Toma de Muestras-Koneman

CAPTULO
Introduccin 1
a la microbiologa
Parte I: El papel del laboratorio de
microbiologa en el diagnstico de las
enfermedades infecciosas: gua para
la prctica y el tratamiento
Introduccin Fases del ciclo diagnstico

Lineamientos del libro Fase preanaltica
El mundo de las enfermedades Recoleccin de la muestra
infecciosas Transporte de la muestra
Recepcin de la muestra y observaciones
La trada de las enfermedades preliminares
infecciosas Criterios para el rechazo de las muestras
El agente infeccioso Relacin costo-eficacia en la fase
preanaltica
Clases de agentes infecciosos
Fase analtica
Interacciones entre huspedes y agentes
infecciosos Examen microscpico
Funcin de los agentes infecciosos Procesamiento de las muestras
en la naturaleza Interpretacin de los cultivos
Virulencia Procedimientos para la identificacin
El ambiente preliminar de las bacterias aisladas
El husped infectado Identificacin de microorganismos
diferentes de las bacterias
Defensa humoral innata (no celular)
Antibiograma
Defensa celular innata
Relacin costo-eficacia en la fase analtica
Tipos de inflamacin
Fase posanaltica
Defensa celular inmunitaria adaptativa
Informe de los resultados
Defensa no celular inmunitaria adaptativa
(humoral) Interaccin con los epidemilogos
Signos y sntomas clnicos de infeccin Anlisis de los resultados
Efectos indirectos de los agentes Conservacin de las muestras
infecciosos en seres humanos y de los registros
1
Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana
2 CAPTULO 1 Introduccin a la microbiologa: Parte I
Aspectos administrativos del laboratorio Envo de muestras y de agentes etiolgicos

de microbiologa Peligros no biolgicos
Regulacin estatal Bioterrorismo
Gestin de riesgos Aseguramiento de la calidad
Seguridad del laboratorio Control de calidad

Componentes de un programa de control de calidad
Normas y reglamentaciones generales de seguridad
Control de los aparatos del laboratorio
Precauciones habituales de seguridad
Control de los medios de cultivo, reactivos e insumos
Agentes biolgicos
Precauciones universales
tanto agentes infecciosos como depredadores; por ejemplo, los

Introduccin artrpodos. Tampoco pudieron vislumbrar las consecuencias
Lineamientos del libro negativas inesperadas de los principales avances mdicos que
prolongan la vida, a veces con efectos devastadores sobre los
Hay casi tantas formas de observar el mundo de las enfer- mecanismos de defensa del husped. Lejos estuvieron tambin
medades infecciosas como cantidad de agentes que las provo- de apreciar los efectos de la incursin humana en el medioam-
can. En este libro nos centraremos en la deteccin e identifica- biente o las consecuencias de los desplazamientos irrestrictos
cin de los agentes infecciosos en el laboratorio clnico, segui- de plantas y animales, incluidos los seres humanos, alrededor
do de la determinacin de la sensibilidad a los antibiticos del mundo. Como resultado, la lista de nuevas enfermedades
cuando corresponda. Desde el punto de vista conceptual, el infecciosas o de enfermedades reactivadas que han resultado
libro se divide en tres secciones. Los primeros dos captulos una plaga para la humanidad a partir de aquellas predicciones
cubren los principios generales de las enfermedades infeccio- errneas es larga y sigue creciendo. En el cuadro 1-1 se pre-
sas y el laboratorio diagnstico. En la segunda seccin, se presenta una enumeracin parcial.
sentan las tcnicas inmunolgicas y moleculares que tienen
aplicacin casi universal. Por ltimo, la tercera y ms amplia
seccin es un extenso anlisis de los grupos de agentes infec-
ciosos y las enfermedades que generan. En un captulo separa- La trada de las enfermedades infecciosas
do se explican los principios generales de la bacteriologa de-
bido a la diversidad de los organismos en este gran grupo de Para entender las enfermedades infecciosas el estudiante
patgenos humanos. debe considerar las interacciones entre las tres partes que inter-
vienen:
El mundo de las enfermedades infecciosas
1. El husped infectado. Este husped ser casi siempre un ser
Durante la mayor parte de la existencia de la humanidad, las humano, en nuestra perspectiva antropocntrica. Los veteri-
enfermedades infecciosas han sido la causa predominante de narios se ocuparn de los huspedes animales, mientras que
enfermedad y de muerte, que no slo han restringido el bienes- un botnico se ocupar de las plantas. El husped infectado
tar de las personas sino que, adems, han cercenado la prospe- puede, incluso, ser un agente infeccioso.
ridad social. Recin en el siglo XX las mejoras en las condicio- 2. Un agente infeccioso. Esta designacin es la descripcin
nes de vida, la sanidad y las intervenciones mdicas lograron ms amplia para diversas formas de vida que interactan
que las sociedades desarrolladas emergieran de la devastacin ntimamente con otras.
provocada por las enfermedades infecciosas. Lamentablemen- 3. El ambiente. El ambiente natural, inanimado y animado, es
te, los beneficiarios de estos progresos se concentraron en los esencial para el mantenimiento de la mayora de los agentes
pases ms ricos. El desafo para la comunidad mundial es ha- infecciosos y para su transmisin de un husped a otro.
cer extensivos estos logros a todo el gnero humano.
Hacia la dcada de 1950, los avances de la medicina moder- Una entretenida y muy educativa visin de estas relaciones
na y de la salud pblica parecan tan impresionantes que que merece la pena leer ha sido presentada por E. W. Kone-
muchos cientficos prominentes se vieron impulsados a prede- man,54 en El otro extremo del microscopio: las bacterias cuen-
cir el control de las enfermedades infecciosas y la erradicacin tan su historia, donde el autor hace un relato fantstico sobre
de plagas como causas de miseria en toda la Tierra. William H. una asamblea de bacterias que se reunieron para exponer sus
Stewart, un cirujano general de los Estados Unidos, afirm en quejas respecto del giro que los seres humanos impusieron a
1969: Es tiempo de concluir el captulo de las enfermedades sus relaciones y pone patas arriba nuestra visin tradicional
infecciosas. Es lamentable que muchos hombres sabios sub- del mundo.
estimaran la capacidad de adaptacin de las diversas y nume- Cedric Mims, el distinguido microbilogo britnico, prepar
rosas formas de vida que comparten el planeta con nosotros, un relato ms tradicional, tambin muy interesante, sobre la

La trada de las enfermedades infecciosas 3
Cuadro 1-1 Enfermedades infecciosas recin reconocidas y patgenos identificados desde la conquista de las enfermedades
infecciosas*
AO AGENTE ENFERMEDADES
1977 Virus bola Fiebre hemorrgica del bola

Especies de Legionella Enfermedad de los legionarios
Virus Hantann Fiebre hemorrgica con sntomas renales
Campylobacter jejuni Gastroenteritis
1982 Escherichia coli 0157 (productora de verotoxina) Colitis hemorrgica; sndrome urmico hemoltico
Borrelia burgdorferi Enfermedad de Lyme
1983 Helicobacter pylori lcera gstrica/duodenal
Virus de la inmunodeficiencia humana Sndrome de inmunodeficiencia adquirida
1989 Virus de la hepatitis C Hepatitis no A, no B
1991 Ehrlichia chaffeensis Ehrlichiosis monoctica humana
Virus Guanarito Fiebre hemorrgica venezolana
1993 Virus Sin nombre Sndrome pulmonar por hantavirus
Bartonella henselae Enfermedad del araazo de gato; angiomatosis bacilar
1994 Herpesvirus humano 8 Sarcoma de Kaposi
Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophilum Anaplasmosis (ehrlichiosis) granuloctica humana
1995 Virus Hendra Enfermedad respiratoria; meningoencefalitis
1996 Lyssavirus australiano Rabia humana
1997 Virus influenza H5N1 Gripe aviar en seres humanos
1999 Virus Nipha Enfermedad respiratoria; meningoencefalitis
Virus influenza H9N2 Nueva variante de la gripe aviar en seres humanos
2001 Metapneumovirus humano Enfermedad respiratoria
2003 Coronavirus del SARS Sndrome respiratorio agudo grave
* Con las contribuciones de Joseph McDade.
dilucidacin de las complejas interconexiones entre los seres ras son hongos unicelulares que se reproducen por fisin
humanos y los agentes infecciosos. Esta obra ha sido actuali- binaria. Los mohos u hongos filamentosos son organismos
zada por sus colegas y es un excelente modo de explorar el fas- multicelulares ms complejos que se reproducen en forma
cinante tema de la patogenia.69 sexuada y asexuada. Algunos hongos tienen fases levaduri-
forme filamentosa y se denominan hongos dismrficos.
El agente infeccioso 3. Los parsitos son un grupo grande y complejo de microbios.
CLASES DE AGENTES INFECCIOSOS Entre ellos se incluyen los animales unicelulares, como los
Los agentes infecciosos pueden dividirse en un nmero fini- protozoos, y los organismos multicelulares muy complejos
to de tipos. La mayora de ellos viven en forma libre, contie- que tienen rganos y tejidos bien definidos, como el tracto
nen todo lo necesario para el mantenimiento de su especie y gastrointestinal y los sistemas genitales. Algunos de estos
son conocidos como microbios. Los agentes infecciosos tra- parsitos son, en efecto, pequeos animales. Otros, por lo
dicionales son las bacterias, los hongos, los parsitos y los general los protozoos, carecen de las estructuras necesarias
virus. para una reproduccin independiente y deben obtener del
husped las sustancias que necesitan.
1. Las bacterias comprenden el mayor nmero de especies 4. Los virus comprenden un gran nmero de agentes infeccio-
patgenas para los seres humanos. Son organismos unicelu- sos que, hablando estrictamente, no son microbios porque
lares y contienen DNA y RNA, pero no estn diferenciadas carecen del equipamiento gentico completo para su propia
en ncleo y citoplasma; se reproducen por fisin binaria. propagacin. Salvo raras excepciones contienen DNA o
Existen unas pocas familias de bacterias que carecen de RNA, pero no ambos. Por lo tanto, deben infectar otra forma
algunas estructuras necesarias para la replicacin y deben de vida, como seres humanos, animales, plantas, bacterias e
interactuar con la clula del husped para reproducirse, las incluso, otros virus. Representan la forma ms simple de un
ms sobresalientes son Rickettsiaceae, Anaplasmataceae y agente infeccioso. Los microbios se reproducen por multi-
Chlamydiaceae. plicacin; despus de la divisin de su material gentico se
2. Los hongos son agentes unicelulares o multicelulares que dividen en dos formas nuevas idnticas. Por el contrario, los
presentan un ncleo y un citoplasma definidos. Las levadu- virus se reproducen por replicacin, hacen copias de sus ci-

dos nucleicos, luego de lo cual los nuevos genomas se ten en forma extracelular y pueden crecer in vitro en ausencia
empaquetan en forma individual dentro de los lmites de la de clulas. Los microbios intracelulares facultativos pueden
clula infectada. crecer in vitro en ausencia de clulas; in vivo crecen en forma
intracelular o extracelular, pero a menudo tienen una relacin
Adems de los agentes infecciosos tradicionales, miembros especial con los macrfagos. Los agentes infecciosos intrace-
ms evolucionados del reino animal, como los insectos, pueden lulares estrictos carecen de algunas estructuras necesarias para
considerarse una forma de parsitos si su existencia est rela- una vida extracelular; por eso requieren una clula husped que
cionada en forma ntima con un husped. En el otro extremo, les suministre los elementos requeridos. Estas relaciones se
los priones, completamente no convencionales, no contienen resumen en el cuadro 1-2.
cidos nucleicos y, por consiguiente, no pueden replicarse de
acuerdo con las leyes establecidas de la naturaleza. No obstan-
te, su estructura proteica anormal deriva en un proceso similar FUNCIN DE LOS AGENTES INFECCIOSOS EN LA NATURALEZA
a una infeccin con un ciclo de replicacin. Aunque las vctimas de los efectos nocivos de los agentes
infecciosos tengan una visin diferente, stos no tienen la fun-
cin de hacer penosa la vida de los seres humanos. Las bacte-
INTERACCIONES ENTRE HUSPEDES Y AGENTES INFECCIOSOS rias son carnvoras y un componente esencial en la degradacin
Si un agente infeccioso y su husped coexisten y ninguno de de los tejidos muertos. Adems, desempean un papel princi-
ellos se beneficia o se perjudica, el proceso se denomina co- pal en muchas reacciones qumicas en la naturaleza y han sido
mensalismo y el agente, comensal. utilizadas para tareas tan desagradables como la descontamina-
Si el agente infeccioso obtiene un beneficio de su husped, cin de los derrames txicos.
pero no le causa dao, el agente infeccioso se denomina sapr- Por el contrario, los hongos son vegetarianos. Cumplen una
fito. Si el agente infeccioso y el husped obtienen un beneficio funcin principal en la eliminacin de la vegetacin en des-
del encuentro, el proceso se denomina simbiosis o mutualismo. composicin. Nadie a quien le guste el pan, la cerveza, el vino
Por otro lado, si el husped es daado por el agente infec- o el queso necesita que le recuerden la importancia de las leva-
cioso con beneficio de este ltimo el proceso se denomina duras en nuestra sociedad. Y, por supuesto, los hongos superio-
parasitismo y el agente infeccioso, parsito (un uso general res sirven como fuente de alimento, desde los championes
de la palabra ms all de la clase de los agentes infecciosos hasta las trufas.
conocidos como parsitos). Todos los tipos de agentes infec-
ciosos pueden ser parsitos.
Cuando los microorganismos viven en la superficie externa VIRULENCIA
(piel o cabello) o interna (vas respiratorias altas y tubo digesti- La virulencia es la suma de las caractersticas que le dan al
vo) del cuerpo, se describen como flora colonizante. La rela- agente infeccioso una ventaja en la batalla contra sus huspe-
cin entre la flora colonizante y el husped puede ser comensal, des elegidos (o vctimas). No es un fenmeno de todo o nada;
saprfita o parsita. Incluso, puede cambiar de un momento a existen grados muy variables de virulencia. La mayora de los
otro si se altera la virulencia del microbio o disminuye la capa- anlisis sobre la virulencia se centran en los factores microbia-
cidad de resistencia del husped a la infeccin. nos, pero, en realidad, lo ms importante es el balance entre los
Un microorganismo capaz de ocasionar infecciones se deno- tres miembros de la trada.11
mina patgeno. Si el microbio produce enfermedad en forma El organismo ms virulento no causar enfermedad si no
ocasional, es un patgeno potencial. Un patgeno potencial se tiene acceso a un husped vulnerable debido a una de estas dos
describe como un agente oportunista si produce infecciones razones:
slo en las personas que tienen comprometidos los mecanis-
mos de defensa. 1. El organismo existe en un compartimento ambiental diferen-
Los agentes infecciosos tambin establecen numerosos tipos te del husped potencial. Despus de que se interrumpi el
de relaciones con sus huspedes a nivel celular. Los microbios de ciclo del virus de la fiebre amarilla en los mosquitos urba-
vida libre (algunas bacterias, los hongos y los parsitos) exis- nos, la transmisin de la enfermedad se detuvo hasta que los
Cuadro 1-2 Relaciones entre los agentes infecciosos y sus huspedes a nivel celular
RELACIN AGENTES INFECCIOSOS EJEMPLOS
Independencia La mayora de las bacterias, hongos Staphylococcus,

y parsitos Enterobacteriaceae,
Candida, Aspergillus,
protozoos, helmintos
Intracelulares facultativos Ciertas bacterias, micobacterias, Legionella, Brucella,
ciertos hongos Mycobacterium tuberculosis,
hongos dismrficos
Intracelular estricto Ciertas bacterias, hongos y Rickettsia, Ehrlichia,
protozoos; virus Anaplasma; Toxoplasma
gondii; virus influenza

seres humanos ingresaron en un ciclo de fiebre amarilla, humanos pueden infectarse en forma letal, pero otros huspe-
hasta entonces desconocido, con especies de mosquitos que des vertebrados pueden no enfermarse o hacerlo slo de mane-
vivan en la selva. ra leve.
2. Todos los huspedes disponibles han desarrollado una La virulencia puede ser el resultado de factores que vir-
inmunidad protectora. Por ejemplo, muchas infecciones tualmente operan en cualquier etapa del proceso infeccioso.
virales que generan inmunidad protectora, como la del Si se piensa en trminos ms amplios, la virulencia debe
virus del sarampin, se consumen luego de que todas las incluir caractersticas ms all de las que propician el desa-
personas susceptibles han sido infectadas. Slo despus de rrollo de la enfermedad en un husped infectado. En el cua-
que crezca una nueva generacin de individuos no infecta- dro 1-3 se resumen algunos ejemplos. Los lectores que deseen
dos, y por lo tanto vulnerables, puede ocurrir una nueva informacin ms detallada pueden encontrar referencias exce-
epidemia. lentes.36,41,53,55,62,100,101
Por el contrario, un organismo que no causa enfermedad o El ambiente

que lo hace slo en forma leve en personas inmunocompeten-
tes (esencialmente de baja virulencia) puede provocar una El espectro de huspedes de algunos agentes infecciosos se
enfermedad devastadora en alguien cuyo sistema inmunitario limita a los seres humanos. El mantenimiento de estos organis-
est comprometido. mos requiere el acceso a un nuevo husped vulnerable y la capa-
Se podra argumentar que los agentes infecciosos ms exito- cidad de sobrevivir durante la transferencia. Por lo tanto, los
sos son los que tienen las mejores estrategias de supervivencia, factores ambientales son relativamente de poca importancia.
que incluyen una virulencia mnima o ausente. Sobre todo para No obstante, la mayora de los agentes infecciosos tienen
los patgenos intracelulares estrictos, un agente que destruya una fase en la cual viven libres en el medioambiente, infectan
rpidamente a su husped pronto quedar excluido. Como huspedes no humanos o pasan a travs de un vector, casi siem-
ejemplo, se ha establecido una hiptesis acerca de que el virus pre un artrpodo, entre varios huspedes vertebrados. Algunas
de Epstein-Barr est diseado para permanecer en los linfoci- de estas interacciones pueden ser extremadamente complejas,
tos de memoria y ha desarrollado estrategias para reducir los con mltiples transferencias a travs de diferentes fases del
efectos negativos sobre su husped.113 ambiente; por ejemplo, los numerosos estadios de desarrollo de
Sin embargo, un organismo puede ser virulento para su un parsito en una serie de huspedes animales.
husped humano, pero sobrevivir porque tiene una relacin El ambiente es el vnculo entre el agente infeccioso y el
permisiva con otros huspedes. En otras palabras, los seres husped final. La transferencia a un nuevo husped requiere
Cuadro 1-3 Factores de virulencia seleccionados
CATEGORA FACTOR DE VIRULENCIA EJEMPLO
Supervivencia en el medioambiente Replicacin intracelular en amebas de vida libre Especies de Legionella
Resistencia a la desecacin Virus de la viruela
Transferencia/transmisin eficaz Formas mviles que pueden buscar un husped Cercaria de esquistosoma
sensible
Adaptacin a un vector que puede transmitir la Rickettsia rickettsii en las garrapatas
infeccin
Evasin de las defensas del husped Lisis de clulas polimorfonucleares inflamatorias Leucocidinas de Streptococcus pyogenes
Destruccin de tejidos Proteasas de Pseudomonas aeruginosa
Destruccin de tejidos Invasin de los vasos sanguneos por Aspergillus fumigatus
Destruccin de linfocitos Virus de la inmunodeficiencia humana
Modulacin antignica para subvertir la inmunidad Deriva y cambio antignico del virus influenza; variacin anti-
humoral (anticuerpos) gnica de Borrelia recurrentis o de Trypanosoma brucei
Localizacin intracelular en macrfagos Mycobacterium tuberculosis
Confinamiento en un sitio Localizacin intracelular en neuronas de los gan- Virus varicela-zster o virus del herpes simple
inaccesible glios espinales
Resistencia a los antibiticos Resistencia a los desinfectantes Pseudomonas aeruginosa y antispticos
Resistencia a los fijadores Priones y formaldehdo
Resistencia a los agentes antiinfecciosos Staphylococcus aureus y meticilina
Resistencia a los agentes antivirales Virus de la inmunodeficiencia humana; citomegalovirus

Cuadro 1-4 Vas de transmisin y puertas de entrada comunes de los agentes infecciosos
FUENTE DEL AGENTE MECANISMO DE ENTRADA PUERTA DE ENTRADA EJEMPLO
Ser humano infectado Aerosoles Respiratoria Virus influenza

Ser humano infectado Contacto directo Cutnea Virus del herpes simple en los
luchadores
Ser humano infectado Relaciones sexuales Genital Sfilis; gonorrea
Ser humano infectado o paciente Secreciones orales o nasofarngeas hacia el ojo Ocular Conjuntivitis bacteriana o viral
Ser humano infectado Transfusin de productos de la sangre Intravascular Virus de la hepatitis
Ambiente contaminado Alimentos o agua Gastrointestinal Patgenos entricos bacterianos
y virales
Ambiente contaminado Acondicionadores de aire Respiratoria Enfermedad de los legionarios
Animal infectado Mordeduras de animales Cutnea Rabia
Garrapata infectada Picadura de garrapatas Cutnea Enfermedad de Lyme
Paciente Aspiracin de la flora endgena Respiratoria Neumona bacteriana
Paciente Diseminacin de la flora intestinal a travs de la pared Gastrointestinal Peritonitis bacteriana
intestinal daada
Paciente Migracin de las bacterias desde la orofaringe hacia el Odo Otitis media bacteriana
odo medio a travs de la trompa de Eustaquio
una puerta de entrada. En el cuadro 1-4 se resumen las vas de alteracin anormal de los tejidos u rganos causada por el dao
transmisin y las puertas de entrada ms comunes. En el recua- o la destruccin del tejido. La inflamacin tiene componentes
dro 1-1 se definen algunos de los trminos utilizados para des- inmunitarios y no inmunitarios. En cada caso, la defensa puede
cribir enfermedades infecciosas en la poblacin. ser celular o no celular (humoral). El sufijo -itis se utiliza
para indicar inflamacin; cuando se lo asocia con un sitio ana-
El husped infectado tmico, describe un proceso de enfermedad. Por ejemplo, la
apendicitis es un proceso inflamatorio que afecta el apndice,
Una vez que un individuo ha sido infectado, se producen mientras que la hepatitis es la inflamacin del hgado y la endo-
diversas respuestas en el husped. La respuesta puede ser loca- carditis es la inflamacin del endocardio (el revestimiento de
lizada en el sitio de la infeccin o generalizada (sistmica). La las cmaras del corazn).
reaccin local a la infeccin toma la forma de inflamacin. La inmunidad innata y la inmunidad adaptativa son los dos
Inflamacin es un trmino general que hace referencia a la brazos principales de la respuesta inmunitaria.104,27,28,63 La res-
puesta innata es la ms primitiva de ambas. Proporciona una
respuesta inmediata contra los microbios invasores, sin tener
en cuenta su carcter inmunitario. Los receptores que hacen
contacto entre el invasor y la clula defensora son compuestos
Recuadro 1-1 Categoras de las enfermedades infecciosas denominados lectinas que se encuentran ampliamente distri-
buidos en la naturaleza. La respuesta innata est limitada por
la falta de un sistema de amplificacin de defensas especfi-
Enfermedad transmisible: afeccin que un individuo puede adquirir de cas. En su lugar, las defensas innatas envan seales que acti-
una fuente externa, animada o inanimada van el segundo brazo: la inmunidad adaptativa. Para utilizar
Enfermedad contagiosa: afeccin que puede ser transmitida de un una analoga militar, la respuesta inmunitaria innata es com-
paciente a otro parable con una patrulla de frontera con poca dotacin de
Infeccin iatrognica: infeccin que se produce como consecuencia de la armamentos que enva seales a los rangos superiores del
intervencin mdica ejrcito regular cuando detecta que un invasor ha cruzado los
Enfermedad infecciosa: afeccin causada por un agente externo que se lmites nacionales.
replica o multiplica La respuesta inmunitaria adaptativa es inmunolgicamente
Infeccin intrahospitalaria: infeccin que se adquiere en un centro de especfica. Responde a componentes que detecta como no pro-
salud
pios o extraos mediante la multiplicacin del nmero de
Infeccin oportunista: infeccin en un paciente con las defensas compro-
defensores con armas especficas dirigidas contra un determi-
nado enemigo. Es decir, se adapta para combatir contra una
metidas causada por un agente de baja virulencia que no producira
amenaza muy definida, en vez de reaccionar en forma univer-
infeccin en una persona sana
sal a todas las amenazas. Una vez que se activ, la respuesta
Infeccin subclnica: infeccin que produce respuesta inmunitaria pero
inmunitaria adaptativa sirve como misin de control para el
no sntomas clnicos (tambin llamada infeccin asintomtica) resto de la campaa hasta la victoria, la derrota u, ocasional-
mente, un empate.

DEFENSA HUMORAL INNATA es un material lquido que contiene gran nmero de clulas
(NO CELULAR) inflamatorias y que tiene una densidad que excede 1,013. La
La defensa ms bsica en esta categora es el muco que clulas combatientes iniciales y dominantes son los neutrfilos
reviste todas las superficies mucosas (p. ej., el muco gstrico o polimorfonucleares.61 Luego, los macrfagos ingresan en el
la sustancia tensioactiva [surfactante] que reviste la membrana rea para ayudar en la limpieza de los desechos y los fibro-
pulmonar) y los lquidos que barren los potenciales patgenos blastos pueden activarse en el proceso de cicatrizacin (fibro-
hacia afuera (p. ej., el flujo del lquido biliar, las lgrimas y la sis o tejido cicatrizal).
orina). Adems, ciertos compuestos antibacterianos, como la El trmino celulitis se utiliza a menudo para describir la
lisozima, pueden ayudar a disminuirle el nmero de bacterias. afectacin del tejido conectivo subcutneo laxo en el cual se
Por ltimo, algunas defensas primitivas o preinmunitarias dispersa el exudado purulento entre las capas del tejido invo-
desempean un papel importante en la defensa del husped. lucrado. Necrosis hace referencia a la muerte celular o a la
Estos compuestos se denominan en forma general reactantes de disolucin del tejido, la cual puede ser ocasionada por la
fase aguda.36 El primero que se identific, en 1930, fue la pro- accin de enzimas destructivas o por la restriccin de nu-
tena C reactiva, que reaccionaba con el polisacrido del neu- trientes en ese sitio, debido casi siempre al bloqueo del flujo
mococo C. La va alternativa del sistema del complemento es sanguneo. Absceso es el trmino que se utiliza cuando los
una defensa temprana contra algunas infecciones bacterianas neutrfilos segmentados se ubican en un rea no delimitada
antes de que se desarrollen los anticuerpos especficos. Final- de inflamacin supurativa, con la resultante destruccin del
mente, las defensas celulares innatas producen diversos modu- tejido.
ladores inflamatorios entre los que se encuentran los quimioa- La inflamacin purulenta es un marcador de las infecciones
tractantes para otras clulas inflamatorias. Estos compuestos causadas por las bacterias y algunos hongos, aunque ciertos
son el medio por el cual una clula se comunica con otra y se virus y parsitos tambin pueden provocar una respuesta infla-
denominan citocinas (a veces mencionadas como quimiocinas matoria supurativa o aguda. Sin embargo, los abscesos son casi
o linfocinas).25 La primera citocina que se descubri (interleu- exclusivamente causados por bacterias y algunas levaduras. La
cina 1 o IL-1), el principal mediador responsable para la res- respuesta inmunitaria humoral suele ser importante en las
puesta febril, es sintetizada por los monocitos y los macrfa- infecciones supurativas.
gos.30 Como se describe ms adelante, las citocinas tambin Inflamacin granulomatosa. La infeccin granulomatosa es un
cumplen una funcin preponderante en la respuesta inmunita- subtipo de infeccin crnica en la cual se forman granulomas.
ria adaptativa. Un granuloma puede definirse como la concentracin focal
de macrfagos o histiocitos grandes activados que tienen una
capacidad aumentada de fagocitosis y digestin de partculas
DEFENSA CELULAR INNATA extraas. Estas clulas tambin se denominan epitelioides
Las clulas primarias no inmunitarias son los macrfagos porque en ocasiones se alinean de manera que se asemejan a
fijados a los tejidos (histiocitos), sus contrapartes circulantes las clulas epiteliales escamosas. Los macrfagos suelen agre-
(monocitos) y los neutrfilos polimorfonucleares. Los macr- garse para formar clulas gigantes multinucleadas. Otros com-
fagos de tejido son las defensas primarias contra algunos agen- ponentes celulares del granuloma son los linfocitos y los
tes infecciosos invasores. Por ejemplo, los macrfagos alveola- fibroblastos. La activacin de los macrfagos se produce por
res son muy efectivos para desechar las bacterias invasoras; medio de los productos de los linfocitos inmunolgicamente
mientras que los organismos que pueden sobrevivir en los especficos.
macrfagos (p. ej., micobacterias o especies de Legionella) tie- Ciertos granulomas contienen un tipo particular de necrosis,
nen una ventaja competitiva. Los macrfagos tisulares del la necrosis caseosa, en la cual el tejido tiene una consistencia
hgado, el bazo y los ganglios forman el sistema reticuloendo- similar al queso. (Cabe destacar cun a menudo los patlogos
telial; son crticos para la eliminacin de partculas circulantes, han utilizado las analogas con los alimentos para describir los
como los agentes infecciosos de la sangre. Los pacientes a procesos de las enfermedades). La presencia de clulas gigantes
quienes se les ha eliminado el bazo o cuyo hgado est daado multinucleadas y la necrosis caseosa son caractersticas de la
tienen un mayor riesgo de contraer infecciones bacterianas tuberculosis, pero tambin pueden verse en otras infecciones,
serias. sobre todo en las provocadas por hongos dismrficos. Si el gra-
Una segunda defensa celular es un sistema efector constitui- nuloma es slido y las clulas estn intactas, se lo describe
do por las clulas natural killer (NK). Este sistema es activo como no necrosante o no caseoso.
principalmente contra los microorganismos. Los granulomas se encuentran en las infecciones por mico-
Por ltimo, pero no menos importante, las barreras fsicas de bacterias y hongos y en algunas infecciones bacterianas y para-
la piel, el aparato respiratorio, el tubo digestivo y el aparato sitarias. El correlato inmunitario de los granulomas es la inmu-
genitourinario tienen un importante papel en la resistencia a las nidad mediada por clulas.
infecciones. Las terribles consecuencias de los procesos infec- Inflamacin linfohistioctica. Algunas infecciones, en especial las
ciosos en las heridas por quemaduras son el testimonio de la causadas por virus, desencadenan una respuesta inflamatoria
eficacia de la piel. La barrera fsica del aparato respiratorio se compuesta por linfocitos y macrfagos. Estn involucradas las
complementa con la accin de los cilios ubicados en su super- respuestas inmunitarias humoral y celular.
ficie que eliminan de l los materiales extraos. Esta defensa en Inflamacin atpica. Las reacciones alrgicas estn mediadas por
forma conjunta con el revestimiento no celular se denomina un grupo diferente de clulas: los eosinfilos, los basfilos y
escalador mucociliar. los mastocitos (basfilos fijados a los tejidos). El alergeno esti-
mulante puede ser qumico, como la hierba y el polen, que
afectan a las personas alrgicas durante los diferentes perodos
TIPOS DE INFLAMACIN121 estacionales.52 Ciertos patgenos, sobre todo los parsitos,
Inflamacin aguda supurativa (o purulenta). Una infeccin aguda desencadenan una respuesta inflamatoria mediada por los eosi-
supurativa evoca una respuesta en la cual se forma pus. El pus nfilos.

