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LA BIOQUMICA Y SU ESTUDIO

Se puede definir la Bioqumica como la ciencia que estudia los procesos qumicos que
tienen lugar en los seres vivos. Los objetivos de la Bioqumica consisten en estudiar:

la composicin qumica de los seres vivos (las biomolculas)


las relaciones que se establecen entre dichos componentes (interacciones)
sus transformaciones en los seres vivos (metabolismo)
la regulacin de dichos procesos (fisiologa)

El investigador es incapaz de percibir a travs de sus sentidos los sucesos que tienen
lugar en el interior de un ser vivo. Necesita, por tanto, utilizar diversos instrumentos y
tcnicas experimentales que le permitan estudiar estos procesos. Por este motivo, el
desarrollo de la Bioqumica est ntimamente relacionado con los avances tecnolgicos.

La Bioqumica es una ciencia emprica y, por tanto, su desarrollo est ligado a la


observacin y a la experimentacin. Para generar conocimientos, la Bioqumica utiliza
el denominado mtodo cientfico. Segn el Oxford English Dictionary, el mtodo
cientfico es: un mtodo o procedimiento que ha caracterizado a la ciencia natural
desde el siglo XVII, que consiste en la observacin sistemtica, medicin,
experimentacin, la formulacin, anlisis y modificacin de las hiptesis.

El mtodo cientfico est sustentado por dos pilares fundamentales. El primero de ellos
es la reproducibilidad, es decir, la capacidad de repetir un determinado experimento,
en cualquier lugar y por cualquier persona. Este pilar se basa, esencialmente, en la
comunicacin y publicidad de los resultados obtenidos (por ejemplo, en forma de un
artculo cientfico). El segundo pilar es la refutabilidad, es decir, que toda proposicin
cientfica tiene que ser susceptible de ser rechazada. Para ello habra que disear
experimentos, que en el caso de dar resultados distintos a los predichos, negaran la
hiptesis puesta a prueba.

En cada rama de la ciencia se aplican versiones distintas del mtodo cientfico. En


Bioqumica, los investigadores utilizan el mtodo hipottico-deductivo para hacer de
su actividad una prctica cientfica.

El mtodo hipottico-deductivo consta de varias


fases:

Planteamiento del problema: se observa


el fenmeno a estudiar y se recopila la
mayor cantidad de informacin posible
sobre el tema.
Elaboracin de una hiptesis que
explique dicho fenmeno.
Deduccin de las consecuencias derivadas
de dicha hiptesis.
Verificacin experimental de los
enunciados deducidos.
Este mtodo obliga al cientfico a combinar la reflexin racional (pasos 2 y 3:
elaboracin de la hiptesis y deducciones) con procedimientos empricos (pasos 1 y 4:
observacin de la realidad y verificacin experimental).

TIPOS DE EXPERIMENTOS QUE SE PUEDEN HACER


EN BIOQUMICA
Los seres vivos son sistemas complejos en constante estado de cambio y los procesos
qumicos que tienen lugar en su interior se ven afectados por numerosos factores, en
muchos casos, desconocidos. Cuando los bioqumicos realizan un experimento se
enfrentan a un dilema: por un lado, intentan hacerlo en condiciones lo ms parecidas
posible a la realidad y, por otro lado, pretenden hacerlo de forma controlada.
Cumplir ambos objetivos es imposible: para ganar control sobre el sistema, hay que
alejarlo de la realidad. Desde este punto de vista, se distinguen cuatro tipos distintos de
experimento:

1.- Experimentos in vivo

Son aqullos en los que el sujeto de experimentacin es un ser vivo. En este caso, las
condiciones experimentales son prcticamente idnticas a las condiciones reales. Sin
embargo, apenas se tiene control sobre los parmetros que pueden afectar al sistema y
eso limita mucho el tipo de experimentos que se pueden llevar a cabo. La interpretacin
de los resultados tambin es ms complicada, ya que son muchas las variables que
intervienen en el sistema.

