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MONOGRAFIA SOBRE

PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA CON DOS ORGANISMOS MODELOS


EN ACETOGENINAS DE ANNONACEAE CON ACTIVIDAD BIOPESTICIDA

LINA MARCELA FLOREZ ACEVEDO


VIVIANA MESA SALAZAR

DIRECTORA:
GLORIA EDITH GUERRERO A.

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PERIRA


FACULTAD DE TECNOLOGIAS
ESCUELA DE QUIMICA

PEREIRA
2007
MONOGRAFIA SOBRE
PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA CON DOS ORGANISMOS MODELOS
EN ACETOGENINAS DE ANNONACEAE CON ACTIVIDAD BIOPESTICIDA

LINA MARCELA FLOREZ ACEVEDO


VIVIANA MESA SALAZAR

Documento presentado como requisito parcial para obtener el titulo de


TECNOLOGO QUIMICO

DIRECTORA:
GLORIA EDITH GUERRERO A.

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PERIRA


FACULTAD DE TECNOLOGIAS
ESCUELA DE QUIMICA

PEREIRA
2007
NOTA DE ACEPTACION

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GLORIA EDITH GUERRERO ALVAREZ


Doctor en Ciencias Qumica.

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LUZ ANGELA VELOZA.


Directora Programa de Tecnologa Qumica.

i
DEDICATORIA

Este trabajo esta dedicado a nuestras familias los cuales nos impulsaron en el
transcurso de nuestros estudios y que nos apoyaron para lograr que culminramos
esta meta. Gracias.

ii
AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos a Gloria Edith Guerrero por su valiosa colaboracin durante todo


este proceso.

A LOS JURADOS Jaime Nio osorio

A Brbara Moreno, a Francisco Javier Jimnez y dems entrevistados por su


paciencia y su dedicacin para con nosotras y este trabajo.

iii
GLOSARIO

ACETOGENINAS: Compuestos activos que afectan la produccin de Trifosfato de


adenosina (ATP) en la mitocondria. El ATP es la fuente principal de energa de la
clula. Las acetogeninas modulan selectivamente la produccin de ATP en clulas
especficas. La modulacin de la produccin de ATP afecta la viabilidad de clulas
especficas y el crecimiento de vasos sanguneos que los nutren.

ACTIVIDAD BIOLGICA: Expresin que describe los efectos beneficiosos o


nocivos de una droga en la materia viva. Cuando la droga es una mezcla qumica
compleja, esta actividad es ejercida por el ingrediente activo o el farmacforo de la
sustancia pero se puede modificar por los otros componentes. La clase principal
de actividad biolgica es toxicidad de una sustancia.

ANNONACEAE: Familia de plantas dicotiledneas, arbreas o arbustivas, a


menudo trepadoras, propias de las zonas tropicales e intertropicales, con las hojas
alternas, simples y enteras, flores casi axilares, solitarias o en manojo y fruto
simple o compuesto, seco o carnoso, con pepitas duras y frgiles.

ANTIHELMNTICO: Drogas que expulsan a los helmintos y gusanos parsitos del


cuerpo, matndolos o expulsndolos vivos. Los remedios tradicionales de este tipo
se llaman vermfugos.

ANTIMICROBIANO: Que impide el desarrollo de los microbios.

APOPTOSIS: Muerte celular programada, un proceso que juega un importante


papel desde el desarrollo temprano hasta el envejecimiento. Tiene especial
importancia en el cncer y es objeto de un estudio intenso dado que es una

iv
solucin tentadora, que por otro lado, puede interferir en los tratamientos
teraputicos.

ARTEMIA SALINA O BRINE SHRIMPS: Pertenece a un grupo de crustceo que


ha habitado la tierra por 300 millones de aos, y esta ha sido un importante
eslabn en la cadena alimenticia desde entonces.

La Artemia salina tal cual como lo indica su nombre, no es un habitante directo del
mar sino de salinas, que no son sino lagunas y estuarios cercados, cercanos a las
costas martimas. En ocasiones se pueden hallar en masas de agua saladas
atrapadas dentro de los continentes como en caso del famoso lago Salt Lake.

CIDO HMICO: Molculas complejas orgnicas formadas por la descomposicin


de materia orgnica. Contribuye significativamente en la estabilidad y fertilidad del
suelo resultando un crecimiento excepcional de la planta y en la absorcin de
nutrientes.

ACUICULTURA: Es el cultivo de animales y plantas en el agua, se incluyen


peces, reptiles, anfibios, crustceos, moluscos, plantas y algas destinados para
alimento, alguna otra utilidad por parte del hombre (recreacin, estudio, obtencin
de productos) o para su conservacin y proteccin.

BIOPESTICIDA: Pesticida hecho a base de recursos biolgicos, es decir, de


toxinas que se producen naturalmente.

BACTERIAS: Microorganismo unicelular, sin ncleo definido por una membrana.


Interviene en procesos como la fermentacin, y puede ser la causa de
enfermedades tales como el tifus, el clera, afecciones venreas, etc.

BIOTOPO: Regin de caracteres climticos y geogrficos definidos que es


ocupada por una biocenosis o comunidad de especies animales y vegetales.

v
BIOTERIO: Conjunto de instalaciones, muebles e inmuebles destinados al
alojamiento y manutencin de animales de laboratorio durante una o varias de las
fases de su ciclo vital; esto es, nacimiento, desarrollo, reproduccin y muerte.

BRCTEA: Organo foliceo en la proximidad de las flores y diferente a las hojas


normales y las piezas del perianto.A pesar de ser verdes, su funcin principal no
es la fotosntesis, sino proteger las flores o inflorescencias.

CEPA: en microbiologa, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el


mismo patrimonio gentico.

CISTOS DE ARTEMIA: Huevos deshidratados de Artemia salina con una rpida


eclosin en agua salada.

CULCIDOS: (latn Culicidae) son mosquitos, insectos pertenecientes al orden de


los dpteros; sus gneros incluyen Anopheles, Culex, Psorfora, Oclerotatus, Aedes,
Stegomyia, Sabetes, Culiseta y Haemagoggus. Existen 35 gneros en total con ms de
2700 especies reconocidas. Son insectos voladores, que poseen un cuerpo
delgado y patas alargadas; el tamao de los adultos vara de especie a especie,
pero rara vez superan los 15 mm. Las larvas se desarrollan en el agua.

CULTIVAR: Combinacin de las palabras "cultivada" y "variedad", y en la literatura


ms antigua puede verse como "variedades", uso que hoy en da est
desaconsejado y no debe confundirse con la definicin actual de variedad.
"Cultivar" es el trmino que se reserva para aquellas poblaciones de plantas
cultivadas que son genticamente homogneas y comparten caractersticas de
relevancia agrcola que permiten distinguir claramente a la poblacin de las dems
poblaciones de la especie y traspasan estas caractersticas de generacin en
generacin, de forma sexual o asexual.

vi
CRUSTCEO: Clase de artrpodos de respiracin branquial, cubiertos
generalmente de un caparazn duro o flexible y con dos pares de antenas:
los cangrejos y las langostas son crustceos.

DOSIS LETAL DL 50: La dosis letal 50 es la dosis nica que, obtenida por
estadstica, de una sustancia de la que puede esperarse que produzca la muerte
del 50% de los animales a los que se haya administrado. El valor de la DL50 se
expresa en peso de la sustancia por unidad de peso del animal (miligramos por
kilo, mg/kg).

DOSIS EFECTIVA DE 50: En farmacologa, se entiende por dosis efectiva de un


medicamento a la dosis mnima capaz de producir el efecto deseado de la droga.
La dosis que produce el efecto deseado en el 50% de la poblacin se conoce
como dosis efectiva 50%, o por sus siglas en ingls DE-50.

DENGUE: Enfermedad producida por un virus transmitido por mosquitos de


Amrica central y zonas calurosas de Asia y Australia, tambin llamada la fiebre
de los siete das.

EPMERO: En qumica, un epmero es un estereoismero de otro compuesto que


tenga una diversa configuracin a solamente uno de varios centros quirales del
carbn. Los estereoismeros incluyen los enantimeros y los diasteremeros,
ambos que contengan un centro quiral del carbn (excepto los ismeros
geomtricos, que es una clase de diasteremeros).

ENANTIMERO: Imagen especular no superponible de s mismo. Tienen las


mismas propiedades fsicas y qumicas, excepto por la interaccin con el plano de
la luz polarizada o con otras molculas quirales. Son molculas quirales. La mezcla
de enantimeros en una solucin se denomina mezcla racemica.

ECOTOXICOLOGA: Estudia el destino y los efectos de los contaminantes en los


ecosistemas, intentando explicar las causas y prever los riesgos probables. La
vii
ecotoxicologa prospectiva evala la toxicidad de las sustancias antes de su
produccin y uso. La ecotoxicologa retrospectiva se ocupa de confirmar si la
sustancia produce daos en el ecosistema.

ENCEFALITIS: Inflamacin del encfalo.

ENCFALO: Conjunto de rganos que forman parte del sistema nervioso de los
vertebrados y estn contenidos en la cavidad del crneo.

ERITEMA: Inflamacin superficial de la piel, caracterizada por manchas rojas.

EVALUACIN CITOLGICA: Anlisis de las clulas bajo un microscopio para


evaluar su apariencia, su origen, as como la manera como se forman y
funcionan.

FARMACOLOGA: Ciencia que trata de los medicamentos, sus propiedades y su


composicin.

FISIOLGICO: Que posee una funcin normal dentro del organismo.

FILARIAS: Grupo heterogneo, no taxonmico, de nemtodos filiformes,


ovovivparos, parsitos del hombre o de los animales. Desde el punto de vista
patognico, las filarias propias del hombre las podemos clasificar en dos grupos,
filarias patgenas, y filarias apatgenas o poco patgenas. En las primeras, los
adultos se localizan en la piel (Dracunculus medinensis, Loa loa y Onchocerca
volvulus) o en los vasos linfticos (Brugia malayi, Brugia timori y Wuchereria
bancrofti), mientras que en las segundas, lo hacen en la piel (Mansonella
streptocerca) o en las serosas (Mansonella ozzardi y Mansonella perstans).

FILARIASIS: Grupo de enfermedades parasitarias infecciosas diferentes que


tienen como denominador comn el ser producidas por nemtodos (gusanos en
forma de hilo) de la misma familia, y transmitidas de persona a persona por la
picadura de insectos.
viii
GLABRA GLABRO: Desprovista de pelo o vello.Que no tiene pelos o es
totalmente lampio.Sin pelos.

GEN: Fragmento de cido Desoxirribonucleico (ADN) dispuesto en un orden fijo


en los cromosomas, que determina la aparicin de los caracteres hereditarios en
los seres vivos.

GENOMA: Conjunto de los cromosomas de una clula: el genoma humano est


formado por 23 pares de cromosomas.

HONGO: Ser vivo talofito sin clorofila, de reproduccin preferentemente asexual,


por esporas, que suele ser parsito o vive sobre materias orgnicas en
descomposicin: el champin es un hongo.

HIPOTENSOR: Sustancia que reduce (baja) la tensin arterial.

INHIBICIN: Efecto que produce sobre el funcionamiento de un rgano, tejido o


principio activo cualquier agente fsico, qumico, nervioso, etc., y que se manifiesta
en una detencin total o parcial de dicha funcin.

INGREDIENTE ACTIVO: Es la parte biolgicamente activa del producto


fitosanitario presente en una formulacin.

LARVA: Animal en estado de desarrollo, cuando ha abandonado las cubiertas del


huevo y es capaz de nutrirse por s mismo, pero an no ha adquirido la forma y la
organizacin propia de los adultos de su especie.

MATERIAL GENTICO: todo material de origen vegetal, animal, microbiano o de


otro tipo que contenga unidades funcionales de la herencia.

ix
MICROORGANISMO: organismos microscpicos pertenecientes por regla general
a virus, bacterias, algas, hongos o protozoos.

MITOCONDRIA: DEL GRIEGO: mitocondrias, thread + chondros, grnulo es el


sitio donde se lleva a cabo la respiracin celular, el metabolismo aerobio, en la
mayora de los organismos eucariontes (con ncleo verdadero).

MALARIA: Enfermedad causada por un protozoo, que se transmite al hombre por


la picadura del mosquito anofeles y produce fiebres muy intensas.

MOSQUITOS: Nombre comn de diversas especies de insectos dpteros


pequeos y delgados, con dos alas transparentes y patas largas, cuya hembra
chupa la sangre de las personas y de los animales de piel fina y produce una
picadura molesta: las larvas de los mosquitos son acuticas.

NAUPLIOS: Como se conoce a la Artemia recin eclosionada.

NEUROTXICA: Se dice de las sustancias que inhiben o alteran gravemente las


funciones del sistema nervioso.

ORGANISMO: entidad biolgica capaz de reproducirse o de transferir material


gentico, incluyndose dentro de este concepto a las entidades microbiolgicas,
sean o no celulares. Casi todo organismo est formado por clulas, que pueden
agruparse en rganos, y stos a su vez en sistemas, cada uno de los cuales
realizan funciones especficas.

ORGANISMO MODELO: En biologa es una especie muy estudiada para entender


fenmenos biolgicos particulares, que puede dar una idea de cmo funcionan
esos procesos en otros organismos. En particular, los organismos modelos son
ampliamente usados para analizar las causas de enfermedades humanas.

x
OVPARO: Un animal ovparo (del latn ovum, "huevo", y parire, "parir") es un
animal cuya modalidad de reproduccin incluye el depsito de huevos en el medio
externo, donde completar su desarrollo antes de la eclosin. Son ovparos la
mayora de los insectos, los peces, los anfibios y los reptiles, as como la totalidad de
las aves. Entre los mamferos slo son ovparos los monotremas (el ornitorrinco y los
equidnas).

OVOVIVIPARIDAD: Un animal es ovovivparo (del latn ovum, "huevo, vivus,


"vivo", y parire, "parir") cuando los huevos permanecen dentro del cuerpo de la
hembra hasta su eclosin. sta puede producirse inmediatamente antes de lo que
vendr a ser un parto, o inmediatamente despus de la puesta.

PATOLGICO: Que constituye una enfermedad o es sntoma de ella:


inflamacin patolgica; miedo patolgico.

PECIOLO: (del latn "petiolus", forma diminutiva de "pes" "pedis", pie, tronco de
una planta) es el rabillo que une la lmina de una hoja a su base foliar o al tallo.
Falta en las hojas ssiles. El peciolo puede ser una caracterstica determinante
para la identificacin de la planta.

PLAGUICIDA: Sustancias u organismos capaces de exterminar toda vida animal o


vegetal que pueda afectar a la salud, la alimentacin o a la economa del hombre.
Entre los plaguicidas se encuentran los insecticidas, acaricidas, herbicidas y
fungicidas.
Se trata de sustancias mayormente destinadas a la proteccin vegetal o productos
fitosanitarios principalmente de origen qumico para combatir y controlar plagas
y/o transmisores de enfermedades bacterianas o virales de los cultivos y
productos que controlan a algunas especies vegetales que compiten con los
cultivos (malezas).

xi
Estos productos qumicos tambin pueden ser utilizados para el control de
vectores de enfermedades humanas y animales en reas abiertas o dentro del
domicilio. A estas sustancias tambin se las llama ocasionalmente biocidas.

PROTOZOARIOS: Organismos unicelulares microscpicos flagelados.


PARTENOGNESIS: (del griego parthenos = virgen + gnesis =
generacin) es una forma de reproduccin basada en el desarrollo de clulas
sexuales femeninas no fecundadas, que se da con cierta frecuencia en
platelmintos, rotferos, tardgrados, crustceos, insectos, peces, anfibios y reptiles, entre
los animales, y tambin en las plantas.

PATGENO: Se dice de las sustancias que inhiben o alteran gravemente las


funciones del sistema nervioso.

PUPA: Fase de desarrollo de un insecto posterior al estado de larva y anterior al


de adulto.

SUSTANCIAS COADYUVANTES: Normalmente pertenecen al grupo de


diluyentes, humectantes, absorbentes o aditivos. Los adsorbentes para retener
algo que pueda perjudicar al principio activo, los absorbentes son sustancias que
favorecen la absorcin de una tercera, los coadyuvantes solo cuando sea
necesaria su presencia.

WUCHERERIA BANCROFTI: Es la ms extendida de las filarias, apareciendo por


toda la costa atlntica de Amrica Central y del Sur, oeste, centro y este de frica,
centro-sur, sureste y este de Asia e islas del Pacfico.

xii
CONTENIDO

Pg.