DEFENSA CELULAR INMUNITARIA ADAPTATIVA El sistema inmunitario es el resultado del control de los agen-
La estacin central de las defensas inmunitarias es el lin- tes infecciosos y la vigilancia de los cambios neoplsicos de las
focito, del cual existen dos clases principales. Los linfocitos B clulas. No podemos sobrevivir sin l y nos encontramos frente
y las clulas plasmticas son responsables de producir anti- a un gran riesgo cuando est comprometido, ya sea por defectos
cuerpos inmunolgicamente especficos y componen el siste- naturales o por productos qumicos. Estos ltimos pueden pro-
ma inmunitario humoral. venir del ambiente o pueden administrarse en forma teraputica,
Sin embargo, el intimidador del sistema inmunitario es el dado que son necesarios para la atencin mdica. El ejemplo cl-
linfocito T, que conforma la inmunidad celular. Los linfocitos sico es el husped receptor de un rgano trasplantado. Para evi-
T se dividen en 1) linfocitos helper (fenotipo CD4), responsa- tar que el cuerpo rechace el rgano extrao, el sistema inmunita-
bles de la memoria inmunitaria y de la secrecin de las citoci- rio debe suprimirse, al menos en forma temporaria. Durante este
nas que modulan la respuesta inmunitaria, y 2) los linfocitos proceso, las defensas contra los microbios invasores y las clulas
supresores (fenotipo CD8), que son citotxicos y responsables tumorales se encuentran comprometidas, a veces con conse-
de la eliminacin del material celular extrao (p. ej., las clu- cuencias imprevisibles.88
las infectadas por virus). Los linfocitos supresores a veces se La complejidad del sistema inmunitario es muy admirable.
los menciona en forma alarmante como linfocitos T asesi- Su complicacin es asombrosa y an no se comprende por
nos. A su vez, los linfocitos CD4 se dividen en clulas de tipo completo. El lector interesado puede referirse a varias revisio-
1 (Th1) y de tipo 2 (Th2) de acuerdo con las citocinas que nes excelentes sobre este tema.104,27,28,63
secretan.
SIGNOS Y SNTOMAS CLNICOS DE INFECCIN

DEFENSA NO CELULAR INMUNITARIA Los signos y sntomas de infeccin pueden ser generales o
ADAPTATIVA (HUMORAL) sistmicos o bien, focales o localizados en un rgano o un sis-
Estas defensas humorales son conducidas y producidas por tema determinado. Los primeros mdicos griegos y romanos
clulas inmunitarias especficas. El sofisticado sistema de reconocan cuatro signos principales de la inflamacin:
comunicacin que coordina la actividad de todas las defensas
del husped se compone de sustancias qumicas producidas 1. Dolor
por los linfocitos denominadas citocinas.25 Las citocinas tam- 2. Calor
bin actan como efectores moleculares de los linfocitos cito- 3. Rubor (enrojecimiento)
txicos. 4. Tumor (tumefaccin)
Otra defensa humoral importante es el sistema del comple-
mento, que consiste en una cascada de enzimas que da como Los mecanismos subyacentes que predisponen a estos signos
resultado un grupo de compuestos (C7-C8-C9) conocido en no se han dilucidado an por completo. El mecanismo fisiopa-
forma conjunta como complejo de ataque.117,116 Estos com- tolgico inicial es la dilatacin de los vasos sanguneos causa-
puestos son molculas efectoras crticas en la defensa contra da por una compleja cascada de aminas vasoactivas y otros
ciertos patgenos, como los meningococos. El sistema del mediadores qumicos.23 La liberacin local de mediadores qu-
complemento funciona en forma similar al sistema de la coa- micos da como resultado 1) aumento del flujo sanguneo con
gulacin. Los componentes intermediarios del sistema, en par- congestin capilar y venosa (calor y rubor) y 2) aumento de la
ticular C3a y C5a, son extremadamente importantes como qui- permeabilidad de los vasos que lleva a la extravasacin de los
mioatractantes, es decir, reclutan las diversas clulas inflama- lquidos, la sangre y las protenas hacia los espacios extracelu-
torias hacia el sitio de la infeccin. lares (dolor y tumor). Los neutrfilos segmentados son atrados
El sistema del complemento tiene dos ramas que convergen por las sustancias quimiotcticas hacia el rea de irritacin y se
en C3; ms all de ese punto, la va es la misma. La rama cl- escapan a travs de la vasculatura permeable hacia los espacios
sica es inmunolgicamente especfica; los complejos de ant- extracelulares (formacin de pus).
genos y sus correspondientes anticuerpos desencadenan su Signos y sntomas generales o sistmicos de infeccin. En la fase
activacin. La rama alternativa (antes conocida como sistema aguda de la infeccin, el paciente puede presentar fiebre (a
de la properdina) y el sistema de unin a las lectinas, ms menudo alta y en picos), escalofros, ruborizacin (vasodilata-
recientemente reconocido, no son inmunolgicamente espec- cin) y pulso rpido. Los pacientes con infecciones subagudas
ficos y forman parte de la respuesta inmunitaria innata. o crnicas pueden padecer sntomas mnimos o vagos, como
En ocasiones, la respuesta inmunitaria se puede desviar. fiebre leve intermitente, prdida de peso o fatiga y cansancio.
Durante el desarrollo normal el sistema inmunitario reconoce Las reacciones txicas a los productos bacterianos pueden pro-
los constituyentes del husped como propios, fenmeno ducir eccemas o reacciones hemorrgicas en la piel o bien
denominado tolerancia.31 El problema surge cuando los com- diversos signos y sntomas neuromusculares, cardiorrespirato-
ponentes normales del tejido se consideran por error extra- rios o gastrointestinales, que son los primeros indicadores de
os o no propios y son atacados. La fiebre reumtica es el una infeccin subyacente.
ejemplo clsico de un dao no intencional, que ocurre cuando Las radiografas muestran infiltrados pulmonares, engrosa-
la respuesta inmunitaria confunde la miosina de las fibras del miento fibroso del revestimiento de las cavidades, presencia de
msculo cardaco con la protena M de Streptococcus pyoge- gas y tumefaccin de los tejidos blandos, masas radiopacas o
nes, que es muy similar.93 Adems, a menudo hay un dao acumulacin de lquido dentro de las cavidades o los rganos.
colateral cuando el tejido normal se daa o incluso se destru- Los parmetros de laboratorio que sugieren infeccin en los
ye durante el proceso de eliminacin del agente invasor o del pacientes con sntomas mnimos o incipientes son elevacin de
tumor. Esta respuesta anmala se conoce como autoinmuni- la velocidad de sedimentacin globular (eritrosedimentacin),
dad.26 Los defectos en el sistema inmunitario innato tambin leucocitosis o monocitosis en sangre perifrica y alteraciones
pueden causar enfermedades serias y respuestas inflamatorias en las protenas plasmticas. Otros indicadores pueden ser la
anmalas.57 elevacin de las -globulinas; la presencia de ciertas protenas

reactivas, como la protena C reactiva, o la produccin de anti- EFECTOS INDIRECTOS DE LOS AGENTES INFECCIOSOS
cuerpos tipo-especficos. EN SERES HUMANOS
Signos locales de infeccin. Los signos principales de inflama- Las luchas que los seres humanos hemos librado contra los
cin son una manifestacin inequvoca de infeccin local. agentes infecciosos han generado muchos cambios en nuestra
Puede observarse enrojecimiento localizado, calor y tumefac- impronta gentica. El desarrollo del sistema inmunitario es el
cin o una masa tumorosa si se presentan en las superficies ejemplo ms espectacular e importante, pero se pueden encon-
externas, o se detectan en las radiografas con otras tcnicas no trar otros. El paludismo es una de las infecciones ms preva-
invasivas (ecografa, tomografa computarizada, resonancia lentes y devastadoras del mundo, aunque no es comn en los
magntica, etc.). Si las terminaciones nerviosas estn irritadas Estados Unidos. Es posible que la aparicin de la hemoglobina
o estiradas por la masa que se expande o por sustancias qumi- S, que redunda en una infeccin menos grave por Plasmodium
cas irritantes, se puede sentir dolor en el rea inmediata o en falciparum,58 sea un cambio adaptativo. Lamentablemente,
otros sitios a travs de las vas eferentes complementarias cuando desaparece la exposicin a la infeccin, las consecuen-
(conocido como dolor referido). Un seno con secreciones y cias negativas de esta hemoglobina, puestas de manifiesto
los exudados purulentos son tambin indicadores de un proce- como anemia drepanoctica, son relevantes. De manera similar,
so inflamatorio o infeccioso localizado. Cualquiera de estos la entrada de merozotos de P. vivax a los eritrocitos requiere el
signos y sntomas sealan al mdico la necesidad de obtener antgeno Duffy de grupo sanguneo. A pesar de que es un ant-
material para examen microscpico directo y cultivo. geno prevalente, el reconocimiento de este fenmeno biolgi-
En el captulo 2 se detallan los signos y los sntomas espec- co proporcion las herramientas para la creacin de vacunas
ficos de infeccin que se manifiestan en diversos aparatos (res- que bloquean la entrada de los parsitos causantes del paludis-
piratorio, gastrointestinal, urinario, genital y otros). mo en sus clulas diana.65
CICLO DE DIAGNSTICO
El paciente con signos y sntomas

de enfermedad infecciosa
consulta al mdico
Fase preanaltica
El mdico examina El mdico interpreta
al paciente y hace diagnstico los informes e instituye
clnico tentativo el tratamiento apropiado
Se recolecta(n) la(s) muestra(s) Se prepara el informe final

apropiada(s) para cultivo. del cultivo y se enva al consultorio
Todos los recipientes se rotulan mdico, clnica u hospital
debidamente
Fase posanaltica
Se transcriben las rdenes

escritas a un formulario de solicitud
Se examinan los subcultivos
de laboratorio. El formulario Se pueden emitir informes y los resultados de los sistemas
y las muestras se transportan preliminares o no de identificacin
al laboratorio
Luego de la recepcin en el Luego de la incubacin,

laboratorio, los datos del formulario se examinan los cultivos.
de solicitud se ingresan en un Se establecen los sistemas
archivo en el ordenador o en el de identificacin definitiva
cuaderno de registro del laboratorio
Las muestras se procesan.

Fase analtica Se seleccionan los medios
La muestra se examina de cultivos, se inoculan e incuban
directamente. Pueden implementarse Se pueden emitir informes
o no los montajes para microscopia, presuntivos o no
los frotis y las tinciones
Figura 1-1 Diagnstico clnico y de laboratorio de las enfermedades infecciosas: revisin esquemtica del ciclo de diagnstico.

incluso perjudiciales en el caso de que el tratamiento se dirija

Fases del ciclo diagnstico contra un microorganismo comensal o contaminante. Por ejem-
plo, presuponer que Klebsiella pneumoniae, un reconocido
Es til considerar los exmenes de laboratorio como una agente causal de la neumona, como su nombre de especie lo
secuencia de diversos sucesos (fig.1-1). Tradicionalmente, los indica, se aisl del esputo de un paciente con neumona clni-
microbilogos, al igual que otros bioqumicos, se concentraron ca. Se sabe que Klebsiella pneumoniae tambin coloniza la
en las mediciones cientficas, la fase analtica. En la actualidad, nasofaringe. Si el esputo de este caso hipottico fue mal reco-
est claro que los sucesos que ocurren antes de la medicin lectado y consiste principalmente en saliva, el aislamiento de
(fase preanaltica) y luego de que la determinacin cientfica se K. pneumoniae podra no reflejar la verdadera causa de la neu-
haya completado (fase postanaltica) son tan importantes como mona, sino simplemente la colonizacin de la nasofaringe. El
la exactitud de la medicin. El control del funcionamiento a tratamiento podra ser inadecuado o slo eficaz por causalidad
travs del ciclo completo es parte del aseguramiento de la cali- si la especie bacteriana que causa la neumona tiene el mismo
dad para el laboratorio,84 como se analizar ms adelante en patrn de sensibilidad a los antibiticos que K. pneumoniae. Si
este captulo. el agente causal hubiera sido Pseudomonas aeruginosa, el tra-
tamiento hubiese sido equivocado. Esta situacin terica ocu-
Fase preanaltica rri realmente en Pensilvania en 1976. Los concurrentes a la
convencin anual de la Legin Americana de Pensilvania se
RECOLECCIN DE LA MUESTRA infectaron en el hotel de la convencin en Filadelfia, pero se
Una vez que se sospecha una enfermedad infecciosa deben enfermaron luego cuando regresaron a sus hogares. Fueron tra-
ordenarse las pruebas apropiadas. Los enfoques diagnsticos tados con antibiticos ineficaces contra bacilos entricos que
posibles son: el cultivo, la deteccin serolgica de antgenos o colonizaban las vas areas altas. El patgeno real, Legionella
anticuerpos, o la deteccin molecular de cidos nucleicos. pneumophila, no se conoca en ese entonces y, lamentablemen-
Como se analizar en los captulos 3 y 4, se utiliza cada vez con te, se utiliz un enfoque teraputico equivocado sobre la base
mayor frecuencia la deteccin directa de los antgenos y los de los inconducentes resultados de laboratorio.33
cidos nucleicos en las muestras clnicas, como tambin la A continuacin se enumeran los principios que hay que tener
aplicacin de este enfoque para la identificacin de los micro- en cuenta para la recoleccin de la muestra:
organismos aislados. En la mayora de las instituciones y 1. El material debe provenir del sitio real de la infeccin y recolec-
comunidades, los patlogos, los microbilogos y los auxiliares tarse con un mnimo de contaminacin de los tejidos, rganos y
de laboratorio colaboran con los mdicos en la seleccin de las secreciones adyacentes. Por ejemplo, los hisopados de garganta
muestras adecuadas para el cultivo y en la eleccin de las prue- para la bsqueda de estreptococos deben tomarse de la fosa
bas apropiadas para lograr la mxima eficiencia de aislamiento peritonsilar y de la pared posterior de la faringe, evitando el
y deteccin de los microorganismos. contacto del hisopo con otras reas de la boca. Debe tambin
Los adecuados recoleccin y transporte de una muestra al reducirse al mnimo la contaminacin del esputo o de las mues-
laboratorio para su anlisis es un paso crtico y principal en la tras de las vas areas bajas con secreciones orofarngeas. Otras
confirmacin de que determinado microorganismo es respon- situaciones en que una muestra recolectada en forma inadecua-
sable de una enfermedad infecciosa.68 Una muestra mal reco- da puede conducir a un resultado errneo son:
lectada puede impedir el aislamiento de los agentes infecciosos
importantes; ms an, puede conducir a terapias incorrectas e a. No cultivar la zona ms profunda de una herida o el dre-
naje de una cavidad sin tocar la piel adyacente.
b. Limpieza incorrecta del tejido periuretral y perineal antes
de recolectar una muestra de orina del chorro medio de la
100
miccin obtenida en condiciones adecuadas de higiene en
una mujer.
Porcentaje de pacientes con cultivos positivos
90 Aglutininas sricas
c. Contaminacin de una muestra de endometrio con secre-
80 ciones vaginales.
Sangre d. No acceder a la parte profunda de un absceso con agujas
70 o cnulas de aspiracin.
60 En general, los hisopados no constituyen un mtodo adecua-
do de recoleccin de muestras en la mayora de los casos; debe-
50
Heces ra alentarse la utilizacin de punciones y aspiracin a travs de
40 agujas y catteres. Los recipientes protectores para descartar
los objetos cortopunzantes deben estar accesibles y ser aptos
30 Orina
para la eliminacin de las agujas con el fin de reducir el riesgo
de accidentes.
20 2. Se deben establecer los tiempos ptimos de recoleccin de mues-
tras para proporcionar la mejor oportunidad de recuperar los micro-
10 organismos que son agentes causales. El conocimiento de la evo-
lucin natural y de la fisiopatologa de los procesos infecciosos
0 es importante para determinar el momento correcto de la reco-
1 2 3 4 5 6 7 8 leccin de muestras. A pesar de que la fiebre tifoidea es ahora
Semanas de infeccin poco comn en los Estados Unidos, la progresin del proceso
infeccioso en esta enfermedad es un ejemplo ilustrativo de la
Figura 1-2 Diagnstico de fiebre tifoidea por cultivo y serologa. importancia de recolectar las muestras adecuadas en diferentes

Fases del ciclo diagnstico 11
momentos (fig. 1-2). La bacteria causal puede aislarse en forma

ptima en muestras de sangre durante la primera semana de
enfermedad. El cultivo de heces o de orina es casi siempre po-
sitivo durante la segunda y la tercera semanas. Las aglutininas
sricas comienzan a aumentar durante la segunda semana,
alcanzan un pico a la quinta semana, y se pueden detectar du-
rante varias semanas despus de la remisin clnica de la enfer-
medad, pero no se las suele utilizar con fines diagnsticos en
los laboratorios modernos.
No deben recolectarse muestras clnicas para cultivo duran-
te 24 horas, en especial esputo u orina, porque el riesgo de con-
taminacin o de sobrecrecimiento de las bacterias comensales
de rpido crecimiento es mayor que si se toma una muestra
nica y se enva al laboratorio. Aspirado Hisopado
3. La muestra debe obtenerse en una cantidad suficiente para la
realizacin de los anlisis requeridos. Se deben establecer guas
para definir el volumen de material requerido para los anlisis.
En la mayora de las infecciones bacterianas activas se produ-
ce suficiente cantidad de pus o secrecin purulenta de modo Figura 1-3 Comparacin de muestras de una articulacin infectada, obteni-
que el volumen no debera significar un problema. Sin embar- das por aspiracin (pus) e hisopado. La aspiracin dio origen a un cultivo puro
de Staphylococcus coagulasa positivo. El estafilococo tambin se aisl en la
go, muchas veces, un mdico que no lo sabe puede enviar una muestra recolectada con el hisopo, pero estaba mezclado con otras bacterias de
muestra pequea y descartar el resto del material. la flora contaminante. La interpretacin con el aspirado fue inmediata; la
En las formas crnicas o leves de infeccin, puede ser difcil determinacin del significado del cultivo del hisopado es problemtica, aun en
obtener material suficiente. El envo al laboratorio de un hiso- presencia de un patgeno potencial.
po seco o de una muestra escasa de secreciones con la espe-
ranza de poder aislar algn patgeno es a menudo un ejercicio
intil y, posiblemente, de un costo considerable para el pacien-
te. O lo que es peor an, se puede considerar de manera inco-
rrecta que la lesin no estaba infectada basndose en un culti- Los hisopos se utilizan para obtener diferentes tipos de
vo falso negativo. muestras para cultivo; sin embargo, suelen ser menos conve-
En forma frecuente se enva al laboratorio una muestra de nientes que otros mtodos para la recoleccin de muestras, por
0,5 mL o menos de un material rotulado como esputo o lo tanto, en la medida de lo posible, se debe desalentar su uso.
lavado bronquial y se solicitan pruebas de rutina, tinciones Si se los utiliza, hay que tomar ciertas precauciones. Los hiso-
para bacterias cido-alcohol resistentes y cultivo para hongos. pos de algodn pueden tener cidos grasos residuales y el algi-
Estas muestras pueden no representar las secreciones pulmo- nato de calcio puede liberar productos txicos que inhiben el
nares del sitio de la infeccin y el pequeo volumen puede crecimiento de ciertas bacterias con requerimientos nutriciona-
resultar insuficiente para permitir la realizacin de todos los les especiales (fastidious). En general son preferibles los hiso-
procedimientos requeridos. Se pueden suministrar tubos que pos con puntas de polister de Dacron o de Rayon. No se
contienen medios de transporte como solucin fisiolgica (no debe permitir que las muestras estn en contacto con el hisopo
nutritivo) o caldo de fosfato, levadura y glucosa (PYG) (nutri- ms tiempo que el necesario. Adems de la toxicidad, la capa-
tivo). El mdico puede inocular directamente cualquier canti- cidad de los hisopos de absorber y luego liberar las muestras
dad de material que pueda recolectar. As, la muestra puede vara con el material utilizado en su fabricacin.
dividirse en el laboratorio para inocularla en numerosos medios Los hisopos deben colocarse en un medio de transporte o en
de aislamiento primario. En algunas instituciones, se proveen un recipiente hmedo para evitar que las bacterias se sequen y
varios tubos cada uno de los cuales contiene los medios de cul- mueran. Se ha demostrado un buen aislamiento de la mayora
tivo ptimos para el aislamiento de micobacterias, hongos y de las especies bacterianas en estos tubos hasta 48 horas o ms
virus. Si las secreciones que se obtuvieron son mnimas, el luego de la recoleccin de la muestra. La utilizacin de tubos
mdico deber elegir el tubo basndose en las consideraciones que contienen medio de transporte semislido de Stuart o de
clnicas. Amies, con carbn o sin l, tambin son tiles para mantener
Cuando el tamao de la muestra es demasiado pequeo para los hisopos de cultivo durante el transporte. Existen algunas
cumplir con los requisitos en forma apropiada, es conveniente excepciones a esta normativa. Las muestras de raspado de piel
comunicarse con el mdico para establecer las prioridades de o de cortes de uas para el aislamiento de hongos dermatofti-
cultivo. El informe debe indicar que el material enviado para cos deben enviarse secas en un recipiente limpio para evitar el
anlisis era escaso. sobrecrecimiento de las bacterias. Los hisopados de garganta
4. Para asegurar la recuperacin ptima de los microorganismos se para aislamiento de Streptococcus pyogenes pueden enviarse
deben utilizar dispositivos de recoleccin de muestras, recipientes en medio de transporte, pero el aislamiento de esta bacteria
y medios de cultivo apropiados. Se deben utilizar recipientes est- resistente a la sequedad mejora si se enva el hisopo seco por-
riles para la recoleccin de la mayora de las muestras. Es que mueren otras bacterias que colonizan la orofaringe.
importante que estn diseados para facilitar esa recoleccin, La capacidad para recolectar casi cualquier muestra con un
sobre todo si el paciente debe tomar su propia muestra. Los hisopo es un problema an mayor que la toxicidad y la reten-
frascos de boca angosta no son tiles para muestras de esputo cin de material. Mientras un aspirado o una biopsia garantizan
o de orina. Los recipientes tambin deben tener tapas que cie- una muestra que puede generar resultados interpretables, posi-
rren en forma ajustada para evitar los derrames o la contami- tivos o negativos, un hisopo puede haberse utilizado para tomar
nacin durante el transporte. una muestra de un proceso inflamatorio o de la flora que colo-

Sistema con un hisopo
Sistema con dos hisopos
Figura 1-4 Sistemas de transporte de hisopos. El sistema ms simple consta de un nico hisopo en un tubo de transporte que contiene un medio sin nutrientes
para mantener la humedad (arriba). Se comercializa un sistema similar con dos hisopos en un nico tubo de transporte (abajo); en este caso uno de los hisopos puede
utilizarse para cultivo y el segundo hisopo, para realizar un frotis directo.
niza. A veces, el verdadero patgeno puede estar escondido en transporte con dos hisopos al personal auxiliar para evitar que
una mezcla de bacterias que se tomaron con un hisopo, pero es enven un nico hisopo en un pedido de extendido y de cultivo
casi imposible estar seguro. Se puede llegar a interpretar en el (fig. 1-4).
caso de un microorganismo que es un patgeno documentado En particular, se desaconseja la obtencin de muestras con
y nunca coloniza a seres humanos, pero esos criterios se cum- hisopos para el aislamiento de bacterias anaerobias; en cambio,
plen rara vez. En la figura 1-3 se comparan los resultados del para este fin se recomiendan la aspiracin con aguja y jeringa.
cultivo de un aspirado y de un hisopo del mismo sitio. Las muestras recolectadas deben siempre protegerse de su
Es posible hacer un frotis y un cultivo a partir de un nico exposicin al oxgeno ambiental y evitar que se sequen hasta
hisopo si el portaobjetos se flamea para esterilizarlo antes de que puedan procesarse en el laboratorio. Los sistemas de trans-
que se prepare el extendido. Sin embargo, muchos laborato- porte seleccionados para las muestras anaerobias se enumeran
rios requieren que se enven dos hisopos, uno para el frotis y en el cuadro 1-5.
otro para el cultivo, de modo que haya material adecuado Se requiere educacin continua para impedir la utilizacin
para ambos. En ese caso es importante proveer sistemas de errnea de los hisopos, que constituye un hbito muy arraiga-
Cuadro 1-5 Recipientes para el transporte de muestras anaerobias
RECIPIENTE FUNDAMENTO O DESCRIPCIN
Jeringa y aguja para aspiracin Los exudados frescos o las muestras lquidas pueden transportarse al laboratorio luego de expeler
con cuidado las burbujas de la jeringa e insertar la punta de la aguja en un tapn estril. Este pro-
cedimiento es vlido slo si la muestra puede ser transportada al laboratorio sin demora. Esta
prctica est bajo discusin dada la probabilidad de transmisin de HIV por heridas con la aguja
Tubo o frasco ampolla Tubos o frascos ampolla que contienen un medio semislido, una atmsfera con 5% de CO2, un
agente reductor y el indicador resazurina para dar una seal visual de anaerobiosis. El tubo se uti-
liza principalmente para la insercin de muestras en hisopos; los frascos ampolla se utilizan para
la inoculacin de las muestras lquidas
Hisopo con sistema de cubierta plstica El tubo o cubierta plstica incluye un hisopo y contiene el medio Cary-Blair, Amies de transporte o
prerreducido (PRAS). El sistema Culturette tambin incluye un frasco ampolla o cmara separa-
da por una membrana que contiene sustancias qumicas que generan catalizadores de CO2 y dese-
cantes para atrapar el O2 residual que pueda quedar dentro del sistema
Bolsa para materiales biolgicos o bolsa de plstico Bolsas de plstico transparentes para materiales biolgicos que contienen un sistema generador de
CO2, un catalizador de paladio y un indicador anaerobio. La bolsa es lo suficientemente grande
como para guardar una placa de Petri inoculada que contiene un medio prerreducido o una bande-
ja de microtubos de identificacin bioqumica, como las utilizadas para realizar las pruebas
Minitek. La bolsa para materiales biolgicos o bolsa de plstico se sella luego que se introdujo
en ella la placa inoculada y se activ el sistema generador de CO2. La ventaja de estos sistemas es
que las placas pueden observarse directamente a travs del plstico transparente y delgado de la
bolsa para efectuar la visualizacin del crecimiento temprano de las colonias

do. La educacin se puede realizar mediante instrucciones de

recoleccin de muestras impartidas por la direccin de los ser-
vicios del laboratorio, a travs de boletines informativos o
comentarios en los informes de muestras que se han enviado en
hisopos.
En el quirfano no existen motivos que justifiquen la obten-
cin de muestras con hisopos. Se debe llevar a cabo una cam-
paa para eliminarlos del quirfano y evitar su reingreso. Un
medio til para lograr este objetivo es la comunicacin con los
enfermeros del quirfano. En la Vermont University diseamos
un mtodo propio para la recoleccin de muestras en el quir-
fano, porque no estn disponibles comercialmente los recursos
adecuados. En el laboratorio se preparan frascos ampolla est-
riles que contienen una rosca en la parte superior con un dia-
fragma de goma. En el fondo del frasco se coloca una capa del-
gada de agar no nutritivo para mantener la humedad. Luego se
lo coloca en un envase adecuado para ponerlo en el autoclave; C B A
de este modo, un asistente puede colocar el envase estril sobre
la bandeja de instrumentacin en el quirfano. El cirujano Figura 1-5 Sistema de transporte para cultivos aerobios o anaerobios. Se cie-
puede inyectar el material a travs del diafragma de goma o rra un frasco ampolla con una tapa a rosca que contiene un diafragma de goma.
colocar el tejido dentro del frasco ampolla luego de desenros- Una capa de agar en el fondo del frasco ampolla mantiene la humedad; un indi-
cador de oxidorreduccin en el agar indica visualmente la oxigenacin de la
car la tapa. El tejido se encuentra en un ambiente lo suficiente- atmsfera. El frasco ampolla A contiene un lquido aspirado que ha sido ino-
mente anaerobio y, por lo tanto, el sistema es perfecto para el culado a travs del diafragma de goma. El frasco ampolla B contiene un frag-
aislamiento de microorganismos anaerobios y facultativos. Sin mento de tejido que se coloc dentro del frasco ampolla destapado en la ciru-
la proteccin del envoltorio, el frasco ampolla sirve como ga. El frasco ampolla C ha sido esterilizado dentro de un envoltorio fabricado
medio general de transporte (fig. 1-5). para instrumentos quirrgicos; est listo para abrirse sobre un campo estril.
Cualquiera que sea el sistema de transporte utilizado, la prin-
cipal tarea es reducir al mnimo la demora entre la recoleccin
de la muestra y su inoculacin en el medio. Por ejemplo, si se
utilizan los hisopados rectales para el aislamiento de Shigella
de pacientes con disentera bacilar, el material recolectado debe tis es mucho ms til que el cultivo, como en el caso del espu-
inocularse directamente sobre la superficie del medio de to expectorado. Los extendidos permiten la determinacin de
MacConkey o en un caldo para enriquecimiento de gramnega- la naturaleza inflamatoria de una muestra e indican si los
tivos. La utilizacin de un medio de mantenimiento o de trans- resultados del cultivo tienen significado clnico. Por ejemplo,
porte puede poner en peligro el aislamiento de ciertas cepas. la muestra de una herida que no contiene neutrfilos polimor-
Las secreciones uretrales o cervicales que se obtienen para el fonucleares y da un cultivo positivo de flora bacteriana mixta
aislamiento de Neisseria gonorrhoeae tambin deben ser ino- no puede considerarse vlida. Es muy probable que los mdi-
culadas en una superficie de agar chocolate y en uno de los cos que confan en los resultados de este cultivo se sientan
numerosos medios de cultivo selectivos. En su defecto, se decepcionados.
puede utilizar un sistema de transporte comercial que incluye Adems, las tinciones de Gram indican la flora microbiana
una tableta de la generacin de CO2 (BD BBL Jembec sys- presente. Un frotis que tiene muchos bacilos gramnegativos
tem; BD, Franklin Lakes, NJ) para el aislamiento de N. gonorr- que no pueden crecer en un cultivo aerobio clsico indica que
hoeae. En forma similar, las muestras de las vas areas altas las condiciones del cultivo no eran las ptimas o que los micro-
para el aislamiento de Bordetella pertussis deben inocularse organismos no eran viables. Las condiciones de cultivo subp-
sobre agar Bordet-Gengou, carbn Regan-Lowe94 recientemen- timas incluyen una atmsfera incorrecta de incubacin (anae-
te preparado, o un medio equivalente a la cabecera del paciente robios) o un medio incorrecto (organismos con requerimientos
o en la clnica, a menos que se utilice un medio de transporte nutricionales especiales como Legionella o Bordetella). Los
adecuado (como el medio Regan-Lowe). microbios pueden no ser viables como consecuencia de una
5. Cuando sea posible, deben obtenerse los cultivos antes de la terapia antimicrobiana apropiada o de una respuesta inflamato-
administracin de los antibiticos. Se recomienda la obtencin de ria eficaz.
los cultivos antes de prescribir los antibiticos, sobre todo para Las reglamentaciones estatales sobre fraude y abuso exigen
el asilamiento de los microorganismos que son muy sensibles a que un laboratorio realice slo los anlisis que le han sido soli-
ellos, como los estreptococos -hemolticos de las muestras de citados. Ms adelante se comentarn los mecanismos para
hisopado de garganta, N. gonorrhoeae de las muestras del apa- intensificar el uso apropiado del laboratorio en la fase preana-
rato genitourinario o Haemophilus influenzae o N. meningitidis ltica.
del lquido cefalorraqudeo. La administracin de antibiticos 7. El recipiente de cultivo debe estar rotulado en forma adecuada.
no impide siempre el aislamiento de los microorganismos de Cada recipiente de cultivo debe tener una etiqueta legible, con
las muestras clnicas; en estas circunstancias, obtener una la siguiente informacin mnima:
muestra puede ser mejor que no hacerlo, en tanto y en cuanto
los mdicos entiendan que los resultados deben analizarse con Nombre del paciente
cierto reparo. Nmero de identificacin del paciente
6. En muchas instancias, adems de los cultivos se deben realizar Fuente de la muestra
frotis. Los frotis proporcionan una informacin extremadamen- Mdico
te til que complementa al cultivo. En ciertas situaciones el fro- Fecha y hora de la recoleccin

Utilice el nombre completo del paciente y evite las iniciales.