In vivo In vitro

2.- Experimentos in vitro

Son aqullos en los que slo se estudia una parte del ser vivo. Representan una visin
reduccionista de la realidad ya que presuponen que "el todo puede ser explicado nada
ms que con la suma de sus partes constituyentes". En este tipo de experimentos, lo
primero que se hace es aislar (o purificar) la parte del sistema que se va a estudiar (un
rgano, un tejido, un tipo celular, un orgnulo o una biomolcula). En muchos casos es
un trabajo largo y tedioso que, sin embargo, hay que hacer con muchsimo cuidado para
preservar la integridad estructural y funcional del sistema.
Estos experimentos son los ms frecuentes en Bioqumica, ya que tienen la ventaja de
que es relativamente sencillo controlar las variables que afectan al sistema (pH,
temperatura, concentracin de determinadas sustancias, etc.) y los resultados se pueden
interpretar ms fcilmente. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el sistema original
ha sufrido una perturbacin considerable y que las condiciones experimentales
pueden estar muy alejadas de la realidad. Existe la posibilidad de que los efectos que
se observan in vitro no se reproduzcan en experimentos in vivo. Por tanto, para poder
extrapolar los resultados obtenidos in vitro a condiciones in vivo es necesario hacer
numerosos controles experimentales.

3.- Experimentos in situ

Representan una situacin intermedia entre los experimentos in vivo y los


experimentos in vitro. Este tipo de experimentos tienen la ventaja de que las
condiciones experimentales se asemejan mucho a la realidad y, adems, es posible
controlar hasta cierto punto las variables que afectan al sistema. Sin embargo, los
animales de experimentacin sufren una manipulacin tan drstica que obliga a
sacrificarlos una vez finalizado el experimento.

In situ In silico

4.- Experimentos in silico

Los ordenadores estn cada vez ms presentes en los laboratorios de bioqumica.


Existen numerosos programas que nos permiten analizar con todo detalle la estructura
de las biomolculas, determinar cmo interaccionan entre s, descubrir posibles ligandos
que potencien o inhiban su funcin, etc. Adems, las tcnicas bioinformticas nos
permiten buscar secuencias de protenas o de cidos nucleicos en las bases de datos y
establecer relaciones estructurales, funcionales o evolutivas entre ellas.

Todas estas actividades pueden considerarse como verdaderos experimentos y tienen la


ventaja de que no es necesario hacerlos dentro de un laboratorio. En este tipo de
experimentos se tiene un control total sobre la realidad. La nica pega es que se trata
de una realidad virtual y los resultados proporcionados por el ordenador no dejan de
ser simples modelos o predicciones. Slo sern verdaderamente tiles en el caso de que
puedan ser verificados experimentalmente.
NIVELES DE EXPERIMENTACIN EN BIOQUMICA
Cada cientfico est interesado en un problema cientfico concreto y, para su estudio,
utiliza el sistema experimental que considera ms adecuado. Este sistema experimental
tambin se denomina sistema modelo y a partir de los resultados obtenidos
experimentalmente se extraern conclusiones de carcter ms general.

En funcin de cul sea el sistema modelo utilizado, se distinguen distintos niveles de


investigacin: estudios con un animal entero, estudios con rganos aislados, estudios
con cultivos de tejidos o de clulas, estudios con orgnulos celulares o estudios
moleculares. Dependiendo de cul sea el nivel en el que trabajemos (1) se necesitar
ms o menos trabajo previo para la preparacin de las muestras experimentales y (2) se
podrn utilizar una gama ms o menos amplia de tcnicas y mtodos de
experimentacin.

1.- Estudios a nivel animal

En la mayora de los casos se utilizan organismos modelo:

Animales: rata (Rattus norvegicus), ratn (Mus musculus), pez cebra (Danio
rerio), mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), gusanos (Caenorhabditis
elegans), etc.
Plantas: arabidopsis (Arabidopsis thaliana)
Microorganismos eucariotas: levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
Microorganismos procariotas: bacterias (Escherichia coli)

En algunos casos, despus del experimento (1) se pueden extraer fludos corporales del
animal para hacer estudios analticos o (2) se puede proceder al sacrifcio del animal y a
la extraccin de muestras para hacer estudios analticos y/o morfolgicos.
2.- Estudios a nivel de rgano entero

Los rganos se pueden estudiar (1) in situ, sin aislar el tejido del animal o (2), mediante
tcnicas de diseccin, extirpar el rgano y mantenerlo en un medio de incubacin
adecuado para hacer los experimentos. En algn caso tambin es posible cultivar los
rganos extirpados fuera del organismo.