1.0 JUSTIFICACION 1
2.0 OBJETIVOS 5
2.1 OBJETIVO GENERAL 5
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 5
3.0 GENERALIDADES DE LAS ANNONACEAE 6
3.1 CLASIFICACION BOTANICA DE LAS ANNONACEAE 6
3.2. ALGUNAS ANNONAS 9
3.2.1. Annona cherimola chirim. 9
3.2.2. Annona muricata L. 9
3.2.3. Annona diversifolia Safford. 10
3.2.4. Annnona purpurea L. 11
3.2.5. Annona reticulata L. 12
3.3 ANNONACEAE EN COLOMBIA 14
3.4 Compuestos Activos De Las Annonaceae 15
3.4.1 Clasificacin De Las Acetogeninas De Annonaceae 15
3.4.2 Separacin e Identificacin de las Acetogeninas 17
3.4.3 Mecanismo De Accin De Las Acetogeninas De Annonaceae 18
4.0 ACTIVIDAD BIOLOGICA 19
4.1 Actividad Biolgica Biopesticida 21
4.1.1. Clasificacin De Los Biopesticidas 23
4.1.1.1. Bioinsecticidas. 23
4.1.1.2.Biofungicidas. 24
4.1.1.3.Bioherbicidas. 25
4.1.1.4.Biobactericidas. 25
4.1.1.5.Bionematicidas. 25
4.1.2. Biopesticidas a Partir de Extractos Vegetales. 26
4.1.2.1. Insecticidas Derivados de Plantas y
Productos Naturales. 26
4.2. PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA Y ORGANISMOS
MODELOS. 28
4.2.1. LOS MOSQUITOS (DIPTERA: CILICIDAE) 31
4.2.1.1. Gneros de la Familia Culicidae 33
4.2.2 LA ARTEMIA SALINA O BRINE SHRIMPS Y SU CLASIFICACION 36
4.2.2.1. Distribucin De La Artemia salina 37
4.2.2.2. Ciclo De Vida De La Artemia salina 38
4.2.2.3. La Importancia De La Artemia salina
En Las Investigaciones 41
4.3. ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LAS ACETOGENINAS

xiii
DE ANNONACEAE 42
5.0. PROTOCOLOS 49
5.1. PROTOCOLOS CON ARTEMIA SALINA 49
5.1.1. Procedimiento Del Laboratorio UNAL-Departamento 49
de Qumica, Grupo de Productos Naturales.
5.1.2. Procedimiento De La Universidad Del Quindo 53
5.1.3. Procedimiento De La Universidad Nacional De Colombia 54
5.2. PROTOCOLOS CON MOSQUITOS. 56
5.2.1. Procedimiento #1 Para La Evaluacin De Toxicidad Con
Mosquito Culex. quinquefasciatus . 56
5.2.2. Procedimiento #2 Para La Evaluacin De Toxicidad Con
Larvas Del IV Estadio De Anopheles. 58
5.2.3. Procedimiento #3 Para La Evaluacin De Toxicidad Con
Mosquito Culex. quinquefasciatus. 59
5.3. PROTOCOLOS RECOMENDADOS PARA EVALUAR POSIBLE
ACTIVIDAD BIOLGICA BIOPESTICIDA. 62
5.3.1. Diagrama De Flujo #1: Bioensayo Preliminar Con Artemia salina 62
5.3.2. Diagrama De Flujo #2: Bioensayo Especfico Con El
Mosquito Culex quinquefasciatus 66
6.0. DISCUSION GENERAL 69
7.0. CONCLUSIONES 72
BIBLIOGRAFIA 74
ANEXOS 86

xiv
LISTA DE FIGURAS

Pg.
FIGURA 1. ACETOGENINAS UTILIZADAS COMO BIOPESTICIDAS 1
FIGURA 2. Frutos de Annona chirimoya 9
FIGURA 3. Fruto de Annona muricata 10
FIGURA 4. Frutos de Annona diversifolia 10
FIGURA 5. Frutos de Annona purpurea 12
FIGURA 6. Fruto de Annona reticulata 13
FIGURA 7. CICLO DE VIDA DE UN MOSQUITO 32
FIGURA 8. MOSQUITO DEL GENERO CULEX 33
FIGURA 9. MOSQUITO DEL GENERO AEDES 34
FIGURA 10. MOSQUITO DEL GENERO ANOPHELES 35
FIGURA 11. ARTEMIA SALINA 36
FIGURA 12. CICLO DE VIDA DE LA ARTEMIA SALINA 38
FIGURA 13. TANQUE PARA HUEVOS DE ARTEMIA 50
FIGURA 14. MADURACION DE BRINE SHRIMPS 50
FIGURA 15. VIALES AGRUPADOS DE A TRES 51
FIGURA 16. EVALUANDO MOVILIDAD DE LARVAS 52
FIGURA 17. MOSQUITERO 59
FIGURA 18. ALGODN CON AZUCAR 59

xv
LISTA DE TABLAS
Pg.

TABLA 1. ESTUDIOS REALIZADOS CON PRUEBAS DE ACTIVIDAD


BIOLOGICA. 3
TABLA 2. LISTA DE ALGUNOS GNEROS DE LA FAMILIA
ANNONACEAE CON SUS RESPECTIVAS ESPECIES 7
TABLA 3. CLASIFICACION DE ACETOGENINAS DE ANNONACEAE 16
TABLA 4. EJEMPLOS DE ACTIVIDADES BIOLOGICAS 19
TABLA 5. ORGANISMOS MODELOS EMPLEADOS EN
LA BUSQUEDA DE BIOENSAYOS 30
TABLA 6. CETOGENINAS DE ANNONACEAE CON
ACTIVIDA BIOLOGICA BIOPESTICIDA 42
TABLA 7.ACETOGENINAS CON MAYOR
ACTIVIDAD BIOPESTICIDA 45
TABLA 8. ESTUDIOS REALIZADOS CON ACETOGENINAS
DE ANNONACEAE EN ARTEMIA SALINA Y MOSQUITOS
(DIPTERA:CULICIDAE) 46
TABLA 9. DIFERENCIA ENTRE MOSQUITOS SANOS
Y AFECTADOS POR ANONACINA 48
TABLA 10. CARACTERISTICAS DE LOS MOSQUITOS 88
TABLA 11. DOSIS EFECTIVA MEDIA Y DOSIS LETAL MEDIA 92

xvi
LISTA DE ANEXOS

Pg.

ANEXO 1. MATERIAL Y REACTIVOS A UTILIZAR. 87


ANEXO 2. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS MOSQUITOS 88
ANEXO 3. PROGRAMA PROBIT. 91
ANEXO 4. DETERMINACION DE LA DOSIS LETAL
DE UNA SUSTANCIA. 92
ANEXO 5. PRODUCCION DE GUANABANA EN COLOMBIA
EN EL AO 2003. 93
ANEXO 6. PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA ELABORACION
DE UN BIOPESTICIDA NATURAL. 94
ANEXO 7. CONDICIONES AMBIENTALES. 95
ANEXO 8. LISTA AMPLIADA DE GNEROS DE LA FAMILIA
ANNONACEAE CON SUS RESPECTIVAS ESPECIES 98

xvii
1. JUSTIFICACION

Las acetogeninas, son compuestos bioactivos presentes tanto en las races como
en las semillas de algunos frutas, son componentes naturales los cuales presentan
una extensa gama de actividades biolgicas: antitumoral, citotxica,
antimicrobiana, plaguicida, antiprotozoaria y antihelmintica, (1, 2).

Las Acetogeninas son compuestos de estructura qumica caractersticas como se


aprecia en la figura 1.

FIGURA 1. ACETOGENINAS UTILIZADAS COMO BIOPESTICIDAS

1-Escuamocina, Acetogenina Bis-THF

2-Anonacina, Acetogenina mono THF - dihidroxilada

1
Se encuentran presentes en semillas de plantas de la familia Annonaceae como la
Annona cherimolia, Annona glabra, Annona muricata, Annona esquamosa y otras.
Algunos estudios han sugerido que ciertas acetogeninas de la guanbana y de
otras anonceas tienen un excelente potencial como biopesticidas, (1, 2).

Los biopesticidas son productos que contienen un microorganismo como


ingrediente activo, o bien son molculas que se extraen de un ser vivo mediante
procesos que no alteran su composicin qumica. El biopesticida es un pesticida
hecho a base de recursos biolgicos, es decir, de toxinas que se producen
naturalmente, no alteran el equilibrio ecolgico del suelo, cuando son
microorganismos muy especficos, dado que cuando muere el husped, en este
caso el parsito, muere tambin el microorganismo, (2, 3).

En los ltimos aos se ha tratado de desarrollar biopesticida que no tengan


efectos sobre la salud humana y animal, que no tengan influencia negativa sobre
el medio ambiente y que sean suficientemente efectivo para los usos propuestos,
(2, 3).

Tanto las investigaciones biolgicas bsicas como las investigaciones aplicadas,


han determinado muchos e importantes adelantos de la ciencia mdica. Resulta
indispensable seguir realizando investigaciones de ambas clases con el fin de
descubrir las causas, mecanismos, prevencin y tratamiento de enfermedades que
an no son bien conocidas por el hombre, as como para probar la eficacia e
inocuidad de muchos de los principios activos utilizados en medicina humana y
veterinaria, y en general para avanzar en el conocimiento biolgico, (3).

En medicina humana y veterinaria se utilizan animales en investigaciones


fisiolgicas, patolgicas, farmacolgicas, toxicolgicas, teraputicas y de
conducta, en ciruga experimental, en ensayos de medicamentos y preparados
biolgicos, y tambin con fines docentes en todas estas disciplinas, incluyendo la
formacin quirrgica, (3).

2
Adems, de los experimentos, los animales son indispensables para probar la
potencia e inocuidad de muchas de las sustancias biolgicas utilizadas en
medicina humana y veterinaria. Las pruebas de actividad biolgica son, adems,
esenciales para las numerosas sustancias sintticas que jams existieron en la
naturaleza: productos farmacuticos, aditivos alimentarios y productos qumicos
agrcolas, y es evidente que dichas pruebas slo pueden realizarse con animales,
aunque los sujetos de las pruebas definitivas tengan que ser seres humanos en
contacto directo o indirecto con las mencionadas sustancias, (3).
Algunos ejemplos de los organismos modelos utilizados para las pruebas de
Actividad Biolgica son: levadura (Saccharomyces cerevisiae), gusano
(Caenorhabditis elegans), mosca (Drosophila melanogaster) y ratn (Mus
musculus), los cuales comparten con los seres humanos un gran nmero de
genes, protenas e incluso vas genticas; de igual forma como ejemplos de
estudios realizados con pruebas de actividad biolgica se presentan algunos
estudios de Acetogeninas de Annonaceae con organismos modelos como se
muestra en la siguiente tabla:

TABLA 1. ESTUDIOS REALIZADOS CON PRUEBAS DE ACTIVIDAD


BIOLOGICA

EXTRACTO ORGANISMO OBJETIVO REFERENCIA


EMPLEADO BIBLIOGRAFICA
Demostrar
Extracto crudo Larvas Del Cogollero la eficiencia de
metablico de Del Maz Spodoptera acetogeninas
acetogeninas, frugiperda (Lep: Annonaceae como
obtenido de Noctuidae) alternativa ecolgica
(4)
semillas de Annona en el manejo
muricata- clon Elita integrado de plagas,
debido a la
abundancia de
semillas de
A. muricata.

3
Acetogeninas de Leptinotarsa Evaluar dos
Annonaceae, 1- decemlineata Acetogeninas de
Escuamocina, 2- (escarabajo de la papa Annonaceae y sus
(5)
Anonacina rosada), Spodoptera Efectos Insecticidas
littoralis (Lepidoptera: y Mutagnico sobre
Noctuidae) Polifago y diferentes especies
Myzus persicae con distintos hbitos
(Homoptera:Aphididae) alimentarios

El estudio de las Pruebas de Actividad Biolgica es complejo por su gran aporte


en diferentes sectores como son: la agricultura, la medicina, la veterinaria, etc. Por
tal razn la presente monografa pretende documentar pruebas de actividad
biolgica con dos organismos modelos: Artemia salina y Mosquitos (Diptera:
Culicidae), proponer un mtodo para la evaluacin de la actividad biolgica de las
Acetogeninas de especies de la familia Annonaceae como biopesticidas, que
contribuyan en el desarrollo de trabajos posteriores dentro de una nueva lnea de
investigacin del grupo de Oleoqumica de la Escuela de Tecnologa Qumica.

4
2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Documentar la informacin existente sobre pruebas de actividad biolgica con dos


organismos modelos Artemia salina y Mosquitos (Diptera: Culicidae), seleccionar
un mtodo para la evaluacin de la actividad biolgica de las Acetogeninas de
Annonaceae como biopesticida, y contribuir al aprovechamiento integral de
subproductos de las Annonaceae.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Recopilar informacin de diferentes fuentes sobre pruebas de actividad


biolgica con dos organismos modelos (Artemia salina y Mosquitos (Diptera:
Culicidae)).

Seleccionar el mtodo mas viable para realizar pruebas de actividad


biolgica con Acetogeninas de Annonaceae con actividad biopesticida.

5
3. GENERALIDADES DE LAS ANNONACEAE

3.1. CLASIFICACION BOTANICA DE LAS ANNONACEAE

La familia Annonaceae cuenta con 130 gneros y se estima que hay 2.300
especies en el mundo; algunas de estos gneros con sus especies se pueden
observar en la tabla 2. Entre ellas hay numerosos frutales, especialmente en los
gneros Annona y Rollinia; la mayora de las especies del genero Annona y todas
las del genero Rollinia son originarias del Nuevo Mundo, (6).

El gnero Annona se caracteriza por tener sus hojas alternas, simples, enteras,
finas o coraceas, decduas o persistentes y sin estpulas. Las flores son
bisexuales, con frecuencia en tonos de color caf y amarillo, solitarias o en
racimos, compuesta de 3 spalos y 6 ptalos, generalmente el cliz es tubular.
Los estambres son numerosos, aglomerados, con filamentos carnosos portando
anteras largas y espirales. La fruta es grande, carnosa, estando formada por la
fusin de los pistilos y los receptculos, (6, 7).

Los indgenas cultivaron cuidadosamente muchas de ellas, en Mesoamrica, los


valles interandinos, Amazonia y otros lugares. Hay tres especies, Annona
cherimola, A. muricata y A. squamosa, marginales en varias regiones de Amrica
tropical; otras tres, A. diversifolia, A. reticulata y A. scleroderma en cambio, han
sido marginadas, a pesar de su valor intrnseco y potencial como fruta fresca,
(6,7).

6
TABLA 2. Lista De Algunos Gneros De La Familia Annonaceae

Con sus Respectivas Especies, (6, 7, 8).

GENERO ESPECIE
crassipetala Hemsl.
dolichocarpa Sprague & Sandwith
Anaxagorea panamensis Standl.
phaeocarpa Mart.

amazonica R. E. Fr.
cherimola Mill.
glabra L.
montana Macfad.
muricata L.
pittieri Donn. Sm.
Annona pruinosa G. E. Schatz
purpurea Mo. & Sess ex Dunal
reticulata L.
squamosa L.
volubilis Lundell

Cananga odorata (Lam.) Hook. f. & Thomson

costaricense (Donn. Sm.) Saff.


lanugipetalum Woodson & Schery
Cymbopetalum torulosum G. E. Schatz

bibracteata (Rob.) Saff.


heteropetala R. E. Fr.
Desmopsis maxonii Saff.
microcarpa R. E. Fr.
oerstedii Saff.
schippii Standl.

Duguetia panamensis Standl.

7
aeruginosa Standl.
amplifolia Triana & Planch.
chiriquiensis R. E. Fr.
costaricensis R. E. Fr.
diospyroides Baill.
dolichopoda Donn. Sm.
Guatteria elegantissima R. E. Fr.
lucens Standl.
oliviformis Donn. Sm.
recurvisepala R. E. Fr.
tonduzii Diels
verrucosa R. E. Fr.

Malmea costaricensis R. E. Fr.


hypoglauca (Standl.) R. E. Fr.

Oxandra longipetala R. E. Fr.


venezuelana R. E. Fr.

Rollinia membranacea Triana & Planch.


mucosa Baill.
pittieri Saff.

Sapranthus palanga R. E. Fr.

Stenanona costaricensis R. E. Fr.

hammelii G. E. Schatz
panamensis R. E. Fr.
Unonopsis pittieri Saff.
storkii Standl. & L. O. Williams
theobromifolia N. Zamora &
Poveda

aromatica (Lam.) Mart.


bocatorena Schery
Xylopia frutescens Aubl.
macrantha Triana & Planch.
sericophylla Standl. & L. O.
Williams

Para tener una informacin completa de los gneros y especies de la familia


Annonaceae se puede observar el Anexo 8.

8
3.2. ALGUNAS ANNONAS

3.2.1 Annona cherimola chirim, (chirimoya, chirimoyo, anona).

La chirimoya (ver figura 2), se considera originaria de los valles fros, pero libres
de heladas de los Andes, entre 700 a 2400 m, (6).

FIGURA 2. Frutos de Annona cherimola

Se conocen excelentes cultivares, todos de propagacin vegetativa, que se


plantan a escala comercial en Espaa, Chile, Australia, Israel, Estados Unidos
(California, Florida) y la isla de Madeira. Los frutos se venden en los
supermercados de muchos pases y son muy apreciados. En las regiones donde
la chirimoya es todava un cultivo marginal, hay que aplicar mtodos de:
polinizacin artificial, injerto en patrones de la misma especie o de A. squamosa o
A. glabra, de cultivares superiores, (6, 8).

3.2.2. Annona muricata L. (guanaba, guanbana).

Es nativa posiblemente de las Antillas y de la parte septentrional de Amrica del


Sur, y crece entre 0-1000 m de altura. Su produccin comercial se ha desarrollado
en Brasil, Venezuela, Costa Rica y otros pases, para el consumo local y la
exportacin. Hay mucha variacin en el tamao del fruto y en el contenido de
azcares (ver figura 3), (7, 9).

9
FIGURA 3. Fruto de Annona muricata

3.2.3. Annona diversifolia Safford (ilama, ilamatzapotl, izlama, papausa,


Ann).

Este frutal como se aprecia en la figura 4, es muy estimado en su rea de origen


Guatemala, no se ha desarrollado como merece por tratarse de una especie
plantada principalmente por los indgenas, (6, 7).