El nmero de identificacin debe ser el nmero del hospital, Recuadro 1-2 Medio de transporte de Stuart
del consultorio o de la clnica, la direccin de su casa o el
nmero del seguro social, segn las circunstancias. El nombre
del mdico o del contacto en el consultorio es necesario por si Cloruro de sodio 3g
Cloruro de potasio 0,2 g
se requiere alguna consulta o adelantar un informe. El origen
Fosfato disdico 1,25 g
de las muestras debe anotarse para que, si es necesario, se
Fosfato monopotsico 0,2 g
seleccione un medio especial de cultivo. La fecha y hora de la Tioglicolato de sodio 1g
recoleccin deben aparecer en la etiqueta para determinar su Cloruro de calcio, 1% en agua 10 g
procesamiento a tiempo. Otra informacin til es el diagnsti- Cloruro de magnesio, 1% en agua 10 g
co clnico y la historia de tratamiento con antibiticos del Agar 4g
paciente. Agua destilada cantidad suficiente para 1L
pH = 7,3
TRANSPORTE DE LA MUESTRA
El objetivo principal del transporte de la muestra para diag-
nstico, ya sea dentro del hospital, desde la clnica o su envo una solucin de borato de sodio como conservante.98 Para el
por correo hacia un laboratorio de referencia, es mantenerla, aislamiento de ciertos virus, como los del herpes, un buen
dentro de lo posible, de la manera ms parecida a su estado ori- medio buffer de transporte es sacarosa-fosfato-glutamato. En
ginal. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)85 algunos centros tambin se utilizan con xito los hisopos
ha creado diversas guas para los fabricantes de los dispositivos Culturette para el transporte de muestras para aislamientos
para la recoleccin y el transporte de muestras. Los peligros virales.107
para las personas que manipulan las muestras se reducen si los
dispositivos de recoleccin cierran en forma ajustada y se colo-
can dentro de recipientes de proteccin adecuados. Para man- RECEPCIN DE LA MUESTRA Y OBSERVACIONES PRELIMINARES
tener la integridad de la muestra se deben evitar las condicio- En la mayora de los laboratorios clnicos se designa un rea
nes ambientales adversas, como la exposicin al fro o al calor para la recepcin de las muestras. Las observaciones iniciales
extremos, los cambios rpidos de presin (durante el transpor- y la manipulacin deben realizarse en una cabina de seguridad
te areo) o el secado excesivo. Si se estima una demora pro- biolgica (vase ms adelante) debido al riesgo de que el per-
longada hasta el procesamiento de la muestra (p. ej., ms de 4 sonal pueda sufrir una infeccin adquirida en el laboratorio a
das), es preferible congelarla a 70 C. Para perodos cortos de partir de muestras que contienen patgenos. El personal debe
almacenamiento, un congelador con temperaturas de 20 C vestirse con indumentaria de proteccin adecuada, bata, guan-
puede ser til para algunas muestras siempre que el aparato no tes de goma y, en ciertos casos, mscaras de proteccin. Estas
sea del tipo que no produce escarcha. Muchos virlogos creen precauciones se tomaban antes slo con las muestras que lle-
que las muestras para cultivo de virus (y los aislamientos vira- vaban etiquetas de peligro. Sin embargo, es imposible determi-
les) nunca deben almacenarse a 20 C. nar si un paciente est infectado con un agente transmisible o
Las muestras de esputo que se recolectan principalmente si una muestra contiene un patgeno muy contagioso. Por lo
para el aislamiento de micobacterias y hongos en recipientes de tanto, es prudente tener un cuidado especial cuando se mani-
propileno o polietileno pueden enviarse sin ningn acondicio- pulan todas las muestras (cuidados universales).
namiento posterior. No se deben utilizar recipientes de vidrio El procesamiento de las muestras incluye: 1) el registro de
para evitar roturas durante el transporte. los datos fundamentales en un cuaderno o base de datos de or-
La mayora de las muestras lquidas deben ser transportadas denador, 2) el examen visual y la evaluacin de si se cumplen
al laboratorio lo antes posible. En un hospital, se recomienda un todos los criterios para aceptarla (vase la seccin inmediata
mximo de 2 horas entre la recoleccin y el envo de la mues- adelante sobre los criterios para el rechazo de una muestra) y
tra.5,49 Este lmite de tiempo resulta un problema para las 3) para ciertas muestras, el examen microscpico de los mon-
muestras que se toman en el consultorio mdico. Si no es po- tajes directos o las tinciones de los frotis para establecer un
sible su transporte rpido, se pueden utilizar recipientes con diagnstico presuntivo.
una pequea cantidad de cido brico para el transporte de
orina. De manera alternativa, las muestras de orina pueden
refrigerarse hasta 24 horas antes de su cultivo. Para la mayora CRITERIOS PARA EL RECHAZO DE LAS MUESTRAS
de las otras muestras se puede utilizar un medio de manteni- En todos los laboratorios se deben establecer los criterios
miento o transporte, siguiendo las instrucciones del fabricante. para el rechazo de las muestras que no son adecuadas para el
Los medios de transporte empleados con mayor frecuencia son cultivo.112 A pesar de que existen normas generales y de que las
Stuart, Amies y Carey-Blair (recuadro 1-2). agencias acreditadas han establecido los estndares, cada direc-
Estos medios son esencialmente soluciones amortiguadoras tor de laboratorio debe decidir los parmetros por utilizar,
(buffers) con hidratos de carbono, peptonas y otros nutrientes, segn las condiciones locales. Se deben verificar los formula-
sin factores de crecimiento, diseados para mantener la viabi- rios de pedido y las etiquetas de las muestras para corroborar
lidad de las bacterias durante su transporte pero sin permitir su que se incluya toda la informacin fundamental y que sta sea
multiplicacin. Se les agrega tioglicolato de sodio como reduc- coherente. Ante un problema, la recoleccin de una nueva
tor para mejorar el aislamiento de las bacterias anaerobias y la muestra es lo ms recomendable. Si la muestra no puede
pequea cantidad de agar les proporciona una consistencia tomarse nuevamente, se debe buscar a una persona responsable
semislida que evita la oxigenacin y el derrame durante el para adoptar las medidas pertinentes. Se debe incluir un
transporte. Para enviar a laboratorios distantes muestras en las comentario en el informe final en el cual se indique que la
que se sospecha la presencia de micobacterias, se recomienda muestra fue recibida con un problema (especfico) y agregar el

nombre de quien resolvi ese problema. Si es posible determi- Los criterios de rechazo deben enumerarse en forma clara en
nar el tipo de muestra, puede aceptarse que en ciertos casos se las directivas de los servicios del laboratorio. Se debe instruir al
incluya en el informe: la muestra parece ser...; de lo contra- personal del hospital sobre la importancia del envo de muestras
rio, se la debe rechazar. Siempre que haya discrepancia, se aptas para el cultivo. Adems, se deben publicar los problemas
debe hacer un informe escrito de cmo se manej la situacin recurrentes y sus soluciones en los boletines del laboratorio y en
y de los nombres de las personas que se contactaron, en la parte otras publicaciones que estn al alcance del personal del hos-
de atrs de la solicitud del estudio, en el cuaderno de registro o pital y de los mdicos de planta.
en la base de datos del ordenador.
En el recuadro 1-3 se enumeran los tipos de muestras y los
pedidos de cultivos que deben aparecer en una lista de recha- RELACIN COSTO-EFICACIA EN LA FASE PREANALTICA
zos y que no deben procesarse. La relacin costo-eficacia fue una mala palabra durante
Cuando se rechaza una muestra, debe contactarse a la perso- muchos aos en microbiologa clnica. Los microbilogos tra-
na que la envi y ponerla al tanto sobre la situacin. Se debe dicionales consideraban este tema antiacadmico, impuro e
intentar en lo posible no rechazar las muestras difciles de reco- incluso peligroso. Sin embargo, otro punto de vista es la apli-
lectar nuevamente, como el lquido cefalorraqudeo o los lava- cacin de lo que es clnicamente relevante al diagnstico
dos bronquiales. Si no se puede resolver un problema en forma microbiolgico. El objetivo no es identificar todo microorga-
expeditiva, se deben realizar los cultivos para evitar la prdida nismo que pueda ser aislado o hacer el antibiograma a cada
de la integridad de la muestra. La decisin sobre informar o no uno que crece en el laboratorio. La idea es proporcionarle a los
los resultados se puede tomar con posterioridad. Si correspon- mdicos la informacin que les permita brindar la mejor aten-
de, las condiciones de la muestra se deben incluir en el infor- cin a los pacientes. Desde este enfoque, el trabajo del micro-
me. Luego, el mdico tendr la responsabilidad sobre la inter- bilogo puede ser usualmente ms econmico que hacer todo
pretacin del informe a la luz de los datos disponibles. lo que sea posible. Es decir, el criterio de relevancia clnica
iguala a la relacin costo-eficacia. La relacin costo-eficacia
no significa barato: significa el mejor valor para el dinero.
Raymond Barlett, un distinguido patlogo y director duran-
te muchos aos del laboratorio de microbiologa del Hartford
Recuadro 1-3 Tipos de muestras o solicitudes de cultivo Hospital de Connecticut, es reconocido como el padre del cri-
que deben rechazarse
terio de relevancia clnica en los laboratorios de diagnstico
microbiolgico. An hoy es importante que los microbilogos
1. Cualquier muestra recibida en formol. La nica excepcin podran lean su libro original sobre el tema.5,6 Todos los que siguieron
ser las muestras grandes con un corto tiempo de exposicin al for- al doctor Barlett tienen con l una deuda de gratitud.
mol (menos de 1 hora). En estas circunstancias, el tejido deber ser En cada paso del procesamiento de laboratorio debe infor-
cortado en dos con una cuchilla o tijera estril y se tomar una marse la relevancia clnica y la relacin costo-eficacia. En el
muestra de la porcin ms interna para su cultivo cuadro 1-6 se detallan algunas sugerencias para la fase preana-
2. Los esputos recolectados durante 24 horas. Es difcil evitar la conta- ltica. Se pueden lograr ahorros sustanciales de materiales y
minacin y las muestras individuales que contienen una alta concen- tiempo.70 Las condiciones varan en cada institucin, por lo
tracin de microorganismos se diluirn por las muestras siguientes tanto, cada director de laboratorio debe decidir sobre las opcio-
menos concentradas nes ms adecuadas.
3. Los frotis de secreciones del cuello interno, del canal vaginal o de
ano para la deteccin de Neisseria gonorrhoeae por tincin de Gram
Fase analtica
4. Hisopado nico enviado para mltiples solicitudes, por ejemplo;
aerobios, anaerobios, hongos y tuberculosis
EXAMEN MICROSCPICO
5. El envo en un recipiente inadecuado, no estril u obviamente conta-
minado, en el cual parte de la muestra se ha derramado. Cualquier Se han enfatizado las razones por las cuales se debe realizar
recipiente con filtraciones que tenga un rtulo de peligro biolgico el examen microscpico de los materiales clnicos.5,7
debe ser manipulado con extremo cuidado
6. Las placas de cultivo que estn sobrecrecidas o resecas. Una excep- 1. El nmero y el porcentaje de neutrfilos segmentados que
cin podra ser una placa de cultivo de un aislamiento de uno de los estn presentes indican la magnitud y el tipo de respuesta
hongos patgenos (vase cap. 19). A veces, uno de los hongos pat- inflamatoria. La calidad de la muestra se puede validar.
genos de crecimiento ms lento puede an crecer por encima de bac- 2. La observacin de bacterias, elementos miceliales, formas
terias u otro hongo filamentoso. Puede ser adecuada la consulta con de levaduras, estructuras de parsitos o inclusiones virales
el mdico puede proporcionar informacin suficiente para la elabora-
7. Las muestras que estn obviamente contaminadas como lo pone en cin de un diagnstico presuntivo inmediato.
evidencia la presencia de materiales extraos, como bario, colorantes 3. El examen microscpico directo puede tambin proporcionar
coloreados o sustancias qumicas oleosas evidencia presuntiva inmediata de la presencia de bacterias
8. Las siguientes muestras no son aceptables para cultivos anaerobios: anaerobias. Con estos datos en la mano, el mdico puede
lavados gstricos, orina del chorro medio, secreciones prostticas por tomar una decisin ms racional sobre el tratamiento antimi-
recoleccin transuretral, heces (excepto para el aislamiento de espe- crobiano inicial.
cies de Clostridium asociadas con enfermedad gastrointestinal como
C. difficile, C. perfringens, C. septicum), hisopados de ileostoma o El examen por microscopia de contraste de fase o de campo
colostoma, muestras de faringe, nariz u otras zonas orofarngeas oscuro de material sin tincin de muestras hmedas es til para
(excepto las muestras obtenidas de un tejido profundo durante una demostrar movilidad y la resistencia de espiroquetas y endos-
ciruga bucal), piel superficial y cultivos del ambiente poras. Las tinciones de Giemsa, de Wright o naranja de acridi-
na pueden ser de ayuda para la observacin de formas bacteria-

Cuadro 1-6 Relacin costo-eficacia en la fase preanaltica de las pruebas
ACCIN FUNDAMENTO COMENTARIOS
Cultivo selectivo de LCR para hon- Bajo rendimiento en pacientes inmunocompetentes que Cryptococcus neoformans puede causar infeccin crnica sin
gos70 tienen valores normales en las pruebas qumicas y en pleocitosis en el LCR
el recuento de clulas en el LCR
Cultivo selectivo de LCR para Bajo rendimiento en pacientes inmunocompetentes que En las poblaciones con bajo riesgo de tuberculosis el rendi-
micobacterias70 tienen valores normales en las pruebas qumicas y en miento puede ser an menor
el recuento de clulas en el LCR
Cultivo selectivo de heces para Bajo rendimiento en pacientes que han sido hospitaliza-
patgenos bacterianos o anlisis dos durante ms de 3 das
para huevos y parsitos70,105
Cultivo selectivo de aspirados Incremento en el aislamiento de flora orofanngea conta- Los investigadores han aplicado varios criterios diferentes
endotraqueales o esputos expec- minante si se observan ms de 10 clulas epiteliales
torados70 pavimentosas por campo de bajo aumento
Utilizacin selectiva de caldos de Utilidad cuestionable excepto para biopsias de tejidos y Los caldos de cultivo pueden utilizarse en otras situaciones
cultivo de apoyo para los cultivos ciertos lquidos, como pacientes con desvos de LCR o si se examinan slo cuando un microorganismo presente
bacterianos que son sometidos a dilisis peritoneal crnica en frotis no se recupera en las placas. stos nunca deben
aplicarse a muestras de las superficies mucosas
No utilizar pruebas de antgenos Escasa sensibilidad y especificidad que limitan su

bacterianos en LCR70,111 utilidad
Cultivo selectivo de lquido Patrn de aislamiento de patgenos y perfiles de sensibi- Cultivos indicados en peritonitis primaria (peritonitis bacte-
peritoneal lidad predecibles en pacientes con peritonitis secunda- riana espontnea) y en peritonitis adquirida en el hospital
ria (adquirida en la comunidad)
Cultivo selectivo de muestras Streptococcus pyogenes es el principal agente etiolgico Los cultivo para Corynebacterium diphteriae, Neisseria
de faringe de la faringitis: el cultivo de rutina con mltiples gonorrhoeae o virus del herpes simple deben solicitarse
medios probablemente proporcione informacin falsa especficamente si es apropiado. Arcanobacterium hemoly-
ticum causa faringitis en nios mayores y adolescentes,
pero se asla en medios aptos para Streptococcus pyogenes
Cultivo selectivo de bacterias anae- Los cultivos de anaerobios deberan realizarse en forma Nunca realizar cultivos de anaerobios en muestras de sitios
robias sistemtica slo en tejidos o lquidos aspirados/pus que pueden estar contaminadas con flora de las mucosas o
heces
Limitar la frecuencia del cultivo Las muestras de faringe, orina y heridas se limitan a una Se debe sugerir el cultivo con una frecuencia no menor de
cada 24 horas; las muestras de sangre se limitan a dos 48 a 72 horas (tiempo requerido para evaluar la primera
o tres cultivos (10 a 20 mL por cultivo) cada 24 horas muestra)
Limitar la frecuencia de los ex- El rendimiento a partir de los exmenes de Giardia Para otros parsitos intestinales probablemente sea adecuado
menes de huevos y parsitos como mnimo luego de tres muestras, las cuales debe- realizar menos de tres exmenes
rn recolectarse en das alternos
Limitar la frecuencia de pruebas Rendimiento luego de dos exmenes negativos como

para C. difficile96 mnimo
Limitar las pruebas de DNA para Rendimiento mnimo si el recuento de clulas en LCR Se describieron excepciones, especialmente en nios
virus del herpes simple en es normal y no hay evidencias de lesiones focales
LCR106,110 por resonancia magntica
Limitar el envo de muestras dupli- Unificar las muestras o seleccionar la mejor muestra (ba- Si existe cualquier incertidumbre en lo que se refiere a la
cadas del mismo sitio en el sado en la tincin de Gram o el tiempo de transporte) equivalencia de las muestras, consultar con el mdico antes
mismo da del procesamiento; cuando sea dudoso, procesarlas de
inmediato en forma separada y consultar en el tiempo
libre; preservar las muestras al menos por 24 horas
Limitar la repeticin de muestras Enviar las muestras siguientes a la evaluacin previa; si Preservar las muestras al menos por 24 horas; preservar las
de un sitio no estril dentro de la muestra siguiente ha sido inoculada en un medio y placas inoculadas que son evaluadas de manera incompleta
un perodo definido se presentan diferencias sustanciales con la muestra por un perodo definido (p. ej., 7 das)
original, consultar con el mdico acerca de las accio-
nes futuras
No cultivar puntas de catteres uri- Rechazar la muestra para cultivo Informar al mdico que debe remitirse la orina
narios permanentes114
LCR = lquido cefalorraqudeo.

Para ms informacin el lector puede consultar las referencias48,67.

grupo 5 se consideran clnicamente relevantes. En un estudio

Recuadro 1-4 Sistema de clasificacin de Bartlett para la clnico, Van Scoy115 recomend que las muestras de esputo que
evaluacin de la calidad de las muestras de contuvieran ms de 25 neutrfilos se acepten para el cultivo aun
esputo si tenan ms de 10 clulas epiteliales (grupo 4). Este criterio
sugerido de evaluacin ha sido valorado mediante su aplicacin
Nmero de neutrfilos por campo de bajo aumento (10 ) Grado a muestras apareadas de secreciones respiratorias obtenidas por
< 10 0 expectoracin y por aspiracin transtraqueal, una tcnica que
1025 +1 evita la contaminacin con la flora de la orofaringe.39
> 25 +2 El sistema de graduacin de los esputos no puede aplicarse
Presencia de moco +1
si se sospechan infecciones pulmonares causadas por micobac-
terias, la mayora de los hongos, especies de Legionella y virus.
Nmero de clulas epiteliales por campo de bajo aumento
(10 ) 1
Adems, el significado de la presencia de neutrfilos polimor-
1025 2
fonucleares se altera en algunas situaciones: 1) cuando el
> 25 paciente est neutropnico a causa de una enfermedad o de un
Total* tratamiento, 2) cuando el paciente no presenta una respuesta
inflamatoria eficaz y 3) cuando un cuerpo extrao causa irrita-
* Promedie el nmero de clulas epiteliales y neutrfilos de alrededor de 20 o 30 cam-
cin de la superficie de la mucosa. La neutropenia puede ser el
pos separados de observacin a 10 y calcule el total. Un resultado final de 0 o menos resultado de una deficiencia hereditaria o de que las clulas
indica ausencia de inflamacin activa o contaminacin con saliva. Debe pedirse una inflamatorias o sus precursores se destruyen por un proceso de
nueva muestra de esputo. enfermedad o por la quimioterapia para el tratamiento de una
enfermedad. En ciertas condiciones, la capacidad de los neu-
trfilos de migrar hacia el sitio de la infeccin est disminuida.
nas que se tien dbilmente o que tienen poco contraste con el Es poco probable que el microbilogo clnico pueda determi-
material de fondo. nar si un paciente est neutropnico a partir de la informacin
Tambin se puede utilizar la tincin de Gram directa sobre que le proporcionan los mdicos. Una de las excepciones, que
los materiales clnicos para determinar si una muestra es repre- an no se comprende con claridad, es la movilizacin deficien-
sentativa del sitio de infeccin. Esta tcnica se aplica para la te de los neutrfilos observada en la infancia.24 La edad exacta
evaluacin de las muestras de esputo. A partir del nmero de a la cual se puede instalar una respuesta de neutrfilos comple-
clulas epiteliales escamosas y de neutrfilos segmentados de ta no est bien definida, pero en el caso de nios muy peque-
las muestras de esputo teidas con Gram en forma directa, os (menores de 2 meses) las decisiones de rechazar una mues-
Barlett5 dise un sistema de graduacin para evaluarlas tra o de evaluar un aislamiento en forma incompleta no debe
(recuadro 1-4). En este sistema se le asignan nmeros negati- basarse en la ausencia de neutrfilos en la muestra.
vos a un frotis en el que se observan clulas epiteliales esca- Las dos situaciones en las que un cuerpo extrao modifica la
mosas, lo cual indica la contaminacin con secrecin orofarn- interpretacin acerca de los neutrfilos son la presencia de un
gea (saliva). Cuando se observa la presencia de neutrfilos seg- catter endotraqueal en las vas areas bajas o la de un catter
mentados se le asignan nmeros positivos, que indican la pre- permanente, como un catter de Foley, en el tracto urinario
sencia de inflamacin activa. La magnitud de esta calificacin inferior. En cada una de estas situaciones la aparicin de neu-
negativa y positiva depende de la cantidad relativa de clulas trfilos en la muestra puede reflejar irritacin causada por el
epiteliales y neutrfilos segmentados, como se observa en el catter en lugar de un agente infeccioso (a pesar de que ambos
esquema del sistema de graduacin de Barlett. Un puntaje final factores pueden estar presentes). En las vas areas, la inflama-
de 0 o menor indica la ausencia de respuesta inflamatoria o la cin puede originarse de una infeccin local (traquetis) en vez
presencia de contaminacin significativa con saliva y, por lo de una neumona, incluso si hay un elemento infeccioso. En el
tanto, invalida la muestra. En la lmina en color 1-1 se obser- tracto urinario inferior, la presencia de leucocitos no puede uti-
van microfotografas que ilustran este sistema de graduacin en lizarse como indicador de infeccin clnica importante si se ha
preparaciones de esputo con tincin de Gram. colocado un catter en el lugar,108 o incluso, si se realizaron
Murray y Washington72 propusieron un sistema similar cateterismos en forma intermitente.40 La infeccin sintomtica
(recuadro 1-5). El nmero elevado de clulas epiteliales en los es el factor determinante para el tratamiento de una infeccin
grupos 1 a 4 de este sistema indica contaminacin con secre- del tracto urinario en el paciente con cateterismo crnico
ciones orofarngeas e invalida la muestra. Slo las muestras del (vase cap. 2). La presencia de neutrfilos en muestras respira-
torias no puede utilizarse como indicador de neumona; este
diagnstico se realiza en forma clnica y radiogrfica, como se
analiza en el captulo 2.
Recuadro 1-5 Sistema de clasificacin de Murray y Tcnicas de microscopia. Se pueden utilizar diversas tcnicas en
Washington para la evaluacin de la calidad el examen microscpico directo de la muestra clnica para
de las muestras de esputo demostrar la presencia de microorganismos o para observar
ciertas caractersticas bioqumicas, fisiolgicas o serolgicas.
Clulas epiteliales Leucocitos por campo Las tcnicas ms comunes en los laboratorios de microbiologa
por campo de bajo aumento de bajo aumento clnica se enumeran en el cuadro 1-7. Como el ndice de refrac-
Grupo 1 25 10 cin de las bacterias y de otros microorganismos es similar al
Grupo 2 25 1025 del medio de montaje, stos no son visibles cuando se los exa-
Grupo 3 25 25 mina con luz brillante. En consecuencia, se puede necesitar
Grupo 4 1025 25 cierta manipulacin de la fuente de luz. A menudo, es de gran
Grupo 5 < 10 25 ayuda reducir la cantidad de luz que ingresa en el campo a tra-
vs del cierre del iris del diafragma, lo cual aumenta el con-

Cuadro 1-7 Tcnicas para el anlisis directo de muestras no teidas
MTODOS Y MATERIALES PROPSITO TCNICAS
Preparacin con solucin fisiolgica Para determinar la actividad biolgica de los microor- Dispersar una pequea cantidad de la muestra para ser exa-
Cloruro de sodio, 0,85% (acuoso) ganismos, como movilidad y reacciones a ciertos minada dentro de una gota de solucin fisiolgica en un
Portaobjetos de vidrio, 7,5 2,5 cm qumicos o reactividad serolgica contra sueros portaobjetos de vidrio. Cubrir con un cubreobjetos y exa-
Cubreobjetos especficos. Esto ltimo incluye la reaccin de hin- minar directamente con un objetivo (de inmersin) del
Mezcla parafina-vaselina (Vaspar) chazn capsular de Neufeld usada para identificar microscopio de 40 o 100 , mientras se cierra el iris del
diferentes tipos capsulares Streptococcus pneumo- diafragma para reducir la cantidad de luz transmitida.
niae y Haemophilus influenzae Para evitar que se seque, se realiza un crculo sobre el
cubreobjetos con una pequea cantidad de parafina-vase-
lina antes de cubrir la gota de muestra que se encuentra
en el portaobjetos
Procedimiento de la gota gruesa La preparacin de la gota gruesa sirve para el mismo Se coloca una pequea cantidad de mezcla parafina-vaseli-
Portaobjetos para gota gruesa (este es propsito que la preparacin con solucin fisiolgi- na alrededor del reborde del pocillo en la superficie infe-
un portaobjeto de vidrio con un ca, excepto que existe menor distorsin debida al rior del portaobjetos para gota gruesa. Se colocan las bac-
pocillo central cncavo) peso del cubreobjetos y puede lograse un campo de terias de una colonia que se va a examinar en el centro del
Cubreobjetos foco ms profundo dentro de la gota. Esta tcnica se cubreobjetos, dentro de una pequea gota de agua o solu-
Solucin fisiolgica o agua utiliza por lo general para el estudio de la movilidad cin fisiolgica. Se invierte el portaobjetos y se presiona
Mezcla parafina-vaselina bacteriana sobre el cubreobjetos, guiando la gota de la suspensin
bacteriana dentro del centro del pocillo. El portaobjetos se
lleva con cuidado a la posicin derecha para el examen
directo con el microscopio
Preparacin con yodo La preparacin con yodo suele utilizarse en paralelo Una pequea cantidad de materia fecal u otro material se
Solucin yodada de Lugol: con la preparacin de solucin fisiolgica cuando se mezcla en una gota de solucin yodada en un portaobje-
Cristales de yodo, 5 g examinan heces u otros materiales para la bsqueda tos. Esto se mezcla para formar una suspensin y se colo-
Yoduro de potasio, 10 g de protozoos o huevos de helmintos intestinales. El ca un cubreobjetos sobre la gota. Luego, el preparado se
Agua destilada, 100 mL yodo tie el ncleo y los orgnulos intracitoplasmti- examina directamente con el microscopio. Si el examen
Disolver el KI en agua y adicionar len- cos de manera que son ms fciles de visualizar directo se retrasa o si se desea realizar una preparacin
tamente los cristales de yodo hasta La preparacin con yodo no pueden utilizarse en reem- semipermanente para un estudio futuro, los bordes del
su disolucin. Filtrar y guardar en plazo de las preparaciones con solucin fisiolgica cubreobjetos pueden sellarse con una mezcla de parafina-
una botella con tapn apretado. dado que el yodo paraliza la movilidad de bacterias vaselina
Diluir 1:5 con agua antes de usar y trofozotos de protozoos
Portaobjetos de vidrio, 7,5 2,5 cm
Cubreobjetos
Preparacin con hidrxido de pota- La preparacin con KOH se utiliza para ayudar en la Se prepara una suspensin con las escamas de piel, uas o
sio (KOH) deteccin de elementos fngicos en materiales pelos en una gota de KOH al 10%. Se coloca un cubreob-
Hidrxido de potasio, 10% (acuoso) mucosos gruesos o muestras que contengan material jetos sobre la gota y se deja a temperatura ambiente por
Portaobjetos de vidrio, 7,5 2,5 cm queratinoso, como escamas de piel, uas o pelos. El alrededor de media hora. El preparado se puede calentar
Cubreobjetos KOH disuelve el fondo de queratina y, por lo tanto, suavemente a la llama de un mechero Bunsen para acele-
desenmascara los elementos fngicos y los hace ms rar el proceso de clarificacin. No hervir la preparacin.
evidentes Examinar con el microscopio para visualizar hifas fngi-
cas o esporas
Preparacin con tinta china Las preparaciones con tinta china o nigrosina se utili- Se centrifuga ligeramente el lquido cefalorraqudeo u otra
Tinta china (Pelikan) zan para el examen microscpico directo de las cp- muestra lquida para concentrar cualquier microorganismo
o sulas de muchos microorganismos. Los grnulos en el sedimento. Se emulsiona una pequea cantidad del
Nigrosina (granular)* finos de la tinta china o la nigrosina dan un fondo sedimento dentro de una gota de tinta china o nigrosina
Portaobjetos de vidrio, 7,5 2,5 cm semiopaco contra el cual las cpsulas claras son fci- sobre un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. No
Cubreobjetos les de visualizar. Esta tcnica se utiliza sobre todo en realizar la emulsin de contraste demasiado gruesa o la
la visualizacin de las grandes cpsulas de luz transmitida puede bloquearse por completo. Examinar
Cryptococcus neoformans en lquido cefalorraqu- el preparado directamente con el microscopio, usando el
deo, esputo y otras secreciones objetivo de 10 para la bsqueda inicial y el objetivo de
40 para la confirmacin de sospecha de microorganis-
mos encapsulados
Examen en campo oscuro El anlisis en campo oscuro se utiliza para visualizar Se obtiene del paciente la secrecin para ser examinada. En
Microscopio equipado con un con- ciertos microorganismos delicados que son invisibles el caso de un chancro, la costra de la superficie se raspa
densador de campo oscuro en el examen microscpico con campo brillante pti- con bistur y una pequea cantidad del material seroso se
Portaobjetos de vidrio, 7,5 2,5 cm co y se tien slo con gran dificultad. Este mtodo coloca sobre un portaobjetos. Realizar un crculo sobre un
Cubreobjetos se utiliza sobre todo en la demostracin de espiro- cubreobjetos con una mezcla de parafina-vaselina y colo-
Solucin fisiolgica quetas en chancros sifilticos en los que se sospecha car sobre la gota de material
Palillos aplicadores o raspadores de Treponema pallidum
ciruga
Mezcla parafina-vaselina
(Contina)

Cuadro 1-7 Tcnicas para el anlisis directo de muestras no teidas (cont.)
MTODOS Y MATERIALES PROPSITO TCNICAS
Examinar el preparado directamente con el microscopio

adaptado con un condensador de campo oscuro con obje-
tivos de 40 o 100 . Las espiroquetas aparecern como
sacacorchos mviles y brillantes contra un fondo negro
Reaccin de hinchazn capsular de Cuando las especies de bacterias encapsuladas se Se dispersa el volumen de un ansa de material, como espu-
Neufeld ponen en contacto con un suero que contiene anti- to emulsionado, lquido corporal o caldo de cultivo,
Suero homlogo anticapsular cuerpos anticapsulares homlogos, sus cpsulas sobre un rea de 1 cm en dos lugares en los extremos
Solucin fisiolgica experimentan un cambio en el ndice de refraccin opuestos de un portaobjetos de vidrio. El volumen de un
Portaobjetos de vidrio, 7,5 2,5 cm para producir hinchazn que es visible en el exa- ansa de suero anticapsular especfico de tipificacin se
Cubreobjetos men microscpico. El procedimiento serolgico se dispersa sobre el rea de una de las preparaciones secas,
utiliza para la identificacin de varios tipos de se recubre el rea opuesta con un ansa de solucin fisio-
Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influen- lgica que sirve como control. Cada rea se recubre con
zae en lquidos biolgicos o en cultivos un cubreobjetos y se examina con el microscopio usando
un objetivo de 100 (de inmersin). Los microorganis-
mos que muestran una reaccin positiva aparecen rodea-
dos con un halo esmerilado, refractario que corresponde
a la hinchazn de la cpsula. Compare la preparacin de
la prueba con un control con solucin fisiolgica donde
no existe hinchazn capsular
* Disponible en Harleco Co., Filadelfia, PA.
traste entre el objeto que se est observando y el fondo. Se debe onda y actan as como prismas qumicos. Algunos de los gru-
desalentar la prctica habitual de bajar el condensador para pos cromforos ms comunes que se encuentran en los colo-
lograr este efecto. rantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O y NO2.
Tinciones directas. Para visualizar las bacterias de manera ade- (Ntese la presencia de estos grupos en las frmulas qumicas
cuada y demostrar los detalles finos de sus estructuras internas, de los colorantes que se muestran en el cuadro 1-8). La inten-
en general se requieren tinciones biolgicas. La introduccin sidad del color de un colorante es proporcional al nmero de
de las tinciones a mediados del siglo XIX fue, en gran parte, res- radicales cromforos presentes en el compuesto.
ponsable de los principales avances que tuvieron lugar en la Los colorantes difieren unos de otros en el nmero y el orde-
microbiologa y en otros campos de la microscopia de diag- namiento de estos anillos y en la sustitucin de los tomos de
nstico durante los ltimos 100 aos. Hoy dependemos tanto hidrgeno con otras molculas. Por ejemplo, existen tres susti-
de las tinciones biolgicas que es difcil darse cuenta cmo tuciones nicas claves para un tomo de hidrgeno del bence-
hubiera progresado el estudio de las bacterias sin su imple- no que constituyen la estructura bsica de la mayora de los
mentacin. En el cuadro 1-8 se enumeran las frmulas qumi- colorantes: 1) sustitucin con un grupo metilo para formar
cas, los componentes y las aplicaciones de las tinciones que se tolueno (metilbenceno), 2) sustitucin con un grupo hidroxilo
utilizan con mayor frecuencia en el laboratorio microbiolgico. para formar fenol (cido carblico) y 3) sustitucin con un
Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u orgni- grupo amino para formar anilina (fenilamina). La mayora de
cas de colorantes o grupos de colorantes que proporcionan una los colorantes utilizados en microbiologa son derivados de la
variedad de colores a los microorganismos y a los tejidos anilina y por eso se denominan colorantes anilina.
vegetales y animales, u otras sustancias de importancia biol-
gica. Los colorantes pueden utilizarse como tinciones directos
de materiales biolgicos, como indicadores de cambios de pH
en los medios de cultivo, como indicadores de oxidacin-
reduccin para demostrar la presencia o la ausencia de condi-
ciones anaerobias o para demostrar las funciones fisiolgicas
de los microorganismos utilizando las tcnicas denominadas
supravitales. Tolueno Fenol Anilina
Casi todos los colorantes con utilidad biolgica son deriva- (metilbenceno) (cido carblico) (fenilamina)
dos del alquitrn de hulla. La estructura qumica bsica de la
mayora de los colorantes es el anillo de benceno. Los coloran- Todos los colorantes biolgicos tienen alta afinidad por el
tes estn compuestos, en general, por dos o ms anillos de ben- hidrgeno. Cuando todos los sitos de la molcula que pueden
ceno conectados por enlaces qumicos bien definidos (crom- unir hidrgeno estn completos, el colorante se encuentra en su
foros) que se asocian con la produccin de color. A pesar de estado reducido y, por lo general, es incoloro. En este estado,
que el mecanismo subyacente del desarrollo del color no se se lo denomina compuesto leuco. Siguiendo con este razona-
comprende por completo, en teora, ciertos radicales qumicos miento, pero de manera opuesta, un colorante retiene su color
tienen la propiedad de absorber la luz a diferentes longitudes de slo en la medida en que su afinidad por el hidrgeno no est

Cuadro 1-8 Tinciones biolgicas comunes utilizadas en bacteriologa
TINCIN FRMULA QUMICA INGREDIENTES PROPSITO
Azul de metileno de Loeffler Azul de metileno 0,3 g Esta es una tincin simple y directa utiliza-
Alcohol etlico, 95% 30 mL da para una variedad de microorganis-
Agua destilada 100 mL mos, se utiliza especficamente para
detectar bacterias en frotis de lquido
cefalorraqudeo en casos de sospecha de
Tetrametil tionina
meningitis bacteriana
Tincin de Gram Violeta de genciana Esta es una tincin diferente que se utiliza
Violeta de genciana 2g para demostrar las propiedades de tincin
Alcohol etlico, 95% 20 mL de bacterias de todo tipo
Oxalato de NH4 0,8 g Las bacterias grampositivas retienen el
Agua destilada 100 mL colorante violeta de genciana luego de la
Yoduro de Gram decoloracin y se observan de color azul
Violeta de genciana Yoduro de potasio 2g intenso
(hexametilpararosaanilina) Cristales de yodo 1g Las bacterias gramnegativas no son capaces
Agua destilada 100 mL de retener la tincin de violeta de gencia-
na luego de la decoloracin y se tien de
rojo con el colorante safranina
Decolorante Las caractersticas de la tincin de Gram
Acetona 50 mL pueden ser atpicas en cultivos muy jve-
Alcohol etlico, 95% 50 mL nes, viejos, muertos o degenerados
Dimetil fenosafranina Contracoloracin Tincin de formas qusticas de