3.- Estudios a nivel tisular o celular

Muchos rganos estn formados por distintos tejidos. Las tcnicas de diseccin
permiten separar un tejido de otro. Los tejidos as obtenidos (1) pueden estudiarse
inmediatamente o (2) pueden cultivarse en un medio adecuado para su posterior estudio.
Los tejidos mantenidos en cultivo se denominan explantes primarios.

Las tcnicas de disgregacin permiten separar las distintas clulas que integran el
tejido. La disgregacin puede ser de tipo mecnico, qumico o enzimtico. Debe ser lo
suficientemente intensa como para permitir separar una clula de otra sin afectar a su
integridad. Las clulas as obtenidas (1) pueden estudiarse inmediatamente o (2) pueden
cultivarse en un medio adecuado para su posterior estudio.

4.- Estudios a nivel de orgnulos celulares

Para aislar los orgnulos celulares es necesario romper la membrana plasmtica de


las clulas correspondientes. Para ello se utilizan tcnicas de homogeneizacin. La
membrana plasmtica se puede romper (1) mediante un simple choque osmtico, (2)
mediante un tratamiento qumico o enzimtico o (3) utilizando diversos mtodos
mecnicos (homogeneizador de vidrio, batidora domstica, ultrasonidos o prensa
French).

En cualquier caso, este proceso debe llevarse a cabo en condiciones (pH, temperatura y
concentracin de determinados metabolitos) que mantengan ntegros y activos los
diversos componentes celulares. Cuando las clulas han sido sometidas a un proceso de
homogenizacin, el medio resultante se denomina homogenado celular o extracto
crudo.

5.- Estudios a nivel molecular

A partir de un extracto crudo se pueden utilizar diversas tcnicas de separacin para


aislar (o purificar) la molcula que nos interesa estudiar. La purificacin de la molcula
se puede llevar a cabo (1) directamente a partir del extracto crudo o (2) a partir de un
orgnulo concreto. En este ltimo caso, hay que romper la membrana (o membranas)
del orgnulo mediante tcnicas de homogeneizacin.

La tcnica de separacin ms utilizada es la cromatografa, en cualquiera de sus


variantes. Una vez purificada la molcula a estudiar, se pueden llevar a cabo estudios
estructurales o estudios funcionales.
FUNDAMENTO DE LOS MTODOS EXPERIMENTALES
UTILIZADOS EN BIOQUMICA
Los experimentos que se llevan a cabo en un laboratorio de Bioqumica tienen como
objetivo separar, caracterizar, modificar o cuantificar las biomolculas. En la
mayora de los casos se trabaja con muestras complejas que contienen un gran nmero
de biomolculas distintas. Por este motivo, los mtodos experimentales utilizados en
Bioqumica tienen que ser altamente especficos y su funcionamiento se basa en las
propiedades fsicas, qumicas o bioqumicas de las biomolculas. El conocimiento
cada vez ms detallado de la estructura y funcin de las biomolculas permite el
desarrollo de nuevos y sofisticados mtodos experimentales. A su vez, los nuevos
mtodos permiten adquirir nuevos conocimientos bioqumicos.

1.- Mtodos basados en las propiedades qumicas de las biomolculas

Algunos compuestos poseen propiedades qumicas que les diferencian de otros como el
color, olor, sabor, etc. Muchas biomolculas tienen un color caracterstico que permite
identificarlos rpidamente (por ejemplo, el color rojo de la hemoglobina, el color
naranja de los carotenos, el color verde de la clorofila, etc.). Adems, la intensidad del
color permite cuantificar la cantidad de sustancia presente en la muestra. La capacidad
para absorber o emitir luz de una longitud de onda determinada tambin permite
identificar y cuantificar bioelementos o biomolculas.

Cuando una biomolcula no posee una caracterstica qumica determinada que permita
diferenciarla de las dems se le puede hacer reaccionar con otra molcula que le
confiera alguna caracterstica distintiva que se pueda medir como, por ejemplo, que
precipite, que cambie de estado fsico, que adquiera un color caracterstico, que emita
fluorescencia o radiactividad, que adquiera actividad enzimtica o actividad
antignica, etc.