FIGURA 4. Frutos de Annona diversifolia

Aunque es muy apreciada y bien pagada en los mercados de Guatemala, su


cultivo no atrae a otros productores agrcolas. Otros factores que ayudan a
marginar su produccin son la baja productividad de los rboles; la dificultad de
germinacin de las semillas (aunque ya se conocen mtodos para promover la
germinacin artificial), y la poca duracin de la fruta en los mercados, 2 a 3 das a
temperatura ambiente. Si se dejan madurar en el rbol, los frutos presentan
rajaduras pero si se recogen en ese estado y se almacenan a temperatura normal,

10
las rajaduras cicatrizan. En Guatemala se acostumbra recogerlos de esta manera
madurndolos en cajones u otros lugares cerrados, (6).

Este rbol se distingue de las otras especies de Annonaceae porque tiene dos
clases de hojas, las corrientes obovadas, glabras, con pecolo, y otras en forma de
brcteas, redondas, caedizas, sin pecolo, que crecen en la base de las ramillas.
En el lado inferior de las hojas, ramillas y frutos, la superficie tiene un aspecto
pulverulento, blancuzco, que es ms notable en las variedades de pulpa blanca.
Las flores tienen tres ptalos externos, de 2 a 5 cm de largo, y tres internos
diminutos; el color de las flores es una caracterstica varietal y va de rosado a rojo
prpura. El fruto, de unos 12 cm de largo, tiene pulpa blanca, rosada o rojiza, con
aroma tpico y sabor dulce y exquisito, segn la mayora de las opiniones superior
al de la chirimoya. Los frutos son muy resistentes, o tal vez completamente
inmunes a los ataques del insecto barrenador de las semillas, (6, 7, 9).

Se cultiva slo en huertos de pocos rboles, y se nota una amplia variabilidad.


Esta se expresa especialmente en caractersticas de los frutos: color, textura, que
puede ser desde ligeramente pastosa a jugosa, suave o con concentraciones de
granos ms duros, sabor dulce y con aroma tpico, (6, 7).

3.2.4. Annona purpurea L. (sincuya, soncoya, chincuya).

Originaria de Mxico y Centro Amrica, es escasamente cultivada. Es un rbol


bajo, de follaje espaciado; las hojas son grandes y delgadas, elpticas a obovadas,
miden de 15 a 30 cm de largo por 10 a 15 cm de ancho. Las lminas son muy
onduladas pues los nervios estn marcadamente hundidos en la cara superior (ver
figura 5), (6).

11
FIGURA 5. Ejemplos de Frutos de Annona purpurea

Por lo comn en los tallos jvenes, los pecolos y nervios de la hoja, muestran
pubescencia rojiza. Las flores son grandes, con los ptalos externos de 4 a 5 cm
de largo, flexibles y amarillentos con manchas violetas en el lado interno; los
ptalos internos son ms cortos, de 3 a 4 cm de largo. El receptculo cnico mide
alrededor de 2 cm de largo por 1.5 cm de ancho y en su parte inferior est cubierto
de estambres y al pice por un anillo de carpelos. El fruto es ovoide a esfrico,
mide de 10 a 14 cm de ancho y est cubierto de un tomento amarillo o rojizo. Los
carpelos tienen prominencias piramidales muy desarrolladas, hasta de 2 cm de
largo, con los pices curvos hacia la base de la fruta. La pulpa es dura, amarilla a
anaranjada, aromtica. Las semillas elpticas, de color caf claro, miden de 2.5 a 3
cm de largo, (6, 7).

3.2.5. Annona reticulata L. (anona, anona colorada, anona rosada, corazn).

Aunque se dice que esta especie es nativa de las Antillas, la presencia en


Guatemala y Belice de una variedad silvestre, A. reticulata var. primigenia, y de
una variabilidad muy amplia de cultivares lo cual indica que esta zona puede
considerarse como la region de origen de la especie, (ver figura 6), (6).

12
FIGURA 6. Fruto de Annona reticulata

Se ha introducido en otras regiones de los trpicos americanos y del sureste de


Asia, sin que haya llegado a alcanzar una importancia comparable a la A.
cherimola y la de A. squamosa. Lo que ms atrae de esta especie son los frutos
de sabor muy agradable, generalmente dulce y cremoso, el volumen ocupado por
la cscara y la semilla, relativamente pequeo, y el que la planta no es demasiado
exigente en cuanto a suelos, el fruto es acorazonado o esfrico, de 8-15 cm de
dimetro; la pulpa variable segn el cultivar, desde jugosa y muy aromtica, hasta
dura y de sabor repulsivo. Es un rbol bajo, de copa abierta e irregular, con hojas
delgadas y glabras, en algunas variedades largas y estrechas, de 10 a 20 y 2 a 7
cm, rectas y agudas en el pice; en otras arrugadas y hasta de 10 cm de ancho.
Las flores por lo comn en grupos de 3 4, con los tres ptalos externos largos y
los tres internos muy pequeos, alta variabilidad en la presencia de grupos de
clulas duras, como granos de arena. El color externo e interno vara segn el
cultivar. A. reticulata crece en Amrica Central en las reas de estaciones
alternas, entre 0-1500 m, y se ha extendido a Amrica del Sur. Pero es en la
primera donde se encuentran las variedades que antes se haban clasificado como
especies: primigenia, ya mencionada y lutescens, la anona amarilla, que crece de
Mxico a Costa Rica, (6, 7, 8).

13
3.3. LAS ANNONACEAE EN COLOMBIA

Las principales Annonas que se encuentran cultivadas en Colombia para su


produccin son en su orden: Annona muricata, Annona cherimola y Annona
blanca. Otras especies de menor importancia se encuentran en forma silvestre
estas son: Rollinia mucosa Bail, Annona colorada y Annona atemoya (hibrido no
comercial), (9).

Existe un especie dentro de la familia de las Annonaceae como es la Annona


muricata; que ha comenzado a perfilarse en los ltimos aos como uno de los
frutales promisorios que se postulan como una alternativa de desarrollo sostenible
en algunas regiones del pas como Tolima, Huila, Valle del Cauca, Costa Atlntica,
Eje Cafetero, ya que estas zonas presentan un clima adecuado para su cultivo, (9,
10).

En Colombia segn una encuesta realizada en el ao 1999, indic que en el pas


se encontraban 4626.4 hectreas sembradas pertenecientes a la familia de las
Annonaceae, pero aclarando que de estas mas o menos 1700 pertenecen a los
cultivos establecidos de Annona muricata, principalmente en los departamentos de
Tolima, Huila, Antioquia, Valle de Cauca y el Eje Cafetero. Una caracterstica
comn de esta especie de Annonaceae, es su potencial econmico, ya que por su
alto valor nutritivo y las diversas formas de transformacin que pueden tener sus
frutos, logran enormes posibilidades de crear su propio espacio en el mercado
local e internacional. Aun as su cultivo comercial es escaso, por lo cual
actualmente se viene realizando avances tecnolgicos para reactivar el cultivo en
todo el pas de las diferentes Annonaceae y as disminuir las altas tasas de
importacin de Venezuela y Ecuador, (9).

14
3.4. COMPUESTOS ACTIVOS DE LAS ANNONACEAE

Los compuestos de inters por su comprobada actividad biolgica presentes en


las Annonaceae se conocen como acetogeninas, estas son un grupo de
sustancias conformadas por una cadena larga de C-32 o C-34 de cidos grasos
que pueden estar combinados con una unidad 2-propanol en el C-2 para formar
una -lactona; las cuales presentan diferentes bioactividades como antitumoral
inmunosupresiva, pesticida, antiprotozoal y antimicrobiana. De las Annonaceae, se
han reportado numerosas acetogeninas aisladas e identificadas tales como la
Uvaracina, la primera que fue aislada de la planta de Uvaria accuminata en 1982,
(10, 11).
Se ha reportado que las acetogeninas de Annonaceae pueden inhibir
selectivamente el crecimiento de las clulas cancergenas y tambin inhibir el
crecimiento de clulas resistentes. Las acetogeninas son potentes inhibidores de
la NADH ubiquinona oxidoreductasa, que es una esencial enzima en el Complejo I
de la cadena respiratoria mitocondrial, (10, 11, 12).

3.4.1 CLASIFICACION DE LAS ACETOGENINAS DE ANNONACEAE

Las acetogeninas de Annonaceae se clasifican segn la cantidad de anillos que


tengan en su estructura (Ver tabla 3), como son:
Mono-Tetrahidrofurano (THF), adyacentes bis-THF, no adyacentes bis-THF y sin
anillo mono THF estas estructuras tambin poseen hidroxilos laterales los cuales
pueden estar a uno u otro lado de la estructura, seguida por una subclasificacin
de las -lactonas o sustituidas por cetolactonas, (12, 13).
Muchas acetogeninas de Annonaceae han sido encontradas y clasificadas por
sntesis total o por el mtodo de Ester Mosher, (13, 14).

15
TABLA 3. CLASIFICACION DE ACETOGENINAS DE ANNONACEAE, (14), (15).

CON ANILLOS:

A ce tog en ina s a dyacen tes b is-T H F


A c e to g e n in a m o n o - T H F

O O O

OH R OH R

Acetogeninas no adyacentes bis-THF

OH OH

O
O

SIN ANILLOS:

A c e to g e n in a s s in a n illo s - T H F

(R)

SUBCLASIFICACION DE ACETOGENINAS CON ANILLOS LACTONA


TERMINALES
R2
R1 Anillo hidroxilados y reducidos
O Cetolactonas cis o trans OH

O
R 1= H 1O H R
O O
R 2=H 1O H
O O

16
3.4.2 SEPARACION E IDENTIFICACION DE LAS ACETOGENINAS.

Las acetogeninas de Annonaceae son fcilmente solubles en la gran mayora de


los solventes orgnicos. La extraccin por etanol del material seco de la planta
seguida por la particin de solventes para concentrar los componentes, (16).
Se han reportado algunas tcnicas nuevas para el aislamiento de acetogeninas a
partir de la planta; siendo los mas utilizados, la extraccin por filtracin en fri y la
extraccin en ter, hexano y etanol, (16).

Se han reportado varias metodologas para la extraccin de acetogeninas, las


cuales se pueden obtener de las hojas, semillas y races, (7,10, 17, 18, 19, 20).
As mismo para la extraccin de Acetogeninas de las semillas y hojas de Annona
muricata se han dado a conocer varios procedimientos, (10, 21, 22).
Para la extraccin de acetogeninas de otras especies de la familia de Annonaceae
como: Annona crassiflora, Annona squamosa, Annona montana, Annona
sennegalencis, Rollina mucosa, Annona bullata rich, Annona cherimola, Annona
glauca, Annona reticulata y Annona atemoya, se pueden encontrar varias
metodologas, (23, 24, 25, 26, 27, 28, 29), entre otras.

Para la identificacin de las diferentes acetogeninas es necesario conocer las


configuraciones, la posicin de los anillos, la posicin de los diferentes grupos y el
peso molecular de cada estructura para lo cual se han utilizado tcnicas como
resonancia magntica nuclear (RMN), infrarrojo (IR) y espectrometra de masas
(EM), (22), (23), (24).

Otra de las formas de identificacin que viene siendo utilizada es el mtodo del
Ester Mosher, el cual permite la determinacin estereoqumica absoluta por medio
de epimeros y enantiomeros de las acetogeninas, (23), (24), (25).

17
3.4.3 MECANISMO DE ACCION DE LAS ACETOGENINAS DE ANNONACEAE

Una serie de experimentos han mostrado que las acetogeninas de Annonaceae


son inhibidoras de la enzima NADH en el complejo I de la cadena respiratoria
mitocondrial. Se encontr que inicialmente la toxicidad presentada por la
exposicin de insectos a las acetogeninas de Annonaceae, incluye una
disminucin lenta en la movilidad y crecimiento antes de la muerte. Tales sntomas
son normalmente atribuidos a los bajos niveles de ATP causados por los
inhibidores respiratorios, sin embargo se requiere de estudios futuros para conocer
el tipo de organismo susceptible a estos componentes, incluyendo mamferos,
(16).

18
4. ACTIVIDAD BIOLOGICA

La actividad biolgica es la capacidad que tiene el material de interactuar


qumicamente con los tejidos del organismo, es una expresin que describe los
efectos beneficiosos o nocivos de un extracto en organismos vivos. Cuando la
droga es una mezcla qumica compleja esta actividad es ejercida por el
ingrediente activo de la sustancia pero se puede modificar por los otros
componentes. La clase principal de actividad biolgica es la toxicidad de una
sustancia. La actividad biolgica se toma generalmente para describir los efectos
beneficiosos en algn tipo de organismo, (30).
As mismo, se han estudiado una gran cantidad de compuestos activos
provenientes de extractos de origen vegetal, los cuales cuentan con algunas
actividades importantes como son: antiparasitaria, antifngica, antibacterial,
antitumoral, antioxidante, antimictico, citotxica, biopesticida, entre otras, (5, 31,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41).

De igual forma como ejemplos de algunos estudios realizados de diferentes


extractos con actividad biolgica se pueden citar en la siguiente tabla:

TABLA 4. EJEMPLOS DE ACTIVIDADES BIOLOGICAS

ACTIVIDAD EXTRACTO OBJETIVO REFERENCIA


BIOLOGICA BIBLIOGRAFICA

Decoccin de Demostrar que la Mentha


Antiparasitaria Mentha piperita Linn posee un efecto (31)
piperita Lin.n antiparasitario presente en
las hojas de esta planta.

19
Alcaloide Realizar la extraccin,
Aislado de elucidacin estructural y
Antifngica berberis actividad antifngica de (32)
serrato- Lauberina.
dentata.

Determinar el efecto
Antibacterial Infusin del t antibacterial de la infusin
verde. del t verde en la formacin (33)
de placa bacteriana por
Streptococcus mutans.

Extractos de Evaluar la actividad


Plantas de la antitumoral de 27 extractos
Antitumoral Flora obtenidos de plantas de la (34)
Cubana. flora cubana en el tumor
seal murino Leucemia
linfoctica trasplantado en
ratones.

Especies Determinar la composicin


Aromticas y qumica y actividad
Medicinales antioxidante de extractos de
Antioxidante con Alto seis especies vegetales (35, 36, 37)
Contenido de (tomillo, organos comn,
Timol y cimarrn, de castilla, rastrero
Carvacrol. y mejorana) y cuatro aceites
esenciales.

20
Extractos Estudiar cinco especies de
Acuosos holoturidas que muestran
Antimictico Obtenidos a actividad hemoltica:
Partir de Ludwigothuria mexicana, (38, 39)
Invertebrados L.grisea,Fossothuria cubana,
Marinos. Istchopus badionotus y
Trachytionidium occidentale.

Extractos de Realizar un ensayo


Citotxica Solanum biodirigido de citotoxicidad (40, 41)
melongena L. frente a tres lneas celulares
(Solanaceae). tumorales humanas.

Extractos de Demostrar
Acetogeninas la eficiencia de acetogeninas (4)
Biopesticida de Annonaceae para el manejo
Annonaceae integrado de plagas en
cultivos.

4.1. ACTIVIDAD BIOLOGICA BIOPESTICIDA

Los biopesticidas o Agentes de Control Biolgico (ACB) son productos que


contienen un ingrediente activo o bien se extraen de un ser vivo mediante
procedimientos que no alteran su composicin qumica. Pueden estar constituidos
por toda o una parte de la sustancia extrada, concentrada o no, adicionada o no a
sustancias coadyuvantes, (16, 42)
Una gran variedad de biopesticidas naturales se han desarrollado y aprobado para
el control de plagas de insectos, pestes y enfermedades bacterianas, estos

21
nuevos derivados botnicos resultan mas amigables con el medio ambiente, y
adems se pueden convertir en una herramienta til para los cultivos de alimentos
donde no se pueda fumigar, (17, 43, 44).

As mismo los biopesticidas son un grupo de pesticidas que pueden reducir el


riesgo del uso de pesticidas. Los biopesticidas en general:

Tienen un espectro de accin muy limitado y un modo de accin especfico;


Actan lentamente;
Tienen tiempos crticos de aplicacin;
Suprime, no elimina la poblacin de la plaga;
Tienen una persistencia limitada en el campo y tienen una vida de almacn
limitada.
Son ms seguros a los humanos y al medio ambiente que los pesticidas
convencionales.
No presenta problemas residuales, (45).

De igual forma los productos a base de microorganismos presentan como


principales ventajas y desventajas.

Ventajas:
1. La especificidad en su actuacin
2. Respeto al medio ambiente
3. Los patgenos tienden a desarrollar menor resistencia a productos
microbianos que a productos qumicos, (45).

Desventajas:
1. Una efectividad de control en general menor que los productos qumicos
2. Generalmente su accin no es inmediata
3. Dificultades de produccin a nivel comercial

22
4. Necesidad de resolver problemas tcnicos como la sensibilidad a
factores ambientales (temperatura, radiacin UV, humedad) que
presentan la mayora de estos productos, (45).