Safranina O 2,5 g Pneumocystis jiroveci (modificacin de
Alcohol etlico, 95% 100 mL Gram-Weigert)
Adicionar 100 mL al 100 mL
agua destilada
Tincin de Ziehl-Neelsen para Carbolfucsina Los bacilos cido-alcohol resistentes se

bacilos cido-alcohol resis- Cristales de fenol 2,5 mL denomina as porque estn recubiertos
tentes Alcohol, 95% 5 mL por una cubierta cerosa que es resistente
Fucsina bsica 0,5 g a la tincin. Se requiere calor o un deter-
Agua destilada 100 mL gente (Tergitol) para permitir que el
Alcohol cido, 3% colorante penetre la cpsula. Una vez
HCl, concentrado 3 mL teidas, estas bacterias resisten la decolo-
Carbolfucsina Alcohol, 70% 100 mL racin, mientras que otras bacterias se
(triaminotrifenilmetano) Azul de metileno destien con cido-alcohol
Azul de metileno 0,5 g
cido actico glacial 0,5 mL
Agua destilada 100 mL
Fluorocromo Auramina O 1,5 g Este colorante fluorocromo tie selectiva-

Rodamina B 0,75 g mente micobacterias porque se une a los
Glicerol 75 mL cidos miclicos de la pared celular.
Fenol 10 mL Esta tincin muestra mejor a la micobac-
Agua destilada 50 mL terias que la tincin para bacilos
Auramina O cidoalcohol resistentes convencional
y permite el cribado de los frotis a bajo
aumento porque los organismos se ven
ms fcilmente
AO en polvo 20 mg El naranja de acridina es una coloracin

Buffer acetato de sodio 190 mL particularmente adaptada para la demos-
(pH 3,5) (Adicionar tracin de bacterias en hemocultivos, fro-
Rodamina B alrededor de 90 mL tis de lquido cefalorraqudeo y uretrales
de HCl 1 M a 100 mL u otros exudados donde pueden estar pre-
de acetato Na 1 M) sentes en un relativo bajo nmero, tanto
como 104 UFC/mL, o cuando son oscure-
cidas por un fondo intenso de leucocitos
polimorfonucleares u otros desechos. A
un pH por debajo de 4, las bacterias y las
levaduras se tien de naranja brillante
Naranja de acridina (AO) contra un fondo negro, verde claro o
amarillo
(Contina)

Cuadro 1-8 Tinciones biolgicas comunes utilizadas en bacteriologa (cont.)
TINCIN FRMULA QUMICA INGREDIENTES PROPSITO
Wrigth-Giemsa Azul de metileno policromtico Colorante de Wright La tincin de Wright-Giemsa se utiliza

Azul de metileno en polvo 9g comnmente para teir los elementos
Azur de metileno Colorante de Giemsa celulares de frotis de sangre perifrica. Es
Eosina en polvo 1g til en microbiologa para demostrar la
Glicerina 90 mL presencia de organismos intracelulares
Alcohol metlico como Histoplasma capsulatum y las
absoluto 2 910 mL especies de Leishmania (vase lmina en
Mezclar en una botella color 1-2G). La tincin tambin es de uti-
color caramelo y dejar lidad para demostrar inclusiones intrace-
reposar un mes antes lulares en frotis directos de piel o muco-
Azur B de metileno de usar sas, como raspados de crnea para
tracoma
Azul de anilina en Cristales de fenol 20 g El colorante es fuertemente cido debido a

lactofenol cido lctico 20 g los grupos sulfnicos y ha sido utilizado
Glicerol 40 mL como contracoloracin para tejidos no
Agua destilada 20 mL fijados, bacterias y protozoos, en combi-
Disolver los nacin con otros colorantes. Actualmente
Azul de anilina ingredientes, se utiliza para la tincin directa de mice-
luego adicionar: lios fngicos y estructuras de fructifica-
Azul de anilina 0,05 g cin, las cuales toman un delicado color
azul claro
satisfecha por completo. Dado que el oxgeno suele tener El violeta de genciana (cristal violeta) es el colorante princi-
mayor afinidad por el hidrgeno que muchos colorantes, se pal; se une a la pared bacteriana luego del tratamiento con una
retiene color en presencia de aire. Esto permite la utilizacin de solucin dbil de yoduro, que acta como mordiente para fijar
ciertos colorantes, como el azul de metileno, como indicadores el colorante. Algunas especies de bacterias, como consecuencia
de oxidacin-reduccin en ambientes anaerobios, dado que el de la naturaleza qumica de sus paredes celulares, tienen la
indicador se vuelve incoloro en ausencia de oxgeno. capacidad de retener el violeta de genciana aun luego del trata-
En trminos generales, los colorantes se clasifican como cimiento con un decolorante orgnico, como la mezcla de partes
dos o bsicos; esta denominacin no indica necesariamente su iguales de acetona y alcohol etlico al 95%. Las bacterias que
pH de reaccin en solucin, sino en cambio, si una parte signi- retienen el colorante aparecen de color azul-negro cuando se
ficativa de la molcula es aninica o catinica. Desde el punto observan con el microscopio y se denominan grampositivas.
de vista prctico, los colorantes bsicos tien estructuras ci- Ciertas bacterias pierden el colorante principal violeta de gen-
das, como la cromatina del ncleo de las clulas; los coloran- ciana cuando se las trata con el decolorante, debido tal vez al
tes cidos reaccionan con sustancias bsicas, como las estruc- alto contenido de lpidos de su pared celular. Estas bacterias
turas citoplasmticas. Si en un preparado se quieren teir las cambian de color, toman la contracoloracin de safranina y
estructuras del ncleo y del citoplasma, se pueden utilizar com- aparecen de color rojo vistas con el microscopio: son las gram-
binaciones de colorantes cidos y bsicos. Un ejemplo comn negativas (lmina en color 1-2A). Se puede mejorar la visuali-
es la hematoxilina (bsica) y la eosina (cida), o coloracin H zacin de ciertos bacilos gramnegativos con requerimientos
y E, utilizada para el anlisis de cortes de tejido. nutricionales especiales mediante el agregado de 0,05% de car-
Utilizacin de colorantes en microbiologa. Es conveniente que los bolfucsina al contracolorante safranina. Esta reaccin de Gram
microbilogos realicen un anlisis microscpico directo de las puede emplearse para hacer identificaciones presuntivas cuan-
muestras enviadas para cultivo. Esto no slo le puede propor- do se la utiliza en forma conjunta con la observacin de la mor-
cionar al mdico un rpido diagnstico presuntivo, sino ade- fologa (cocos y bacilos) y con la disposicin bacteriana.
ms, la deteccin de microorganismos especficos puede servir Friedly ha revisado las aplicaciones comunes de la tincin de
como gua para seleccionar el medio de cultivo adecuado y Gram.34 Los cocos grampositivos dispuestos en grupos sugie-
suministrar un valioso control de calidad comparativo con los ren estafilococos; la disposicin en cadena indica estreptoco-
aislamientos obtenidos. En el cuadro 1-9 se enumeran, sobre cos. Los diplococos grampositivos, con forma de lanceta son
una seleccin de muestras que se envan en forma habitual a los caractersticos de Streptococcus pneumoniae cuando se los
laboratorios de microbiologa, los hallazgos positivos de varios observa en los frotis de muestras de esputos; estas caractersti-
procedimientos de tincin y las enfermedades asociadas. A cas no pueden utilizarse como diagnsticas en otras muestras
continuacin se hace una breve descripcin de las tinciones ya que la apariencia de los enterococos es similar. Los diplo-
ms utilizadas. cocos gramnegativos arrionados son caractersticos de las
Tincin de Gram. La tincin de Gram, descubierta hace poco especies de Neisseria. Los bacilos grandes grampositivos
ms de 100 aos por Hans Christian Gram, suele utilizarse para denotan especies de Bacillus o Clostridium; los bacilos peque-
el examen directo por microscopia de las muestras y los sub- os grampositivos sugieren especies de Listeria o alguna de las
cultivos (en el cuadro 1-8 se puede hallar la frmula). En el corineformes (difteroides) si se observan ordenamientos simi-
recuadro 1-6 se explica el procedimiento de la tincin. lares a las letras chinas. Los bacilos gramnegativos curvos en

Cuadro 1-9 Diagnstico de enfermedades infecciosas por anlisis directo de muestras de cultivo
MUESTRAS ENFERMEDAD SUPUESTA PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO HALLAZGOS POSITIVOS
Cultivo farngeo Difteria Tincin de Gram Delicados bacilos grampositivos pleomrficos en

una disposicin similar a letras chinas
Tincin con azul de metileno Bacilos teidos de azul claro; con grnulos meta-
cromticos prominentes
Faringitis estreptoccica aguda Tcnica de fluorescencia directa con anti- Cocos encadenados fluorescentes; usar controles
cuerpo (luego de 4-6 horas de incubacin positivos y negativos en cada tincin
en caldo de Todd-Hewitt)
lceras orofarngeas Enfermedad de Vincent Tincin de Gram Presencia de bacilos gramnegativos y bacilos del-
gados con forma de espiral
Esputo Neumona bacteriana Tincin de Gram Variedad de tipos bacterianos; Streptococcus

Aspirados transtraqueales pneumoniae con cpsulas particularmente
Lavados bronquiales diagnsticas
Tuberculosis Tincin para bacilos cido-alcohol resistentes Bacilos cido-alcohol resistentes

Micosis pulmonar Tincin de Gram, tincin de Wright-Giemsa Levaduras en brotacin, seudohifas, hifas
o blanco de calcoflor verdaderas o cuerpos de fructificacin
Tincin de Gram-Weigert
Lesiones cutneas o dre- Celulitis bacteriana Tincin de Gram Variedad de tipos bacterianos; sospecha de espe-
najes purulentos de cies anaerobias
senos subcutneos
Gangrena gaseosa (mionecrosis) Tincin de Gram Bacilos grampositivos que sugieren Clostridium
perfringens; usualmente no se observan esporas
Micetoma actinomictico Preparacin directa con solucin Grnulos sulfurosos

fisiolgica Delicados filamentos ramificados grampositivos;
Tincin de Gram o tincin para bacilos las especies de Nocardia pueden ser dbilmente
cido-alcohol resistentes modificada cido-alcohol resistentes
Micetoma eumictico Preparacin directa con solucin Grnulos blancos, grisceos o negros
fisiolgica Hifas verdaderas con tumefaccin focal o clami-
Tincin de Gram o montaje azul dosporas
de algodn en lactofenol
Lquido cefalorraqudeo Meningitis bacteriana Tincin de Gram Bacilos gramnegativos pleomorfos pequeos
(Haemophilus influenzae)
Diplococos gramnegativos (Neisseria meningitidis)
Diplococos grampositivos (Streptococcus
pneumoniae)
Tincin con azul de metileno Formas bacterianas que se tien azul-negro
Tincin con naranja de acridina Formas bacterianas que resplandecen naranja bri-
llante bajo iluminacin ultravioleta
Meningitis neumoccica Reaccin de hinchazn capsular de Neufeld Hinchazn o apariencia de vidrio esmerilado de las
(antisuero tipo especfico) cpsulas bacterianas
Meningitis criptoccica Tinta china o preparacin con nigrosina Levaduras encapsuladas con brotes unidos por una
hebra fina
Listeriosis Tincin de Gram Bacilos grampositivos delicados

Preparacin de la gota gruesa Bacterias con movilidad en paraguas (tumbling)
Orina Infeccin por levaduras Tincin de Gram o tincin de Seudohifas o levaduras en brotacin
Wright-Giemsa
Infeccin bacteriana Tincin de Gram Variedad de tipos bacterianos
Leptospirosis Examen en campo oscuro Espiroquetas levemente espiraladas mviles
(Contina)

Cuadro 1-9 Diagnstico de enfermedades infecciosas por anlisis directo de muestras de cultivo (cont.)
MUESTRAS ENFERMEDAD SUPUESTA PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO HALLAZGOS POSITIVOS
Secrecin uretral- Gonorrea Tincin de Gram Diplococos gramnegativos intracelulares

purulenta
Infeccin por Chlamydias Tcnica de fluorescencia directa con anti- Cuerpos elementales
cuerpo del frotis
Secrecin Infeccin por levaduras Examen directo o con tincin de Gram Seudohifas o levaduras en brotacin
vaginal purulenta
Infeccin por tricomonas Examen directo Flagelados con rpida movilidad
Gardnerella vaginales Tincin Pap o tincin de Gram Clulas epiteliales cubiertas con cocobacilos
Medicin del pH de las secreciones vaginales (clulas clave) o pH vaginal > 5,5
lcera de pene o Sfilis primaria Montaje para el examen en campo oscuro de Espiroquetas fuertemente espiraladas mviles
vaginal (chancro) la secrecin del chancro
Chancroide Tincin de Gram de la secrecin de la Bacilos pequeos gramnegativos intracelulares o

lcera o del aspirado del bubn (fornculo) extracelulares
inginal
Ojo Conjuntivitis purulenta Tincin de Gram Variedad de especies bacterianas
Tracoma Tincin de Giemsa del raspado de crnea Agrupamientos de inclusiones perinucleares

intracelulares
Heces Enterocolitis purulenta Tincin de Gram Neutrfilos y agregados de estafilococos
Clera Examen directo con agua peptonada alcalina Bacilos con movilidad rpida caracterstica; sin
de enriquecimiento neutrfilos
Enfermedad parasitaria Examen directo con solucin fisiolgica o Parsitos adultos o fragmentos de parsitos; pro-
yodo tozoos o huevos
Raspado de piel, Dermatofitosis Examen de las muestras obtenidas por Hifas delicadas o agrupamiento de esporas
fragmentos de uas purgas
o pelos extrados
Tia versicolor Preparacin con KOH al 10% Hifas y esporas que se asemejan a espaguetis y
albndigas
Sangre Fiebre recurrente (Borrelia) Preparacin con KOH al 10% o con azul de Espiroquetas con morfologa tpica
algodn en lactofenol
Parsitos sanguneos: paludismo, Tincin de Wright o de Giemsa Parsitos intracelulares (plasmodium, babesia)
tripanosomiasis, filariasis Examen en campo oscuro Formas extracelulares: tripanosomas
Tincin de Wright o de Giemsa o microfilarias
Examen directo de sangre anticoagulada para
la bsqueda de microfilarias
muestras de heces diarreicas indican especies de Vibrio, o si miento para su ejecucin correcta. Un observador casual no lo
tambin se ven formas de sacacorchos sugieren especies de har tan bien como alguien que mira regularmente las tinciones
Campylobacter. Los bacilos gramnegativos son las bacterias y tiene la oportunidad de cotejar los hallazgos morfolgicos
que se encuentran con mayor frecuencia en los laboratorios cl- con los resultados del cultivo. Un ejemplo excelente de este
nicos e incluyen Enterobacteriaceae, bacilos no fermentado- hecho es un interesante estudio que compar el desempeo del
res, especies de Haemophilus y una variedad con requerimien- personal del hospital respecto de los microbilogos experimen-
tos nutricionales especiales. En la lmina en color 1-3 se inclu- tados en el diagnstico de la neumona adquirida en la comu-
yen imgenes seleccionadas de tinciones de Gram, las cuales se nidad.31 El personal del hospital fue mejor para obtener el espu-
analizarn con mayor detalle en una seccin posterior de este to purulento que el personal de enfermera, pero la preparacin
captulo. e interpretacin de los frotis fue inferior a la de los microbi-
La tincin de Gram es un procedimiento engaosamente logos.
simple. Puede realizarse en forma rpida y fcil. Sin embargo, Algunas razones tcnicas y microbiolgicas justifican la
la preparacin e interpretacin de los frotis es otro tema. Es importancia de la experiencia. La mayora de las veces la mor-
esencial una considerable experiencia y un cuidadoso entrena- fologa de las bacterias coincide con las descripciones clsi-

dificultades. En el cuadro 1-10 se resumen algunas de las

Recuadro 1-6 Tcnica de la tincin de Gram trampas clsicas que puede presentar la tincin de Gram. La
regla esencial es que la interpretacin final debe hacerse sobre
la base del color de la tincin, la morfologa bacteriana y las
1. Realice un frotis fino del material de estudio y djelo secar al aire variantes que se conocen. Para complicar an ms la situacin,
2. Fije el material al portaobjetos pasndolo tres o cuatro veces a travs diversos artefactos pueden asemejarse a los agentes infeccio-
de la llama de un mechero Bunsen, de manera que el material no se sos y ser informados de manera errnea como microbios. En
lave durante la tincin. Algunas personas ahora recomiendan la utili- la lmina en color 1-4 se ilustran algunas de estas posibles
zacin de alcohol para la fijacin de material para teir con tincin fuentes de error. Si se considera la posibilidad de un artefacto,
de Gram (cubrir el frotis por completo con metanol o etanol durante una estrategia es teir otro frotis con naranja de acridina
algunos minutos) (vase ms adelante); con esa tincin se puede establecer si la
3. Coloque el frotis en un soporte para tincin y recubra la superficie estructura contiene DNA, y por lo tanto, es biolgica. A pesar
con solucin de violeta de genciana. de que el procedimiento es simple, el paso de cambio de color
4. Luego de 1 minuto (se puede utilizar menos tiempo con algunas solu- puede ocasionar problemas si no se realiza de manera adecua-
ciones) de exposicin al colorante violeta de genciana, lave exhausti- da. Si se utiliza acetona como decolorante, debe tenerse espe-
vamente con agua destilada o buffer cial cuidado porque acta en forma muy rpida. El cambio de
5. Cubra el frotis con solucin yodada de Gram durante 1 minuto. color insuficiente puede controlarse observando el ncleo
Nuevamente, lave con agua de las clulas inflamatorias; si stas no estn completamente
6. Sujete el frotis entre el pulgar y el dedo ndice e impregne la gramnegativas, el cambio de color del frotis no se realiz en
superficie con unas gotas de decolorante alcohol-acetona, hasta que forma adecuada. La nica receta para detectar un exceso en el
el lavado deje de tener color violeta. Esto suele tomar 10 segundos cambio de color es la comparacin entre la reaccin de Gram
o menos y la morfologa de la bacteria. Si el programa de asegura-
7. Lave con agua corriente y coloque el frotis nuevamente en el soporte miento de la calidad (vase ms adelante) incluye una revisin
para tincin. Cubra la superficie con la tincin de safranina durante 1 de los frotis que no se correlacionan con los cultivos, es posi-
minuto. Lave con agua corriente ble detectar el cambio de color inadecuado y los artefactos no
8. Coloque el frotis en posicin vertical en el soporte para tincin, para bacterianos que se informaron de manera errnea y el obser-
permitir que el exceso de agua drene y el frotis se seque vador puede aprender del error.
9. Examine el frotis teido bajo el objetivo de 100 (de inmersin) de
La tincin de Gram tambin puede aplicarse a la identifica-
un microscopio. Las bacterias grampositivas se tien de azul oscuro;
cin de formas no bacterianas, como tricomonas, larvas de
las bacterias gramnegativas aparecen de color rosa o rojo
estrongiloides, quistes de Pneumocystis jiroveci (carinii) y tro-
fozotos de Toxoplasma gondii, aunque no es tan sensible como
otras tinciones especiales que se utilizar para visualizar estos
microorganismos. Estas diversas aplicaciones demuestran la
versatilidad de la tincin de Gram.
cas. Lamentablemente, las bacterias no siempre leyeron el Tincin para bacilos cido-alcohol resistentes. Las micobacterias
reglamento. Los microbilogos con buen entrenamiento, prc- estn recubiertas con un material grueso y ceroso resistente a la
tica y deseos de aprender de los errores pueden superar las tincin. Sin embargo, una vez que se tien, las bacterias resis-
Cuadro 1-10 Dificultades en la interpretacin de la tincin de Gram
MICROORGANISMO PRESENTACIN CLSICA VARIANTE DE PRESENTACIN COMENTARIOS
Streptococcus pneumoniae Diplococos grampositivos con Cocos alargados, semejantes a Puede ser mal interpretado como una mezcla de
forma de lanceta bacilos cortos microorganismos
Especies de Acinetobacter Cocobacilos gramnegativos Cocos gramnegativos Puede confundirse con especies de Neisseria e infor-
marse como cocos gramnegativos; buscar el frotis
para comprobar la presencia de algunos microorga-
nismos que demuestren las formas alargadas, las
cuales no han sido vistas en las especies de
Neisseria
Cocos grampositivos Puede confundirse con Streptococcus pneumoniae e

informarse como cocos grampositivos; sumado a la
forma de coco las clulas retienen fuertemente el
cristal violeta durante la decoloracin
Clostridium perfringens Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos o con tincin Puede confundirse con bacilos gramnegativos; la
en tndem de Gram variable forma de vagn es un indicio de que el organismo
es grampositivo; otros clostridios y las especies de
Bacillus pueden tambin aparecer en forma similar
Levaduras, especialmente Clulas grampositivas redondas Clulas con tincin de Gram Puede confundirse con artificios; el tamao y la
Cryptococcus neoformans u ovales con brotaciones variable forma los distinguen de las bacterias

ten el cambio de color con solventes orgnicos fuertes, como el (para evitar el dao al filtro excitador), 2) un filtro excitador
cido-alcohol. En consecuencia, se las conoce como bacilos con un ancho de banda de onda apropiado para la longitud de
cido-alcohol resistentes, un fenmeno descrito por primera onda de la luz que produce el fluorocromo excitado, 3) un fil-
vez en 1881 por Ziehl y Neelsen. tro que absorba el color rojo para bloquear cualquier luz roja
Para esta tincin se requiere un tratamiento especial con el que emitan los filtros de excitacin azul y 4) un filtro barrera
fin de que el colorante primario, la carbolfucsina, penetre el para que absorba cualquier luz residual de excitacin inciden-
material ceroso de los bacilos cido-alcohol resistentes. En la tal de corta longitud de onda (que daara los ojos del operador
tcnica convencional de Ziehl-Neelsen se utiliza el calor. del microscopio) y que permita slo el pasaje de la luz visible
Luego de que la superficie del frotis que se va a teir se cubre de mayor longitud de onda. El rendimiento subptimo de un
con una capa de carbolfucsina, se flamea por debajo del porta- microscopio de fluorescencia se debe a menudo a la mala
objetos con la llama de un mechero Bunsen hacia adelante y seleccin de la combinacin de los filtros. Los fabricantes de
hacia atrs. El frotis se calienta hasta que se observa la presen- microscopios proporcionan la informacin y el asesoramiento
cia de vapor, justo antes de que hierva. La modificacin de la de modo que los usuarios puedan obtener un rendimiento pti-
tincin para bacilos cido-alcohol resistentes realizada por mo. Hoy se comercializan, con un precio aceptable para la
Kinyoun se denomina mtodo fro, porque se utiliza un mayora de los laboratorios clnicos, los sistemas de fluores-
detergente tensioactivo, como Tergitol, en lugar del trata- cencia que utilizan 1) epiluminacin, 2) lmparas halgenas de
miento con calor. luz azul que no requieren transformadores de alto costo y 3) fil-
Con cualquiera de estas tinciones, los bacilos cido-alcohol tros de interferencia con mximos picos de absorcin con lon-
resistentes aparecen de color rojo contra un fondo verde o azul, gitudes de onda visibles ms largas.
segn el contracolor utilizado (lmina en color 1-2B). A pesar Tinciones con fluorocromos para micobacterias. Para demostrar la
de que este mtodo es satisfactorio para la mayora de las mico- presencia de bacilos cido-alcohol resistentes se pueden utili-
bacterias, ciertas cepas de bacilos cido-alcohol resistentes zar los fluorocromos colorantes auramina y rodamina. Los
dbiles de especies de rpido crecimiento (complejo Mycobac- bacilos aparecen de color amarillo, rojo o naranja cuando se los
terium fortuitum/chelonae) se pueden teir mejor con el mto- observa con el microscopio de fluorescencia (segn la combi-
do de Ziehl-Neelsen (en el captulo 19 se encuentra un anlisis nacin de filtros y los colorantes utilizados) y el fondo es oscu-
ms detallado). Adems, ciertas bacterias, como las especies de ro si se emplea permanganato de potasio como contracolora-
Nocardia, muestran de manera caracterstica una dbil o par- cin (lmina en color 1-2C). La utilizacin del procedimiento
cial tincin para bacilos cido-alcohol resistentes. de fluorescencia facilita el examen de los frotis, sobre todo
Tinciones por fluorescencia. El isotiocianato de fluorescena con un objetivo de 25 . Este objetivo proporciona un aumen-
(FITC) y el isetionato de tetrametilrodamina (TMRI) son dos to lo suficientemente bajo como para examinar campos
fluorocromos utilizados con frecuencia, que en su estado exci- microscpicos amplios, y lo suficientemente alto para ver los
tado por accin de la luz ultravioleta o visible de corta longitud puntos de luz amarilla que emanan de las bacterias fluores-
de onda emiten ondas de luz en el espectro visible, con una centes (lmina en color 1-2C). Se puede utilizar mayor aumen-
absorcin mxima de 490 nm y 555 nm, respectivamente. Es- to para confirmar los objetos sospechosos observados con la
tos fluorocromos se unen qumicamente con diversas protenas, lente de 25 .
como antgenos y anticuerpos, y funcionan como una etiqueta La tincin para bacilos cido-alcohol resistentes se puede
o marca a travs de la cual se pueden visualizar las reacciones utilizar tambin para la identificacin de microorganismos
inmunitarias en frotis directos de lquidos biolgicos o secre- diferentes de las micobacterias. Los ovocitos de las especies de
ciones, o en cortes de tejidos. La variacin en la relacin fluo- Cryptosporidium y de Isospora belli, dos microorganismos coc-
rocromo/protena de los diferentes reactivos permite lograr una cdeos que han resultado importantes agentes etiolgicos de las
ptima tincin de los objetos deseados con un mnimo de fondo gastroenteritis, son cido-alcohol resistentes y pueden detec-
no especfico. El desarrollo actual de los anticuerpos monoclo- tarse con facilidad en preparaciones de heces teidas de mane-
nales, que son monoespecficos para sus antgenos respectivos, ra adecuada (lmina en color 1-2J).
condujo a la preparacin de reactivos fluorescentes para la Naranja de acridina. La tincin con naranja de acridina (NA) se
deteccin directa o indirecta de numerosos patgenos: est utilizando cada vez ms en los laboratorios de microbiolo-
Chlamydia trachomatis, especies de Legionella, Treponema ga para detectar bacterias en frotis preparados de lquidos y
pallidum, Toxoplasma gondii y varios virus, como varicela- exudados, en los cuales se espera que las bacterias se hallen en
zster, herpes simple, influenza, citomegalovirus y sincitial baja concentracin (103 a 104 unidades formadoras de colonias
respiratorio, entre otros. [UFC]/mL) o estn atrapadas dentro de un denso agregado de
La microscopia de fluorescencia es una tcnica minuciosa desechos del fondo, lo cual dificulta visualizarlas mediante los
que requiere un microscopio de alta calidad, la combinacin procedimientos de tincin convencionales. En un principio, la
adecuada de los objetivos, condensadores de campo brillante y tincin con NA fue utilizada por los microbilogos para
oscuro, un arco de mercurio o una fuente de luz ultravioleta demostrar la presencia de bacterias en muestras de tierra. En
halgena y la combinacin adecuada de los filtros de excitacin forma similar a cuando se aplican colorantes fluorocromos
y barrera o supresin.21 Los objetivos acromticos son apropia- para el estudio de los bacilos cido-alcohol resistentes, los fro-
dos para la mayora de las aplicaciones, excepto en investiga- tis teidos con NA y examinados bajo luz ultravioleta pueden
cin, en que pueden requerirse lentes apocromticas de mayor ser explorados de manera ms rpida y eficiente con bajo
costo para alcanzar el mximo de iluminacin y resolucin. aumento (100 ) y se examinan con aumento de 450 o mayor
Para un rendimiento ptimo es crtica la seleccin de portaobje- cuando se visualizan formas sospechosas. Esta tincin detecta
tos y cubreobjetos de grosor adecuado y la utilizacin de acei- bacterias vivas y muertas, pero no indica si son grampositivas
tes de inmersin y lquidos de montaje de baja fluorescencia. o gramnegativas. Una vez que la bacteria se ha sido detectada
La eleccin de los filtros para el microscopio de fluorescen- utilizando la tincin con NA, se debe aplicar tincin de Gram
cia tambin es decisiva para un trabajo exitoso. Se requieren para establecer sus caractersticas diferenciales de tincin
cuatro filtros en forma secuencial: 1) uno que absorba el calor (lmina en color 1-2D).

excitacin y de la combinacin de filtros utilizada, cuando se

Recuadro 1-7 Preparacin de una tincin NA las observa con el microscopio bajo luz ultravioleta (lmina en
color 1-2F). Los hongos se diferencian con facilidad de los
desechos del fondo, las clulas y los fragmentos de tejidos. El
Ingredientes: NA en polvo 20 mg, buffer acetato de sodio 290 mL, blanco de calcoflor tiene como ventaja adicional que los cor-
HCl 1 M
tes de tejidos pueden teirse luego con cido perydico de
Preparacin del reactivo: agregar 20 mg de NA en polvo (JT Backer Schiff (PAS), metenamina argntica de Gomori (GMS) u otras
Chemical Co, Philipsburg NJ) a 290 mL de buffer acetato de sodio (solu- tinciones especiales sin interferencia, si se desea la confirma-
cin de reserva 100 mL de 2 molar [M] CH2COONa.3H2O y 90 mL de 1 cin de los hallazgos o disponer de frotis permanentes. La tc-
M HCl); el HCl 1 M debe agregarse en cantidad suficiente para mantener nica es rpida y proporciona una buena definicin de las finas
la tincin diferencial de las bacterias contra el fondo de desechos.56 La estructuras fngicas y un mejor contraste respecto del fondo
solucin debe ser almacenada en una botella color caramelo a temperatu- que la tincin con azul de anilina en lactofenol ampliamente
ra ambiente. utilizada.42
Procedimiento: la tincin se realiza cubriendo completamente la superficie Tincin de impregnacin argntica. Ciertas bacterias, por ejemplo
del frotis del material para ser examinado, previamente fue secado al aire las espiroquetas (incluido el agente etiolgico de la enferme-
y fijado con metanol, con el colorante NA durante 2 minutos, seguido por dad de Lyme, Borrelia burgdorferi) y los pequeos microorga-
un lavado con agua corriente. Los portaobjetos teidos se secan nismos con forma de bacilo asociados con la enfermedad del
y examinan con un microscopio equipado con una fuente de luz araazo de gato (Bartonella henselae y Bartonella quintana),
ultravioleta. no se tien con los mtodos convencionales. Estos microorga-
nismos son muy delgados para ser visualizados por microsco-
pia de campo brillante, no se encuentran presentes en concen-
tracin suficiente como para ser detectados o su composicin
qumica no interacta con los colorantes. La microscopia de
campo oscuro ha sido utilizada para identificar Treponema
Lauer y cols. encontraron que la tincin con NA es ms sen- pallidum, el agente etiolgico de la sfilis y otras espiroquetas
sible que la de Gram para detectar bacterias en los sedimentos de no treponmicas, como Leptospira interrogans, el agente cau-
LCR, sobre todo cuando estn presentes bacterias gramnegati- sal de la leptospirosis. Una limitacin del procedimiento de
vas.56 La tincin con NA tambin es til para el anlisis de mues- campo oscuro es la necesidad de examinar enseguida las mues-
tras de orina en busca de bacteriuria significativa.45 En el recua- tras hmedas que contienen microorganismos vivos ya que la
dro 1-7 se esquematiza la preparacin de la tincin con NA. visualizacin de la bacteria en movimiento es esencial para su
Azul de toluidina y azul de metileno. El azul de toluidina, un colo- deteccin. La tincin argntica se ha sido utilizado para obser-
rante muy relacionado con el azur A y el azul de metileno, se var estos microorganismos en cortes de tejido y se dispone de
utiliza para teir improntas de biopsias de pulmn y frotis de reactivos inmunofluorescentes para la deteccin de algunos
secreciones respiratorias para la deteccin de Pneumocystis patgenos, como T. pallidum.
jiroveci (carinii) en forma rpida. Las tinciones con azul de Las tinciones de impregnacin argntica de Warthin-Starry,
metileno se pueden realizar sobre sedimentos de lquido cefa- Dieterle y Steiner se han utilizado durante aos para demostrar
lorraqudeo en forma conjunta con la tincin de Gram. Las bac- la presencia de espiroquetas en cortes de tejidos fijados en for-
terias gramnegativas H. influenzae y N. meningitidis, no suelen mol. Estas tcnicas se realizan en forma equivalente.
resaltar sobre el fondo teido de rojo en la tincin de Gram. Tincin de Wright-Giemsa. La tincin de Wright-Giemsa suele
Con el azul de metileno, los leucocitos polimorfonucleares se utilizarse para teir los elementos celulares de los frotis de san-
tien de azul y las bacterias que tambin se tien de azul inten- gre perifrica. Tiene poca utilidad para teir bacterias, pero se
so son ms fciles de detectar contra el fondo teido de gris utiliza principalmente para detectar las formas de levaduras
claro (lmina en color 1-2E). La tincin con azul de metileno intracelulares de Histoplasma capsulatum o los amastigotes
debera considerarse un complemento de la tincin de Gram en intracelulares de las especies de Leishmania o Trypanosoma
los laboratorios donde la falta de acceso al microscopio de cruzi (lmina en color 1-2G). Tambin es de utilidad para
fluorescencia imposibilita la utilizacin del procedimiento de demostrar ciertas inclusiones virales intracelulares (vase cua-
tincin con NA. dro 1-8).
Blanco de calcoflor. El blanco de calcoflor, un colorante inco- cido perydico de Schiff. La tincin con cido perydico de
loro utilizado en la industria para blanquear telas y papeles, Schiff se basa en la oxidacin de las hexosas y las hexosaminas
tiene dos propiedades que lo hacen til en microbiologa: 1) la por medio del cido perydico, que rompe sus anillos de pira-
unin a los polisacridos con uniones 1-3 o 1-4 (especfica- nosa y produce dialdehdos que reaccionan con el reactivo de
mente a la celulosa y a la quitina) y 2) la fluorescencia cuan- Schiff. ste es un colorante trifenilmetano preparado a partir
do es expuesto a luz ultravioleta de longitudes de onda larga y de fucsina bsica o p-rosanilina mediante la reduccin con
a la luz visible de longitud de onda corta. El blanco de calco- cido sulfrico. La mayora de las sustancias que contienen
flor es una valiosa tincin con fluorocromo para la deteccin hexosas o hexosaminas son PAS positivas y se tien de color
rpida de hongos en preparados hmedos, frotis y cortes de rojo contra un fondo verde o azul de acuerdo con la contraco-
tejido, debido a que la pared celular de los hongos y las plan- loracin utilizada. Esta tincin se utiliza en forma muy fre-
tas es rica en quitina. Esta tincin ha sido til principalmente cuente para demostrar la presencia de hongos en cortes de teji-
en la deteccin de levaduras, hifas y seudohifas en raspados de dos (lmina en color 1-2H).
piel y de mucosas. Cuando se lo mezcla con hidrxido de
potasio al 10%, se puede realizar la bsqueda rpida de der-
matofitos en los montajes de raspado de piel. Las estructuras PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
fngicas muestran un color verde manzana brillante o un blan- Una vez recibida la muestra para cultivo en el laboratorio de
co azulado fantasmal, segn la longitud de onda de la luz de microbiologa, se deben tomar las siguientes decisiones:

