los que recibieron el premio Nobel. Estas
enzimas forman parte del sistema de defensa (sistema de modificacin-restriccin) de las
bacterias frente a la entrada de ADN exgeno en su interior. Existen cientos de endonucleasas
diferentes que reconocen distintas secuencias cortas de tipo palndrmico. En la siguiente tabla
se indican algunas de las endonucleasas ms frecuentes:
Las tcnicas de hibridacin "in situ" permiten localizar un segmento concreto de ADN (por
ejemplo un gen) en una posicin determinada de un cromosoma eucaritico. Es posible obtener
preparaciones citolgicas de cromosomas en metafase mittica o en otras fases del ciclo,
desnaturalizar el ADN de los cromosomas en la propia preparacin citolgica y posteriormente
hibridar con la pieza de ADN deseada marcada. Actualmente, el marcaje suele ser de tipo
fluorescente, denominndose dicha tcnica Hibridacin "in situ" mediante fluorescencia
(abreviadamente FISH). Tambin, es posible marcar todo el ADN de un genomio o juego de
cromosomas completo y realizar una Hibridacin "in situ" Genmica (abreviadamente GISH) que
permite averiguar si los cromosomas de un determinado genomio estn presentes. Otra
aplicacin, consiste en detectar determinados cromosomas o regiones cromosmicas concretas
utilizando sondas o piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia y procedentes solamente
del cromosoma deseado, de esta manera, se obtiene lo que se denomina Pintura Cromosmica.
Pintura
FISH trigo (Triticum GISH: Hbrido Pintura cromosmica
cromosmica
intermedium) (Liliaceae) (humanos)
(ratn)
El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un
segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por
tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Adems, debe estar en estado de hlice
sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La
ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hlice sencilla y siguiendo las
reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de
un cebador o "primer".
Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar
radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucletidos
trifosfato en cada reaccin.
Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los
nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la
posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN
naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por
tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de
ADN.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica
de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la
autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del
ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al
nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.
Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si
comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos
aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de
nueva sntesis en la direccin 5' 3'.
Breve descripcin del mtodo automtico de secuenciacin
La principal diferencia entre mtodo enzimtico de terminacin de cadena y el mtodo
automtico de secuenciacin radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el mtodo
automtico en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro
mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un
fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible
leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de
reaccin.