4.1.1. Clasificacin de los Biopesticidas

4.1.1.1. Bioinsecticidas

Histricamente los bioinsecticidas han sido los ms estudiados de los


biopesticidas. Estos pueden estar formulados a base de bacterias, virus, u hongos:

a. Bacterias: la mayora de productos estn basados en diferentes cepas de la


bacteria gram-positiva Bacillus thuringiensis Berliner, la cual produce toxinas
especficas (-endotoxinas) txicas para diferentes rdenes de insectos. Otro tipo
de productos se basan en la extraccin de la -endotoxina que es incorporada a
un plsmido que se inserta a un aislado de Pseudomonas fluorescens. A las
clulas bacterianas recombinantes se les permite crecer en un medio de cultivo
adecuado para que expresen la -endotoxina y posteriormente se les aplica un
tratamiento de alta temperatura. Las clulas bacterianas muertas sirven de
microcpsulas que protegen a la toxina de Bacillus thuringiensis, (45).

A nivel comercial, las bacterias se multiplican generalmente en un tanque de


fermentacin lquida. Los ACB (Agentes de Control Biolgico) pueden ser
formulados en estado de dormancia o pueden ser metablicamente activos. Las
formulaciones que contienen clulas activas son menos tolerantes a fluctuaciones
ambientales, menos compatibles con productos qumicos, de vida ms corta, y
requieren un empaquetamiento que permita el intercambio de gases y de
humedad. Sus ventajas son que al estar activas, empiezan actuar en el momento
de su aplicacin, (45, 46).

23
b. Virus: otra estrategia consiste en utilizar diferentes virus que poseen una
elevada especificidad en sus huspedes. Estos productos no han tenido el xito
que cabra esperar, debido a su bajo nivel de virulencia, poca estabilidad a la luz
UV, dificultades en la reproduccin y una pobre persistencia en el entorno, (46).

c. Hongos: de entre ellos destacan Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y


Paecilomyces fumosoreus para el control de la mosca blanca, Verticillium lecanii
para fidos, y Metarrhizium anisopilae y M. flavoviride Gams y Rozsypal para
cucarachas. Estos productos se aplican directamente sobre el insecto en forma de
polvo, emulsin o polvo mojable. En condiciones de campo, pueden aplicarse
mezclados con aceites a volmenes ultrabajos a fin de incrementar su eficacia y
proteger el ACB de la radiacin solar, (45, 46).

4.1.1.2. Biofungicidas

Muchos han sido los organismos que de manera experimental han sido aislados y
se ha probado su actividad fungicida, aunque no todos han desarrollado un
producto comercial. En general son productos formulados a base de bacterias u
hongos, (47).

a. Bacterias: es posible encontrar en el mercado distintos productos de origen


bacteriano para el control de hongos de raz y cuello a base de diferentes aislados
de los gneros Bacillus, Pseudomonas y Streptomyces, (47).

b. Hongos: existe un considerable trabajo realizado con Trichoderma y


Gliocladium debido a su fcil aislamiento, cultivo y fermentacin a gran escala.
Otros hongos como Ampelomyces quisqualis Cesati ex Schlecht., Fusarium
oxysporium Schlecht., Phytium oligandrum Drechler, Coniothyrium minitans
Campell y Phlebiopsis gigantea tambin han desarrollado distintos productos
comerciales, (46, 47).

24
4.1.1.3. Bioherbicidas

Los bioherbicidas son productos basados en microorganismos capaces de matar


selectivamente las malas hierbas sin daar los cultivos. Estos ACB pueden ser de
origen bacteriano o bien fngico, (46).

a. Bacterias: Requieren una elevada humedad y presencia de heridas o entradas


naturales en la planta, (45, 46).

b. Hongos: la temperatura y la humedad son las principales limitaciones para su


eficacia, (45).

4.1.1.4. Biobactericidas

Hasta el momento solamente existen productos basados en bacterias como ACB


para el control de enfermedades bacterianas, (45, 47).

4.1.1.5. Bionematicidas

Pocos son los productos bionematicidas que se comercializan. La mayora de


organismos estudiados son de tipo fngico aunque tambin existen algunas
bacterias, (47):

a. Bacterias: ensayos realizados desde hace dcadas con Pasteuria penetrans,


Sayre y Starr demuestran su capacidad en controlar nematodos, pero la
complejidad del cultivo, y la dificultad de producir esporas en cantidades elevadas
13
(10 esporas/L), y la especificidad husped-bacteria, son las principales
limitaciones para su uso a nivel comercial, (46, 47).

b. Hongos: Ciertas especies de hongos como Nematophtora gynophila Kerry y


Crump, Arthrobotrys oligospora Fresenius, Paecylomyces lilacinus, y Verticillum

25
chlamydosporium Goddard son parsitos de nemtodos. Pero su produccin a
nivel comercial no existe debido a su lento crecimiento en condiciones in vitro, el
poco tiempo de supervivencia del cultivo, sus requerimientos nutricionales y
algunas inconsistencias entre los distintos ensayos de campo, (46, 47).

4.1.2. BIOPESTICIDAS A PARTIR DE EXTRACTOS VEGETALES.

La obtencin de insecticidas a partir de fuentes naturales especialmente de


plantas, donde se aprovecha los mecanismos de defensa qumica, que las propias
plantas han desarrollado a travs de la evolucin; presenta la ventaja de no
introducir en el medio natural productos ajenos al mismo, y adems este medio
natural es capaz de degradarlos. Entre los insecticidas biolgicos ms utilizados,
estn los preparados a base de pelitre (extracto de Chrysanthemum
cinerariaefolium), la rotenona (extracto de races de Derris ellptica), los
preparados a base de plantas como adelfa, ajo, ortiga, el Equisetum arvense o
Cola de Caballo, y otros preparados a base de Azadirachta indica (rbol del
Neem), (48, 49).

4.1.2.1. Insecticidas Derivados de Plantas y Productos Naturales.

Nicotina: Es un extracto del tabaco que para los animales de sangre


caliente es muy txico. Comercialmente la nicotina slo se vende a
horticultores profesionales. Como insecticida natural se elabora con un
concentrado lquido de sulfato de nicotina que se diluye en agua
aplicndolo en aspercin sobre las plantas a tratar. Tambin existe en polvo
pero este puede irritar la piel. La nicotina se utiliza principalmente contra
insectos perforadores-chupadores como los pulgones, moscas blancas,
tisanpteros y saltadores de las hojas, (48, 49).

26
Rotenona: Se utiliza en forma de aspercin y de polvo. En los animales
de sangre caliente produce baja toxicidad y no deja ningn residuo daino
en los cultivos de la huerta; este es txico para los peces, insectos
beneficiosos, huevos, larvas y en menor grado para los adultos de las
mariquitas y altamente txico para las moscas neurpteras verdes adultas,
algunas abejas parsitas y para los caros depredadores y para las abejas
melferas, (49).

Riania: Se usa como insecticida y proviene de la madera, la variedad


Ryania speciosa que contiene un principio activo denominado rianodina que
se usa principalmente contra la mariposa nocturna de la manzana. Presenta
una baja toxicidad en los animales de sangre caliente y es venenosa en la
mayora de insectos beneficiosos y caros depredadores por contacto como
por ingestin, (48, 49).

Quassia: La quassia proviene de las plantas de la familia de las


Simarubaceas (todas las especies de Balanites, Picrasma y Quassia) y se
utiliza como pesticida natural. La cuasia se presenta por lo general en forma
de astillas de madera que se hierven en agua y luego se utiliza en forma de
aspercin contra pulgones, orugas de mosca sierra y caros (48, 49).

Cebadilla: Se extrae de la planta Schoenocaulon officinale. Es un


insecticida venenoso si se ingiere y altamente txico para las abejas
melferas y mamferos. Este potente insecticida natural se deteriora de
forma rpida con la presencia de la luz y no se debe aplicar antes del
anochecer lo que adems minimiza sus efectos sobre las abejas. La
cebadilla es muy utilizada en los EE.UU. como insecticida general contra un
gran nmero de plagas, (49).

Piretro: Es elaborado principalmente con la flor del Crysanthemum


cinerariafolium, una planta que contiene numerosos componentes
insecticidas que se denominan Piretros. Al igual que la cebadilla, el piretro

27
se descompone de forma rpida con la presencia de la luz dejando pocos
efectos residuales. Es txico para las plagas de moscas, pulgones,
tisanpteros, moscas blancas y otras plagas de insectos al igual que para
las mariquitas, avispas parsitas y peces, (48, 49).

Almidn de la patata: Es un insecticida de contacto que se elabora a partir


de los hidratos de carbono de la patata. Es efectivo contra pulgones,
chinches de las plantas y caros, (48).

4.2. PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA Y ORGANISMOS MODELOS.

Estas pruebas determinan si los compuestos en investigacin sirven como


antibiticos y actan contra bacterias, virus y hongos. Igualmente se estudia si
tienen algn efecto sobre el sistema nervioso central, adems de ser antitumoral,
anticancerosa, hipotensora e hipoglicemiante. Hay otras pruebas que determinan
cmo la planta influye en la reproduccin humana, si produce malformaciones
congnitas o si es neurotxica, (50).

Estas actividades se pueden estudiar in vitro, o sea en el laboratorio, o in vivo con


seres vivos, stas ltimas se requieren permisos especiales. Cada organismo
modelo tiene su propio conjunto de ventajas y desventajas para los investigadores,
que deben elegir cuidadosamente cul es el mejor modelo para un experimento
particular. No obstante, cada vez ms los cientficos pueden escoger entre
diferentes especies, incluyendo algunos nuevos organismos modelos, tales como
los peces, para aprovechar las cualidades especiales de cada una, (51).
A pesar de todas las diferencias obvias entre, por ejemplo, una mosca y un ser
humano, y a pesar de las amplias variaciones en el nmero de genes y de
cromosomas que contienen, cada organismo tiene aproximadamente el mismo
nmero de protenas fundamentales, (50, 51)
La experimentacin animal ha sido base fundamental de los grandes avances de
los conocimientos biolgicos y del bienestar del hombre y de los animales, (4).

28
Tanto las investigaciones biolgicas bsicas como las investigaciones aplicadas,
han determinado muchos adelantos importantes de la ciencia mdica. Por eso
resulta indispensable seguir realizando investigaciones de ambas clases con el fin
de descubrir las causas, mecanismos, prevencin y tratamiento de enfermedades
que an no son bien conocidas por el hombre, as como para probar la eficacia e
inocuidad de muchos de los principios activos utilizados en medicina humana y
veterinaria, y en general para avanzar en el conocimiento biolgico, (4).
Un requisito importante estipulado en los cdigos de tica internacionales y en
muchas legislaciones nacionales para experimentacin en seres humanos, es que
no se deben emplear nuevas sustancias ni dispositivos en seres humanos, a
menos que las pruebas previamente efectuadas en animales, permitan hacer una
suposicin razonable de su inocuidad, (4, 52)
Los organismos modelos comnmente empleados en medicina humana y
veterinaria se utilizan animales tales como: levadura (Saccharomyces cerevisiae),
gusano (Caenorhabditis elegans), mosca (Drosophila melanogaster) y ratn (Mus
musculus), en investigaciones fisiolgicas, patolgicas, farmacolgicas,
toxicolgicas, teraputicas y de conducta, en ciruga experimental, en ensayos de
medicamentos y preparados biolgicos, y tambin con fines docentes en todas
estas disciplinas, incluyendo la formacin quirrgica, (52, 53)
Adems de los experimentos, los animales son indispensables para probar la
potencia e inocuidad de muchas de las sustancias biolgicas utilizadas en
medicina humana y veterinaria, (53).
Las pruebas de actividad biolgica son, adems, esenciales para las numerosas
sustancias sintticas que jams existieron en la naturaleza: productos
farmacuticos, aditivos alimentarios y productos qumicos agrcolas, y es evidente
que dichas pruebas slo pueden realizarse con animales, aunque los sujetos de
las pruebas definitivas sean seres humanos en contacto directo o indirecto con las
mencionadas sustancias, (53, 54).

Particularmente los dos organismos modelos mas empleados (Ver tabla 2) para
evaluar posible actividad biolgica biopesticida son: la Artemia salina y los

29
Mosquitos (Diptera: Culicidae). A pesar de sus obvias diferencias de tamao y
forma de vida, estos organismos modelos producen protenas que realizan las
mismas funciones bsicas que en los seres humanos: le indican al organismo
cundo y cmo crecer, reproducirse, combatir el estrs y eventualmente morir,
(51, 54).
En la siguiente tabla se presenta una breve descripcin de los dos organismos
modelos seleccionados.

TABLA 5. ORGANISMOS MODELOS EMPLEADOS EN LA BUSQUEDA DE


BIOENSAYOS, (51, 55, 56).

CARACTERISTICAS

Mosquitos (Diptera: Artemia salina (Brine

Culicidae) Shrimps)

Organismo multicelular con un Mide entre 0,8 y 1,5 cm de


TAMAO comportamiento complejo, de 4 longitud y su morfologa
mm de largo. cambia en funcin de la
cantidad de sal del agua.

2 a 3 meses. Una generacin Se reproduce por medio de


nueva cada 10 das huevos (que pueden
LONGEVIDAD desecarse). Nacen 24 horas
despus del desove y llegan a
ser adulta para reproducirse a
las 3 semanas
aproximadamente.

30
165 millones de pares de bases Presenta 42 cromosomas, de
de ADN. 13.600 genes, de los 1 a 3 centromeros, diploides.
cuales cerca del 50% Posee un contenido elevado
GENOMA equivalentes humanos en protenas y sirven como
alimento para invertebrados,
crustceos y peces marinos,
de acuerdo a su fase de
evolucin (larva o adulto).

4.2.1. LOS MOSQUITOS (DIPTERA: CULICIDAE) COMO ORGANISMO


MODELO.

Los mosquitos son insectos del orden Dpteros y de la familia Culicidae, que se
caracterizan por su pequeo tamao, con abdomen delgado, alas estrechas,
antenas largas y extremadamente plumosas en los machos; presentan un aparato
bucal adaptado para picar, con una trompa o pico largo y no articulado, constituido
por el labio inferior, por lo que son chupadores labiales. El pico les sirve a los
machos para chupar el jugo o nctar de los vegetales y a las hembras, que son
hematfagas, para chupar la sangre de los vertebrados, (55, 56).

El ciclo de vida de un mosquito se desarrolla en cuatro etapas que son :


Huevo esta encerrado en una cubierta de tres capas con un pasaje con aspecto
de embudo que facilita la entrada de espermatozoides. Los huevos son
depositados en el agua (ver figura 7), (55, 56, 57).

Larva alargada, sin patas con pelos enrollados y ramificaciones transversales o


simples, distribuidos en todo su cuerpo pasa a travs de cuatro etapas hasta

31
alcanzar la longitud de un adulto. Nadan desordenadamente alcanzando la
superficie para respirar (ver figura 7), (56, 57).

Pupa megalocfala, curva, que semeja un signo de puntuacin coma. La pupa


se sumerge rpidamente con una sucesin de saltos como respuesta a estmulos
(ver figura 7), (57).

Adulto al madurar la pupa la membrana es rota por la vescula area y la


actividad del insecto adulto al escapar (ver figura 7), (56).

FIGURA 7. CICLO DE VIDA DE UN MOSQUITO, (55, 56)

Los mosquitos de la familia Culicidae constituyen el grupo de insectos ms


importantes a nivel mundial desde el punto de vista mdico y veterinario.
El hbito hematfago de las hembras los convierte frecuentemente en plagas
sanitarias muy molestas, adems de que al travs de su picadura pueden
transmitir varios agentes patgenos causantes de enfermedades entre los
vertebrados. Diversas encefalitis, la fiebre amarilla, el dengue, la malaria y ciertas
filariasis, son ejemplos de enfermedades en las que los mosquitos funcionan como

32
vectores. Estas enfermedades han cobrado a lo largo de la historia millones de
vidas y muchas de ellas continan siendo hoy da problemas de salud prioritarios
especialmente en los trpicos y subtrpicos. Adems, diversos factores como el
cambio climtico global, la colonizacin humana de nuevos ambientes, el mercado
internacional, el transporte moderno, entre otros, favorecen la posibilidad de que
se establezcan poblaciones de vectores exticos y que circulen patgenos en
reas que previamente estaban libres de ellos, (55, 56, 57).

4.2.1.1. GENEROS DE LA FAMILIA CULICIDAE

Mosquito Culex quinquefasciatus: Muchas especies del gnero Culex (Ver


figura 8) con sus subgneros, estn distribuidos por todo el mundo, principalmente
en regiones clidas. Estos mosquitos, pequeos o de mediano tamao, viven
principalmente en masas permanentes de agua y su distribucin es urbana y rural,
(55, 56).

FIGURA 8. MOSQUITO DEL GENERO CULEX

Esta especie se ha relacionado con la transmisin de filarias como Wuchereria


bancrofti y Dirofilaria immitis, del virus del Nilo occidental y de los virus causantes
de la encefalitis de San Luis y la encefalitis equina venezolana, entre otros. En
reas donde no existe riesgo de transmisin de agentes patgenos por parte de
esta especie, constituye un problema de salud pblica debido a la alergia
ocasionada por su picadura y a las molestias causadas por las altas densidades
de poblacin, (58).

33
Los estadios inmaduros se desarrollan preferiblemente en depsitos de agua y los
criaderos son variados, constituidos por aguas con un alto grado de
contaminacin, abundante contenido de materia orgnica, con detritos en proceso
de fermentacin y en ambientes sombreados cercanos al ambiente domiciliario,
(58, 59).
Debido a su antropofilia acentuada, la resistencia a los insecticidas, su capacidad
vectorial y a las altas densidades que puede llegar a alcanzar, Culex
quinquefasciatus es un factor de riesgo para las poblaciones urbanas. Por tanto, el
conocimiento de los aspectos biolgicos, fisiolgicos y bioqumicos de la especie
se constituyen en el primer paso que conlleva a la implementacin de medidas
que conduzcan al control de las poblaciones de mosquitos en las reas urbanas,
(58, 59, 60).