1. Seleccionar el medio de cultivo primario apropiado para la tras clnicas. Para el aislamiento de Haemophilus influenzae se
muestra en particular. necesita agar sangre de caballo, agar sangre de carnero con adi-
2. Determinar la temperatura y la atmsfera de incubacin para tivos, como IsoVitaleX (o un suplemento similar que incluya
el aislamiento de todos los microorganismos potencialmen- nicotinamida adenina dinucletido [NAD] y un producto deri-
te importantes. vado del hemo) porque no tiene efectos inhibitorios sobre el
3. Determinar cul de los aislamientos que se recuperaron en el crecimiento bacteriano y es una fuente rica de factor X. El agar
medio primario requieren caracterizacin posterior. chocolate tambin es importante para el aislamiento de
4. Establecer la necesidad de realizar el antibiograma. Neisseria gonorrhoeae.
El agar sangre puede hacerse selectivo mediante el agregado
No se puede esperar que un nico enfoque cubra todas las de antibiticos o inhibidores qumicos. Es una regla general que
necesidades de los laboratorios y del mbito clnico. El proto- los agares con inhibidores no deben utilizarse solos, porque sue-
colo utilizado en un hospital de 50 camas de una comunidad len inhibir los organismos de inters, slo menos que a la otra
rural diferir del que se emplea en un gran centro mdico con flora. Muchas veces la inhibicin es slo parcial, por lo tanto el
mltiples departamentos. Sin embargo, todos reconocen las crecimiento en un agar selectivo no debe tomarse como prueba
dificultades de mantener la calidad del servicio frente a la de que se aisl el microorganismo diana. Por ejemplo, los ente-
demanda cada vez ms exigente en la contencin de los costos. rococos y las levaduras a menudo crecen y producen pequeas
Los directores y los supervisores deben eliminar gran parte del colonias en el agar de MacConkey sobre todo si la formulacin
trabajo sin relevancia clnica que se realizaba en el pasado. Se no contiene violeta de genciana.
espera que los tiempos del pancultivo (la solicitud indiscri- Tambin se puede lograr que un medio sea diferencial
minada de cultivos de todos los sitios accesibles del cuerpo con mediante el agregado de ciertos colorantes u otras sustancias
la esperanza de aislar un patgeno) se hayan terminado. qumicas y obtener as algunos indicios acerca de la identidad
Durante las dcadas pasadas muchos microbilogos han trata- del microorganismo aislado. En el cuadro 1-11 se resumen
do de ejercer lo que Barlett llama control del procesamiento:5 algunos de los medios inhibidores y diferenciales preparados
restriccin del procesamiento e informe de muestras para cul- con agar.
tivo slo a aquellas que proporcionarn una informacin previ- Tcnicas para la transferencia y el cultivo de muestras clnicas. Una
siblemente til. vez que una muestra super los numerosos criterios de
Seleccin del medio para un cultivo primario. En un laboratorio rechazo y fue aceptada para su cultivo, se deben transferir
diagnstico se requieren slo unos pocos medios de uso dia- cantidades adecuadas de sta a los medios de cultivo ya des-
rio. Comnmente se utilizan placas de agar. La inoculacin de critos. Esta actividad suele llevarse a cabo en un rea del
caldos de cultivo para el aislamiento primario de microorga- laboratorio diseada para tal fin. La transferencia de todas las
nismos debe limitarse a algunos tipos de muestras para las muestras a los medios de cultivo debe realizarse en una cabi-
cuales se ha demostrado la utilidad de estos caldos suplemen- na de seguridad biolgica (vase ms adelante). La mejor
tarios (vase cuadro 1-6). En la mayora de los laboratorios se poltica es manipular todas las muestras como si fueran alta-
ha abandonado la prctica de inocular de rutina el caldo de tio- mente infecciosas. Se debe exigir que el personal utilice
glicolato para el aislamiento de anaerobios o como un proce- guantes de goma cuando manipula la mayora de las mues-
so de enriquecimiento para recuperar patgenos de las heces. tras; el uso de una mscara de ciruga es opcional, ya que no
En casi todas las circunstancias, el aislamiento de un microor- es necesario para gran parte de los procedimientos que se rea-
ganismo en caldo de cultivo luego de 4 o 5 das de incubacin lizan en el laboratorio de diagnstico microbiolgico (excep-
tendr muy poca relevancia clnica. La incubacin de los cal- to para la micobacteriologa).
dos de cultivo por perodos prolongados tambin lleva al ais- El rea de inoculacin debe estar equipada con todos los
lamiento frecuente de contaminantes.71 Los aislamientos bac- implementos necesarios y se debe contar con reserva de medios
terianos en muy baja concentracin rara vez son significativos de cultivo. Para un almacenamiento prolongado, la mayora de
y el tiempo prolongado de aislamiento suele dar informacin los medios deben refrigerarse, pero se los debe templar a tem-
irrelevante para el tratamiento eficaz del paciente. En algunos peratura ambiente para su inoculacin.
laboratorios se inoculan los caldos de cultivo para ciertas A pesar de que el personal que trabaja tiempo completo en
muestras, pero slo se los examina si no se detecta crecimien- el rea de organizacin puede conocer de memoria los medios
to en las placas de agar o si las bacterias, cuya morfologa se de cultivo que requiere cada tipo de muestra, es esencial tener
observ en un frotis directo de un material de un paciente, no los protocolos adecuados y las instrucciones escritas en un
se aislaron en el agar. boletn de anuncios o incluidas en el manual de polticas y
En algunas situaciones los caldos de cultivo son tiles o inclu- procedimientos para las personas que realizan estas tareas en
so esenciales. El caso ms obvio es el hemocultivo, en el cual la forma ocasional. Se debe procurar que el procesamiento de
mayora de las veces se espera un nico patgeno y no flora las muestras sea llevado a cabo por personal bien entrenado,
comensal. Otras situaciones clnicas cumplen con estos princi- bajo una estricta supervisin. Los errores o los juicios equi-
pios y en ellas los caldos de cultivo pueden ser tiles: la perito- vocados que se cometen durante esta fase del ciclo de diag-
nitis bacteriana espontnea (primaria) (opuesta a la peritonitis nstico pueden anular toda la pericia profesional que se pueda
que se produce luego de la rotura de una vscera abdominal),9 las aplicar en la lectura e interpretacin de los cultivos. Los
infecciones peritoneales en pacientes que reciben dilisis perito- microbilogos y los tcnicos expertos a menudo no pueden
neal2 y la artritis sptica.46 llegar a un diagnstico definitivo porque se seleccion un
Los medios pueden ser selectivos o no selectivos. Los medio inadecuado o incorrecto para una muestra.
medios no selectivos no contienen inhibidores y en ellos pue- Tcnicas para el cultivo de las muestras. El equipamiento necesa-
den crecer la mayora de los microorganismos que se aslan en rio para la inoculacin primaria de las muestras es bastante
los laboratorios clnicos. El medio no selectivo ms utilizado es simple. Se recomienda el uso de un ansa o ansa recta de inocu-
el agar sangre de carnero al 5% y se lo incluye en el conjunto de lacin de Nichrome o de platino (fig. 1-6), con un extremo
los medios de aislamiento primarios para casi todas las mues- insertado en una empuadura cilndrica para facilitar su utili-

Cuadro 1-11 Agares diferenciales e inhibidores utilizados con mayor frecuencia
AGAR INHIBIDOR (I) COMPUESTOS MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS COMENTARIOS/REFERENCIA

O DIFERENCIAL (D) AGREGADOS (I O D) INHIBIDOS ENRIQUECIDOS DE CAPTULO
Bacteriodes bilis-esculina Sales biliares (I); esculina (D) Mayora de las bacterias Grupo de Bacteroides La bilis estimula el crecimiento de B.
(BBE) (I, D) fragilis fragilis
Campy-BAP (I) Bacitracina, novobiocina, colisti- Mayora de las bacterias Campylobacter jejuni La incubacin a 42 C tambin selec-
na, cefalotina, polimixina B (I) ciona a C. jejuni
CCFA (I, D) Cicloserina, Cefoxitina (I); Mayora de las bacterias Clostridium difficile Colonias amarillas; muy inhibidor
Fructosa (D)
CHROMagar (D) Varios (D) ND (no disponible) Varios El color sugiere la identificacin de las
colonias
CIN (I) Cefsulodina, Irgasan, Mayora de las bacterias Especies de Yersinia Varias formulaciones disponibles
novobiocina (I) Especies de
Aeromonas
CNA (I) Colistina, cido nalidxico (I) Bacterias gramnegativas Bacterias grampositivas Se inhiben la mayora de las cepas de
Staphylococcus saprophyticus34 y
algunas cepas de S. aureus
EMB (I, D) Eosina (I); eosina, azul de metile- Bacterias grampositivas Bacterias gramnegativas Ligeramente selectivo (inhibidor); los
no, lactosa, sacarosa (D) organismos fermentadores de lactosa
o sacarosa producen colonias azul-
negro (los fermentadores de sacarosa,
como Yersinia enterocolitica, apare-
cen idnticos a los fermentadores de
lactosa); los fuertes fermentadores de
lactosa (como Escherichia coli o
Candida kefyr) producen brillo verde
caracterstico
Hektoen entrico Sales biliares (I); lactosa, s Bacterias grampositivas Patgenos entricos* Moderadamente inhibidor; los fermen-
(HE) (I, D) acarosa, salicina, azul de bro- tadores de lactosa (sacarosa, salicina)
motimol, fucsina cida (D); tio- producen colonias verdes; los pro-
sulfato de sodio, citrato amnico ductores de sulfuro de hidrgeno for-
frrico para la produccin de man colonias negras
sulfuro (D)
LKV (I) Kanamicina, vancomicina (I) Bacterias aerobias; Bacilos gramnegativos Se agrega sangre hemolizada como
bacterias grampositivas anaerobios, particular- fuente de nutrientes; en este medio
anaerobias mente Bacteroides pueden seleccionarse enterococos
resistentes a la vancomicina
MacConkey (I, D) Sales biliares, cristal violeta (I); Bacterias grampositivas Patgenos entricos* Moderadamente inhibidor (selectivo);
lactosa, rojo neutro (D) los fermentadores de lactosa produ-
cen colonias rojas; estn disponibles
formulaciones sin cristal violeta
Manitol-sal (I, D) NaCl (I); Manitol, rojo fenol (D) Bacterias gramnegativas; Staphylococcus aureus Los estafilococos coagulasa negativos
bacterias grampositivas crecen en agar sal, pero no fermentan
que no sean manitol
Staphylococcus
Micobitico/micosel (I) Cloranfenicol, cicloheximida (I) Bacterias; hongos Dermatofitos, hongos dis-
saprofticos (y algunos mrficos
patgenos fngicos)
(Contina)

Cuadro 1-11 Agares diferenciales e inhibidores utilizados con mayor frecuencia (cont.)
AGAR INHIBIDOR (I) COMPUESTOS MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS COMENTARIOS/REFERENCIA

O DIFERENCIAL (D) AGREGADOS (I O D) INHIBIDOS ENRIQUECIDOS DE CAPTULO
PC (Pseudomonas Violeta de genciana, sales biliares Bacterias grampositivas; Burkholderia cepacia Alta selectividad; las colonias rosas
[Burkholderia] cepacia) para bacterias grampositivas (I); la mayora de las bacte- no son completamente especficas
(I, D) polimixina B, ticarcilina para rias gramnegativas para B. cepacia
bacterias gramnegativas (I);
piruvato (D)
PEA (I) Feniletil alcohol (I) Bacterias gramnegativas Bacterias grampositivas
Salmonella-Shigella (SS) Sales biliares, verde brillante (I); Bacterias grampositivas Patgenos entricos* Ms inhibidor (selectivo) que el agar
(I, D) lactosa, rojo neutro (D); tiosul- de MacConkey y el agar EMB;
fato de sodio, citrato amnico pueden inhibirse las especies de
frrico para sulfuro de hidrge- Shigella
no (D)
Sorbitol- MacConkey (I, Sales biliares, violeta de genciana Bacterias grampositivas Escherichia coli O157 Agar para bsqueda de E. coli pro-
D) (I); sorbitol, rojo neutro (D) (sorbitol negativa) ductora de verotoxina
TCBS (I, D) Tiosulfato de sodio, citrato de Bacterias grampositivas; la Especies de Vibrio Las especies fermentadoras de saca-
sodio, NaCl para bacterias mayora de las bacterias rosa aparecen amarillas, las espe-
gramnegativas (I); sales biliares, gramnegativas cies que utilizan citrato aparecen
NaCl para bacterias grampositi- azules
vas (I), sacarosa, azul de timol-
azul de bromotimol (D)
Medio selectivo GC Vancomicina para bacterias gram- Bacterias grampositivas; Neisseria gonorrhoeae, Mltiples formulaciones disponibles.
(Thayer-Martin, Martin- positivas (I); colistina para bac- bacilos gramnegativos Neisseria meningitidis Algunas cepas de N. gonorrhoeae
Lewis, etc. modificados) terias gramnegativas (I); trime- se inhiben con vancomicina. De
(I) toprima para los abundantes manera ptima debera inocularse
Proteus (I); nistatina, anfoterici- tambin agar chocolate
na B o anisomicina para levadu-
ras (I); suplementos para el cre-
cimiento
XLD (I, D) Sales biliares, NaCl (I); lactosa, Bacterias grampositivas Patgenos entricos* Funciona de manera similar al agar
sacarosa, xilosa, rojo fenol (D); de Hektoen entrico
tiosulfato de sodio, citrato am-
nico frrico para produccin de
sulfuro de hidrgeno (D)
* Patgenos entricos = especies de Salmonella, especies de Shigella y especies de Yersinia.
zacin. La muestra puede ser inoculada de diferentes maneras culacin para desenmascarar las hemolisinas lbiles a la pre-
sobre la superficie del agar en la placa de Petri, una de las cua- sencia de oxgeno, lo cual aumenta la deteccin de estreptoco-
les se muestra en la figura 1-7. La inoculacin primaria puede cos -hemolticos. Tambin se deben sumergir en la profundi-
realizarse con un ansa, un hisopo u otro dispositivo adecuado. dad del agar los pequeos fragmentos de tejido que se enviaron
Una vez que se realiz el inculo primario, se puede utilizar un para el aislamiento de hongos. El crecimiento inicial de
ansa o un ansa recta para esparcir el material dentro de los cua- muchas especies de hongos se ve favorecido por la atmsfera
tro cuadrantes de la placa, como se muestra en la figura 1-8. El microaerfila que se encuentra debajo de la superficie del agar.
inculo se siembra en estra con un movimiento hacia atrs y En la figura 1-9 se muestra la tcnica de siembra en estra
hacia adelante dentro de cada cuadrante girando la placa en utilizada para inocular el agar para el recuento semicuantitati-
ngulos de 90. El ansa o el ansa recta debe esterilizarse entre vo de colonias. Las ansas de inoculacin desechables de pls-
las sucesivas siembras en estra en cada cuadrante. El propsi- tico o de materiales diferentes del hierro (Nichrome o de pla-
to de este proceso es diluir suficientemente el inculo sobre la tino), calibradas para contener 0,01 o 0,001 mL de lquido, se
superficie del medio con agar de manera de obtener colonias de sumergen en una muestra de orina no centrifugada. Luego,
bacterias bien aisladas, conocidas como unidades formadoras se retira el ansa con cuidado y se coloca el volumen completo
de colonias (UFC). Las colonias aisladas pueden subcultivar- sobre la superficie del agar haciendo una nica estra a travs
se de manera individual en otro medio para obtener poblacio- del centro. El inculo se esparce de modo uniforme en ngulos
nes puras de microorganismos para su estudio posterior. rectos respecto de la primera estra; luego se gira la placa 90 y
Cuando se siembran en estra en una placa de agar sangre los se esparce el inculo hasta cubrir la superficie completa. En
hisopados farngeos enviados para la bsqueda de estreptoco- algunos laboratorios, se inoculan dos placas, una con el ansa de
cos, se deben realizar mltiples punzadas en las reas de ino- 0,01 mL y la otra con la de 0,001 mL, lo cual se utiliza como

1 2
3 4
Figura 1-6 Ansa y ansa recta utilizadas para la transferencia e inoculacin de
muestras y cultivos. Figura 1-8 Patrn de siembra en estra para la inoculacin de muestras sobre
placas de cultivo para obtener colonias bacterianas aisladas.
control de calidad. A pesar de que las ansas de inoculacin 60 mL de colorante a una cubeta con 2 mL de agua que luego
estn calibradas para tomar el volumen de orina establecido, la se lee en un espectrofotmetro a 590 nm, o 2) en forma mano-
exactitud tiene una tasa de error de 50% sobre todo cuando mtrica, anotando el cambio en el peso de un disco de papel
se utiliza el ansa de 0,001 mL.1 La toma de muestra en posicin de filtro ubicado sobre la bandeja de una balanza analtica muy
vertical de un recipiente pequeo puede slo contener el 50% sensible, cuando se le agrega un ansa de agua. Existen dispo-
del volumen establecido; mientras que la toma de muestra hori- sitivos para tomar un inculo estndar a partir de muestras
zontal en un ngulo de 45 de un recipiente grande puede con- lquidas.59
tener 150% del volumen. Los microbilogos deben estar aler- Luego de 18 a 24 horas de incubacin se estima el nmero
tados sobre estos posibles errores y utilizar un ngulo estndar de bacterias en una muestra de orina mediante el recuento de
para el muestreo en el laboratorio, basndose en el volumen de colonias sobre la superficie del agar. Como se muestra en la
los recipientes. figura 1-10, hay aproximadamente 50 colonias. Si se utiliz un
Se pueden realizar estudios de exactitud y precisin del ansa de 0,001 mL para inocular el medio, el nmero de colo-
volumen del inculo: 1) en forma fotomtrica, agregando un nias debe multiplicarse por 1 000. Por lo tanto, el recuento de
ansa de violeta de genciana tomada a partir de un recipiente de esta figura es 50 000 UFC/mL.
1 2 3
Inoculacin primaria Estras Estras en ngulo
en ngulo recto recto para producir
una superficie
Figura 1-7 La superficie de una placa de agar se inocula con una muestra de crecimiento
contenida dentro de un ansa de inoculacin. La inoculacin se logra tocando
primero la superficie del agar en un rea pequea, luego haciendo un movi- Figura 1-9 Placas de cultivo donde se muestran los patrones de siembra en
miento en forma de estra de un lado a otro sobre la superficie mediante un estra de muestras en las cuales se realizar un recuento semicuantitativo de
patrn que se muestra en la figura 1-8. bacterias.

Las tcnicas semicuantitativas se utilizan ms a menudo con

las muestras de orina, pero tambin se han empleado para otros
tipos de situaciones. La cuantificacin de bacterias aisladas de
las vas areas bajas por tcnicas de broncoscopia puede ayu-
dar en la interpretacin de estos cultivos.20 Cuando las bacterias
estn presentes en concentraciones mayores de 103104 UFC,
la probabilidad de que sean el agente causal de la neumona es
mayor que cuando se encuentran en menor cantidad. Se puede
evitar un trabajo considerable si no se realiza el anlisis de los
recuentos bajos que corresponderan a flora contaminante de la
faringe.
Para evaluar la probabilidad de que los catteres intravascu-
lares sean la fuente de una bacteriemia, suelen emplearse los
cultivos semicuatitativos. A pesar de que se han utilizado
numerosas tcnicas, el enfoque ms usual es hacer rodar el seg-
mento amputado del catter sobre la superficie del agar.60 Si los
recuentos muestran ms de 15 colonias bacterianas, existe una
asociacin estadstica entre el aislamiento de la bacteria y la
bacteriemia relacionada con los catteres. En este enfoque, el
catter se extrae con el objeto de realizar el anlisis. La cuanti-
ficacin de las bacterias en una muestra de sangre obtenida a
travs de un catter intravascular permanente se ha utilizado,
adems, para determinar el papel del catter en un proceso
infeccioso.32 Figura 1-10 Placa doble de agar sangre-agar de MacConkey previamente
La cuantificacin tambin puede ser de utilidad en virologa estriada para un recuento semicuantitativo de colonias como se ilustra en la
para determinar el significado de un virus, como citomegalovi- figura 1-9. Aparecen, aproximadamente, 50 colonias a cada lado de la placa.
Si se utiliz para la siembra en estra en cada medio un ansa de inoculacin de
rus, que puede provocar una infeccin persistente.10 Adems, orina semicuantitativa calibrada de 0,001 mL, el recuento de colonias sera
puede controlarse la eficacia de la quimioterapia antiviral a trade 50 000 unidades formadoras de colonias (UFC) por mL.
vs del seguimiento de la cantidad de virus presente.47 Muchos
de los anlisis cuantitativos para las enfermedades virales (car-
gas virales) emplean la deteccin molecular en lugar de los cul-
tivos. crecimiento de las bacterias contaminantes. Otras muestras que
Los medios en los tubos pueden ser lquidos, semislidos se envan para el aislamiento de micobacterias, como la orina o
(0,3% a 0,5% de agar) o slidos (1% a 2% de agar). El agar la suspensin de heces, tambin pueden ser tratadas brevemen-
semislido es adecuado para ensayos de movilidad. Un tubo te con NaOH para eliminar las bacterias colonizantes. De
con caldo puede inocularse con los mtodos que se muestran en manera similar, se pueden utilizar antibiticos para controlar el
la figura 1-11. El tubo debe inclinarse en un ngulo aproxima- crecimiento bacteriano en el medio de cultivo y en las mono-
do de 30 y el ansa de inoculacin con la muestra debe tocar la capas de clulas que se emplean para el aislamiento de virus.
superficie interna del vidrio, justo por arriba del punto donde Los lquidos corporales, como los obtenidos por toracentesis
la superficie del caldo forma un ngulo agudo. Cuando el tubo y paracentesis, primero deben dejarse sedimentar, luego de lo
de cultivo retorna a su posicin vertical, el rea de inoculacin
queda sumergida por debajo de la superficie. Los directores de
laboratorio y los supervisores de microbiologa deben determi-
nar qu muestras deben transferirse a caldos de cultivo de ruti-
na (vase cuadro 1-6).
El agar en pico de flauta (en tubo inclinado) se inocula
punzando primero la profundidad del agar y luego haciendo
una estra sobre el agar inclinado desde abajo hacia arriba con
un movimiento de S a medida que se retira el ansa recta de ino-
culacin (figs. 1-12 y 1-13). Cuando se inocula un tubo de agar
semislido para ensayos de movilidad, es importante que el
ansa recta de inoculacin se retire exactamente por el mismo
sitio en que se punz el medio. Un movimiento en abanico Punto de Punto de
puede dar como resultado un patrn de crecimiento a lo largo inoculacin inoculacin
de la lnea de puncin que puede interpretarse en forma err-
nea como movilidad bacteriana.
Ciertas muestras pueden necesitar centrifugacin o filtrado
para concentrar cualquier microorganismo presente. Las mues-
tras densas y mucosas de esputo pueden hacerse ms lquidas A B
con N-acetilcistena (Mucomyst, WellSpring Pharmaceutical
Corp., Neptune, NJ) para facilitar la siembra en estra sobre la Figura 1-11 Tcnica para la inoculacin de un caldo de cultivo en un tubo.
(A) Inclinar el tubo e inocularlo tocando la superficie interna hmeda del
superficie del agar. Las muestras de esputo que se procesan vidrio en el ngulo agudo del menisco. (B) Retornar el tubo a la posicin ver-
para el aislamiento de las especies de Mycobacterium deben tical, lo cual tiene el efecto de sumergir el punto de inoculacin bajo la super-
tambin tratarse con hidrxido de sodio para reducir el sobre- ficie.

2. Las relaciones semicuatitativas de los tipos bacterianos ais-

lados se pueden ver en una placa de agar pero se pierden en
un caldo de cultivo.
3. El frotis directo, tan importante para determinar la naturale-
za inflamatoria de una muestra, y los tipos de bacterias pre-
sentes, se pierden si se inocula la muestra completa en un
caldo.
Las muestras de lquido cefalorraqudeo, en particular para

el aislamiento de Cryptococcus neoformans, deben centrifu-
garse y parte del sedimento transferirse al medio de cultivo
apropiado; o preferiblemente, se debe pasar el lquido por un
filtro microbiolgico de 0,45 m para atrapar a las levaduras
ms grandes que pudieran estar presentes.
Los microorganismos difieren en su temperatura ptima de
incubacin. En los laboratorios pequeos que cuentan con
recursos limitados, a veces no es posible disponer de las tem-
peraturas ptimas de incubacin para el crecimiento de todos
A B los aislamientos clnicos. La mayora de los microorganismos
crecen a 35 C; por lo tanto, si se dispone de un solo incuba-
Figura 1-12 Tcnica de inoculacin en agar inclinado con un ansa recta. (A) dor, ste debe fijarse a 35 C. Incluso los microorganismos
Pinchar en profundidad el agar en pico de flauta hasta una distancia de 2-3 mm como Campylobacter jejuni, que crece en forma ptima a
del fondo del tubo. Si se toca el fondo del tubo puede ingresar aire e invalidar
las condiciones anaerobias. (B) Retirar lentamente el ansa recta y estriar la
42 C, crecern a 35 C si se los incuba por 24 a 48 horas ms.
superficie del agar con un movimiento de un lado a otro en forma de S. Sin embargo, en este caso se pierde el efecto diferencial de la
incubacin a temperaturas mayores en las que otras bacterias
no crecen. El crecimiento de la mayora de los microorganis-
mos se ve favorecido en una atmsfera de 5% a 10% de CO2.
Si se dispone slo de aire ambiental, es decir de un incubador
sin CO2, los tubos y las placas de cultivo pueden ubicarse en
cual las alcuotas de sedimento se centrifugan para concentrar una jarra de anaerobiosis por extincin con una vela y colocar
cualquier bacteria que pudiera estar presente. Se deben propor- entonces todo este dispositivo en incubacin. Por el contrario,
cionar frascos de hemocultivo para inocular en forma directa se puede mantener una atmsfera de aire ambiental en un incu-
ciertas muestras, como ya se analiz. Esta prctica es adecua- bador con CO2 colocando los cultivos dentro de una jarra con
da en las pocas situaciones en las que se esperan pequeas can- la tapa muy ajustada (es adecuada una jarra o cmara de anae-
tidades de un nico patgeno. En otras situaciones debe desa- robiosis). Sin embargo, hay que tener en cuenta que un micro-
lentarse esta prctica por numerosas razones: organismo como C. jejuni, que requiere una tensin reducida
de oxgeno del 5% o menor, tendr dificultades para crecer en
1. Si se encuentran presentes especies bacterianas mixtas, las una jarra de anaerobiosis por extincin de una vela, en la cual
bacterias que crezcan ms rpido sobrepasarn en nmero a la concentracin de oxgeno se encuentra en el rango de 10%.
sus parientes que crecen ms lentamente. Muchos microorganismos crecen en forma ptima dentro de
un estrecho rango de temperatura; otros tienen un espectro rela-
tivamente amplio dentro del cual pueden aislarse. Ya se men-
cion la temperatura ptima de crecimiento de C. jejuni s de
42 C. La mayora de los hongos crecen a 30 C; sin embargo,
pueden ser aislados a temperatura ambiente o a 35 C en el
medio adecuado. Yersinia enterocolitica crece de manera pti-
ma apenas por encima de la temperatura ambiente. No obstan-
te, la mayora de las cepas tambin crecern a 35 C, aunque las
colonias pueden ser pequeas o requerir un perodo de incuba-
cin adicional de 24 horas. Por consiguiente, no es habitual que
la disponibilidad de una nica estufa de incubacin comprome-
ta la capacidad del microbilogo de aislar la mayora de las bac-
terias de importancia clnica. En los grandes laboratorios donde
existe posibilidad de contar con varias temperaturas de incuba-
cin, el aislamiento de los microorganismos es, a menudo, ms
rpido y la apariencia de las colonias se asemeja ms a la mor-
fologa verdadera. En ocasiones, la incubacin a temperatura
ambiente por un perodo prolongado puede ser necesaria para
demostrar ciertas caractersticas bioqumicas o fsicas, como la
produccin de un pigmento y la movilidad. Estos ajustes se
Figura 1-13 Tcnica para la inoculacin de la profundidad de un agar con un
ansa recta como se mostr en la figura 1-12A. La parte profunda del medio se
aprenden con la experiencia y por ensayo y error.
pincha con el ansa recta hasta una distancia de 2-3 mm del fondo del tubo; des- Aun ms importante que una temperatura especfica de incu-
pus de sacar lentamente la aguja, se estra la superficie del agar con un movi- bacin es, probablemente, evitar las fluctuaciones en la tempe-
miento de un lado a otro en forma de S, como se muestra en la figura 1-12B. ratura de la estufa. Se debe controlar esa temperatura de modo

muy estricto con fluctuaciones no mayores de 12 de un da

para otro. Las estufas de incubacin deben ubicarse y prote-
gerse de manera que las perillas de control no puedan ser fcil-
mente alteradas por el personal de limpieza durante las horas
en que el laboratorio est cerrado.
Tambin es importante el control de la humedad interna de
la estufa. La mayora de los microorganismos crecen al mxi-
mo cuando la humedad es de 70% o mayor y los medios de
cultivos tienden a deteriorarse ms rpidamente cuando se
secan de manera inapropiada. El aislamiento en particular de
H. pylori, y en menor medida, de N. gonorrhoeae requiere una
atmsfera de alta humedad. La mayora de las estufas com-
pradas durante los ltimos aos contienen reservorios de agua
mediante los cuales se puede controlar la humedad en la cma-
ra de incubacin. De lo contrario, se pueden ubicar sobre los
estantes recipientes abiertos de boca ancha con agua para que
proporcionen por evaporacin la humedad necesaria. Tambin
se debe controlar peridicamente las estufas para verificar que Figura 1-14 Placa de agar, la cual ha sido inoculada con una muestra de piel,
que contiene flora bacteriana mixta. Se puede ver el rastro zigzagueante de
no se produzcan derrames que pasan inadvertidos y que pue- bacterias en medio de las colonias aisladas (flecha). Adems, los patrones line-
den producir contaminaciones o una acumulacin de sustan- ales inusuales de las colonias maduras pueden representar el mismo proceso
cias qumicas de los reactivos que inhiban el crecimiento bac- (puntas de flecha). La explicacin ms probable es que un insecto que estaba
teriano. presente en la muestra transport las bacterias alrededor de la placa. Se des-
cribi que este fenmeno es producido tambin por las amebas de vida libre.
INTERPRETACIN DE LOS CULTIVOS

La interpretacin de los cultivos primarios despus de 24 a
48 horas de incubacin requiere una habilidad considerable. A
partir de la observacin inicial el microbilogo debe determi- estril. Es difcil evitar la sospecha de que alguien estornud
nar la naturaleza de las colonias aisladas y decidir si se requie- sobre la placa, pero la evaluacin posterior depender del an-
ren otros procedimientos. Los parmetros relevantes son las lisis de todos los factores, quizs incluso consultando con el
caractersticas y el nmero relativo de cada tipo de colonia que mdico. En la figura 1-14 se muestra un fenmeno de labora-
se aisl en el cultivo en agar; la pureza, la reaccin de Gram y torio muy inusual.
la morfologa de las bacterias en cada tipo de colonia; y los Caractersticas macroscpicas de las colonias. La determinacin
cambios en el medio, los cuales reflejan la actividad metabli- de las caractersticas generales de las colonias suele realizarse
ca de las bacterias en las colonias adyacentes. a travs de la inspeccin de la superficie de la placa de agar.
Durante el proceso de obtencin de las muestras de los Este anlisis se realiza sosteniendo la placa en una mano y
pacientes o de su manipulacin en el laboratorio se pueden observando la superficie del agar para verificar la presencia de
introducir microorganismos extraos del ambiente o de la flora crecimiento bacteriano (fig. 1-15). Las placas de cultivo estn-
propia del individuo que manipula el cultivo. Por ejemplo, en dares tienen un dimetro de 100 mm y son adecuadas para sos-
los hemocultivos es frecuente el hallazgo de flora de la piel que tenerlas con una mano. Debe estudiarse cada placa con cuida-
debe interpretarse con cuidado. Adems, se pueden introducir do, porque la bacteria que se asla inicialmente de las muestras
contaminantes en el proceso de fabricacin y manipulacin se encuentran a menudo en un cultivo mixto y puede haber pre-
de los productos microbiolgicos, como las placas de agar. sentes diversos tipos de colonias. Las colonias puntiformes de
Puede ser extrao que una colonia aparezca en la segunda o la bacterias de crecimiento lento pueden pasarse por alto entre
tercera rea de siembra en estra de la placa, sin que haya cre- colonias ms grandes, sobre todo si hay una tendencia de cre-
cido en la zona de inoculacin inicial. Estas colonias pueden cimiento a esparcirse sobre la superficie de la placa.
ignorarse aunque se les debe prestar especial atencin a los Durante el examen, las placas deben ser inclinadas en varias
patgenos importantes que son contaminantes poco comu- direcciones, bajo iluminacin directa brillante, de manera que
nes. Un problema mayor se presenta cuando desarrolla una la luz se refleje desde varios ngulos. Se recomienda la utiliza-
nica colonia de un microorganismo de la piel, como cin de una lupa o de un microscopio de diseccin para ayudar
Staphylococcus coagulasa negativo, en la zona primaria de ino- en la deteccin de las colonias pequeas o inmaduras y mejo-
culacin. Existe, por supuesto un tercio o un cuarto de proba- rar la observacin de sus caractersticas (fig. 1-16). Las placas
bilidad de que un contaminante de la placa se encuentre en la de agar sangre deberan examinarse con un transiluminador de
primera zona. Si la muestra es crtica, como lquido cefalorra- luz brillante por detrs para detectar las reacciones de hemli-
qudeo, y se conserv en el laboratorio, puede inocularse nue- sis en el agar (fig. 1-17).
vamente sobre la superficie del agar. Aunque no es apropiado La figura 1-18 contiene trminos e ilustraciones tiles para
ignorar la cepa aislada en estas circunstancias, corresponde la descripcin de las colonias bacterianas. En los recuadros 1-
adjuntar un comentario donde conste que se aisl una nica 8 a 1-10 se esquematizan guas adicionales.
colonia y que no fue nuevamente aislada en la muestra. Luego, Aunque son difciles de describir en forma especfica, los
el mdico puede reunir la evidencia del laboratorio y clnica olores producidos por la accin de ciertas bacterias en los me-
antes de hacer la interpretacin final del significado. dios de cultivo slidos y lquidos pueden ser muy tiles en la
A veces se presentan situaciones atpicas. Por ejemplo, se identificacin tentativa de los microorganismos involucrados
pueden aislar microorganismos mixtos que se asemejan a la (cuadro 1-12). El olfateo siempre debe realizarse con precau-
flora propia de las vas areas altas de un sitio normalmente cin, levantando la tapa de la placa de Petri levemente para

Figura 1-17 Tcnica para el anlisis del crecimiento de las colonias en la

superficie de una placa de agar utilizando la luz transmitida. Esta tcnica es til
para la evaluacin de las propiedades hemolticas de las colonias que crecen en
agar sangre.
Figura 1-15 Tcnica para el anlisis de la superficie de la placa de agar por

medio del reflejo directo y oblicuo de la luz.
puntiforme irregular
Forma circular rizoide
filamentosa ahusada
pulviniforme
plana
en forma
Elevacin elevada de botn
convexa umbilicada
liso corrodo
o continuo
Borde ondulado filamentoso

o festoneado
lobulado encrespado
Figura 1-16 Tcnica para el anlisis del crecimiento de las colonias en la Figura 1-18 Ilustraciones de diversas formas morfolgicas de las colonias,
superficie de una placa de agar que utiliza una lente de mano. con el nombre de los trminos de cada una.