2.- Mtodos basados en las propiedades fsicas de las biomolculas

Si queremos separar biomolculas que tienen los mismos grupos funcionales, sus
propiedades qumicas sern muy parecidas o idnticas. Por tanto, habr que utilizar
mtodos experimentales basados en las propiedades fsicas de las biomolculas como,
por ejemplo, el tamao, la forma, la carga o la polaridad. Esta ltima propiedad es
especialmente importante, ya que afecta a la solubilidad, la volatilidad y a la capacidad
de adsorcin de las biomolculas.

3.- Mtodos basados en las propiedades bioqumicas de las biomolculas

Estos mtodos se han desarrollado gracias a los avances en la investigacin bioqumica


y estn basados en las interacciones especficas que se establecen entre diversos tipos
de biomolculas.
Mtodos enzimticos

Las muestras biolgicas contienen muchos tipos distintos de protenas y, en muchos


casos, sus propiedades fsicas y qumicas son muy parecidas, lo que dificulta
enormemente su separacin y caracterizacin. Pero, afortunadamente, muchas protenas
son enzimas que reaccionan de forma especfica con un sustrato para convertirlo en
producto. La actividad enzimtica est basada en la interaccin enzima-sustrato y
permite caracterizar y cuantificar este tipo de protenas incluso en presencia de otras
protenas y biomolculas. Cuando el sustrato o el producto presentan una caracterstica
qumica que se pueda medir, resulta relativamente sencillo seguir el desarrollo de una
reaccin enzimtica, bien midiendo la desaparicin del sustrato o bien midiendo la
aparicin de producto.

Antes de la reaccin Despus de la reaccin Desarrollo de la reaccin

Cuando ni el sustrato ni el producto presentan una caracterstica distintiva que se pueda


medir, se pueden utilizar reacciones acopladas, en las que el producto de una reaccin
enzimtica es el sustrato para otra reaccin enzimtica que s presenta alguna
caracterstica qumica que se pueda medir.

Mtodos inmunolgicos

Estos mtodos se basan en las interacciones antgeno-anticuerpo. Los anticuerpos


(tambin llamados inmunoglobulinas) son protenas producidas por las clulas del
sistema inmunitario que se unen a molculas ajenas al organismo (antgenos) y las
neutralizan antes de que puedan causar daos irreparables. Cada anticuerpo se une de
forma altamente especfica a un slo tipo de antgeno. La especificidad de la unin se
debe a que las estructuras tridimensionales del antgeno y del anticuerpo presentan una
regin de complementariedad con superficies que encajan perfectamente entre s,
formando complejos antgeno-anticuerpo que, normalmente, precipitan.

Cuando no se forma un precipitado, la formacin del complejo antgeno-anticuerpo


puede medirse de forma indirecta, utilizando anticuerpos secundarios marcados con
istopos radioactivos, con sustancias fluorescentes o con enzimas que, al aadirles un
sustrato, generen un producto coloreado (ver tabla inferior).
Complejo Deteccin de la formacin de
Antgenos y anticuerpos
antgeno-anticuerpo complejos antgeno-anticuerpo

Mtodos de hibridacin

Estos mtodos se basan en las interacciones que se establecen entre pares de bases
complementarias en los cidos nucleicos (la adenina se empareja con la timina o con el
uracilo, mientras que la citosina se empareja con la guanina).

Se utilizan principalmente para identificar molculas de ADN o de ARN que


presenten una secuencia determinada. Para ello, es necesario disponer de una
pequea molcula de ADN o ARN complementaria a la secuencia que nos interesa. Esta
molcula se denomina "sonda" y, normalmente, se sintetiza por mtodos qumicos
(sntesis orgnica) o bioqumicos (reaccin en cadena de la polimerasa, o PCR). El
emparejamiento entre la sonda y una molcula de ADN o ARN que contenga una
secuencia complementaria se denomina hibridacin.

Para poder detectar y cuantificar la formacin de hbridos es necesario recurrir a


mtodos indirectos. El mtodo ms habitual consiste en marcar la sonda con istopos
radioactivos, con molculas fluorescentes o con algn antgeno que, posteriormente,
pueda ser detectado con un anticuerpo unido a una enzima (ver la tabla inferior).