Mosquito Aedes aegypti: El gnero Aedes (ver figura 9) comprende muchas


especies de mosquitos de distribucin cosmoplita. Viven en agujeros en los
rboles, o en estanques transitorios de agua dulces o corrientes. Muchas
especies de Norte Amrica producen picaduras molestas. Ciertas especies
pueden actuar como transmisores de fiebre amarilla, dengue, wucheriasis y
encefalitis viral, (55, 56).

FIGURA 9. MOSQUITO DEL GENERO AEDES

Se caracteriza por sus hbitos intradomiciliarios, asociado directamente al hombre.


Sobre este mosquito han sido numerosos los estudios que se han realizado desde
que J. Finlay en el siglo XIX, lo describiera como el agente trasmisor de la fiebre
amarilla. Hoy se sabe que est asociado con la transmisin de dengue, en sus

34
formas clsica y hemorrgica. Desde 1947, cuando se lanza el Programa
Continental de Erradicacin del mismo, hasta 1980, este vector se haba eliminado
de la mayora de los pases de la regin, (61).

Actualmente, el transporte pasivo de la especie, que el hombre efecta por va


area, martima y terrestre de huevos, larvas y adultos de este culcido, lo ha
difundido, con consecuentes epidemias de dengue en la mayora de los pases
reinfectados, (61, 62).

Anopheles: Las abundantes espcies de Anopheles (Ver figura 10) varan mucho
en cuanto a el hbitat, encontrandose en campo abierto, reas boscosas,
comunidades urbanas o rurales y a diversas altitudes. Las diversas especies
tienen muchas variaciones en cuanto a preferencias de hbitat, por lugares
sombrios o soleados, aguas dulces o muy saladas, estancadas o de corrientes
moderadas, tambin con amplios lmites en contenido de oxgeno libre. Los
mosquitos anofelinos son los nicos transmisores del paludismo transmiten las
filariasis de Bancroft y de Malaya, (55, 56).

FIGURA 10. MOSQUITO DEL GENERO ANOPHELES

Es considerado como un vector primario de malaria en las Amricas. Dada su


importancia mdica ha sido necesario profundizar en el conocimiento de su
bionoma, en especial sobre la ecologa de sus criaderos, para detectar factores
vulnerables que permitan utilizar esta informacin en la planificacin de medidas
de control, (63, 64, 65).

35
Esta especie se reproduce en una gran diversidad de hbitats acuticos. La
calidad del agua va desde clara a moderadamente turbia, puede ser salobre o
fresca, relativamente limpia o con moderada polucin y la vegetacin en sus
criaderos es diversa, (63).

4.2.2. LA ARTEMIA SALINA O BRINE SHRIMPS Y SU CLASIFICACION

FIGURA 11. ARTEMIA SALINA

El "camarn de salmuera" o "brine shrimp", conocido como Artemia LEACH, es el


crustceo anostrcodo usado durante aos como modelo para realizar
investigaciones en disciplinas bsicas y/o aplicadas. El gnero Artemia agrupa
especies que viven y se reproducen en ambientes hipersalinos continentales o
costeros alrededor del mundo, excepto en la Antrtica, (66, 67).

La clasificacin sistemtica de la Artemia hasta el nivel de gnero es dado por


Flssner (1972), (67):

Clase: Crustacea
Subclase: Branchiopoda
Super Orden: Anostraca
Familia: Artemiidae
Gnero: Artemia

36
Originalmente la Artemia salina ha sido descrita como la nica especie dentro del
gnero Artemia. Y desde el principio del siglo 20 investigaciones citolgicas y
genticas complementaron los mtodos tradicionales de clasificacin basados en
aspectos morfolgicos. El gnero Artemia ha sido dividido en 6 especies
hermanas, (67, 68):

-Artemia salina Lymington, Inglaterra (actualmente extinta)


-Artemia tunisiana Europa
-Artemia franciscana Amrica (Norte, Central y Sur)
-Artemia persimilis Argentina
-Artemia urmiana Iran
-Artemia monica Lago Mono, California-EUA.

4.2.2.1. DISTRIBUCION DE LA ARTEMIA SALINA

Hasta hoy se conoce que la Artemia se encuentra en casi 400 sitios esparcidos
sobre los cinco continentes. Su amplia distribucin es atribuida a la dispersin
natural por el viento o por aves migratorias y/o introduccin deliberada realizada
por el hombre con fines comerciales. Estos hbitas presentan caractersticas
climatolgicas, ecolgicas y fisico-qumicas particulares, las cuales se reflejan en
variaciones en rasgos de la historia de vida, plasticidad fenotpica y/o
heterogeneidad gentica, (66).

En poblaciones permanentes la Artemia est presente durante todo el ao o


sobrevive a condiciones ambientales o climatolgicas adversas en un estado de
proteccin bajo la forma de quistes o huevos latentes. Poblaciones no
permanentes de Artemia no pueden vencer condiciones ambientales o
climatolgicas adversas y el hombre tiene la necesidad de reintroducir nuevas
poblaciones sobre una base anual, (66, 69).

37
La Artemia es un filtrador no-selectivo y se alimenta filtrando materia particulada
de origen biolgico (detritus orgnico de aguas de manglares) as como tambin
de organismos vivos de tamao apropiado (bacterias y algas microscpicas). De
hecho debido a la ausencia de predadores y competidores por alimento, la Artemia
frecuentemente se desarrolla en grandes monocultivos, y las densidades son
principalmente controladas por la limitacin de alimento. La reproduccin
ovovivpara (nauplios como descendencia) ocurre mayormente en niveles de baja
salinidad, considerando que los quistes (reproduccin ovpara) son producidos en
salinidades ms all de 150 ppt, (67, 69).

4.2.2.2. CICLO DE VIDA DE LA ARTEMIA SALINA

El camarn de salmuera posee la propiedad de reproducirse de dos maneras


diferentes. Dependiendo de las condiciones ambientales ya sea larvas de libre
natacin (ovoviviparidad) o quistes o huevos latentes (oviparidad). La Artemia es
capaz de sobrevivir condiciones ambientales extremas. Con la interrupcin de la
condicin de diapausa y con la transferencia de los quistes a condiciones ptimas
de incubacin, (67).

La primera etapa larval de la Artemia (liberada como tal por ovoviviparidad


reproduciendo hembras o incubando fuera de los quistes), tambin llamada Instar
I, tiene un color castao-anaranjado y cuyas medidas promedian 0,5 mm de
longitud. Los aspectos tpicos de esta etapa son los 3 pares de extremidades en la
regin frontal, cada una de ellas con funciones especficas: las primeras antenas
(o antnulas teniendo una funcin sensorial), las segundas antenas (con funcin
locomotora y filtradora) y las mandbulas (con funcin de captura de alimento), (67,
70).

38
La larva Instar I es incapaz de tomar el alimento, ya que su sistema digestivo no
es an funcional (la boca y el ano estn todava cerrados). Despus de alrededor
de 12 horas el animal muda en la segunda etapa larval (Instar II). A partir de esta
etapa el sistema digestivo es funcional y pequeas partculas de tamao que
oscilan entre 1-40 mm pueden ser ingeridas (clulas de algas, bacterias, detrito),
(67).

La larva de Artemia crece a la etapa adulta mediante una serie de 15 mudas.


Durante este desarrollo larval las extremidades en la regin frontal continuamente
se diferencian resultando en, la reduccin gradual de las mandbulas larvales,
finalmente reemplazadas por las mandbulas del adulto y por un dimorfismo sexual
de las segundas antenas. En los machos stas se desarrollan en agarraderas
musculares en forma de gancho que desempearn en el futuro un rol pre-
copulatorio. Las antenas de las hembras se degeneran en pequeos apndices
sensoriales, (67, 71).

En la Artemia adulta el aparato filtrador alimentario de la larva es reemplazado por


las maxilas, las maxilulas y 11 pares de toracpodos que se desarrollan en la
regin del tronco. Las ltimas estructuras son multi-funcionales y juegan un rol no
solamente en la captacin alimentaria pero tambin en la locomocin y
respiracin, (67).

Dependiendo de la cepa y de las condiciones ambientales, la etapa de actividad


reproductiva se alcanza en un perodo de crecimiento de 2 a 3 semanas. La
Artemia adulta posee entonces una longitud 10-20 mm (los animales ms grandes
son encontrados dentro de las poblaciones partenogenticas), (70, 71).

Los machos tienen un par de penes en la parte posterior de la regin del tronco
mientras que las hembras pueden ser fcilmente reconocidas por el distintivo saco
embrionario o tero que se ubica inmediatamente detrs el undcimo par de

39
toracpodos. El par de ovarios se sitan detrs los toracpodos sobre ambos
lados del tracto digestivo lineal, (67, 68).

La pre-copulacin en la Artemia bisexual madura es iniciada por el macho con el


apego a las hembras con sus agarraderas musculares. En esta "posicin de
equitacin" los animales pueden nadar conjuntamente por largos perodos de
tiempo mientras ellos mueven sus toracpodos en un golpe sincrnico. La real
copulacin con la consecutiva fertilizacin consiste de un rpido reflejo del macho
en doblarse hacia adelante e introduciendo un pene en la apertura del tero. En la
Artemia partenogentica (poblaciones hembras) la fertilizacin no tiene lugar y el
desarrollo embrionario comienza tan pronto como los huevos alcanzan el tero,
(67, 68, 71).

A continuacin se presenta el ciclo de vida de la Artemia salina figura 12.

FIGURA 12. CICLO DE VIDA DE LA ARTEMIA SALINA, (71).

40
4.2.2.3. LA IMPORTANCIA DE LA ARTEMIA SALINA EN LAS
INVESTIGACIONES.

Actualmente, la Artemia se utiliza como especie de bioensayo para una variedad


de objetivos tales como:
Investigacin de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias qumicas y
muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias qumicas,
deteccin de toxinas naturales en comestibles y farmacuticos, estudios de
modelos de accin txica de sustancias, y estudios de la transferencia trfica de
contaminantes (72).

El potencial de Artemia para investigacin y aplicaciones en toxicologa acutica


se ha explorado desde 1975 en el Laboratorio de Investigacin Biolgica en
Toxicologa Acutica de la Universidad Estatal de Ghent, Blgica. En 1981 se
desarroll el primer ensayo estandarizado de ecotoxicologa marina: el ensayo
ARC (Agencia de Residuos de Catalunya), que es un ensayo de 24 (horas de 48)
horas para determinar la concentracin letal media (CL50) en nauplios de nstares
II y III. La confiabilidad y precisin de este ensayo fue investigada durante un
extenso ejercicio de calibracin involucrando a 80 laboratorios americanos y
europeos, dando resultados muy satisfactorios. La experiencia obtenida desde
entonces ha abierto el camino para mejorar uno de los ensayos de tamizaje ms
sencillos, ms reproducible y rentable en toxicologa acutica, (72).

41
4.3. ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LAS ACETOGENINAS DE ANNONACEAE

Las acetogeninas de Annonaceae son sustancias que poseen dos importantes


actividades biolgicas, actividad citotxica y actividad biopesticida (ver tablas 6 y
7); en la citotxica se inhibe la enzima NADH en el complejo I en la cadena
respiratoria mitocondrial, esta accin agota el ATP e induce en las clulas una
muerte programada (apoptosis), se ha demostrado que las acetogeninas buscan
selectivamente las clulas cancergenas para atacarlas y las clulas normales
permanecen intactas, (73, 74).
La actividad biopesticida adems de ser favorable para el medio ambiente, es una
herramienta til para los cultivos donde no se puede fumigar, (75, 76, 78).

TABLA 6. ACETOGENINAS DE ANNONACEAE CON ACTIVIDAD BIOLOGICA


BIOPESTICIDA, (16, 75, 76, 77, 78).
ANNONACEAE ACETOGENINAS AISLADAS

Annonacina
Annona muricata Corossolina
(Semillas) Corossolona
Diepomuricanina
Gigantetrocina
Gigantetrocina A
Gigantetriocina
Muricatetrocina
Muricatetrocina A
Murisolina
Rolliniastatina 1
Guanbana Rolliniastatina2
Solamina

42
Annona squamosa
(Corteza)
Nombre comn o vulgar: Ann, Bullatacina
Annona, Annona blanca, Annona del Bullatacinona
Per, Rin Squamona
El Ann es una fruta parecida a la
chirimoya, con escamas exteriores
muy pronunciadas.

Annona squamosa
(Semillas)

Annonacina
Annonacina A
Annonastatina
Annonin VI
Annonin I
Asimicina
Bullatalicina
Bullatanocina
Neoannonina

43
Asimina triloba
(Corteza-Tallo) Annonacina
Cis-Annonacina-A-one
Trans-Annonacina-Aone
Asimicina
Bullatacina
Bullatacinona
Cis-Gigantetrocinona
Tran- Gigantetrocinona
Squamocina
Trilobacina

Las acetogeninas que tienen mayor actividad biolgica biopesticida son el


resultado de diferentes estudios en laboratorios; concluyendo entonces que las
acetogeninas ms importantes para este tipo de actividad son las que se
presentan en la tabla 7, (16, 22, 42),

Tambin algunos estudios realizados con acetogeninas de Annonaceae en


organismos modelos (mosquitos (Diptera:Culicidae) y Artemia salina); y su efecto
en un mosquito como es el Aedes aegypti demuestra el gran potencial insecticida
que poseen estos compuestos naturales (Ver tablas 8 y 9), (45).

44
TABLA 7. ACETOGENINAS CON MAYOR ACTIVIDAD BIOPESTICIDA (16,
22,42).

ACETOGENINAS ESTRUCTURAS

ACETOGENINAS
DEL TIPO OH
CH3
ASIMICINA O
H3C O
Bullatacina o O

Asimicina, OH OH
O
Rolliniastatina-1,
Rolliniastatina-2.

OH

O
SQUAMOCINA CH3
O
O CH3 CH3
HO O

OH OH

CH3
H3C O
O O
ANONACINA
OH O

45
TABLA 8. ESTUDIOS REALIZADOS CON ACETOGENINAS DE ANNONACEAE
EN ARTEMIA SALINA Y MOSQUITOS (DIPTERA:CULICIDAE).

EXTRACTOS ORGANISMO OBJETIVO REFERENCIA


MODELO BIBLIOGRAFICA

Acetogeninas Realizar ensayos


Tripoxyrollin, Artemia salina citotoxicos in vitro (79)
scuamocin y sobre lineas
rolliniastatin-2. celulares KB y
VERO.

Extractos de Demostrar la
Annona muricata, Culex accin larvicida de
Ambrosia quinquefasciatus diferentes (59)
artemisiaefolia y extractos sobre el
Annona squamosa mosquito Culex
quinquefasciatus.

Evaluar la
toxicidad larvicida
de suspensiones
Extractos de Aedes aegypti acuosas de
Annona muricata extractos de las (80)
semillas, flores,
hojas, corteza de
ramas y corteza
de raices de la
annona muricata.

46
Extractos de Larvas del IV Estudiar el efecto
semillas de Estadio de bioinsecticida de
Annona cherimolia Anopheles ambos extractos (81)
y Annona muricata sobre larvas del IV
estadio de
Anopheles.

47
TABLA 9. DIFERENCIA ENTRE MOSQUITOS SANOS
Y AFECTADOS POR LA ACETOGENINA ANONACINA, (45).

En la pupa normal se desarrollan las


alas, patas y dems rganos del
mosquito del dengue. Las larvas normales tienen el cuerpo
arqueado, son semitransparentes y
tienen la cabeza pegada al trax.

La anonacina provoca que la pupa


deje al descubierto las partes internas
de su cuerpo y no alcance a
completar su ciclo de desarrollo. Despus de exponerla a la anonacina
la larva se rigidiza, la cabeza se
separa del trax y la infeccin por la
sustancia ennegrece su cuerpo.

48
5.0 PROTOCOLOS

A continuacin se presenta una serie de protocolos resultado de una bsqueda en


diferentes fuentes, incluyendo entrevistas personales con investigadores de varias
universidades del pas, donde se vienen haciendo pruebas de actividad biolgica.

5.1. PROTOCOLOS CON ARTEMIA SALINA

5.1.1. PROCEDIMIENTO DEL LABORATORIO UNAL-DEPARTAMENTO DE


QUIMICA, GRUPO DE PRODUCTOS NATURALES, (82).

5.1.1.1. Incubacin de huevos para la obtencin de larvas:

Utilizar el sustrato de Artemia salina; huevos que se consiguen en el mercado en


las tiendas de alimentos para peces, se debe preparar agua de mar artificial, esta
agua de mar artificial se prepara, pesando 38 gramos de sal marina por litro de
agua y se filtra, con doble papel o con membrana, (filtrar 2 veces), (82).

Colocar 200mg de huevos en agua de mar a temperatura ambiente a un lado de


las divisiones del tanque y tapar ese lado (Ver figura 13); a las 24 horas
comienzan a eclosionar las larvas; se pueden utilizar mximo hasta la 48 horas, ya
que despus de pasado este tiempo las larvas comienzan a morir de hambre, (82).

49
FIGURA13. TANQUE PARA HUEVOS DE ARTEMIA

Permitir el transcurso de 2 das para la maduracin de los brine shrimps (Ver


figura 14), (82).