Recuadro 1-8 Caractersticas utilizadas para la identifica- Cuadro 1-12 Olores caractersticos de los microbios
cin de las colonias bacterianas seleccionados*
Tamao: dimetro en milmetros MICROBIO OLOR

Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, ahusada
Elevacin: plana, elevada, convexa, pulviniforme (en forma de almoha- Alkaligenes faecalis (odorans) A manzanas recin cortadas
da), en forma de botn, umbilicada Grupo EF-4 de los CDC Similar a las palomitas de maz
Margen (borde de la colonia): liso o continuo, ondulado, lobulado,
corrodo, filamentoso, encrespado Especies de Candida A levadura
Color: blanca, amarilla, negra, beige, naranja, otros Especies de Citrobacter A calzado sucio
Superficie: brillante, mate, otras Clostridium difficile A podrido, heces
Densidad: opaca, translcida, transparente, otras
Consistencia: untuosa o mantecosa, viscosa, membranosa, quebradiza, Especies de Corynebacterium, DF-3 Frutal
otras Eikenella corrodens A leja
Especies de Haemophilus A pelaje hmedo
Vanse tambin fig. 1-18 y lmina en color 1-5. Especies de Nocardia A stano con moho
Pasteurella multocida Pungente (indol)
Peptostreptococcus anaerobius Fecal
Grupo de Bacterioides pigmentados Acre
Especies de Proteus A chocolate quemado
Recuadro 1-9 Reacciones en medio agar utilizadas en la Pseudomonas aeruginosa A jugo de uvas
identificacin de las bacterias Especies de Staphylococcus A calzado sucio
Especies de Streptococcus A manteca
Hemlisis en agar sangre
Alfa: clarificacin parcial de la sangre alrededor de las colonias con Especies de Streptomices A stano con moho
un cambio de color al verde del medio; contorno de los eritrocitos
intactos * Ciertos microorganismos (que aqu no se enumeran) son peligrosos si se huelen.
Vase el texto para el estudio.
Beta: zona de clarificacin completa de la sangre alrededor de las colo-
nias debido a la lisis de los eritrocitos
Gamma: sin cambios en el medio alrededor de la colonia; sin lisis o
cambio de color de los eritrocitos
Alfa prima: halo de lisis incompleta inmediatamente alrededor de las detectar el olor. Se debe advertir al personal del laboratorio que
colonias, con una segunda zona de hemlisis completa en la periferia algunas especies pueden infectar a las personas y no deben olfa-
tearse nunca. Si se sospecha la presencia de Bacillus anthracis,
Produccin de pigmentos en medio agar Francisella tularensis, Burkholderia pseudomallei, especies de
Pigmentos solubles en agua que producen un cambio de color en el Brucella o Neisseria meningitidis, el cultivo debe ser trasladado
medio a una cabina de seguridad biolgica, donde puede realizarse
Piocianina
todo el trabajo siguiente sin riesgo de transmisin al operador.
Pigmentos fluorescentes
Por supuesto que las placas y los tubos nunca deben abrirse en
Pigmentos que no se difunden confinados a las colonias
un laboratorio de micobacteriologa o cuando en un laboratorio
Reaccin en agar yema de huevo
de micologa hay hongos filamentosos. Algunos olores, como
Lecitinasa: zona de precipitado en el medio que rodea las colonias los de Nocardia y Streptomyces, son tan fuertes que pueden per-
Lipasa: capa perlada, una pelcula iridiscente dentro e inmediata- cibirse aun sin levantar la tapa de la placa de Petri.
mente alrededor de las colonias, visible por reflejo de la luz El microbilogo puede hacer una identificacin preliminar
Protelisis: zona clara que rodea las colonias de la bacteria aislada en el cultivo primario a travs de la deter-
minacin de las caractersticas de las colonias descritas y de la
accin sobre el medio. Estas caractersticas son tiles para
seleccionar otros medios diferenciales y ensayos apropiados
para completar la identificacin de los aislamientos. En el cua-
dro 1-13 se enumeran algunos de los tipos de colonias que se
encuentran en forma ms frecuente, junto con los grupos de
bacterias que se asocian con cada una, los ensayos adicionales
que se requieren para la identificacin definitiva y la referencia
de la imagen correspondiente a la lmina en color 1-5.
La inspeccin inicial de las colonias para la identificacin
Recuadro 1-10 Cambios en los medios diferenciales preliminar de las bacterias es uno de los puntos principales del
diagnstico microbiolgico y se analiza en detalle en los cap-
Varios colorantes, indicadores de pH y otros ingredientes se incluyen tulos siguientes dedicados a los grupos especficos de bacterias
en los medios diferenciales de siembra en placa, sirven como indica- y de otros microorganismos patgenos.
dores de actividades enzimticas y ayudan a la identificacin de los Diferenciacin de distintos tipos morfologa bacteriana en los culti-
aislamientos bacterianos vos mixtos. Cuando las placas de agar son sembradas para el
aislamiento de bacterias, es fcil seleccionar las colonias aisla-

Cuadro 1-13 Identificacin preliminar de las bacterias por los tipos de colonias
GRUPO MARCO DE PLACAS

TIPO DE COLONIA BACTERIANO PRUEBAS ADICIONALES ILUSTRANDO EL TIPO
Convexa, bordes lisos, 23 Staphylococcus Catalasa 15A

mm, cremosa, amarillenta, Coagulasa
zona de -hemlisis DNasa
Utilizacin de manitol
Reduccin de telurito
Resistencia a la novobiocina
Resistencia a la furazolidona
Convexa o pulviniforme, Streptococcus Catalasa 15B, C

translcida, de tamao pun- Disco A
tiforme, mantecosa, zona Tolerancia al NaCl 6,5%
ancha de -hemlisis Bilis-esculina
Prueba de CAMP
Hidrlisis de hipurato
L-pirrolidonil--naftilamida (PyR)
Umbilicada o plana, transl- Pneumococcus Disco P 15G

cida, mantecosa o mucosa, Solubilidad en bilis
zona amplia de -hemlisis
En forma de almohada, Escherichia coli Pruebas mltiples 15D

semiopaca, gris, desde y otras Entero- Indol
hmeda hasta algo seca, bacteriaceae Rojo de metilo
puede o no estar presente la Reaccin de Voges-Proskauer
-hemlisis Citrato
Descarboxilasas
Ureasa
Plana, gris, dispersa como Proteus Fenilalanina

una pelcula delgada sobre Fermentaciones de hidratos de carbono
la superficie del agar; olor a Fenilalanina desaminasa
chocolate quemado Ureasa
Lisina desaminasa
Plana, opaca, gris a verdosa, Pseudomonas Citocromo oxidasa

mrgenes corrodos o dis- Flourescencia por asimilacin de hidra-
persos, pigmento verde- tos de carbono
azul, olor similar a uvas Desnitrificacin
DNasa
Hidrlisis de acetamida
Crecimiento a 42 C
das para su subcultivo. Sin embargo, en ocasiones el creci- bacteriana a la superficie del vidrio con calor, pasando rpida-
miento muestra tal amontonamiento que es difcil elegir colo- mente el portaobjetos cuatro o cinco veces a travs de la llama
nias individuales aisladas. Ante esta eventualidad, los micro- de un mechero Bunsen o cubriendo el frotis con metanol o eta-
bilogos cuentan con varios recursos (cuadro 1-14). nol durante algunos minutos. El frotis fijado se ubica sobre un
Examen de las tinciones de Gram de los cultivos. Las impresiones soporte para tincin y se realiza la tincin de Gram como se
preliminares, basadas en la observacin de las caractersticas describe en el recuadro 1-6.
de las colonias, pueden confirmarse mediante el estudio de los El frotis teido debe examinarse con el microscopio utili-
frotis teidos con Gram, una tcnica de realizacin bastante zando un objetivo de inmersin (las bacterias grampositivas
simple. La parte superior y el centro de la colonia que se va a aparecen azules; las gramnegativas aparecen rojas o rosas).
estudiar se tocan primero con el extremo de un ansa de inocu- Otras tres caractersticas son tiles para realizar la identifica-
lacin recta, cuidando de no tocar el agar adyacente (fig. 1-19). cin preliminar de las cepas aisladas: 1) el tamao y la forma
La parte de la colonia que conforma la muestra se emulsiona en de las bacterias, 2) el ordenamiento de las bacterias y 3) la pre-
una pequea gota de agua o solucin fisiolgica sobre un por- sencia o la prdida de estructuras especficas u orgnulos
taobjetos para dispersar las bacterias individuales (fig. 1-20). (esporas, grnulos metacromticos, cuerpos de inclusin u
Luego de que el portaobjetos se sec al aire, se fija la pelcula otras caractersticas).

Cuadro 1-14 Tcnicas de preparacin de aislamientos puros

a partir de cultivos mixtos
TCNICA DESCRIPCIN
Subcultivo directo Tocar con cuidado la superficie de la colonia

deseada con la punta de una aguja de ino-
culacin (no un ansa); estriar una nueva
placa para el aislamiento
Uso de medios selectivos Subcultivar la colonia de inters sobre un

agar que inhibir el crecimiento de las
colonias no deseadas; por ejemplo, subcul-
tivar un bacilo gramnegativo sobre un agar
de MacConkey para separarlo de cocos
grampositivos
Uso de sustancias qumi- Subcultivar la colonia de inters sobre un

cas inhibidoras incorpo- agar que contenga antibiticos o sustancias
radas dentro del agar qumicas que inhibirn el crecimiento de
(anlogo a un medio las colonias no deseadas
selectivo)
Uso de discos de antibi- Subcultivar la colonia de inters sobre la

ticos (anlogo a una superficie de una placa con agar y ubicar
placa de agar que con- un disco impregnado en antibitico disea- Figura 1-19 Tcnica para tomar una colonia bacteriana aislada con un ansa
tiene antibiticos, pero do para inhibir la bacteria no deseada recta con el objeto de realizar un subcultivo en otro medio.
ms flexible)
biticos especficos antes de que se cuente con la identificacin

final o el antibiograma.
Para realizar la identificacin preliminar de un aislamiento
bacteriano, el microbilogo debe evaluar cada una de estas
caractersticas. En la lmina color 1-3 se muestra una serie de PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIN PRELIMINAR
microfotografas de varias tinciones que ilustran numerosos DE LAS BACTERIAS AISLADAS
tipos de morfologa y ordenamientos espaciales de las bacterias La mayora de los ensayos utilizados para determinar la
que se encuentran con mayor frecuencia en los laboratorios cl- actividad bioqumica o metablica de las bacterias con el pro-
nicos. psito de identificar una cepa aislada se realizan mediante la
Con la informacin que se obtiene del anlisis de las colo- inoculacin de la cepa aislada primaria en medios de pruebas
nias bacterianas y la tincin de Gram de los frotis bacterianos,
el microbilogo puede orientarse hacia los ensayos particulares
que le permitan realizar la identificacin correcta. Por ejemplo,
una colonia hemoltica amarilla cremosa y elevada presente en
un agar sangre que consiste en cocos grampositivos agrupados
es muy probablemente Staphylococcus (vase lmina color 1-
3C). Una colonia -hemoltica translcida puntiforme sobre
agar sangre formada por cocos grampositivos organizados en
cadena es muy probable que sea un estreptococo (vase lmina
en color 1-3D).
Sin embargo, los microbilogos aprenden enseguida a no
basarse slo en el examen de la tincin de Gram de los frotis
porque las reacciones de tincin pueden ser variables, sobre
todo en el caso de las colonias muy jvenes o muy viejas. La
morfologa de las bacterias en una tincin de Gram es ms
caracterstica cuando los frotis se preparan de un caldo de sub-
cultivo fresco (4-6 horas), momento en el cual las bacterias se
encuentran en la fase logartmica de crecimiento. A menudo,
cuando los frotis se preparan de colonias que crecen en la
superficie del agar, la morfologa en la tincin de Gram es
menos caracterstica.
Los microbilogos deben proporcionar a los mdicos tanta Figura 1-20 Tcnica para la preparacin de un frotis para la tincin de Gram.
La parte superior de una colonia bacteriana aislada, como se ilustra en la figu-
informacin preliminar como sea posible. En ciertos casos ra 1-19, se toca con un ansa recta o ansa de inoculacin, luego la punta del ansa
especiales, como cuando se observan bacterias en un hemocul- se sumerge en una gota de agua o solucin fisiolgica en un portaobjetos de
tivo o directamente en LCR, esta informacin preliminar puede vidrio. El inculo se emulsiona y la preparacin se seca al aire antes de fijarla
ser lo suficientemente til para indicar el tratamiento con anti- con calor y teirla.

diferenciales o en soluciones. La observacin inicial y la inter- gulasa positivos o negativos, en lugar de un nombre especfico
pretacin de un medio de cultivo deben utilizarse para deter- de especie (p. ej., S. aureus).
minar si el o los microorganismos aislados merecen identifica- Prueba de la mancha directa de indol. Se transfiere una
cin posterior y si se debe realizar el antibiograma. pequea porcin de la colonia que se va a ensayar desde un
Procedimientos bioqumicos directos para la identificacin bacteria- medio no selectivo, como agar sangre o chocolate, a una tira de
na preliminar. Se pueden realizar ciertas observaciones prelimi- papel de filtro previamente saturada con el reactivo de Kovac o
nares o un ensayo rpido directo sobre las colonias selecciona- una solucin de p-dimetilaminocinamaldehdo (PACA). La
das. Con frecuencia, una bacteria puede identificarse hasta un aparicin inmediata de color rojo con el reactivo de Kovac indi-
nivel de utilidad clnica basndose slo en estas determinacio- ca la presencia de indol y la prueba es positiva (vase protoco-
nes. Por ejemplo, las propiedades de utilizacin de la lactosa de lo 1-4). El PACA es ms sensible que el reactivo de Kovac y la
los bacilos gramnegativos pueden evaluarse directamente sobre rpida aparicin de color azul indica una reaccin positiva. En
el agar de MacConkey observando la pigmentacin roja de las muchos laboratorios, aparecen luego de 24 horas de incubacin
colonias; la produccin de H2S puede detectarse en los agares en el agar de MacConkey colonias de aspecto seco, lactosa
de Hektoen y XLD observando un centro negro en las colonias. positivas y mancha de indol positiva, sobre todo en aislamien-
Tambin se puede sospechar la descarboxilacin de la lisina tos de las vas urinarias, que se identifican presuntamente como
cuando se advierte crecimiento de colonias en el agar XLD. Un E. coli y casi nunca se realizan otras pruebas posteriores. En
halo rojo alrededor de la colonia, que indica una variacin a pH estos casos, la prueba de la mancha de indol debe efectuarse
alcalino, revela la descarboxilacin de la lisina. sobre colonias que estn creciendo en placas de agar sangre en
A continuacin se describen los ensayos directos que pueden paralelo, debido a que la pigmentacin de las colonias lactosa
realizarse sobre colonias aisladas que se recuperaron a partir de positivas en el agar de MacConkey dificulta la interpretacin
placas de cultivo primario: de la reaccin de color.
Prueba de la catalasa. Se colocan unas gotas de perxido Prueba de la citocromooxidasa. Se extiende una parte de la
de hidrgeno al 3% directamente sobre la colonia. La rpida colonia que se va a ensayar sobre un rea de una tira para la prue-
efervescencia indica la produccin de oxgeno molecular y un ba de oxidasa impregnada con el reactivo. La aparicin inme-
resultado positivo (vase protocolo 1-1). Puede ser difcil obte- diata de color azul indica actividad de citocromo oxidasa y un
ner resultados exactos si el ensayo se realiza en colonias que resultado positivo de la prueba (vase protocolo 1-5). La prue-
crecen sobre placas de agar sangre debido a la presencia de ba de citocromo oxidasa es de utilidad para la categorizacin
peroxidasa en los eritrocitos. Sin embargo, la reaccin de pero- inicial de muchas especies bacterianas que tienen diferente
xidasa que producen los eritrocitos es tarda y dbil y puede morfologa de colonia. Se puede descartar que las colonias oxi-
diferenciarse con facilidad de la reaccin inmediata y fuerte- dasa positivas pertenezcan a las Enterobacteriaceae, las cuales
mente activa que causan las bacterias catalasa positivas. La son uniformemente negativas. Las especies bacterianas que
prueba de la catalasa se usa muy a menudo para diferenciar los producen citocromo oxidasa incluyen las especies de
estafilococos (positiva) de los estreptococos (negativa) o las Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas y Pasteurella.
especies de Bacillus (positiva) de las de Clostridium tertium Prueba de MUG. Se pueden utilizar otras pruebas directas
(negativa). para el anlisis inicial de ciertos microorganismos a partir de
Prueba de solubilidad de la bilis. Se utilizan dos mtodos cultivos primarios, lo cual ofrece un posible ahorro en procedi-
para determinar la solubilidad de la bilis. A modo de anlisis mientos de diferenciacin que insumen ms tiempo y son cos-
inicial, se colocan unas gotas de una solucin de desoxicolato tosos. La prueba de MUG (4-metilumberiferil--D-glucuroni-
de sodio al 10% sobre las presuntas colonias de Streptococcus dasa), una de ellas, se basa en la capacidad de un microorga-
pneumoniae. Las colonias de neumococos se lisan por completo nismo desconocido para producir -glucuronidasa. Esta prueba
y desaparecen luego de unos 30 minutos (vase protocolo 1-2). puede utilizarse como anlisis preliminar de E. coli en lugar de
Esta prueba es a veces difcil de interpretar; el ensayo en tubo la prueba del indol. Se inocula una suspensin concentrada del
es ms directo. Se puede resuspender un inculo de la colonia microorganismo desconocido dentro del reactivo MUG, que ha
bacteriana desconocida en una solucin de desoxicolato al 10% sido resuspendido en tubos o impregnado en discos deshidrata-
(sales biliares) hasta que se alcanza turbidez. La clarificacin dos. Si la -glucuronidasa est presente, el reactivo fluoresce
de la turbidez luego de una incubacin de 30 a 60 minutos a 35 debido a la liberacin de 4-metilumbeliferona. Tambin puede
C indica la solubilidad de la bilis (vase protocolo 1-2). En detectarse indol mediante el agregado del reactivo de Kovac al
forma simultnea se debe efectuar un ensayo de control con tubo de MUG, lo cual convierte esta prueba combinada en un
Streptococcus viridans, que no se disuelve en la bilis. Como mtodo de valor para el anlisis de los bacilos entricos fer-
alternativa, se puede realizar un ensayo rpido de aglutinacin mentadores de lactosa.
de partculas de ltex para neumococos. Prueba de PYR. El sustrato L-pirrolidonil--naftilamida
Prueba de la coagulasa en portaobjetos. Se emulsiona una (PyR) es un mtodo simple para la identificacin rpida de
colonia que se presume de Staphylococcus en una gota de plas- enterococos. Luego de 4 horas de incubacin, a partir de la ino-
ma de conejo sobre un portaobjetos de vidrio. La agregacin de culacin del sustrato con una suspensin lquida concentrada
las bacterias dentro de los 2 minutos indica la presencia de coa- del microorganismo desconocido preparada a partir de una
gulasa unida y constituye un resultado positivo de la prueba placa de aislamiento primario, la produccin de color rojo
(vase protocolo 1-3). Luego de una prueba de la coagulasa en luego del agregado del reactivo N,N-metilaminocinamaldehdo
portaobjetos con resultado negativo debe realizarse una prueba indica la presencia de enterococos (los estreptococos del grupo
de la coagulasa en tubo convencional. Tambin se pueden uti- A son tambin PyR positivos, pero pueden diferenciarse me-
lizar las pruebas de aglutinacin para la deteccin de la prote- diante criterios morfolgicos; vase protocolo 1-6).
na A de estafilococos como un marcador de Staphylococcus Identificacin de las bacterias segn las especies y seleccin de las
aureus. Muchos laboratorios basan la identificacin de los esta- caractersticas diferenciales. La caracterizacin final de una
filococos en la presencia o la ausencia de coagulasa. En ese cepa bacteriana aislada desconocida suele lograrse mediante el
caso, el informe debe indicar la presencia de estafilococos coa- ensayo de sistemas enzimticos caractersticos para cada espe-

cie. Estos sistemas de enzimas se detectan por la inoculacin

de pequeas porciones de una colonia bacteriana bien aislada Recuadro 1-11 Factores que influyen en el antibiograma
dentro de diversos medios de cultivo que contienen sustratos
especficos e indicadores qumicos. A travs de ellos, el micro- Factor Criterio
bilogo puede detectar cambios en el pH del medio provoca-
dos por la utilizacin de los sustratos qumicos o cambios de Aislamiento Patgeno potencial de una muestra vlida (pro-
color causados por productos derivados especficos. El micro- bablemente no representa flora colonizante)
bilogo clnico debe seleccionar grupos apropiados de carac- Sensibilidad No predecible para agentes infecciosos y anti-
tersticas diferenciales que le permitan la identificacin de biticos
cada grupo de bacterias. Uno de los mayores avances en el Situacin clnica Indicacin del tratamiento con antibiticos
diagnstico microbiolgico ha sido la miniaturizacin de los Estndares de Disponibilidad de criterios validados para la
sistemas bioqumicos, de modo que se pueden examinar ml- interpretacin determinacin del significado clnico del
tiples caractersticas de manera expeditiva y a un costo relati- resultado
vamente bajo. Antes de estos progresos, se realizaba un nme-
ro pequeo de pruebas en tubos o placas, seguidas de anlisis
basados en los resultados iniciales. Este proceso era lento, cos-
toso y ms proclive al error que los enfoques modernos.87 (vanse caps. 17 y 19). La tarea del microbilogo clnico es
asegurar, en el mayor grado posible, que el ensayo se realice
sobre el aislamiento apropiado y con los mtodos vlidos. El
IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS DIFERENTES camino ms fcil es ceder ante la insistencia de un mdico que
DE LAS BACTERIAS requiere un ensayo sobre una cepa para la cual no existen
Hongos. Las levaduras comparten muchas caractersticas con estndares de interpretacin, pero el microbilogo debe resistir
las bacterias y, en consecuencia, se aplican enfoques similares. la tentacin de hacerlo.
Se puede utilizar la prueba de la ureasa (incluida la versin En ciertas situaciones se puede requerir un anlisis de sensi-
rpida) para examinar microorganismos aislados de muestras bilidad para bacterias anaerobias, hongos y virus, pero no es
respiratorias, debido a que el patgeno ms frecuente (Crypto- necesario realizarlo en forma sistemtica. Si se analizan estos
coccus neoformans) produce ureasa, mientras que la levadura agentes, es importante que un mdico experimentado, capaz de
comensal aislada ms a menudo (especies de Candida) no con- interpretar los resultados de manera apropiada, participe en la
tiene esta enzima, salvo raras excepciones. Las levaduras se atencin del paciente.
identifican por sus caractersticas morfolgicas, adems de por Utilizacin de los resultados del antibiograma para el control de
la asimilacin o fermentacin de los hidratos de carbono. Para calidad de los datos de identificacin bacteriana. Algunas bacte-
la identificacin de las levaduras suelen emplearse variaciones rias presentan una sensibilidad predecible a ciertos antibiti-
de los enfoques que se aplican para las bacterias. cos y no necesitan ensayarse. Muchas ms tienen patrones de
Sin embargo, la base de la identificacin de las cepas de hon- sensibilidad caractersticos que no son lo suficientemente
gos filamentosos es el estudio morfolgico de los caracteres absolutos como para obviar el ensayo. Sin embargo, estos
reproductivos asexuales. Las pruebas bioqumicas tienen un patrones pueden utilizarse como control de la caracterizacin
papel secundario. taxonmica. Por ejemplo, Klebsiella pneumoniae es casi siem-
Micobacterias. Dado que se trata de bacterias especializadas, el pre resistente a la ampicilina, pero sensible a las cefalospori-
enfoque para su identificacin es similar al de las bacterias. No nas de primera generacin. Por el contrario, las especies de
obstante, las pruebas bioqumicas son mucho ms difciles en Enterobacter suelen ser resistentes a ambos grupos de antibi-
el caso de las micobacterias que de las bacterias convenciona- ticos. Si una bacteria se identific como Enterobacter, pero es
les. La mayora de los directores de los laboratorios eligen sensible a estos agentes, se deben poner en duda estos resul-
enviar las muestras a laboratorios especializados o utilizar tc- tados. Se deben repetir los ensayos para caracterizacin y
nicas de biologa molecular con sondas moleculares especficas sensibilidad, dado que uno, ambos o ningn resultado podr-
para la identificacin de las especies aisladas con mayor fre- an estar equivocados. De manera ptima se debera utilizar un
cuencia. mtodo diferente del que se emple al principio para repetir
Parsitos. Salvo raras excepciones, la caracterizacin de los la prueba.
parsitos se efecta por medio de estudios morfolgicos. Es
muy raro que se realice el cultivo de los parsitos.
Virus. Dado que se trata de patgenos intracelulares estrictos, RELACIN COSTO-EFICACIA EN LA FASE ANALTICA
los virus requieren un enfoque diagnstico muy diferente. Las En la fase analtica, los recursos pueden utilizarse de mane-
tcnicas predominantes utilizadas para el diagnstico virolgi- ra eficaz si se presta particular atencin a algunas de las reas
co son la caracterizacin de antgenos y la de cidos nucleicos. de esta fase. Es posible utilizar protocolos abreviados para la
identificacin de ciertos microorganismos (cuadro 1-15). El
NCCLS ha proporcionado recomendaciones de consenso para
ANTIBIOGRAMA ciertos enfoques.80 En el cuadro 1-16 se resumen otras formas
En muchos aspectos, la determinacin de la sensibilidad de para optimizar los recursos. El fundamento de estos enfoques
un patgeno a un antibitico determinado es la tarea ms se centra en los resultados que pueden interpretarse en forma
importante que se realiza en los laboratorios de diagnstico correcta y que conducirn al mejor tratamiento para el pacien-
microbiolgico. En el recuadro 1-11 se resumen algunos de los te. Un principio conceptual es pensar que las muestras pueden
factores que deben evaluarse cuando se consideran los antibio- agruparse en dos categoras amplias: 1) aquellas a partir de las
gramas. cuales se aslen agentes que son muy probablemente patgenos
Los antibiogramas se usan muy a menudo como gua para el y 2) aquellas a partir de las cuales se aslen agentes que no pue-
tratamiento de las infecciones bacterianas y micobacterianas den interpretarse con confianza. Si un microbilogo le presta

Cuadro 1-15 Identificacin abreviada de las bacterias y los hongos
PROTOCOLO DE PRUEBAS
SITUACIN ABREVIADO IDENTIFICACIN
Gramnegativo, no abundante, oxidasa negativo, -hemoltico en Sin pruebas adicionales Escherichia coli
agar sangre de carnero*
Gramnegativo, no abundante, oxidasa negativo, no hemoltico en PYR negativa Escherichia coli

agar sangre de carnero, fermentador de lactosa*
Gramnegativo, no abundante, oxidasa negativo, no hemoltico en MUG positiva Escherichia coli

agar sangre de carnero, no fermentador de lactosa*
Bacilos pequeos o cocobacilos gramnegativos aislados de muestras Prueba rpida para sntesis de porfi- Haemophilus influenzae (no puede diferenciarse
respiratorias o de lquido cefalorraqudeo; crecimiento en agar rinas negativa de Haemophilus hemolyticus, un patgeno
chocolate con 5% de CO2 pero no en agar sangre de carnero* humano poco comn)
Diplococos gramnegativos, oxidasa positivos, crecimiento en agar Prueba rpida de esterasa de butirato Moraxella catarrhalis
chocolate y agar sangre de carnero* o DNAsa positiva
Bacilos gramnegativos, oxidasa negativos, no fermentadores de Indol positiva Proteus vulgaris

lactosa, crecimiento abundante en agar chocolate o agar sangre
de carnero*
Bacilos gramnegativos, oxidasa negativos, no fermentadores de Indol negativa; sensible a ampicilina Proteus mirabilis
lactosa, crecimiento abundante en agar chocolate o agar sangre
de carnero*
Bacilos gramnegativos, oxidasa negativos, no fermentadores de Indol negativa; resistente a ampicili- Proteus mirabilis
lactosa, crecimiento abundante en agar chocolate o agar sangre na; maltosa negativa; ornitina posi-
de carnero* tiva
Bacilos gramnegativos, oxidasa negativos, no fermentadores de Indol negativa; resistente a ampicili- Proteus penneri
lactosa, crecimiento abundante en agar chocolate o agar sangre na; maltosa positiva; ornitina nega-
de carnero* tiva
Bacilos gramnegativos, oxidasa positivo, aroma tpico de uvas Sin pruebas adicionales Pseudomonas aeruginosa (los aislamientos poco
Concord, morfologa tpica de las colonias (brillo metlico, comunes de Aeromonas pueden ser similares
verde/rojizo/negro, mucoide)* pero dan positiva la prueba de la mancha de
indol)
Cocos grampositivos en agrupamientos; catalasa positivos; colo- Coagulasa en portaobjetos y/o coa- Staphylococcus aureus (Staphylococcus coagula-
nias cremosas opacas amarillentas en agar sangre de carnero gulasa de 4 horas en tubo positivas sa positivas); rara vez otros estafilococos pue-
(coloracin acentuada en agar chocolate)* den ser positivos en una u otra prueba de la
coagulasa
Cocos grampositivos en pares o cadenas cortas; catalasa negativos PYR positiva Especies de Enterococcus; el fracaso del creci-
u ocasionalmente positivos dbiles; no -hemolticos en agar miento adecuado en las pruebas de sensibilidad
sangre de carnero* sugiere que el asilamiento puede ser de otro
gnero
Cocos grampositivos en pares o cadenas cortas; catalasa negativos; Prueba rpida de hidrlisis de hipu- Streptococcus agalactiae (grupo B); los entero-
usualmente una zona estrecha de -hemlisis * rato positiva; prueba de la mancha cocos -hemolticos puede ser hipurato positi-
CAMP positiva; o aglutinacin de vos, pero tambin son PYR positivos
ltex con anticuerpos especficos
positiva
Cocos grampositivos en pares o cadenas cortas; catalasa negativos; Mancha de bilis o solubilidad de Streptococcus pneumoniae
-hemolticos en agar sangre de carnero; colonias tpicamente bilis en tubo positiva;
mucosas o en forma de damero* Pneumoslide positivo; reaccin
de hinchazn capsular positiva; o
aglutinacin de ltex con antisue-
ros especficos positiva
Cocos grampositivos en pares o cadenas; catalasa negativos; PYR positiva o aglutinacin de ltex Streptococcus pyogenes (grupo A); cepas ocasio-
-hemolticos en agar sangre de carnero con una zona ancha de con antisueros especficos positiva nales de enterococos -hemolticos tienen dife-
hemlisis; colonias usualmente secas y pequeas en relacin con rente morfologa de colonias y presentan aglu-
la hemlisis* tinacin negativa
Bacilos gramnegativos pequeos; oxidasa positivos; agar poceado, Sin pruebas adicionales Eikenella corrodens
colonias con apariencia de sombrero mexicano o gota de
roco en agar sangre de carnero, olor a leja
(Contina)

Cuadro 1-15 Identificacin abreviada de las bacterias y los hongos (cont.)
PROTOCOLO DE PRUEBAS
SITUACIN ABREVIADO IDENTIFICACIN
Bacilos regulares o cocobacilos gramnegativos con grandes colonias (> 1 No son esenciales las pruebas adiciona- Grupo Bacteroides fragilis
mm) en agar sangre anaerobio y un tamao similar en agares LKV y les; puede usarse como evidencia adi-
BBE; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2* cional el patrn de discos (resistencia
a penicilina, resistencia a kanamicina;
sensibilidad a rifampicina)
Bacilos gramnegativos fusiformes, delgados, puntiformes; colonias de Mancha de indol positiva Fusobacterium nucleatum
miga de pan u opalescentes en agar sangre anaerobio; sin crecimiento en
agar BEE; sin crecimiento en agar chocolate 5% CO2*
Bacilos gramnegativos; colonias pequeas (< 1 mm) en agar sangre anae- Catalasa fuertemente positiva Bilophila wadsworthia
robio y agar BEE luego de al menos 48 horas de incubacin; sin creci-
miento en agar chocolate en 5% CO2; punto negro en el centro de la
colonia por produccin de H2S*
Bacilos gramnegativos cocobacilares pequeos; colonias negras (o con Sin necesidad de pruebas adicionales Especies de Prevotella; Preveotella
fluorescencia rojo ladrillo bajo luz UV de longitud de onda larga) en intermedia si la mancha de indol es
agar LKV; colonias pequeas translcidas u opacas en agar BAP anaero- positiva
bio; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2*
Bacilos gramnegativos cocobacilares pequeos; colonias pequeas transl- Mancha de indol positiva Especies de Porphyromonas
cidas u opacas en agar BAP anaerobio con fluorescencia rojo ladrillo
bajo luz UV de longitud de onda larga; sin crecimiento en agar chocola-
te en 5% CO2*
Bacilos gramnegativos delgados; colonias planas, transparentes que produ- Sin necesidad de pruebas adicionales Bacteroides ureolyticus
cen hoyos en el agar BAP anaerobio; sin crecimiento en agar LKV; sin
crecimiento en agar chocolate incubado en 5% CO2; catalasa negativos;
ureasa positivos*
Diplococos gramnegativos diminutos; colonias pequeas (< 1 mm) de Sin necesidad de pruebas adicionales Especies de Veillonella
transparentes a opacas en agar BAP anaerobio con fluorescencia roja
bajo luz UV de longitud de onda larga; sin crecimiento en agar BBE; sin
crecimiento en agar chocolate en 5% CO2*
Bacterias grampositivas o gramvariables, grandes, en forma de vagn, de Sin necesidad de pruebas adicionales Clostridium perfringens
extremos romos; colonias grandes (> 2 mm) irregulares con una zona
doble de -hemlisis en BAP anaerobio; sin crecimiento en agares
LKV o BBE; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2; catalasa
negativas*
Bacilos grampositivos delgados con hinchazn, esporas subterminales; Sin necesidad de pruebas adicionales Clostridium septicum
crecimiento liso abundante en agar BAP anaerobio; sin crecimiento en
agares LKV o BBE; sin crecimiento en agar chocolate en 5% CO2; cata-
lasa negativos; mancha de indol negativa*
Bacilos gramnegativos delgados con esporas subterminales; crecimiento Sin necesidad de pruebas adicionales Clostridium tertium
equivalente en agar BAP anaerobio y en agar chocolate en 5% CO2;
catalasa negativos
Bacilos grampositivos pleomrficos corineformes; colonias pequeas (1 a Sin necesidad de pruebas adicionales Propionilbacterium acnes
2 mm) opacas blanco esmalte en agar BAP anaerobio; catalasa positi-
vos; mancha de indol positiva*
Levaduras en brotacin* Prueba de germinacin en tubo positiva Candida albicans

en < 3 horas; o proyecciones micelia-
les desde las colonias en medio que
contiene sangre en menos de 48 horas
de incubacin
Levaduras en brotacin esfricas; a menudo colonias mucosas* Prueba rpida de fenol oxidasas Cryptococcus neoformans (los cripto-
positiva coccos puede excluirse de las colo-
nias con prueba rpida de ureasa
negativa)
* A partir de las recomendaciones consenso de la referencia80.