Deteccin de hbridos
Mediante
cido nucleico y sondas Hibridacin Mediante anticuerpos unidos a
radioactividad o
una enzima
fluorescencia
LOS RESULTADOS GENERADOS EN UN EXPERIMENTO BIOQUMICO

Los resultados que se obtienen tras haber realizado un experimento bioqumico pueden
ser de distinta naturaleza:

1.- Cuantitativos

El resultado es un nmero. Segn la propiedad que se est


midiendo, la cifra puede tener unidades o no. Si las tiene, son
tan importantes como el propio valor numrico. Normalmente se
utilizan las unidades del Sistema Internacional y, si se utiliza
otro sistema de unidades, hay que indicarlo.

Cuando los nmeros son muy grandes, o muy pequeos, se suelen expresar utilizando la
notacin cientfica. Se indica la parte entera con dos o tres decimales (con el redondeo
adecuado), seguido de una potencia del nmero 10. Por ejemplo:

56.862 m = 5,69 104 m


0,008334 s = 8,33 103 s

En muchos casos tambin se pueden utilizar los mltiplos o submltiplos de las


unidades. Por ejemplo:

0,000025 M = 2,5 105 M = 0,025 mM = 25 M


18 l = 0,018 ml = 1,8 105 l = 0,000018 l

Lo normal es que el resultado numrico que proporciona el instrumento sirva de base


para hacer otra serie de clculos que nos permita obtener el valor final que estamos
buscando. Por ejemplo, mediante una serie de operaciones matemticas, los datos de
absorbancia que nos da un espectrofotmetro se convierten en valores de concentracin.

2.- Cualitativos

En este caso, el resultado del experimento no es un nmero, sino un grfico generado


por el propio instrumento de medida.

Un espectro de absorcin Un cromatograma


Estos datos son de naturaleza cualitativa porque nos permiten identificar la presencia
de una sustancia determinada en una muestra biolgica. Por ejemplo, los espectros de
absorcin (que indican la absorbancia de una muestra al iluminarla con luz de distintas
longitudes de onda) presentan unos picos cuya posicin es caracterstica para cada
sustancia y un cromatograma nos muestra en qu orden van saliendo los distintos
componentes de una mezcla por el extremo inferior de una columna de cromatografa.

En muchos casos, a partir del grfico tambin es posible calcular cunta sustancia
hay en la muestra, ya que la altura de los picos es directamente proporcional a la
concentracin.

3.- Semicuantitativos

Estos resultados son cualitativos, porque nos permiten detectar la presencia de una
determinada biomolcula en la muestra. Sin embargo no permiten cuantificar
exactamente la cantidad de sustancia presente. Lo que s nos permiten es establecer
comparaciones y afirmar que la cantidad de sustancia presente en una muestra es
mayor o menor que la de otra.

En algunos casos, este tipo de informacin es relevante porque nos permiten saber, por
ejemplo, si determinados tratamientos han permitido estimular o inhibir la expresin de
algn gen. Ejemplos de este tipo de resultados son los geles de electroforesis de cidos
nucleicos o de protenas.

Electroforesis en gel de agarosa Electroforesis en gel de poliacrilamida


(cidos nucleicos) (protenas)

CONTROLES

Cada vez que se hace un experimento en bioqumica es imprescindible hacer un


experimento paralelo que nos sirva de control para poder comparar lo que ocurre en
unas circunstancias con lo que ocurre en otras. Al experimento control se le puede
denominar de distintas maneras (control, referencia, blanco, cero) pero todas ellas son
equivalentes.

En los ensayos clnicos se somete a una serie de sujetos a un tratamiento con un


frmaco experimental. Como control, se toma otro conjunto equivalente de sujetos y se
le somete a un tratamiento inocuo, a fin de comparar lo que ocurre en un caso y en otro.
Para evitar el efecto placebo en los sujetos estudiados se suele recurrir a la tcnica del
ciego en el que los pacientes no saben si estn tomando el frmaco o el tratamiento
inocuo. En otros casos, para evitar posibles interpretaciones sesgadas por parte de los
investigadores, se utiliza la tcnica del doble ciego en la que ni los sujetos
investigados ni los investigadores saben qu tratamiento ha recibido cada individuo.