FIGURA 14. MADURACION DE BRINE SHRIMPS

50
5.1.1. 2. Preparacin de extractos y adicin de larvas:

Se debe pesar 20mg del extracto a evaluar la cual se disuelve en un vial de boca
ancha, agregar 2mL de solvente el cual puede ser: etanol, metanol, hexano o
clroroformo, depende del extracto a usar; esta solucin de (20mg/2mL) se
reparten en los viales que estn agrupados de a tres (Ver figura 15), en los
cuales se deben tener tres concentraciones y un control, (82).

FIGURA 15. VIALES AGRUPADOS DE A TRES

Concentracin 1: colocar 0.5mL de la solucin patrn.


Concentracin 2: adicionar 50 L de la solucin patrn.
Concentracin 3: en cada uno de los viales adicionar 5 L de la solucin patrn.
Dejar evaporar el solvente; 2 das despus al tener las larvas eclosionadas, se
hace el bioensayo de la siguiente manera:

Colocar 20 L de dimetilsulfoxido en todos los viales (tambin en los


controles). El dimetilsulfoxido se agrega porque es soluble en agua y
ayuda a la disolucin, a que los compuestos del extracto pasen a la
solucin acuosa, es decir crea una interfase.
Adicionar 2mL de agua de mar a cada vial.
Sacar las larvas del tanque, filtrar, (82).

51
Contar 10 larvas o nauplis las cuales se separan y se decantan de las
cscaras con ayuda de una pipeta pasteur y un vaso de precipitado,
(82).

Adicionar las larvas en cada vial (minimo 10 larvas) y llevar a un


volumen de 5mL (completar con agua de mar), dejar a temperatura
ambiente por 24 horas, (82).

5.1.1. 3. Anlisis de mortalidad de las larvas:

Se evala el nivel de mortalidad utilizando cajas de petri pequeas, se vierten all


los contenidos de los viales y se espera que estos se estabilicen (Ver figura 16)
(se lavan los viales con agua de mar para asegurarse de que todas las larvas
salgan del vial a la caja de petri). Hacer una observacin frente a una luz para
evaluar la movilidad de las larvas. Contar las larvas vivas y muertas, (82).

FIGURA 16. EVALUANDO MOVILIDAD DE LARVAS

Analizar los datos con un programa de computador para de terminar los valores
del DL50 (Ver anexo 3 y 4), (82).

52
5.1.2 PROCEDIMIENTO DE LA UNIVERSIDAD DEL QUINDIO, (83).

5.1.2.1. Incubacin de huevos para la obtencin de larvas:

Se adecua un recipiente plstico, de tal forma que quede dividido en dos


secciones por un tabique del mismo material al cual se le acondicionan pequeos
agujeros, la mitad del recipiente se oscurece con papel carbn en su exterior. Se
agregan, en la parte oscura del recipiente, aproximadamente 0.1 gramos de
huevos de Artemia salina por cada litro de solucin salina, la cual se prepara
disolviendo 38 gramos de sal marina en un litro de agua potable comercial; la
utilizacin de agua comercial en lugar de agua destilada se debe al bajo nivel de
DO (Oxigeno Disuelto) en el agua destilada, la cual para su obtencin es sometida
a un fuerte proceso de destilacin que elimina la mayor parte del oxgeno disuelto
en ella; este cambio permite eliminar del procedimiento el suministro de aire a
travs de bombas. A las 48 horas a temperatura ambiente e iluminacin constante
las larvas de Artemia salina Leach son tomadas de a diez para someterlas a las
diferentes concentraciones de los extractos con la ayuda de una pipeta pasteur,
(83).

5.1.2.2. Preparacin de extractos y adicin de larvas:

A partir del residuo seco del extracto obtenido de la especie vegetal, se prepara
con agua destilada un patrn de 1000 mg de extracto por litro de solucin, del cual
se preparan ocho diluciones de 6, 10, 24, 50, 100, 240, 500 y 1000 ppm de
concentracin. Se adiciona un mililitro de cada dilucin de extracto en un vial, se
transfirieren diez larvas de Artemia salina, tomadas con una pipeta pasteur, en
aproximadamente un mililitro de solucin salina y se completa hasta cinco mililitros
con la misma solucin salina en la que estaban las larvas, paralelamente se
prepararan cinco blancos por dilucin de extracto de la siguiente forma: se toman
10 larvas en un vial y se completa el volumen de cada uno a 5 mililitros con
solucin salina en la cual estaban las larvas. Se incuban los tubos a la luz de una
bombilla durante 24 horas, al cabo de los cuales se cuenta el nmero de larvas
muertas en cada tubo, despus de este primer conteo se dejan los viales en las

53
mismas condiciones y se cuentan las larvas muertas al cabo de 48 horas de
sembradas, (83).

5.1.2.3. Anlisis estadstico:

Con los datos obtenidos se determina la DL50 con el 95% de confianza utilizando
el mtodo Probit, (83).

54
5.1.3 PROCEDIMIENTO DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA,
(84).

5.1.3.1. Cultivo de las Larvas de Artemia salina:

Colocar los huevos dentro de un recipiente plstico de 11.3 cm de alto, 9.5 cm de


largo y 10.5 cm de ancho, luego agregar una solucin de agua de mar preparada
en el laboratorio con 37g de sal de mar y 1litro de agua destilada, cubrir el
recipiente con una tapa que tiene en el centro un orificio de un dimetro de 4 cm.
El agua debe llegar hasta este orificio. Se coloca aireacin al recipiente utilizando
una de las salidas de aire en el laboratorio, a la cual se le conecta un tubo plstico
y su extremo se une a un filtro poroso que se coloca dentro del recipiente para
cultivo de las larvas, (84).

5.1.3.2. Adicin de larvas:

Se toma un frasco plstico cilndrico de 7.5 cm de alto, 4.7 cm de dimetro, color


transparente y con tapa plstica que tiene un orificio en el centro de 0.5cm, el cual
contiene agua de mar y se coloca invertido dentro del orificio de la tapa del
recipiente donde se colocaron los huevos de Artemia salina; 48 horas despus se
inicia la recoleccin de las larvas, utilizando una pipeta Pasteur 5 pulgadas se
toman larvas del recipiente de recoleccin y se colocan en un acuario (tubo de
vidrio tapa rosca de 8ml de capacidad, 6 cm de alto y con un dimetro de 1.2cm)
que contiene 5ml de agua de mar, (84).

5.1.3.3. Anlisis estadstico:

Se colocan 10ml de la solucin del compuesto a probar y se hace lectura a las 24


horas, (84).

55
5.2 PROTOCOLOS CON MOSQUITOS

5.2.1 PROCEDIMIENTO #1 PARA LA EVALUACIN DE TOXICIDAD CON


MOSQUITO CULEX. QUINQUEFASCIATUS, (85).

5.2.1.1. Cra del mosquito Cx. quinquefasciatus:

Para iniciar la cra se colectan huevos, larvas y pupas del mosquito Cx.
quinquefasciatus en estanques con agua sucia y en floreros, se deben colocar en
bandejas de plstico (47x35x12 cm) con agua, para su desarrollo en el laboratorio.
Las pupas formadas se colectan diariamente y se depositan en una bandeja de
plstico (24x19x9 cm) con agua. La bandeja con pupas se introduce en una jaula
entomolgica (60x60x60cm) y a los adultos emergidos dentro de sta se les
alimenta de dos maneras: con agua azucarada para los machos y adicionalmente
para las hembras se coloca un pollo (inmovilizado en una pequea jaula) como
recurso hematofgico. Los huevos depositados en la superficie del agua, se
colectan diariamente y se colocan en bandejas de plstico (47x35x12 cm) con
agua para su eclosin. En estas bandejas se desarrollan las larvas, a las cuales se
les proporciona alimento para peces tilapia (Apitilapia nivel 1), previamente molido,
cada dos das. Al terminar el desarrollo larval y al formarse las pupas, se trasladan
a jaulas de emergencia de adultos, para as continuar cotidianamente con todas
las actividades de cra de Cx. quinquefasciatus con la finalidad de disponer
constantemente de larvas de cuarto estadio larval para efectuar los bioensayos,
(85).

5.2.1.2. Preparacin de extractos y adicin de larvas:

La poblacin de larvas de cuarto estadio temprano se concentran en una bandeja


con agua limpia y de ah se seleccionan grupos de 20 larvas para colocarlas en un
vaso de plstico de 150 mL de capacidad, al que previamente se le aaden 100
mL de agua. Posteriormente se aplica 1 mL de los extractos acuosos, aceites o

56
esencias. Al testigo no se le aplic ningn tratamiento. Para cada dosis evaluada
se utilizaron tres repeticiones, (85).

5.2.1.3. Anlisis estadstico:

A las 24 horas despus de la aplicacin de los tratamientos se observa la


mortalidad de las larvas, considerando muertas aquellas que no presente
movimientos normales, (85).

57
5.2.2 PROCEDIMIENTO #2 PARA LA EVALUACIN DE TOXICIDAD CON
LARVAS DEL IV ESTADIO DE ANOPHELES, (81).

5.2.2.1. Crianza de larvas:

La crianza de larvas se realiza en fuentes de porcelana de 40 x 28 x 5 cm con


agua potable declorinada reciclada interdiariamente. La alimentacin a base de
conejilla esterilizada a 80 C se agrega una vez por da proporcional al nmero de
larvas criadas (81).

5.2.2.2. Preparacin de extractos y adicin de larvas:

Se utilizan 825 larvas y se someten a tres repeticiones con 25 especmenes por


repeticin. A los grupos experimentales se les agrega 0,01; 0,05; 0,1; 0,8 y 1,2 mL
de los extractos, respectivamente, aforados hasta 100 mL en agua destilada
contenida en vasos de tecknopor de 250 mL de capacidad. Todos los grupos se
mantienen con un rango de temperatura entre 23 y 26 C y humedad entre 75 y 80
%, (81).

5.2.2.3. Evaluacin de la mortalidad y anlisis estadstico:

Las lecturas de mortalidad se realizan a la 1, 6, 12, 24, 36 y 48 horas. Las larvas


se consideran muertas cuando no reaccionan al momento de ser tocadas con un
puntero romo en la regin cervical. Los clculos de la mortalidad corregida se
realizan mediante la frmula de Abbott en caso de muerte natural en el grupo
testigo cuando ste es menor al 10%. Las concentraciones letales al 50% (CL50) y
90% (CL90) y los tiempos letales al 50% (TL50) y 90 % (TL90), as como los valores
de las pendientes con sus limites de confianza, coeficientes de determinacin y
valores "i" cuadrado (c2) se determinan utilizando el programa Probit, (81).

58
5.2.3 PROCEDIMIENTO #3 PARA LA EVALUACIN DE TOXICIDAD CON
MOSQUITO CULEX. QUINQUEFASCIATUS , (82).

5.2.3.1. Crianza de las larvas:

Tomar las larvas y colocarlas en una jaula de madera (Ver figura 17) de 60cm x
60cm x60cm que esta cubierta con nylon en unas bandejas con agua y un
algodn empapado en agua con azcar (Ver figura 18). A los dos o tres das las
hembras ovipositan sobre el agua formando unas balsitas, se llaman balsitas
porque flotan, (82).
FIGURA 17. MOSQUITERO

FIGURA 18. ALGODN CON AZUCAR

59
Colocar las balsitas en vasos de icopor de 1 litro y llenar bien con agua de la
llave, encima se debe colocar una galleta de perro molida para las larvas, las
larvas comienzan a eclosionar alrededor de 2 o 3 das, presentan respiracin
aerbica; estas salen a la superficie a tomar aire y luego bajan, permaneciendo
en continuo movimiento, de arriba a bajo, (82).
Se dejan all, mas o menos el ciclo hasta el 4 periodo, el ciclo es de 21 das, luego
se registra la fecha de inicio y su crecimiento, (82).

5.2.3.2. Preparacin de extractos y adicin de larvas:

Utilizar una placa de 96 posos, esta placa de 96 posos emplea 8 larvas como
replica y las concentraciones que usa varan mas o menos desde 5000, 500, 50,
5.0 y 0.5 ppm, segn la disponibilidad de muestra y se usa un control. Por cada
placa de 96 pozos se debe poner dos muestras; el pozo tiene un volumen de 250
L de los cuales se colocan 240L de agua y 10 L de la muestra; los 10 L de
muestra debe dar por dilucin las diferentes concentraciones que se quiere aplicar
de la solucin madre de 10000 ppm que se deja al 1% (la solucin madre tiene
solventes orgnicos involucrados, estos se dejan evaporar ya que cualquier traza
de cloroformo o de hexano mata la larva); luego se toman las larvas con una
pipeta pasteur larga y se adiciona una larva en cada poso, (82).

5.2.3.3. Anlisis de mortalidad:

Hacer una lectura a las 48h y medir la mortalidad, utilizar el programa Probit (ver
anexo 3 y 4) para evaluar la concentracin efectiva para matar el 50% de la
poblacin, (82).

Si se obtienen muestras promisorias se debe hacer el protocolo de la


Organizacin Mundial de la Salud (OMS), (82).

60
Protocolo de la OMS:

Este protocolo exige colocar 249 ml de agua con 1 mL de muestra en un


erlenmeyer de 500mL al cual se le adiciona 20 o 30 larvas (por cada erlenmeyer
se hace una triplicacin respectivamente, mnimo 3), esto tiene la desventaja
principal de que consume mucha muestra, al gastar para cada erlenmeyer 1 mL
de la solucin que debe ser bastante concentrada, ya que esto es necesario
porque al diluir ese mililitro 250 veces debe quedar una relacin lgica del orden
de 100ppm, y poderse dar un rango determinado alrededor de este, para que as
este pueda ser til. Tambin se hacen lecturas de mortalidad a las 24 y 48 horas.
(82).

61
5.3. PROTOCOLOS RECOMENDADOS PARA EVALUAR POSIBLE ACTIVIDAD
BIOLGICA BIOPESTICIDA.

5.3.1. Diagrama De Flujo #1: Bioensayo Preliminar Con Artemia salina, (82).

Crianza De Larvas:

Un recipiente plstico y dividirlo en


dos secciones con un tabique del
ADECUAR mismo material.

Agua de mar artificial pesando 38


gramos de sal marina por litro de agua
PREPARAR destilada, filtrar 2 veces o con
membrana. Adicionarla al recipiente de
plstico.

Aproximadamente 200mL de huevos de


Artemia salina a temperatura ambiente
AGREGAR a un lado de las divisiones del tanque o
recipiente, y tapar ese lado.

El transcurso de 2 das para la


PERMITIR maduracin de los brine shrimps

62
Preparacin de Extractos:

20mg del extracto a evaluar el cual se


PESAR disuelve en un vial de boca ancha.

2mL de solvente el cual puede ser: etanol,


metanol, hexano o clroroformo, depende del
extracto a usar.
AGREGAR

Concentracin 1: 0.5ml de la solucin patrn en


cada uno de los tres primeros viales.

PREPARAR Concentracin 2: 50 L de la solucin patrn en


cada uno de los tres segundos viales.

Concentracin 3: 5 l de la solucin patrn en


cada uno de los ltimos tres viales.

Estos viales rotulados a temperatura


DEJAR ambiente en una cesta, se debe dejar
evaporar el solvente.

Un control por dilucin de extracto de la


PARALELAMENTE siguiente forma: tomar 10 larvas en un vial
PREPARAR y completar el volumen con 5 mL de
solucin salina.

63
Adicin de Larvas:

En todos los viales 20 L de


COLOCAR
dimetilsulfoxido (tambin en los
controles).

2ml de agua de mar


ADICIONAR aproximadamente a cada vial.

10 larvas o nauplis que se


separan y se decantan de las
cscaras con ayuda de una
CONTAR
pipeta pasteur y un vasito de
precipitado

Las larvas en cada vial (minimo 10


ADICIONAR larvas) y llevar a un volumen de 5ml
(completar con agua de mar). Esto
frascos de a tres y sus controles se dejan
a temperatura ambiente por 24 horas.

A las 24 horas el nivel de mortalidad y


utilizar cajas de petri pequeas, all se
vierten los contenidos de los viales y
EVALUAR se espera que estos se estabilicen, se
lavan los viales con agua de mar para
asegurarse de que todas las larvas
salgan del vial a la caja de petri.

64
Anlisis De Mortalidad:

Una observacin frente a una luz para


HACER evaluar la movilidad de las larvas.
Contar las larvas vivas y muertas

Los datos en el programa Probit para


ANALIZAR de terminar los valores del LC50.

65
5.3.2. Diagrama De Flujo #2: Bioensayo Especfico Con El Mosquito Culex.
quinquefasciatus, (82).

Se recomienda evaluar actividad con el mosquito Culex quinquefasciatus pues los


bioensayos con Anopheles se realizan en FIDIC (Fundacin-Instituto de
Inmunologa de Colombia) y lo bioensayos con Aedes aegypti los realizan en la
Universidad del Quindo.

Crianza de Larvas:

Moscos adultos y las hembras


COLECTAR con sus huevos.

Las larvas, ponerlas en frascos plsticos y


colocarlas en una jaula de madera que
esta cubierta con nylon; esta tambin
tiene una manga para el manejo de los
TOMAR insectos. La jaula es de 60cm x 60cm
x60cm, en esta se colocan bandejas con
agua.

Un algodn empapado de agua con


azcar en la jaula. A los dos o tres das
COLOCAR las hembras ovipositan sobre el agua
formando unas balsitas.

66
GUARDAR Las balsitas en la nevera.

Las balsitas en vasos de icopor


de 1 litro y llenar bien con agua
PONER de la llave.