Cuadro 1-16 Algunas estrategias sugeridas para optimizar las identificaciones en el laboratorio
CATEGORA CRITERIO PROPUESTO*
Muestras repetidas de un sitio no estril dentro de un perodo definido Referir en las muestras siguientes la evaluacin previa; si las muestras siguien-
tes se inocularon en el medio y se observaron diferencias sustanciales con la
muestra original, consultar con el mdico acerca de las acciones futuras
Flora mixta de un sitio no estril, especialmente si es remitido en un Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa
hisopo; mnima inflamacin o sin disponibilidad de frotis teidos con
Gram
Flora mixta de un sitio no estril, especialmente si es remitido en un Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa, adjuntar un comentario
hisopo; presencia de inflamacin moderada a severa para consultar dentro de los 10 das por el procesamiento ulterior
Flora mixta de un sitio no estril, especialmente si es remitido en un Informar la identificacin de un patgeno predominante y la presencia de flora
hisopo; presencia de inflamacin moderada a severa; presencia de un mixta; realizar el antibiograma sobre el patgeno predominante o adjuntar
nico patgeno potencial predominante un comentario sobre consultar con el laboratorio acerca de las pruebas de
sensibilidad
Aislamiento de levaduras de cultivos mixtos con bacterias a partir de un Informar la presencia de levaduras; considerar adjuntar un comentario acerca
sitio no estril o potencialmente contaminado, como una herida o de consultar con el laboratorio por procesamiento ulterior
lquido peritoneal
Flora mixta a partir de muestras de orina del chorro medio de la mic- Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa, adjuntar un comentario
cin obtenida en condiciones adecuadas de higiene o de un catter sugiriendo 1) repita la recoleccin con un catter que sea extrable, si se
permanente encuentra clnicamente indicado y el paciente no tiene un catter permanente
o 2) notifique al laboratorio si el paciente tiene un catter permanente y
necesita terapia antimicrobiana
Flora mixta con un nico patgeno predominante a partir de muestras Evalu el patgeno predominante, adjunte un comentario que indique la pre-
de orina del chorro medio de la miccin obtenida en condiciones ade- sencia de flora mixta
cuadas de higiene o de un catter permanente
Presencia de flora vaginal mixta Informe slo la presencia o ausencia de los patgenos vaginales documentados
que se encuentran mejor documentados por el cultivo; p. ej., Listeria
monocytogenes, Streptococcus agalactiae (en mujeres en edad frtil),
Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus (si se sospecha un sndrome
de shock txico) y levaduras. Rara vez se indican las pruebas de sensibilidad
Flora mixta a partir de un catter intravascular Informar como flora mixta grampositiva/gramnegativa, adjuntar un comentario
acerca de consultar con el laboratorio por el procesamiento ulterior
Aislamiento de bacterias que se asemejan a Haemophilus influenzae o Proceder con la identificacin e informar el resultado slo si se encuentra un
Moraxella catarrhalis a partir de esputos expectorados organismo en una tincin de Gram concomitante asociada con neutrfilos
polimorfonucleares
* Es un buen criterio preservar las muestras cuya evaluacin no se ha completado durante al menos 24 horas. Preservar las placas de agar cuya evaluacin no se ha completado du-
rante un perodo. Siete das es un lapso conveniente para preservar las placas, dado que todas las placas de un da pueden almacenarse juntas y descartarlas una semana despus.
igual atencin a las dos categoras, es muy probable que se 1. Muestra enviada en hisopos: primer golpe (strike one).
hayan malgastado muchos recursos en muestras de significado 2. Ausencia de neutrfilos polimorfonucleares o no se solicit
dudoso y que las muestras ms importantes sean subestimadas. un frotis para tincin de Gram: segundo golpe (strike two).
La funcin de cada microbilogo es tomar las decisiones del 3. Presencia de flora mixta: tercer golpe (strike three).
laboratorio, de acuerdo con el entorno local. Una primera con- 4. Usted est fuera de juego (out).
sideracin es evitar informar resultados que puedan interpretar-
se de manera errnea. Un informe de flora mixta; interpreta- La pregunta que surge es: Qu es flora bacteriana mixta?.
cin dificultosa es probable que estimule la recoleccin de otra Para tomar la decisin, que debe hacerse en forma individual
muestra (con la esperanza de que sea mejor) o el tratamiento del para cada muestra, son esenciales el sentido comn y una sli-
paciente sobre la base de los patgenos que probablemente sean da base en los principios del diagnstico microbiolgico. Por
la causa de la infeccin particular. Ponerle el nombre a un ejemplo, Streptococcus pyogenes es un patgeno importante,
microorganismo aislado que de hecho es flora colonizante o ms all de cuntas otras especies estn presentes; en cualquier
contaminante le da al microorganismo mayor relevancia de la colonia -hemoltica debe evaluarse la presencia de antgeno
que merece. El agregado de los resultados del antibiograma de estreptococos del grupo A. Como una gua, Schreckenberger
complica an ms la situacin. Se puede utilizar una analoga y Miller propusieron la Regla de tres.67,103 Sugirieron que se
con el bisbol para ilustrar los errores ms comunes: deben evaluar uno o dos patgenos potenciales, incluso en pre-

sencia de flora comensal, pero no se deben evaluar tres o ms sobre las cuales se solicit una consulta o las que contienen
patgenos potenciales. flora mixta. Si cada da las placas se separan, se encintan (con
La gua de la Regla de tres es una ayuda, pero se debe uti- una cinta adhesiva) y se guardan durante siete das, las mues-
lizar un criterio lgico. Por ejemplo, la regla no debe aplicarse tras vencidas pueden descartarse con facilidad. Si surge una
en forma automtica a una muestra de tejido de biopsia, lqui- discusin y se contina con la evaluacin de esa muestra, el
dos de aspirado o pus. En el aparato urinario, una mezcla de microbilogo tendr una posicin ms segura si conserv la
tres o ms microorganismos de cualquier variedad sugiere con- muestra que si la descart.
taminacin con flora vaginal o perineal; aun cuando un pat- Las tcnicas y la interpretacin de los procedimientos ante-
geno potencial sea parte de la mezcla y no predomine, es dif- riores se tratarn con ms detalles en los captulos siguientes.
cil confiar en que el anlisis proporcionar informacin vlida. En la era de los costos restringidos, es imperativo que los
A veces, la relacin cuantitativa de los microorganismos en la microbilogos apliquen sus habilidades de observacin y la uti-
mezcla puede proporcionar un indicio. Si uno o probablemen- lizacin de algunas caractersticas seleccionadas para identifi-
te dos microorganismos predominan claramente, es razonable car las especies bacterianas en forma presuntiva cuando sea
evaluarlos e informar adems la presencia de flora mixta. posible. El desarrollo de este sexto sentido microbiolgico
Cabe destacar que cuando un microbilogo examina una puede ser tambin til para verificar los resultados obtenidos a
placa de agar y determina que hay una mezcla de tipos de bac- partir de equipos de diagnstico comerciales o de dispositivos
terias, en realidad est observando una mezcla de tipos de colo- automticos. En ocasiones, los nmeros de biotipo que infor-
nias bacterianas (diferentes morfologas de colonias). Estas man estos sistemas estn en desacuerdo con las caractersticas
colonias visualmente diferentes suelen representar distintas de las colonias, la morfologa en la tincin de Gram o las prue-
especies (o incluso gneros), pero tambin pueden representar bas bioqumicas de manchas. Se debe realizar un estudio con-
variantes fenotpicas de microorganismos con un solo genoti- tinuo para evitar los informes errneos.
po. La nica manera de estar seguro de que se aislaron mlti-
ples especies de bacterias es identificarlas a todas, y por Fase posanaltica
supuesto, para ese momento ya se habr completado el trabajo.
En la prctica, debemos aplicar nuestro criterio para decidir si INFORME DE LOS RESULTADOS
las colonias son lo suficientemente diferentes como para que se Los informes con los resultados de los cultivos microbiol-
justifique la caracterizacin del crecimiento como una mezcla gicos se deben emitir en cuanto la informacin til est dispo-
o reconocer que a veces es posible equivocarse. nible. Cada director de laboratorio debe establecer los resulta-
Un enfoque sensato en estas situaciones es ofrecerle al mdi- dos que deben considerarse urgentes o valores de alerta.
co la oportunidad de solicitar que se evalen los aislamientos o Asimismo, algunos resultados pueden considerarse importan-
iniciar un dilogo preventivo a travs de un informe verbal tele- tes, pero no necesariamente urgentes. En el cuadro 1-17 se
fnico o de una comunicacin escrita en el cuaderno de regis- enumeran algunos resultados urgentes e importantes tpi-
tro del laboratorio. Un modo sencillo es conservar las placas cos. La confeccin de este tipo de listas vara mucho, de acuer-
Cuadro 1-17 Lista sugerida de informes urgentes o importantes*
INFORMES URGENTES INFORMES IMPORTANTES
Hemocultivos positivos Tejidos y lquidos positivos que no sean sangre ni lqui-

do cefalorraqudeo
Cultivos de lquido cefalorraqudeo positivos Patgenos fecales
Frotis positivos para bacilos cido-alcohol Otros parsitos positivos que no sean las especies de
resistentes Plasmodium
Mycobacterium tuberculosis Patgenos de transmisin sexual
Especies de Plasmodium, especialmente Streptococcus agalactiae si se asla a travs del protoco-

P. falciparum lo de cultivo de preparto
Streptococcus pyogenes a partir de sitio Streptococcus pyogenes a partir de un cultivo farngeo

normalmente estril o de origen genital
Streptococcus agalactiae a partir de un sitio genital Patgenos virales positivos

de una mujer embarazada de trmino
Virus del herpes simple a partir de un sitio genital de Hongos dimorfos positivos
una mujer embarazada de trmino
Antgenos positivos o pruebas de cidos nucleicos reali-

zadas directamente sobre muestras clnicas
* Esta lista es un modelo de sugerencia y debe ser modificada de acuerdo con las condiciones locales.

do con factores como la capacidad de los sistemas de informa-

cin de la institucin y la relacin que se establece entre los m- Recuadro 1-12 Parmetros del desempeo del laboratorio
dicos y el laboratorio. Adems de las categoras definidas, el y de los resultados clnicos
mdico puede tener la oportunidad de solicitar un resultado
sobre algn cultivo en forma telefnica en el momento en que Actividad Parmetros
se solicit el examen.
Los resultados urgentes siempre se deben informar por Hemocultivos Frecuencia y tasa de aislamiento de organismo
de la piel/contaminantes
telfono a la persona que asiste al paciente. Los resultados
Frecuencia y tasa de envos de cultivos nicos
importantes pueden informarse por telfono, fax, ordenador
Frecuencia y tasa de aislamiento de patgenos
o papel. La principal consideracin es que todas las partes potenciales
comprendan las reglas. Si todos los resultados del laboratorio Examen directo de Anlisis del tiempo de respuesta global de un
estn disponibles de manera inmediata y conveniente para los muestras clnicas laboratorio
usuarios de los servicios del laboratorio, los mdicos van a Antibiograma Resumen del porcentaje de sensibilidad de pat-
encontrar mucho ms ventajoso obtener todos los resultados, genos bacterianos de importancia
excepto los urgentes, en forma electrnica. Siempre que un
informe pueda ser visto por personal no autorizado, debe ase-
gurarse la confidencialidad de los datos del paciente; por ejem-
plo, enviar los faxes slo a los aparatos de recepcin seguros.
Es de buena prctica tener un protocolo para los informes tele-
fnicos donde se especifique quin puede recibirlos en caso de forma individual o con grupos de mdicos (p. ej., grupos por
que la persona que asiste al enfermo no se encuentre disponi- especialidad), si los sistemas locales de informacin lo permi-
ble; este protocolo debe ser aceptable para el mdico y para el ten. La herramienta final de control de calidad para los mdi-
personal del laboratorio. cos es recibir una ficha de registro que detalla la solicitud de
Como poltica del laboratorio se deben realizar informes estudios y los resultados de sus pacientes (p. ej., la frecuencia
puntuales preliminares y provisionales. Por ejemplo, los infor- y la tasa de anlisis positivos) en comparacin con la de otros
mes preliminares sobre los cultivos negativos deben emitirse mdicos. Se desalienta el diseo de este tipo de informes por-
dentro de las 48 horas. El momento de emisin del informe ini- que es difcil asegurar que los profesionales que se comparan
cial para otros tipos de agentes variar de acuerdo con la velo- atiendan a grupos de pacientes que son verdaderamente equi-
cidad de crecimiento; por ejemplo, en forma semanal para las valentes. Los estudios sobre el tiempo de respuesta global de
micobacterias, dos veces la primera semana y luego semanal- un laboratorio (turnaround time, TAT) son ms problemticos
mente para los hongos. Un informe provisional de un cultivo en microbiologa que en otras reas del laboratorio a causa de
negativo puede ser de ayuda, ya que el mdico puede desear las demoras inherentes a la generacin de los resultados micro-
evaluar nuevamente el caso mientras est pendiente el informe biolgicos. Ciertos anlisis, como el examen directo de mues-
final. Los informes finales deben emitirse lo antes posible; para tras clnicas, se prestan para evaluar el tiempo de respuesta glo-
la mayora de los cultivos bacterianos, 48 horas es un plazo bal. Se deben suministrar en forma anual los resmenes de los
razonable. resultados del antibiograma.
INTERACCIN CON LOS EPIDEMILOGOS CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REGISTROS

Los microbilogos desempean un papel importante en el Se deben seguir las guas locales y nacionales para el alma-
resguardo de la salud de los pacientes y, en general, de la salud cenamiento de las solicitudes y de los informes. stas difieren
pblica.38,89 Ciertos agentes infecciosos deben informarse por segn el tipo de muestra y la situacin clnica.
ley a las autoridades de salud pblica; la lista vara segn el Los lquidos corporales estriles o los tejidos deben mante-
estado y debe estar disponible en el laboratorio. El informe nerse a temperatura ambiente o en heladera hasta que el culti-
debe ser escrito o, cada vez ms, enviarse por va electrnica. vo se haya evaluado por completo; el lquido cefalorraqudeo
Dentro de una institucin se debe estimular una relacin debe conservarse a temperatura ambiente debido a la labilidad
similar con los epidemilogos del hospital (o del sistema de que presenta Neisseria meningitidis a 4 C. De manera ideal, el
atencin de salud). Los epidemilogos deben revisar ciertos tejido debe ser congelado a 70 C para su futura utilizacin,
resultados de laboratorio en forma regular. Adems, los micro- aunque esto puede ser dificultoso para muchos laboratorios. A
bilogos deben permanecer alertas frente a los patrones poco menudo, no es necesario volver al congelador. Sin embargo, en
comunes de aislamiento que merecen una mencin al epide- ocasiones, los anlisis siguientes (p. ej., luego de la revisin
milogo para que los considere para una investigacin poste- histolgica del tejido) pueden sugerir la necesidad de detectar
rior. A veces, la caracterizacin molecular de un aislamiento micobacterias, virus u hongos luego de una solicitud inicial
puede aumentar la calidad de las investigaciones epidemiolgi- slo de cultivo bacteriano. En esas situaciones, el tejido conge-
cas. Las pruebas adicionales deben hacerse localmente o en un lado representa un recurso invalorable con el cual se puede
laboratorio de referencia, segn la capacidad profesional de obtener un diagnstico etiolgico especfico y se pueden reali-
cada lugar. zar los ensayos de sensibilidad apropiados.
Los aislamientos de los hemocultivos deben mantenerse
durante al menos 30 das. De manera ideal, todos los cultivos
ANLISIS DE LOS RESULTADOS positivos deben retenerse durante un perodo (p. ej., 7 das)
El director es responsable de la comunicacin con los mdi- para permitir su evaluacin posterior; por ejemplo, su tipifica-
cos acerca de ciertos parmetros importantes sobre el funcio- cin molecular, o la realizacin de otras pruebas de sensibili-
namiento del laboratorio (recuadro 1-12). En condiciones pti- dad, si la clnica del paciente lo indica. Una vez ms el man-
mas, esta comunicacin debera tenerse con los mdicos en tenimiento a 70 C de aislamientos importantes o poco co-

Aspectos administrativos del laboratorio de microbiologa 45
munes es un lujo, pero es muy til. Si los aislamientos se con- rigurosos controles de calidad de los laboratorios de diagnsti-
servan, se deber realizar una cuidadosa y rigurosa limpieza co. Se guiar al lector por una extensa exploracin sobre la teo-
de los cultivos para mantener espacio para el almacenamiento ra y la prctica de la gestin de laboratorio.37
de los futuros aislamientos. Se describieron diversos mtodos
para el almacenamiento de los aislamientos microbianos.95 Regulacin estatal
Nosotros encontramos que un mtodo simple y eficaz de pre-
servar aun los aislamientos de bacterias con requerimientos En los Estados Unidos, el gobierno participa en casi todos
nutricionales especiales y de levaduras, es el simple hecho de los aspectos de evaluacin del laboratorio. A pesar de que algu-
colocar en un frasco ampolla estril un bloque de agar cortado nas cuestiones se relacionan directamente con conjuntos de
a partir de una placa, que contiene colonias intactas en su reglamentaciones especficas, todos los aspectos de la gestin
superficie. Los hongos pueden mantenerse como cultivos de laboratorio derivan, de una u otra forma, de leyes estatales.
acuosos a temperatura ambiente. Los virus deben congelarse En muchos casos, los lderes de la industria de los laboratorios
a 70 C. privados y acadmicos establecieron el marco de trabajo y defi-
nieron los estndares, que luego fueron adoptados por el esta-
do y aplicados a todos los laboratorios. En el recuadro 1-13 se
Aspectos administrativos del laboratorio de microbiologa enumeran las agencias federales y las agencias no guberna-
mentales involucradas en las reglamentaciones mdicas y de
El objetivo de este libro se centra en la ciencia de la micro- los laboratorios.
biologa aplicada al diagnstico y el tratamiento de las enfer- La autoridad que regula el alcance del laboratorio clnico
medades infecciosas. Sin embargo, en la prctica es imposible deriva de la Clinical Laboratory Improvement Act of 1967
separar los asuntos de la microbiologa de la ciencia. Una de (CLIA 67, Ley de mejoramiento del laboratorio clnico del ao
las virtudes de los laboratorios microbiolgicos es la sofistica- 1967). Esta legislacin autoriza la reglamentacin de los labo-
cin de los sistemas de soporte para la implementacin de los ratorios clnicos comerciales y de los hospitales. Durante vein-
procesos cientficos. Los laboratorios de investigacin tienen te aos los laboratorios de otras instituciones estuvieron exen-
mucho que aprender sobre el mantenimiento planificado y los tos. Las reformas de la Clinical Laboratory Improvement
Recuadro 1-13 Entidades relacionadas con la prctica mdica y de laboratorio
Entidad rea de responsabilidad
Center for Medicare and Medicaid Establece las reglas para la acreditacin, licencia e inspeccin de los laboratorios; fija
Services (CMS) las tasas de reembolso para los servicios Medicare
Centers for Disease Control and Participan en la categorizacin de la complejidad de las pruebas; proporcionan las
Prevention (CDC) recomendaciones sobre diversos temas, como las tcnicas de laboratorio y la prepa-
racin para el bioterrorismo
National Institute of Occupational Responsable de las reglamentaciones sobre proteccin de peligros qumicos y biol-
Health and Safety (NIOSH); una gicos
divisin de los CDC
Occupational Health and Safety Responsable de las reglamentaciones sobre la seguridad en los lugares de trabajo
Administration (OSHA)
Food and Drug Administration Responsable de la aprobacin de los medicamentos y de los dispositivos mdicos; la
(FDA) FDA quita obstculos para los dispositivos mdicos pero no los aprueba
Veterans Affairs Department Responsable de la salud y el bienestar de los veteranos, incluida la red nacional de
hospitales y clnicas
International Air Transport Organizacin internacional de transportistas areos; involucrada en la promulgacin

Association (IATA) de las reglas para el envo seguro de los agentes infecciosos por va area
Clinical and Laboratory Standards Organizacin voluntaria acadmica, industrial y gubernamental; su objetivo es mejo-
Institute (CLSI) (antes, National rar el desempeo de los laboratorios; aunque es una organizacin consejera, sus
Committee for Clinical Laboratory recomendaciones a menudo se vuelve estndares de la prctica del laboratorio
Standards [NCCLS])
American Medical Association La mayor organizacin de mdicos de los Estados Unidos; es responsable del desa-
(AMA) rrollo de los cdigos de las pruebas de laboratorio y de los procedimientos mdi-
cos, que sirven de base para los reembolsos
Joint Commission for the Inspecciona y acredita a los hospitales y laboratorios hospitalarios, las agencias de
Accreditation of Healthcare cuidado de salud domiciliario, los centros de salud para la atencin de las enferme-
Organizations (JCAHO) dades crnicas y otros

Cuadro 1-18 Categoras de la complejidad de las pruebas de laboratorio segn CLIA 88
REQUERIMIENTOS ENSAYOS DE APTITUD CONTROL

CATEGORA DESCRIPCIN DEL PERSONAL (PROFICIENCY) DE CALIDAD COMENTARIOS
Complejidad alta Pruebas que requieren Los ms estrictos; Se requiere Se requiere Las pruebas de alta y moderada
la mayor habilidad requiere el equivalen- complejidad no se consideran
analtica y criterio te a un ttulo de espe- en su conjunto pruebas de
cialista exencin
Complejidad Pruebas que requieren Menos estricto; requie- Se requiere Se requiere Existe una frmula compleja
moderada habilidad analtica y re entrenamiento que para categorizar las pruebas en
criterio pero en un se puede realizar a la niveles de complejidad
nivel menor vez que trabaja
Microscopia El examen microscpi- Se deben definir los Se requiere si corresponde Se requiere si Esta es una subcategora de las
realizada por co realizado por cier- grupos de operado- corresponde pruebas de moderada comple-
operadores tos grupos de mdicos res; no se puede jidad
delegar en otro
miembro del
personal
Pruebas de Pruebas simples que no Ninguno No se requiere Se deben seguir A la mayora de los trabajadores
exencin es probable que ten- las instruccio- de los laboratorios les lleva
gan consecuencias nes del fabri- mucho tiempo comprender
adversas si se realizan cante para qu vale la pena realizar
de manera incorrecta una prueba si una respuesta
incorrecta no causa ningn
dao
Para obtener informacin ms detallada, dirjase al sitio de los Centers for Medicare & Medicaid Services (CMS): hhttp://www.cms.hhs.gov/clia/appendc.asp
Amendments of 1988 (CLIA 88, Ley de mejoramiento del labo- 3. Los fabricantes se esfuerzan para que sus instrumentos y
ratorio clnico de 1988) extendieron el mandato para incluir productos se ubiquen en la categora de las pruebas de exen-
a los laboratorios estatales, de salud pblica y los laboratorios cin, de modo que puedan comercializarlos directamente
de los consultorios mdicos que realizan anlisis para enferme- con los mdicos como simples pruebas sin los rigurosos
dades humanas. Los anlisis con fines de investigacin (los requerimientos de control y documentacin.
resultados no se aplican a la atencin del paciente) y de medici-
na veterinaria no se encuentran bajo el alcance estatal. Acreditacin e inspeccin del laboratorio. La reglamentacin de la
En la reglamentacin de la CLIA 88 se establecieron varias CLIA 88 otorga las licencias a los laboratorios luego de la ins-
categoras de anlisis (cuadro 1-18); adems, existen muchas peccin realizada por inspectores estatales o por otras organiza-
otras reglamentaciones, segn la categora en la cual se ubique ciones que hayan sido acreditadas por los CMS porque cuen-
el anlisis. Los Centers for Disease Control and Prevention tan con los estndares equivalentes, o an ms estrictos. La Joint
(CDC) tienen a su cargo la tarea de asignar cada anlisis a una Commission for the Accreditation of Healthcare Organizations
categora compleja. Un grupo de consejeros formado por indi- (JCAHO) y el College of American Pathologists (CAP) son dos
viduos del estado, la industria, grupos mdicos, laboratorios organizaciones muy utilizadas por los laboratorios clnicos para
clnicos y de salud pblica y consumidores aconseja al estado la acreditacin y la inspeccin. En todos los casos, el laboratorio
sobre estas decisiones (Clinical Laboratory Improvement debe evaluarse en forma bienal. Los laboratorios que utilizan la
Advisory Committee [CLIAC, Comit consejero sobre el mejo- JCAHO, se encuentran casi siempre en hospitales y su inspec-
ramiento del laboratorio clnico]). cin se realiza al mismo tiempo que la del hospital. En este caso,
En las reglamentaciones se delinean las especificaciones los inspectores son profesionales, por lo general con una pre-
detalladas sobre la calificacin del personal, los ensayos de paracin mdica o de enfermera en lugar de tener un entrena-
aptitud (proficiency) y el control de calidad para todos los labo- miento especfico en laboratorio clnico. El CAP fue la primera
ratorios no exentos que realizan anlisis. organizacin que evalu a los laboratorios antes de la participa-
Han surgido numerosos consecuencias de las reglamentacio- cin del estado en este proceso. Al principio, la acreditacin era
nes de la CLIA 88. voluntaria y se vea como una forma de educacin para la mejo-
ra del propio laboratorio. Su filosofa se basa en la evaluacin
1. La mayora de los mdicos han dejado de realizar todos los por pares. Cada laboratorio que se inspecciona debe suministrar
anlisis excepto los ms bsicos porque las reglamentacio- un equipo para inspeccionar a su vez a otro laboratorio similar.
nes imponen requerimientos considerados demasiado ago- Por lo tanto, los inspectores son profesionales de laboratorio y
biantes. voluntarios.
2. Existe una presin constante por parte de los grupos mdi- Cada organizacin que inspecciona a los laboratorios tiene
cos (que no son patlogos) para que las reglamentaciones un conjunto de estndares para evaluar, los cuales deben ser
sean ms flexibles y permitan la realizacin de anlisis ms enviados a los Centers for Medicare & Medicaid Services
complejos sin controles estrictos. (CMS) para su aprobacin. En algunos estados se debe realizar,