Una galleta de perro molida para


las larvas; las larvas comienzan a
ADICIONAR eclosionar alrededor de 2 o 3 das.

Las larvas all, mas o menos el ciclo


hasta el 4 periodo, el ciclo es de 21
DEJAR das, luego se registra la fecha de
inicio y su crecimiento.

Preparacin De Extractos Y Adicin De Larvas:

La placa de 96 pozos con un volumen de


UTILIZAR
250 L, esta placa utiliza 8 larvas como
replica y las concentraciones que usa
varan mas o menos desde 5000, 500,
50, 5.0 y 0.5 ppm, segn la
disponibilidad de muestra.

67
240L de agua y 10 L de la muestra, los
10 L de muestra deben ser las
ADICIONAR diferentes concentraciones que se quiere
aplicar de la solucin madre de 10000
ppm que se deja al 1%.

Una larva en cada pozo; se dejan


inmvil en ese instante.
AGREGAR

Anlisis De Mortalidad:

Una lectura a las 48h y evaluar la


HACER
movilidad de las larvas. Contar
las larvas vivas y muertas.

El Probit para evaluar la


UTILIZAR concentracin efectiva para
matar el 50% de la poblacin.

68
6.0 DISCUSIN GENERAL

Debido al aumento de la resistencia de los mosquitos vectores de enfermedades a


los insecticidas qumicos, se viene incrementando la bsqueda de mtodos
alternativos como insecticidas naturales, por su bajo costo, capacidad de
biodegradacin, como elemento racionalizador en el uso de insecticidas qumicos
y por su menor impacto ambiental. Estos insecticidas naturales, provienen de
plantas como: Equincea (Equincea angustifolia), Hisopo (Hisopus officinalis),
Lavanda (Lavandula officinalis), Poleo (Mentha pulegium), Albahaca (Ocimun
basilicum), Artemisa (Ambrosia manensis), Salvia (Salvia officinalis), Neem
(Azadirachta indica) y especies de la familia anoncea, (48, 49, 81).

Particularmente en la familia de las Annonaceae se han reportado compuestos de


gran bioactividad, presentes principalmente en las semillas de la planta, esta
actividad es debida a compuestos conocidos como acetogeninas. Las especies
mas enriquecidas con estos compuestos son: Annona cherimola, Annona
muricata, Annona diversifolia, Annona purpurea, Annona squamosa, Annona
triloba y Annona reticulata, por contener acetogeninas con una potente actividad
anticancergena, antiparasitaria y pesticida, (2).

Colombia y Brasil son centro de origen de Annonaceae; Colombia posee


diferentes especies de las cuales se cultivan para su produccin, la Annona
muricata, la Annona cherimola y la Annona squamosa, y adems se han reportado
en forma silvestre la Rolina mucosa Bail, Annona colorada y la Atemoya (hibrido
no comercial), (9).

La especie de Annonaceae mas abundante en Colombia es la Annona muricata;


que ha comenzado a perfilarse en los ltimos aos como una alternativa para el
desarrollo sostenible en algunas regiones del pas (Tolima, Huila, Valle del Cauca,
Costa Atlntica, y Risaralda). El dato mas reciente encontrado de produccin de

69
guanbana en Colombia fue de 9600 toneladas, en un rea de 1.441 Ha, las
cuales estn distribuidas entre 10 departamentos (Antioquia, Bolivar, Cordoba,
Cundinamarca, Huila, Norte de Santander, Risaralda, Santander, Tolima y Valle),
siendo los mas grandes productores, Tolima (Faln, Guamo y San Luis) Y Valle
(Toro) con el 76% de la produccin total nacional, (Ver anexo 5), (86).
El principal uso de la guanbana (Anona muricata) en Colombia industrialmente es
para la elaboracin de jugos nctares, conservas, jarabes, helados, compotas,
dulces, sorbetes, concentrados, entre otros; sin embargo, se desechan su
cscara, semillas y hojas. Teniendo en cuenta los compuestos bioactivos que
estn presentes y que de las especies de annonaceae estudiadas por varios
autores, las mas enriquecidas en acetogeninas de actividad biopesticida
(Asimicina, Squamocina y Anonacina), se encuentran en las especies muricata,
triloba y squamosa, valdra la pena aprovechar estos deshechos principalmente de
las semillas para la obtencin de sus compuestos activos, iniciando como lnea de
investigacin en la Escuela de Tecnologa Qumica de la Universidad Tecnolgica
de Pereira, con la obtencin y evaluacin de extractos de semillas por contener la
mayor concentracin de compuestos activos y por ser el desecho mas importante,
(22, 42).

Por esta razn se elabor la presente documentacin y a partir del anlisis de esta
informacin, se propone como siguiente paso en una lnea de investigacin
encaminada al estudio y aprovechamiento de compuestos activos de Annonaceae,
iniciar con la obtencin de extractos de semillas como principal desecho; en este
proyecto se propone iniciar con la evaluacin de la actividad biopesticida de
extractos crudos por la facilidad de implementacin de los ensayos, puesto que la
actividad anticancergena y antiparasitaria implica un alto costo y requiere de
licencias; sin embargo, estas pueden evaluarse simultneamente en institutos
mdicos especializados y otras universidades.

Igualmente se propone un protocolo (ver anexo 6) para obtener un biopesticida


natural. Iniciando con la toma de muestras de semillas de la guanbana en las

70
industrias despulpadoras de la regin, seguido por su transporte a la Universidad
Tecnolgica de Pereira al Laboratorio de Oleoquimica, para la obtencin de
extractos con actividad biolgica siguiendo los protocolos previamente realizados
en investigaciones hechas por integrantes del grupo de Oleoquimica (referencia
bibliogrfica, 87) a los cuales se les realizara la caracterizacin qumica e
identificacin preliminar de los compuestos reportados por varios autores con
actividad biopesticida (Asimicina, Squamocina y Anonacina), utilizando
Cromatografa Liquida de Alta Resolucin (HPLC), comparando tiempos de
retencin relativos, contra perfiles reportados en la literatura de estudios previos y
la identificacin de compuestos nuevos utilizando tcnicas cromatografas y
tcnicas espectroscpicas (RMN, H, 13 C, IR, EM), (22, 23, 24).
La caracterizacin biolgica se realizara a partir de bioensayos con diferentes
organismos modelos, implementando en la UTP la Artemia salina como bioensayo
preliminar por ser un organismo verstil de fcil adquisicin y los mosquitos como
bioensayo especifico (Culex quinquefasciatus, Anopheles, y Aedes aegypti) por
disponibilidad, economa y por ser un organismo transmisor de agentes vectores
de enfermedades; se recomienda evaluar actividad con el mosquito Culex
quinquefasciatus pues los bioensayos con Anopheles se podran realizar en FIDIC
(Fundacin-Instituto de Inmunologa de Colombia) y lo bioensayos con Aedes
aegypti en la Universidad del Quindo. Igualmente seria importante realizar un
estudio minucioso de los costos de la investigacin y la elaboracin de estas
pruebas de actividad biolgica.

71
7.0 CONCLUSIONES

1. Las principales Annonas cultivadas en Colombia para su produccin son:


Annona muricata, Annona cherimola y Annona blanca.
As mismo en Colombia se genera una cantidad importante de semillas de
Annona muricata las cuales podran se aprovechadas por ser las mayores
proveedoras de compuestos bioactivos para la elaboracin de nuevos
productos naturales que contribuiran al aprovechamiento integral del fruto y al
cuidado del medio ambiente.

2. De acuerdo con los estudios de las acetogeninas de Annonaceae las de


mayor actividad biopesticida corresponden a la asimicina, esquamocina y
anonacina, que se encuentran presentes en la Annona muricata, lo que indica
que sera posible el aprovechamiento de las semillas para la obtencin de un
biopesticida.

3. Las pruebas de Actividad Biolgica con Organismos Modelos son base


fundamental para probar la potencia e inocuidad de muchas de las sustancias
biolgicas; y particularmente para acetogeninas de Anonceas se podra
implementar pruebas de actividad biolgica con Artemia salina y los Mosquitos
(Diptera: Culicidae) por su bajo costo y fcil adquisicin.

4. El mtodo ms viable para realizar las pruebas de actividad biolgica con


Acetogeninas de la familia Annonaceae con actividad biopesticida, es el
bioensayo preliminar con Artemia salina a pesar de ser un organismo sensible a
cambios de pH, temperatura, entre otros; y el bioensayo especfico con el
mosquito Culex quinquefasciatus para evaluar posible actividad bioinsecticida.

72
5. Es importante crear una investigacin encaminada a la evaluacin de la
actividad biolgica de las acetogeninas de Annonaceae como biopesticidas;
comenzando con el aprovechamiento de las semillas de desecho de las
industrias de pulpas existentes en Colombia.

73
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85
ANEXOS

86
ANEXO 1. MATERIAL Y REACTIVOS A UTILIZAR

Bioensayo Para La
Bioensayo Estndar De Evaluacin De
Toxicidad Con Artemia Toxicidad Con El Protocolo de la OMS
Salina Mosquito Culex.
quinquefasciatus
Recipiente plstico
dividido en dos Succionadores Pipetas
secciones
Papel carbn Jaula de madera de Erlenmeyers de 500ml.
60cm x 60cm x60cm.
38 gramos de sal marina Nylon Extracto de la Anoncea
Agua destilada Bandejas con agua Beakers
200 mg de huevos de Agua con azcar Pipeta pasteur larga
Artemia salina
Una lmpara Algodn

Matraz (segn las Vasos de icopor de 1


diluciones a realizar). litro.
Viales (segn las Una dog-cooke, (galleta
repeticiones a realizar). de perro) molida.

Set de microjeringas. Placa de 96 pozos.


Matraz (segn las
Beakers diluciones a realizar).
Extracto de la anoncea. Pipeta pasteur larga
Pipeta pasteur larga Set de microjeringas.

5
Cajas de petri pequeas Extracto de la anoncea.
Beakers.

ANEXO 2. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS MOSQUITOS


A continuacin se muestra una amplia descripcin de los mosquitos de la
Familia Culicidae.
TABLA 10. CARACTERISTICAS DE LOS MOSQUITOS, (51, 55, 56).

PHILUM: Artrpodos METAMORFOSIS COMPLETA


CLASE: Insecta Huevo
ORDEN: Dptera larva
FAMILIA: Culicidae pupa
SUBFAMILIA: Culicinae y adulto
Anophelinae
GENEROS: Aedes, Culex y
Anopheles

LOS HUEVOS SE CARACTERIZAN HUEVOS


POR:

Anopheles: presencia de flotadores,


impiden que se sumerjan.

Aedes: estructura poligonal,


aislados.

Pgina - 2 -
.

Culex: dispuestos en grupo, como


una corona balsa flotante.

Continuacin tabla 1.
LAS LARVAS LARVAS

(Estado evolutivo en que el insecto


se alimenta vorazmente con su
aparato bucal masticador) se
caracterizan:

Anopheles: ausencia de sifn


respiratorio, presenta una placa con
aberturas espiraculares, se disponen
paralelo a la superficie,.

Aedes: sifn respiratorio corto,


cuelgan con la cabeza hacia abajo
perpendicular a la superficie del
agua Culex Anopheles Aedes
,.
Culex: sifn respiratorio largo,

Pgina - 3 -
cuelgan con la cabeza hacia abajo
oblicuo respecto a la superficie del
agua.

LAS PUPAS
(estado evolutivo en el que el
insecto NO se alimenta) se
diferencian por las caractersticas de
las trompetillas.

Aedes: medianas en bisel.


Culex: largas, cilndricas, estrechas.
Anopheles: cortas.

Respectivamente, como estn en


las figuras.
Continuacin tabla 10.

Los mosquitos adultos se diferencian por la longitud de los palpos maxilares


respecto a la probscide.
Anophelinae: igual longitud que probscide.

Culicinae: machos largos e incurvados y las hembras cortos.

Pgina - 4 -
ESQUEMA CORPORAL DE UN MOSQUITO

ANEXO 3. PROGRAMA UTILIZADO (PROBIT)

PROGRAMA PROBIT:

La determinacin de la DL50, se utiliza para encontrar umbrales de toxicidad


para determinadas sustancias; en el desarrollo de pesticidas se utiliza para

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determinar los lmites de resistencia de insectos, por ejemplo, ante ciertos
biocida, (83).

En la investigacin fotoqumica valindose del principio de que farmacologa es


simplemente toxicologa a bajas concentraciones o toxicologa es farmacologa
a concentraciones altas se puede correlacionar la bioactividad con el valor de la
DL50 y al mismo tiempo su grado de toxicidad, (83).

La determinacin de la DL50 requiere de la estadstica cuantal, para lo cual es


necesario transformar los valores de respuesta obtenidos en unidades Anglit,
Logit o Probit y las dosis suministradas en unidades logartmicas conocidas
como dosis metamtricas, (83).

Existen algunos programas especializados que realizan este tipo de clculos


automticamente, pero su confiabilidad depende de la persona o institucin que
los haya desarrollado, (83).

ANEXO 4. DETERMINACION DE LA DOSIS LETAL DE UNA SUSTANCIA

DOSIS LETAL MEDIA (DL50):

Pgina - 6 -
La toxicidad de una droga puede medirse con el conocimiento de la dosis letal
50 (DL50), que es la dosis capaz de provocar la muerte del 50% de los animales
de laboratorio (88).

LA DOSIS EFECTIVA 50 (DE50)


Es por otra parte la dosis que produce los efectos deseados o teraputicos en el
50% de los pacientes u organismos (88).

DOSIS LETAL MNIMA (DLmin):


La menor cantidad de sustancia que introducida en el organismo produce la
muerte a algn animal de experimentacin bajo un conjunto de condiciones
definidas (88).
TABLA 11. DOSIS EFECTIVA MEDIA Y DOSIS LETAL MEDIA

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ANEXO 5. PRODUCCION DE GUANABANA EN COLOMBIA EN EL AO
2003.

Municipio rea sembrada Produccin Rendimiento


Ao 2003 (has) (Ton.) (kg/ha)

Antioquia 170 596 3.505

Bolvar 10 150 15.000

Crdoba 59 840 14.237

Cundinamarca 60 608 10.133

Huila 123 902 7.363

Norte de Santander 6 20 3.333

Risaralda 36 288 8.000

Santander 42 530 12.619

Tolima 557 4.991 8.962

Valle 335 3.380 10.084

Total Guanbana 1.398 12.305

Fuente: Secretarias de Agricultura Departamentales - URPASs, UMATAs,


Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, (86).

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ANEXO 6.

PROTOCOLO GENERAL PARA LA ELABORACIN DE UN


BIOINSECTICIDA NATURAL

Hacienda Calamar
Ubicada en la vereda la
Honda
Desechos de guanbana
(annona muricata)
preferiblemente semillas,
TOMA DE MUESTRAS en la regin.
Hacienda Halcones
Ubicada en la cadena
el Tigre va cerritos.

Al laboratorio de
Oleoquimica de la UTP
TRANSPORTE

En metanol, (Referencia bibliogrfica (87).


EXTRACCION

identificacin de Ascimicina, Squamocina y


Anonacina.
CARACTERIZACON Qumica

Identificacin de compuestos nuevos

Biolgica

Artemia salina Protocolo (5.3.1). UTP

Realizar bioensayos

Mosquito Culex Protocolo (5.3.2).


UTP
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ELABORACION DE
UN Mezclando con Anopheles y Aedes aegypti
BIOINCECTICIDA extractos de plantas Enviar extracto a otras Universidades
NATURAL sinrgicas. y Centros de Investigacin
ANEXO 7. CONDICIONES AMBIENTALES PARA EL MANTENIMIENTO DE
ORGANISMOS MODELOS:

Aire y ventilacin.

Las condiciones ambientales de temperatura, humedad, ventilacin, alumbrado


e interaccin con otros animales debern ser compatibles con las necesidades
de la especie en cuestin, contando con espacios al aire libre en casos en que
sean requeridos, (4).

Los ruidos y olores debern minimizarse dentro de lo posible.

Habrn de existir las instalaciones apropiadas para cadveres y desechos.

Los locales debern contar con las siguientes exigencias de aire y ventilacin:

La inyeccin de aire debe realizarse en los ngulos superiores de los


locales y la extraccin en los inferiores, (4).

Los locales en su interior deben poseer presin positiva de aire respecto


a los pasillos y/o reas exteriores, (4).

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En caso de poseer un bioterio doble pasillo con locales centrales
(Circulacin limpia y sucia), el gradiente de presin ser del limpio al sucio, (4).

Temperatura y humedad.

Las exigencias de temperatura y humedad, son:

Para roedores de 20 2 C.-


La humedad relativa ambiente oscilar entre 40 y 70%, (4).

Intensidad y tipo de iluminacin

Los locales debern contar con las siguientes exigencias de intensidad y tipo de
iluminacin:

La luz deber ser artificial y provista por tubos fluorescentes con incidencia
oblicua, de forma tal que todas las jaulas, independientemente de su ubicacin,
reciban intensidades similares, (4).

Condiciones de alojamiento.-

El alojamiento debe contribuir a la salud general de los animales, y evitarles


todo estrs innecesario, para lo cual deber asignrsele a cada animal, de

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acuerdo a la especie, un espacio adecuado, preservando mnimas condiciones
de higiene y de proteccin contra depredadores, roedores y otras plagas, (4).

Debern existir instalaciones de cuarentena y aislamientos


pertinentes,(4).

Normalmente la entrada debe estar restringida a las personas


autorizadas, (4).

Los animales sern alojados en jaulas adecuadas para cada especie, (4).

El rea requerida para cada especie se ajustar a las disposiciones


vigentes, (4).

El nmero de animales por jaula estar en relacin al tamao corporal


evitndose la sobrecarga, de acuerdo a la reglamentacin emitida por la CHEA,
(4).

Adquisicin de animales

Los animales de experimentacin sern adquiridos en establecimientos de cra


especializados, (4).

Podrn emplearse animales no especficamente criados con este fin, slo si se


observan los requisitos establecidos en materia de investigacin, sobre todo en
lo que respecta a salud y calidad de los mismos (4).

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ANEXO 8. LISTA AMPLIADA DE GNEROS DE LA FAMILIA ANNONACEAE
CON SUS RESPECTIVAS ESPECIES, (5, 6, 7).

GENEROS ESPECIE

 Alphonsea boniana
 Alphonsea elliptica
 Alphonsea javanica
 Alphonsea kinabaluensis
Alphonsea  Alphonsea sp. Kessler 3112
 Alphonsea sp. Kessler 3186
 Alphonsea sp. Mols 16

Ambavia  Ambavia gerrardii

Anaxagorea  Anaxagorea acuminata


 Anaxagorea allenii

Pgina - 13 -
 Anaxagorea angustifolia
 Anaxagorea borneensis
 Anaxagorea brachycarpa
 Anaxagorea brevipedicellata
 Anaxagorea brevipes
 Anaxagorea crassipetala
 Anaxagorea dolichocarpa
 Anaxagorea floribunda
 Anaxagorea gigantophylla
 Anaxagorea guatemalensis
 Anaxagorea inundata

Annickia  Annickia chlorantha


 Annickia kummeriae
 Annickia pilosa

Annona  Annona cherimola (cherimoya)


 Annona cherimola x Annona
squamosa (atemoya)
 Annona deceptrix
 Annona glabra (alligator-apple)
 Annona hybrid cultivar
 Annona montana (mountain
soursop)
 Annona muricata (prickly custard
apple)
 Annona reticulata (bullock's-heart)
 Annona senegalensis (wild
custard-apple)
 Annona squamosa (sugar-apple)
 Annona sp. SM-1999

Anonidium  Anonidium sp. Cheek 7896

Artabotrys  Artabotrys hexapetalus


 Artabotrys odoratissimus
 Artabotrys sp. Wieringa 4018

Pgina - 14 -
Asimina  Asimina angustifolia
 Asimina longifolia (polecat bush)
 Asimina parviflora (dwarf pawpaw)
 Asimina triloba (pawpaw)

Bocageopsis  Bocageopsis multiflora


 Bocageopsis pleiosperma

Cananga  Cananga odorata (ilang-ilang)

Cleistopholis  Cleistopholis glauca

Craibella  Craibella phuyensis

 Cremastosperma brevipes
 Cremastosperma bullatum
Cremastosperma  Cremastosperma cauliflorum
 Cremastosperma cenepense
 Cremastosperma gracilipes
 Cremastosperma leiophyllum
 Cremastosperma macrocarpum
 Cremastosperma magdalenae
 Cremastosperma megalophyllum
 Cremastosperma microcarpum
 Cremastosperma monospermum
 Cremastosperma napoense
 Cremastosperma novogranatense
 Cremastosperma oblongum
 Cremastosperma panamense
 Cremastosperma pedunculatum
 Cremastosperma pendulum
 Cremastosperma peruvianum
 Cremastosperma venezuelanum
 Cremastosperma westrae
 Cremastosperma yamayakatense
 Cremastosperma sp. Chatrou 268
 Cremastosperma sp. Chatrou et al.
103

Pgina - 15 -
 Cremastosperma sp. Escobar
3309
 Cremastosperma sp. Foster 3418
 Cremastosperma sp. Gentry
45510
 Cremastosperma sp. Graham 635
 Cremastosperma sp. Killip 28961
 Cremastosperma sp. Maas 9148
 Cremastosperma sp. Pirie et al. 57
 Cremastosperma sp. Pirie et al. 71
 Cremastosperma sp. Smith 1577
 Cremastosperma sp. Steyermark
94314
 Cremastosperma sp. Tello 3416
 Cremastosperma sp. Woytkowski
7128

Cyathocalyx  Cyathocalyx biovulatus


 Cyathocalyx martabanicus

Cyathostemma  Cyathostemma hookeri


 Cyathostemma micranthum
 Cyathostemma viridiflora

Cymbopetalum  Cymbopetalum brasiliense


 Cymbopetalum torulosum
 Cymbopetalum sp. Chatrou et al.
44
 Cymbopetalum sp. Maas et al.
8811

Dasymaschalon  Dasymaschalon blumei


 Dasymaschalon macrocalyx
 Dasymaschalon sootepense

Desmopsis  Desmopsis microcarpa


 Desmopsis schippii

Pgina - 16 -
Diclinanona  Diclinanona tessmannii

Disepalum  Disepalum platypetalum


 Disepalum sp. Takeuchi et Kulang
18201

 Duguetia bahiensis
 Duguetia cadaverica
 Duguetia calycina
 Duguetia cauliflora
 Duguetia chrysea
 Duguetia confinis
 Duguetia confusa
 Duguetia echinophora
 Duguetia guianensis
 Duguetia hadrantha
Duguetia  Duguetia lucida
 Duguetia macrocalyx
 Duguetia macrophylla
 Duguetia marcgraviana
 Duguetia megalocarpa
 Duguetia moricandiana
 Duguetia neglecta
 Duguetia odorata
 Duguetia panamensis
 Duguetia peruviana
 Duguetia pycnastera
 Duguetia quitarensis
 Duguetia riedeliana
 Duguetia salicifolia
 Duguetia sessilis
 Duguetia sooretamae
 Duguetia staudtii
 Duguetia stelechantha
 Duguetia surinamensis
 Duguetia ulei
 Duguetia uniflora
 Duguetia yeshidan

Pgina - 17 -
Ellipeia  Ellipeia dulcis

Ellipeiopsis  Ellipeiopsis ferruginea

 Enicosanthum fuscum
 Enicosanthum membranifolium
Enicosanthum  Enicosanthum paradoxum
 Enicosanthum sp. Ambriansyah et
al. 2067

 Ephedranthus boliviensis
 Ephedranthus parviflorus
Ephedranthus  Ephedranthus sp. Chatrou et al.
173
 Ephedranthus sp. Maas et al. 8826

Fissistigma  Fissistigma glaucescens


 Fissistigma uonicum

Fitzalania  Fitzalania bidwilii


 Fitzalania heteropetala

Friesodielsia  Friesodielsia desmoides


 Friesodielsia sp. Wieringa et al.
3605

Fusaea  Fusaea longifolia


 Fusaea peruviana

 Goniothalamus curtisii
 Goniothalamus giganteus
 Goniothalamus griffithii
 Goniothalamus holttumii
 Goniothalamus lanceolatus
 Goniothalamus laoticus
 Goniothalamus macrophyllus

Pgina - 18 -
 Goniothalamus malayanus
 Goniothalamus montanus
Goniothalamus  Goniothalamus rotundisepalus
 Goniothalamus scortechinii
 Goniothalamus tapis
 Goniothalamus tenuifolius
 Goniothalamus tomentosus
 Goniothalamus tortilipetalus
 Goniothalamus umbrosus
 Goniothalamus uvarioides
 Goniothalamus wrayi

Greenwayodendron  Greenwayodendron oliveri


 Greenwayodendron suaveolens

Guamia  Guamia sp. Rainer 1593

 Guatteria aeruginosa
 Guatteria alata
 Guatteria allenii
 Guatteria alta
 Guatteria alutacea
 Guatteria amplifolia
 Guatteria anomala
 Guatteria atra
Guatteria  Guatteria australis
 Guatteria aff. australis Lobo and
Fiaschi 499
 Guatteria blainii
 Guatteria boliviana
 Guatteria brevicuspis
 Guatteria brevipedicellata
 Guatteria cf. candolleana Harley et
al. 17360
 Guatteria caribaea
 Guatteria chiriquiensis
 Guatteria diospyroides
 Guatteria discolor
 Guatteria dolichopoda
 Guatteria dumetorum

Pgina - 19 -
 Guatteria dusenii
 Guatteria elata
 Guatteria elegantissima
 Guatteria ferruginea
 Guatteria foliosa
 Guatteria galeottiana
 Guatteria glabrescens
 Guatteria gracilipes
 Guatteria guianensis
 Guatteria heterotricha
 Guatteria cf. hilariana Gottsberger
and Gottsberger 21-9274A
 Guatteria hyposericea
 Guatteria inuncta
 Guatteria inundata
 Guatteria jefensis
 Guatteria cf. lasiocalyx Krukoff
11086
 Guatteria cf. lasiocalyx Maas et al.
9000
 Guatteria latifolia
 Guatteria latisepala
 Guatteria liesneri
 Guatteria cf. lucens Gomez et al.
23305
 Guatteria macropus
 Guatteria maypurensis
 Guatteria megalophylla
 Guatteria cf. meliodora Maas et al.
9231
 Guatteria mexiae
 Guatteria modesta
 Guatteria multivenia
 Guatteria notabilis
 Guatteria oligocarpa
 Guatteria olivacea
 Guatteria oliviformis
 Guatteria ouregou
 Guatteria pacifica
 Guatteria paraensis
 Guatteria parvifolia
 Guatteria pittieri
 Guatteria poeppigiana

Pgina - 20 -
 Guatteria pogonopus
 Guatteria pohliana
 Guatteria polyantha
 Guatteria polycarpa
 Guatteria pubens
 Guatteria pudica
 Guatteria punctata
 Guatteria puncticulata
 Guatteria recurvisepala
 Guatteria reflexa
 Guatteria rigidipes
 Guatteria rotundata
 Guatteria rupestris
 Guatteria salicifolia
 Guatteria scandens
 Guatteria schlechtendaliana
 Guatteria schomburgkiana
 Guatteria schunkevigoi
 Guatteria scytophylla
 Guatteria sellowiana
 Guatteria sessilicarpa
 Guatteria sessilis

Guatteria sordida var. ovalis


 Guatteria sphaerantha
 Guatteria stipitata
 Guatteria subsessilis
 Guatteria talamancana
 Guatteria tonduzii
 Guatteria trichoclonia
 Guatteria venezuelana
 Guatteria verruculosa
 Guatteria villosissima
Guatteria sordida  Guatteria wachenheimii
 Guatteria sp. Chatrou et al. 118
 Guatteria sp. Chatrou et al. 174
 Guatteria sp. Chatrou et al. 196
 Guatteria sp. Chatrou et al. 245
 Guatteria sp. Chatrou et al. 65
 Guatteria sp. Lobo et al. 565
 Guatteria sp. Maas et al. 9570
 Guatteria sp. Pirie et al. 143

Pgina - 21 -
 Guatteria sp. Pirie et al. 50
 Guatteria sp. Prevost 4247

Guatteriopsis  Guatteriopsis ramiflora

Haplostichanthus  Haplostichanthus longirostris

Hornschuchia  Hornschuchia citriodora

Isolona  Isolona campanulata


 Isolona cooperi
 Isolona sp. Chase 542

 Klarobelia candida
 Klarobelia cauliflora
 Klarobelia inundata
 Klarobelia megalocarpa
Klarobelia  Klarobelia stipitata
 Klarobelia sp. Meier and Llamozas
3685

Letestudoxa  Letestudoxa bella


 Letestudoxa glabrifolia

 Malmea dielsiana
 Malmea dimera
Malmea  Malmea surinamensis
 Malmea sp. Chatrou et al. 8

Marsypopetalum  Marsypopetalum pallidum

 Meiogyne cylindrocarpa
 Meiogyne stenopetala
Meiogyne  Meiogyne virgata

Pgina - 22 -
 Meiogyne sp. Kessler 3219

Melodorum  Melodorum fruticosum


 Melodorum cf. fruticosum Mols 10
 Melodorum cf. fruticosum Mols 2

Mezzettia  Mezzettia parviflora

Mezzettiopsis  Mezzettiopsis creaghii

 Miliusa campanulata
 Miliusa cuneata
Miliusa  Miliusa horsfieldii
 Miliusa lineata
 Miliusa longipes

 Miliusa thorelii
 Miliusa velutina
Miliusa mollis  Miliusa sp. Middleton and Lamxay
269

Mitrella  Mitrella kentii

 Mitrephora alba
 Mitrephora celebica
Mitrephora  Mitrephora keithii
 Mitrephora maingayi
 Mitrephora polypyrena

Monanthotaxis  Monanthotaxis whytei


 Monanthotaxis sp. Wieringa 3833

Monocarpia  Monocarpia euneura

Pgina - 23 -
 Monodora crispata
 Monodora myristica
Monodora  Monodora tenuifolia

Mosannona  Mosannona costaricensis


 Mosannona discolor
 Mosannona garwoodii
 Mosannona pacifica
 Mosannona papillosa
 Mosannona vasquezii
 Mosannona sp. Chatrou et al. 71

Neo-uvaria  Neo-uvaria acuminatissima


 Neo-uvaria parallelivenia

Neostenanthera  Neostenanthera myristicifolia

Onychopetalum  Onychopetalum amazonicum


 Onychopetalum periquino

 Orophea brandisii
 Orophea celebica
 Orophea creaghii
 Orophea enneandra
Orophea  Orophea enterocarpa
 Orophea kerrii
 Orophea cf. malayana Hoffmann
11
 Orophea myriantha
 Orophea polycarpa

 Oxandra asbeckii
 Oxandra espintana
 Oxandra euneura
 Oxandra laurifolia
 Oxandra longipetala

Pgina - 24 -
 Oxandra macrophylla
 Oxandra nitida
Oxandra  Oxandra polyantha
 Oxandra sphaerocarpa
 Oxandra venezuelana
 Oxandra xylopioides

Petalolophus  Petalolophus megalopus

Phaeanthus  Phaeanthus ebracteolatus


 Phaeanthus splendens

 Piptostigma fasciculatum
 Piptostigma mortehani
Piptostigma  Piptostigma pilosum

Platymitra  Platymitra macrocarpa




 Polyalthia borneensis
 Polyalthia cauliflora
 Polyalthia celebica
 Polyalthia cerasoides
 Polyalthia cinnamomea
 Polyalthia congesta
 Polyalthia debilis
 Polyalthia discolor
 Polyalthia flagellaris
 Polyalthia cf. glabra Rastini 224
 Polyalthia glauca
 Polyalthia lateriflora
 Polyalthia littoralis
 Polyalthia longifolia
Polyalthia  Polyalthia cf. longifolia Mols 14
 Polyalthia longipes
 Polyalthia obliqua
 Polyalthia pendula
 Polyalthia rumphii

Pgina - 25 -
 Polyalthia sclerophylla
 Polyalthia stenopetala
 Polyalthia stuhlmannii
 Polyalthia subcordata
 Polyalthia suberosa
 Polyalthia sumatrana
 Polyalthia viridis
 Polyalthia xanthopetala
 Polyalthia sp. Ridsdale DV-M1-
12314

Popowia  Popowia hirta


 Popowia odoardi
 Popowia pisocarpa

Porcelia  Porcelia steinbachii

Pseudartabotrys  Pseudartabotrys letestui




Pseudephedranthus  Pseudephedranthus fragrans

 Pseudomalmea diclina
 Pseudomalmea sp. Idarraga 13
Pseudomalmea

 Pseudoxandra bahiensis
 Pseudoxandra longipes
Pseudoxandra  Pseudoxandra lucida
 Pseudoxandra aff. pacifica van
Rooden et al. 565
 Pseudoxandra polyphleba
 Pseudoxandra spiritus-sancti

Pgina - 26 -
 Pseuduvaria brachyantha
 Pseuduvaria coriacea
Pseuduvaria  Pseuduvaria pamattonis
 Pseuduvaria rugosa

Rauwenhoffia  Rauwenhoffia siamensis

 Rollinia edulis
 Rollinia herzogii
Rollinia  Rollinia mucosa (wild sweetsop)

Ruizodendron  Ruizodendron ovale

Sageraea  Sageraea lanceolata

Sapranthus  Sapranthus microcarpus


 Sapranthus viridiflorus

Stelechocarpus  Stelechocarpus burahol


 Stelechocarpus cauliflorus

Stenanona  Stenanona costaricensis


 Stenanona panamensis

Tetrameranthus  Tetrameranthus duckei


 Tetrameranthus laomae

Tridimeris  Tridimeris hahniana

Trigynaea  Trigynaea duckei


 Trigynaea lanceipetala

Pgina - 27 -
Trivalvaria  Trivalvaria macrophylla

 Unonopsis elegantissima
 Unonopsis pittieri
Unonopsis  Unonopsis rufescens
 Unonopsis stipitata

 Uvaria chamae (finger-root)


 Uvaria cordata
 Uvaria faulknerae
 Uvaria grandiflora
Uvaria  Uvaria hahnii
 Uvaria hamiltonii
 Uvaria lobbiana
 Uvaria lucida
 Uvaria macropoda
 Uvaria micrantha
 Uvaria microcarpa
 Uvaria pierrei
 Uvaria rufa
 Uvaria vietnamensis

Woodiellantha Woodiellantha sp. Lugas 311

 Xylopia ferruginea
 Xylopia frutescens
Xylopia  Xylopia hypolampra
 Xylopia peruviana

Pgina - 28 -