adems, la acreditacin ante una agencia estatal si el laborato- laboratorio pueden ser informados a individuos autorizados, la
rio tiene relaciones comerciales con ese estado. persona que requiri el anlisis o quien es responsable de la uti-
Ensayos de aptitud (proficiency). Una parte fundamental de la lizacin de los resultados. En algunas jurisdicciones pueden
acreditacin continua es la participacin en los ensayos de apti- aceptar pedidos de anlisis directamente de los pacientes.
tud. Se envan muestras desconocidas a los laboratorios parti-
cipantes en forma peridica. El laboratorio las evala y enva Gestin de riesgos
los resultados a la agencia de acreditacin, luego de lo cual
estos resultados son evaluados y se le otorga una calificacin. La mayora de los centros de salud estn actualmente invo-
Una vez ms, el CAP inici este protocolo muchos aos antes lucrados en la gestin de riesgos. De hecho, muchos hospitales
que la CLIA 67. Hoy, las reglas son establecidas por el estado, y clnicas han establecido oficinas formales para esa gestin,
aunque existe cierta libertad para trabajar dentro de ellas. Los completamente financiadas y con personal para ayudar a redu-
mejores programas proporcionan una experiencia de capacita- cir al mnimo las probabilidades de accidentes y de prcticas de
cin como parte de los ejercicios. El Clinical and Laboratory alto riesgo que les puedan causar dao a los empleados y a los
Standards Institute (CLSI) ofrece una gua para mejorar el fun- pacientes. A pesar de que el mayor mpetu para esta prctica
cionamiento del laboratorio a travs de los ensayos de aptitud.78 puede estar dirigido hacia la reduccin de los costosos pedidos
Si no se cuenta con una fuente externa de ensayos de aptitud de compensacin de los trabajadores o a los procesos judicia-
para un analito, se debe crear en el laboratorio otro mtodo que les de mala praxis, en un sentido ms amplio, los esfuerzos
permita determinar su desempeo. Existen diversos mtodos, puestos para la gestin de riesgos estn destinados a garantizar
entre ellos el intercambio de muestras entre laboratorios y la un entorno de trabajo seguro y un ambiente en el cual los
elaboracin de un panel de muestras problemas dentro del pacientes puedan recibir la ltima tecnologa mdica sin temor
mismo laboratorio.81 a ser daados.97
En la CLIA 88 se codificaron algunas reglas aparentemente La persona a cargo de la gestin de riesgos, trabajando en
obvias: el protocolo para los ensayos de aptitud debe ser lo ms conjunto con el comit de aseguramiento de la calidad, es asig-
parecido posible al que se utiliza para las muestras clnicas nada para investigar los casos en los cuales el tratamiento de la
(incluida la participacin del mismo personal que realiza el calidad cae por debajo de los umbrales establecidos o las situa-
ensayo) y el personal del laboratorio no puede comparar los ciones en las cuales los empleados o los pacientes puedan estar
resultados antes de enviar las respuestas; en otros palabras, se expuestos a un riesgo indebido. Despus de revisar los detalles
toman precauciones para evitar el falseamiento de datos. de la situacin con los representantes adecuados del departa-
Calificacin del personal. En la reglamentacin de la CLIA 88 mento involucrado y de recabar los datos necesarios, la perso-
para los laboratorios que realizan anlisis reglamentados se na a cargo de la gestin de riesgos enva un informe conciso al
proporcionan especificaciones detalladas para el personal de comit del aseguramiento de la calidad conjunto con las reco-
todos los niveles del laboratorio. mendaciones para las acciones correctivas. El dilogo entre la
Manuales de procedimientos. A pesar de que no existen prescrip- persona a cargo de la gestin de riesgos y el director del comi-
ciones rgidas para la preparacin de las polticas y los proce- t contina hasta que se concreta un plan de accin apropiado.
dimientos escritos, se deben seguir ciertos principios genera- Luego se controla que el departamento involucrado cumpla con
les.82 Se deben establecer y seguir claramente las polticas. Los los planes de accin correctiva.
procedimientos deben incluir los principios del anlisis y las A pesar de que el mayor esfuerzo de la gestin de riesgos
referencias, as como las instrucciones para su realizacin. Los est dirigido hacia la atencin del paciente, el laboratorio clni-
manuales deben estar disponibles para todos los trabajadores co participa en verificar que todas las operaciones del labora-
que necesiten consultarlos. torio cumplan con el total de las prcticas y polticas de la ins-
Requerimientos de espacio. Las reglamentaciones no especifican titucin. Si los equipos o instrumentos se daan debido a un
en forma detallada los requerimientos de espacio. En cambio, incendio o a un accidente elctrico, si el personal se lastima o
indican que debe ser adecuado para realizar el trabajo en forma si los trabajadores contraen infecciones serias en el laboratorio,
satisfactoria. Sin embargo, se describieron guas informales el flujo de trabajo se puede desorganizar y, en consecuencia,
para los laboratorios generales75 y para los laboratorios de los informes de laboratorio se retrasan. Por lo tanto, la gestin
microbiologa120 que pueden ser tiles cuando se construye una de riesgos del laboratorio est relacionada principalmente con
nueva instalacin o para evaluar la adecuacin de un laborato- la implementacin y el control de las prcticas seguras de labo-
rio ya instalado. ratorio, dirigida ms hacia los empleados que a los pacientes.
Laboratorios de referencia o de derivacin. Es un laboratorio poco La responsabilidad de un dao recae claramente sobre el
comn que puede satisfacer todos los requerimientos de los empleador, aun cuando la negligencia que condujo a ese dao
mdicos. Algunas muestras deben enviarse a un laboratorio sea responsabilidad del trabajador.50 Por esta razn, las perso-
especializado para su anlisis posterior.76 La seleccin de uno o nas que se ocupan de la gestin de riesgos insisten en llevar a
ms laboratorios de referencia no debe hacerse en forma cabo cursos de educacin orientados hacia la seguridad y en
casual. Los candidatos posibles deben evaluarse en conjunto revisar que todas las reglas y reglamentaciones pertinentes a la
con el personal mdico adecuado. El precio no es el nico seguridad del laboratorio sean implementadas y seguidas.
determinante o incluso el factor ms importante. La seleccin El aspecto financiero es otra rea importante a la cual las per-
debe someterse a revaluaciones regulares. sonas que se ocupan de la gestin de riesgos le prestan cada vez
Confidencialidad del paciente. La Health Insurance Portability ms atencin. Existen reglamentaciones estrictas para los con-
and Accountability Act of 1996 (HIPAA, Ley de portacin y flictos de inters, las facturaciones fraudulentas y los incentivos
responsabilidad del seguro de salud de 1996) proporciona un ilegales para los negocios (como las comisiones clandestinas).
resguardo para la confidencialidad de la informacin y permi- La facturacin de los programas estatales (el seguro estatal de
te que los pacientes tengan acceso a sus registros mdicos. Sin enfermedad, Medicare y el programa de asistencia estatal para
embargo, la reglamentacin del CLIA 88 para los laboratorios individuos sin recursos, Medicaid) deben utilizar un conjunto de
reemplaza los requerimientos del HIPAA. Los resultados del cdigos de pruebas, denominados Cdigos de Terminologa

de Procedimientos Actuales (Current Procedural Terminology, da. Las sandalias y el calzado del tipo abierto no ofrecen la
CPT). Muchas otras aseguradoras tambin utilizan estos cdi- proteccin adecuada al pie y por lo tanto, no son aceptables.
gos. La American Medical Association (AMA), que ha sido Est prohibido fumar en el laboratorio. Los dedos, los lpi-
designada por el Estado para esta tarea, revisa y publica anual- ces y otros implementos no deben introducirse en la boca.
mente estos cdigos. Cualquier persona u organizacin puede No deben permitirse bromas ni payasadas.
participar en el ingreso de datos para la construccin de los 4. Las lentes de contacto, en especial las de tipo blando, absor-
cdigos, pero el comit operativo de la AMA se forma a partir ben ciertos solventes y pueden ser un peligro si ocurren sal-
de sus sociedades constitutivas. En el campo del laboratorio picaduras o derrames. Se aconseja a los empleados que no
mdico stos son del CAP y de la American Society for Clinical las utilicen en el laboratorio o que usen anteojos de seguri-
Pathology (ASCP). dad cuando trabajan con materiales custicos o infecciosos.
5. No se permite comer ni guardar alimentos o bebidas en el
Seguridad del laboratorio laboratorio o en frigorficos que se utilizan para muestras o
materiales de laboratorio. Se debe designar especficamente
A pesar de que la responsabilidad legal de proporcionar un un frigorfico para guardar comida y bebidas.
ambiente de trabajo seguro es de los directores de los hospita- 6. Est absolutamente prohibido pipetear con la boca cualquier
les y laboratorios, los empleadores deben tambin compartir la material. Se cuenta con numerosos sistemas de ayuda para
responsabilidad de adherirse a los estndares de seguridad deli- hacerlo.
neados en el Manual de Seguridad del Laboratorio, de avisar al 7. El personal del laboratorio que tenga infecciones en la piel,
supervisor acerca de cualquier peligro que pueda surgir duran- infeccin respiratoria aguda u otras enfermedades contagio-
te las actividades laborales y buscar atencin mdica inmedia- sas debe evitar el contacto con los pacientes.
ta ante cualquier accidente potencialmente relacionado con el 8. Es importante que los trabajadores del laboratorio conozcan
trabajo.50 las caractersticas de todos los materiales en uso y, por lo
Se debe designar a una persona en el laboratorio como res- tanto, puedan tomar las precauciones adecuadas durante su
ponsable de la seguridad, cuyos deberes son verificar que los utilizacin y su descarte. Se requiere que los fabricantes
estndares de seguridad y las guas se encuentren escritas y proporcionen estos detalles en las hojas de informacin
publicadas, informar a los empleados acerca de esos estndares sobre la seguridad del material. Estas hojas deben estar
a travs de cursos programados en forma regular sobre seguri- accesibles para todos los miembros del laboratorio.
dad del laboratorio y de reuniones informativas del servicio, e 9. Se deben colocar las etiquetas y los signos apropiados en
implementar un sistema en el lugar para controlar el cumpli- todas las muestras o instrumentos y en todas las reas del
miento. El responsable de seguridad trabajar de manera estre- laboratorio donde sea necesario para mantener un ambiente
cha con la persona a cargo de la gestin de riesgos para recon- de trabajo seguro.
ciliar y corregir cualquier brecha en las conductas o irregulari- 10. En el cuadro 1-19 se resumen los tipos y los niveles de des-
dad que se descubra. contaminacin. Es importante que coincida el tipo de
desinfeccin o esterilizacin con el peligro biolgico.18,19,119
NORMAS Y REGLAMENTACIONES GENERALES DE SEGURIDAD
Se les advierte a los trabajadores del laboratorio que no se
expongan a riesgos innecesarios. El descuido, la negligencia y PRECAUCIONES HABITUALES DE SEGURIDAD
las prcticas inseguras pueden dar como resultado serios acci- Centrifugacin
dentes, no slo para el individuo sino tambin para otros com-
paeros de trabajo y para los pacientes. A continuacin se deta- 1. Antes de centrifugar algo, verifique que los tubos, el frasco
llan consideraciones generales que harn que el trabajo en el ampolla o las botellas no se rompan. Reemplace en forma
laboratorio de microbiologa presente menor riesgo.73 Cada peridica los cojinetes de goma que se encuentran en el
director de laboratorio es responsable de asegurar que las pol- fondo de las camisas portatubos y elimine los vidrios rotos
ticas y los procedimientos del laboratorio estn de acuerdo con que puedan haberse acumulado.
los requerimientos legales (federal, estatal y local) y los estn- 2. Asegrese de que la centrfuga se encuentre correctamente
dares de la buena prctica del laboratorio. balanceada antes de usarla. Verifique los anillos portacami-
sas y las camisas portatubos para estar seguro de que los
1. Cada empleado deber ser instruido acerca de la ubicacin y pesos coinciden.
el manejo de todo el equipamiento y las instalaciones de 3. Espere que la centrfuga se detenga por completo antes de
seguridad, como mantas para incendio, extintores, duchas y abrir la tapa para retirar las muestras. Utilice slo el dispo-
lavabo para lavado ocular. Cada uno de stos debe ser fcil- sitivo de freno para lograr que la rotacin se detenga en
mente accesible en el laboratorio. forma ms rpida y completa.
2. El equipo de proteccin personal (guantes de ciruga, bata, 4. Si se rompe un tubo en la centrfuga, primero apague el ins-
etc.) debe usarse cuando corresponda. Las batas deben trumento, espere al menos 20 minutos antes de abrir la tapa
usarse (con los botones abrochados) en todo momento y luego de colocarse una mscara y guantes, limpie comple-
mientras se est en el laboratorio y deben quitarse cuando se tamente y desinfecte el interior de la centrfuga.
lo abandona. Para algunas manipulaciones que pudieran 5. Cada centrfuga debe limpiarse totalmente con el desinfec-
generar aerosoles infecciosos con patgenos importantes, tante adecuado al final del da, como parte del programa de
como Mycobacterium tuberculosis, deben utilizarse msca- mantenimiento de rutina. Se debe realizar el mantenimiento
ras personales adaptables. preventivo de todas las partes de la centrfuga bajo un cro-
3. Los hbitos y el aseo personal deben estar pautados de ante- nograma regular apropiado.
mano. El cabello largo debe estar recogido para que no obs- 6. Si se centrifuga material potencialmente infeccioso, la mues-
taculice el trabajo con el equipamiento o los reactivos. La tra debe colocarse en un contenedor cerrado (tubos de cen-
aplicacin de cosmticos en el rea de trabajo est prohibi- trfuga con tapa).

Cuadro 1-19 Tipos de descontaminacin, desinfeccin y esterilizacin*
NIVEL CATEGORA EPA/FDA CATEGORA CDC EJEMPLO TIPO DE ORGANISMOS EJEMPLOS
1 Desinfectante hospitalario Desinfectante de bajo Compuestos de amonio Bacterias vegetativas Especies de Staphylococcus
nivel cuaternario
Virus envueltos o de tamao Especies de Pseudomonas

mediano Virus de la inmunodeficiencia
humana
Virus del herpes simple
Virus de las hepatitis B y C
Coronavirus
2 Desinfectante hospitalario Desinfectante de nivel Compuestos de amonio Hongos Especies de Aspergillus

con actividad tuberculocida intermedio cuaternario con alco- Especies de Candida
hol; fenoles; iodfo-
ros; productos que
contienen cloro
Virus no envueltos o de Enterovirus

tamao pequeo Rinovirus
Micobacterias Mycobacterium tuberculosis
3 Esterilizante/ desinfectante de Desinfectante de alto Glutaraldehdo; perxi- Esporas bacterianas Especies de Bacillus
alto nivel nivel do de hidrgeno
4 Esterilizacin Esterilizacin xido de etilieno; Todos los agentes

autoclave
* Los agentes a cada nivel son eficaces tambin contra los organismos que matan a los agentes de un nivel inferior. Los priones requieren una consideracin aparte; consltese la
referencia.99 Adaptado de las referencias 18,19.
Agujas y material de vidrio 3. Los tomacorrientes no deben estar sobrecargados. Nunca uti-
lice enchufes mltiples.
1. Deseche todo el material de vidrio astillado y roto en conte- 4. Todo cable o equipo elctrico que se enchufe debe tener
nedores adecuados. cable y enchufe con descarga a tierra. Todas las descargas
2. Levante los vidrios rotos con un cepillo y una pala; no utili- elctricas, aun las que causan hormigueos pequeos, deben
ce las manos. investigarse de inmediato.
3. Los artculos de vidrio no deben desecharse en el lavabo o 5. Los alargues deben utilizarse slo si cumplen con todas las
sueltos en un cubo de basura donde se arrojan papeles. Los polticas y los procedimientos del hospital.
vidrios pueden producir cortes en los dedos y las manos de
las personas que los retiran. Deben colocarse en un conte- Precauciones en el corredor
nedor diseado para objetos cortantes.
4. Las agujas y las lancetas (punzantes) utilizadas deben colo- 1. Abra las puertas hacia el corredor con precaucin. Debe
carse en los contenedores apropiados para agujas usadas tenerse cuidado con las puertas vaivn. Si hay una ventana
para poder descartarlas en forma segura. Estos contenedores en la puerta, mire hacia afuera para estar seguro de que el
de objetos punzantes se deben controlar y cambiar peridi- corredor est libre antes de abrir la puerta.
camente para evitar su llenado excesivo. 2. Mantenga la derecha al acercarse a la interseccin del corre-
5. Evite, en lo posible, sacar las agujas de las jeringas o cam- dor y al utilizar las escaleras. Camine, nunca corra en los
biar las agujas de las jeringas. La prctica de cambiar la vestbulos, habitaciones y los huecos de las escaleras. Los
aguja antes de inocular la sangre obtenida por venopuncin espejos ubicados de manera apropiada proporcionan imge-
dentro de los frascos de hemocultivo ha sido abandonada en nes del posible trfico en los corredores que se cruzan.
la mayora de los hospitales. 3. Tenga cuidado con la eventual presencia de objetos peligro-
sos en el vestbulo, como camas, carros o mesas, y con los
objetos que se encuentran en el suelo, como sujetapapeles,
Seguridad elctrica cables elctricos, baldosas flojas y lquidos derramados. Se
debe utilizar slo un lado del corredor para el almacena-
1. Todo el personal debe conocer la ubicacin de los interrup- miento temporal de un equipo mvil.
tores maestros y de los tableros de interrupcin de los cir-
cuitos. No intente reparar ningn instrumento mientras est Levantamiento de objetos
enchufado.
2. No se deben utilizar los enchufes o cables que estn rotos, 1. Las lesiones de la espalda se encuentran entre las causas ms
deshilachados o gastados. frecuentes de enfermedad debilitante entre el personal. Evi-

te levantar objetos pesados cuando sea posible. Siempre con- 6. Al final del da o despus de un derrame se deben desinfec-
siga ayuda. tar las superficies de trabajo con un producto eficaz contra
2. Si debe levantar objetos sin la ayuda de otra persona, tome los agentes que pueden contaminar el sitio. Todo equipa-
las siguientes precauciones: miento que se retire del laboratorio debe primero ser des-
a. Estar bien afirmado. Mantener una distancia entre los pies contaminado. Adems, las cabinas de flujo laminar de
de alrededor de 25 cm. seguridad biolgica deben descontaminarse (debe hacerlo
b. Doblar las rodillas para tomar el objeto. preferentemente un tcnico acreditado en el cuidado de este
c. Mantener el objeto cerca del cuerpo y sostenerlo en forma equipamiento) antes de realizar el mantenimiento o de cam-
firme. biar los filtros.
d. Mantener los brazos y la espalda tan estirados como sea
posible y levantar el objeto hacia arriba estirando las
piernas. AGENTES BIOLGICOS
Clasificacin de los agentes biolgicos. Los CDC y el National
Manipulacin de muestras y derrames Institute of Health clasificaron los organismos infecciosos den-
tro de grupos de riesgo,99 que se resumen en el cuadro 1-20. El
1. Las muestras deben recolectarse en recipientes seguros con documento se puede obtener en la oficina de impresiones del
un tipo de cierre adecuado para evitar los derrames y las fil- gobierno o en el sito de Internet: (http//www.cdc.gov/od/ohs/
traciones. Se deben tratar todas las muestras como si fueran biosfty/bmbl4/bmbl4toc.htm).
peligrosas. Contencin fsica de los peligros biolgicos. Las barreras fsicas
2. Se deben cubrir las cortaduras en las manos con vendajes para las infecciones en el laboratorio pueden clasificarse en
adhesivos adecuados. Utilice guantes desechables si la acti- personales o institucionales. Las barreras personales son la
vidad involucra el contacto con sangre, suero, plasma u higiene personal (p. ej., instalaciones separadas para los ali-
otros lquidos o tejidos. mentos o para el lavado de manos) y el equipo de proteccin (p.
3. Si un contenedor presenta evidencia de rotura, filtracin o ej., protectores contra salpicaduras, gafas, guantes, camisolines
mancha, colquese guantes y transfiera la mayor cantidad y mscaras). Las barreras institucionales son estructurales (p.
de muestra posible a un segundo recipiente estril. Tambin ej., instalaciones separadas, puertas y cerraduras) y tecnolgi-
transcriba cualquier informacin pertinente del viejo reci- cas (p. ej., manipulacin y filtracin del aire). Las cabinas de
piente al nuevo. seguridad biolgica (CSB) son un componente crtico en la
4. Las prescripciones que estn contaminadas con sangre deben proteccin de los trabajadores. Es importante tener en cuenta
rechazarse. Maniplelas slo con guantes si su procesa- que las CSB y las campanas para el manejo de los productos
miento es necesario en una emergencia. Notifique al solici- qumicos son diferentes. Es posible construir una CSB que
tante que este tipo de materiales contaminados representan pueda utilizarse como campana para el manejo de los produc-
un peligro para la salud. tos qumicos, pero slo ciertos tipos de CSB se aplican a este
5. Lvese exhaustivamente las manos con agua y jabn varias uso. Las campanas para manejo de productos qumicos no
veces por da, sobre todo despus de manipular muestras deben utilizarse para la manipulacin de agentes infecciosos.
antes de salir para tomar alguna colacin. En el cuadro 1-21 se resume la clasificacin de las CSB y se
6. Los derrames se deben manejar segn la naturaleza del mate- las esquematiza en las figuras 1-21 a 1-25. La mayora de los
rial involucrado. laboratorios clnicos utilizan CSB de tipo II para procesar las
muestras y trabajar con los aislamientos, en especial los que
Manipulacin de desechos y materiales peligrosos presentan peligro de generacin de aerosoles. Hoy es poco
comn que se utilicen las CSB de tipo I, y las de tipo III no sue-
1. Deje aparte en el laboratorio ciertos lavabos para el descar- len utilizarse en los laboratorios de diagnstico. En las cabinas
te de muestras de sangre y orina. No se debe permitir el de clase II o III el aire se dirige, de un modo laminar, a travs de
lavado de las manos en estos lavabos. la superficie de trabajo desde la parte superior de la cabina y
2. Las bolsas para materiales biolgicos peligrosos (as rotu- reduce la contaminacin de las muestras con agentes que for-
ladas) deben utilizarse para descartar todas las muestras man aerosoles. Estos dispositivos se denominan cabinas de
potencialmente contaminadas, tubos con sangre, recipien- flujo laminar de seguridad biolgica. El flujo laminar hacia
tes de muestras, pipetas, puntas de pipetas, recipientes de abajo tambin protege el rea de trabajo del aire no filtrado que
reaccin, tapones y otro material de este tipo. Se debe dejar es empujado a travs de la apertura frontal en las cabinas de
suficiente espacio en la parte superior de modo tal que la clase II; el aire que ingresa frontalmente es dirigido por el flujo
bolsa pueda cerrarse fcilmente y asegurarla con una banda laminar hacia el sumidero ubicado debajo del rea de trabajo
elstica. Es una buena prctica la utilizacin de doble bolsa donde ste se filtra antes de confluir con el flujo laminar que se
para los desechos peligrosos. desplaza hacia abajo.
3. Descarte el material de vidrio y punzante en los recipientes Un tcnico acreditado debe validar la velocidad del flujo del
de pared rgida apropiados. Cuando estos recipientes se lle- aire en las CSB de clases I y II al menos una vez por ao o
nan, deben sellarse con cinta y colocarse en las cajas para cuando se realiza algn trabajo de reparacin. Adems, la cabi-
desechos rotuladas para su descarte correcto. na debe ser descontaminada por un tcnico acreditado antes de
4. Retire las bolsas para materiales biolgicos peligrosos lle- efectuar cualquier manipulacin que comprometa un rea con-
nas a las reas de desechos designadas, en forma tan fre- taminada (p. ej., cambio de los filtros, reemplazo o reparacin
cuente como sea necesario durante el da para evitar su acu- de los motores o traslado de la cabina).
mulacin. Con respecto a los riesgos habituales de infecciones en los la-
5. Sumerja el material de vidrio no desechable contaminado en boratorios de diagnstico, y a pesar de que la mayora de los
soluciones desinfectantes. Enjuague con abundante agua y agentes que se encuentran en un laboratorio clnico pueden
pngalo en el autoclave antes de utilizarlo nuevamente. causar enfermedades a los trabajadores del laboratorio, slo un

Cuadro 1-20 Clasificacin de los agentes biolgicos segn el riesgo*
NIVEL DE EQUIPO DE INSTALACIONES

BIOSEGURIDAD CLASES EJEMPLOS SEGURIDAD (BARRERAS
(BSL) DE AGENTES DE LOS AGENTES PRCTICAS (BARRERAS PRIMARIAS) SECUNDARIAS)
1 No se sabe que cause Prcticas microbiolgi- No se requieren Se requiere una mesada

enfermedad regular- cas estndares abierta con lavabo superior
mente en adultos
sanos
2 Se asocia con enferme- Enterobacteriaceae BSL-1 ms: CSB de clase I o II u otros dis- BSL-1 ms:
dades en seres Especies de Candida Acceso limitado positivos de contencin fsica Disponibilidad de un
humanos Complejo Signos de adverten- utilizados para todas las autoclave
Peligro = lesin percu- Mycobacterium cia de peligro biol- manipulaciones de los agen-
tnea, ingestin avium gico tes que causan salpicaduras o
o exposicin de Virus del herpes Precauciones con aerosoles de materiales
mucosas simple objetos punzo- infecciosos
cortantes EPP: guardapolvos, guantes, y
Manual de bioseguri- proteccin de la cara cuando
dad que defina la se lo requiera
descontaminacin de
los residuos y las
prcticas de vigilan-
cia mdica
3 Agentes endgenos o Mycobacterium Prcticas BSL-2 ms: CSB de clase I o II u otros dis- BSL-2 ms:
exticos con poten- tuberculosis Acceso controlado positivos de contencin fsica Separacin fsica de los
cial transmisin en Francisella tulerensis Descontaminacin utilizados para todas las corredores de acceso
aerosol Virus del Nilo occi- de todos los residuos manipulaciones de los agen- Puertas de acceso dobles
La enfermedad puede dental Descontaminacin de tes que causan salpicaduras o que se cierran solas
tener consecuencias la indumentaria de aerosoles de materiales El aire expelido no se
serias o letales laboratorio antes de infecciosos recircula
ir a la lavandera EPP: guardapolvos, guantes, y Flujo de aire negativo
Muestra de suero proteccin de la cara cuando dentro del laboratorio
inicial se lo requiera
4 Agentes peligrosos o Arenavirus que pro- Prcticas BSL-3 ms: Todos los procedimientos se BSL-3 ms:
exticos que presen- ducen fiebre hemo- Cambio de indumen- llevan a cabo en una CSB de Edificio separado o zona
tan alto riesgo de rrgica (p. ej. taria al ingresar clase III o en CSB de clase I aislada
enfermedades que Lassa, Junn, Ducha al salir o II combinado con un taje Emplea sistemas de abas-
ponen en riesgo la Machupo) Todos los materiales personal de presin positiva, tecimiento y expulsin de
vida, infecciones de Filovirus que produ- se descontaminan con abastecimiento de aire aire y de vaco y descon-
laboratorio que se cen fiebre hemorr- cuando salen del que cubre el cuerpo por taminacin
transmiten por gica (p. ej. lugar completo Otros requerimientos enu-
aerosol Marburg, bola) merados en la referencia99
O agentes relacionados
con un riesgo de
transmisin
desconocida
BSL: nivel de bioseguridad; CSB: cabina de seguridad biolgica; EPP: equipo de proteccin personal.
* Nivel de seguridad de muchos agentes cuando se realizan manipulaciones en las cuales sera razonable esperar que se generen aerosoles o cuando se emplean grandes volmenes
de materiales. Para algunos agentes de nivel 2 se indica un nivel superior cuando se manipulan cultivos que se sabe que contienen al agente. Se utiliza una clasificacin separada
para los agentes que infectan, en forma natural o experimental, a animales.
Adaptado de la referencia99.
nmero relativamente pequeo de ellos las producen. Miller y rosis, el 27%, y las micobacteriosis, un 9%. Las especies de
cols.66 describieron una experiencia de 25 aos con infecciones Salmonella y de Chlamydias, el virus de la enfermedad de New-
humanas adquiridas en el laboratorio en el National Animal castle (un patgeno no humano) y las especies de Trichophyton
Disease Center (NADC) en Ames, Iowa, una institucin donde representaron las otras infecciones adquiridas informadas al
se realizan investigaciones sobre enfermedades comunes del NADC.
ganado y de las aves de corral. El nivel de riesgo para los tra- Las 10 infecciones adquiridas con mayor frecuencia en el
bajadores es probablemente algo mayor que el promedio de los laboratorio que surgen a partir de estudios acumulados son:
laboratorios clnicos. Entre 1960 y 1985 se informaron al 1) brucelosis, 2) fiebre-Q, 3) fiebre tifoidea, 4) tularemia, 5)
NADC 128 exposiciones en laboratorios a organismos zoon- tuberculosis, 6) tifus, 7) hepatitis infecciosa, 8) encefalitis
ticos; esto deriv en 34 infecciones asociadas con el laborato- equina venezolana, 9) coccidioidomicosis y 10) psitaco-
rio. La brucelosis represent el 47% de los casos; la leptospi- sis.90,91,92,118 Algunas de estas infecciones son difciles de evi-

Cuadro 1-21 Comparacin de las cabinas de seguridad biolgica
VELOCIDAD EN RADIONCLIDOS/ PROTECCIN

LA APERTURA QUMICOS NIVELES DE DE PRODUCTOS
TIPO FRONTAL PATRN DEL FLUJO DE AIRE TXICOS BIOSEGURIDAD (MUESTRAS)
Clase I 24 (75) Entrada frontal; parte posterior y arriba a No 2, 3 No

Frente abierto travs de filtro de alta eficiencia (HEPA)
(fig. 1-21)
Clase II 24 (75) 70% de recirculacin a travs de filtro No 2, 3 S

Tipo A HEPA; expelido a travs de filtro HEPA
(fig. 1-22)
Clase II 330 (100) 30% de recirculacin a travs de filtro S (bajos niveles/volati- 2, 3 S

Tipo B1 HEPA; expelido por medio de filtro HEPA lidad)
y conductos rgidos (fig. 1-23)
Clase II 330 (100) Sin recirculacin; expelido total por medio S 2, 3 S

Tipo B2 de filtro HEPA y conductos rgidos
(fig. 1-24)
Clase II 330 (100) El mismo que IIA, pero el aire expelido se S 2, 3 S

Tipo B3 elimina a travs de un espacio de presin
negativa y se lleva por conductos al
exterior
3, 4 S
Clase III ND Provisto de conexiones de entrada y expeli- S
do de aire a travs de dos filtros HEPA
(fig. 1-25)
Tomado de la referencia99.
tar, aunque el objetivo debe ser siempre cero infecciones. Sin las producidas por el virus de la inmunodeficiencia humana
embargo, en algunas circunstancias no es difcil visualizar los (HIV), el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C. En
medios para evitar las infecciones, al menos en retrospectiva. la mayora de los hospitales, el virus de la hepatitis C es el ms
Por ejemplo, un estudiante de auxiliar mdico contrajo fiebre prevalente, debido a que se cuenta con una vacuna eficaz con-
tifoidea con complicaciones luego de trabajar con Salmonella tra el virus de la hepatitis B y a que la incidencia de HIV en la
typhi como un microorganismo desconocido.44 An peor, el poblacin general es baja. Es importante que se cuente con
22% de los auxiliares de laboratorio presentaron gastroenteri- una vacuna eficaz contra el virus de la hepatitis B, porque el
tis por Shigella sonnei. La tipificacin de los aislamientos riesgo de un trabajador no inmunizado de contraer esta infec-
revel que todas las cepas eran idnticas a una que se le haba cin es mucho mayor que la de adquirir una infeccin por el
dado a un estudiante como desconocida.64 Algunos agentes virus de la hepatitis C o el HIV.
que no debieran encontrarse en un laboratorio clnico a veces Los CDC,14-17 el CLSI79 y los trabajadores de los laborato-
pueden causar infecciones en los investigadores22,43,4 cuando rios8 han establecido recomendaciones para reducir al mnimo
se realizan manipulaciones que producen aerosoles sin la con- las infecciones transmitidas por va sangunea.
tencin adecuada. En el cuadro 1-22 se resumen los riesgos de contraer los
principales patgenos transmitidos por esa va.17
Como casi nunca es posible predecir quines son los indivi-
PRECAUCIONES UNIVERSALES duos que pueden ser fuente de riesgo, surgi el concepto de
Irnicamente, los trabajadores del laboratorio tiene un ries- precauciones universales. Esto significa que cada muestra se
go mucho menor de infectarse que sus colegas mdicos. considera de riesgo. La especificacin de que algunas muestras
Numerosas razones explican este fenmeno. Los pacientes son riesgosas incrementa la posibilidad de que se genere una
estornudan y tosen; las placas de cultivo, no. A menos que en falsa sensacin de seguridad.
el laboratorio se realicen procedimientos que generen grandes Los CDC y el OSHA han establecido las siguientes precau-
cantidades de aerosoles, el riesgo para los trabajadores es bas- ciones universales:12
tante bajo. Los mdicos y los enfermeros utilizan con mayor
frecuencia objetos cortopunzantes, como instrumentos y agu- 1. La sangre y los lquidos corporales de todos los pacientes
jas. En la medicina moderna los mayores riesgos infecciosos deben ser manipulados como materiales infecciosos. Todos
son los patgenos transmitidos por la sangre. Una vez ms, es los pacientes deben presumirse como infectados por HIV y
irnico que los microbilogos tengan menor riesgo que sus por otros patgenos de transmisin sangunea.
colegas de otras reas del laboratorio, como qumica y hema- 2. Todas las muestras de sangre y los lquidos corporales deben
tologa, donde diariamente se procesan numerosas muestras colocarse en un recipiente adecuado, con una tapa segura
de sangre. Las infecciones de laboratorio ms importantes son para evitar el derrame durante el transporte.

C
C
D
B E
A B
D
Aire ambiente
Aire ambiente
Aire potencialmente
Aire potencialmente contaminado
contaminado
Aire filtrado
Aire filtrado a travs de HEPA F
a travs de HEPA
Vista lateral
Figura 1-21 Diseo de una cabina de seguridad biolgica de clase I. Estas

cabinas de presin negativa toman aire del ambiente hacia la cabina a una velo- Vista lateral
cidad de 24 m/min (75 pies lineales por minuto) y eliminan el aire a travs de
un filtro HEPA hacia el ambiente o hacia el exterior por medio de un conduc-
Figura 1-22 Diseo de una cabina de seguridad biolgica de clase II A. Estas
to. No protege la muestra de la contaminacin con el material presente en el
cabinas toman aire del ambiente hacia la cabina a travs de su abertura frontal
aire ambiente. Puede utilizarse para sustancias qumicas txicas o radiolgicas
(A), usualmente a una velocidad de 24 m/min (75 pies lineales por minuto).
slo si ventilan hacia el exterior. Adaptada de la referencia99.
Luego ste circula por un compartimento (D) y a travs de un filtro HEPA, una
parte del aire, por lo general el 70%, circula por el lugar de trabajo; el aire
remanente se elimina a travs de un filtro HEPA (C) hacia el ambiente. Si el
aire remanente se elimina a travs de un espacio de presin negativa hacia el
exterior del edificio, la cabina se clasifica como de clase II B3. El trabajo
3. Todas las personas que procesan muestras de sangre y lqui- puede verse a travs de un visor de vidrio (B). Adaptada de la referencia99.
dos corporales (p. ej., quienes quitan las tapas de los tubos
con vaco) deben utilizar guantes y proteccin facial (ms-
cara, antiparras o gafas), si se espera que la sangre o los
lquidos corporales salpiquen. modifican si es necesario. En general, el paciente del cual se
4. Los trabajadores deben cambiarse los guantes y lavarse las obtuvo la muestra debe ser estudiado para determinar si existe
manos cuando concluyen con el procesamiento de las mues- algn riesgo, mientras que al trabajador accidentado se lo debe
tras. estudiar a lo largo del tiempo para establecer si se infect. En
5. Los trabajadores nunca deben pipetear con la boca; deben ciertas situaciones es apropiada una inmunizacin posterior a
utilizar dispositivos mecnicos. la exposicin o quimioterapia antiviral profilctica. Cabe des-
6. La utilizacin de agujas y jeringas debe limitarse a las situa- tacar que se debe prestar principal atencin a la prevencin, de
ciones en las cuales no existe otra alternativa. modo que el problema de un accidente nunca se presente. La
7. Las superficies de trabajo del laboratorio deben descontami- prevencin puede realizarse por medio de la inmunizacin del
narse con las sustancias qumicas germicidas apropiadas personal en riesgo y de la reduccin de la exposicin a los ele-
luego de un derrame de sangre u otros lquidos corporales y mentos cortopunzantes (agujas, hojas de bistur, vidrios rotos,
cuando se ha concluido con las tareas. etc.), que son las fuentes ms comunes de accidentes.
8. Los materiales de trabajo que se utilizan en las pruebas de Limpieza de los derrames de materiales infecciosos. El protoco-
laboratorio deben descontaminarse antes de ser reutilizados lo recomendado para la limpieza de los materiales infeccio-
o colocarse en bolsas para ser desechados de acuerdo con sos es:79
las polticas institucionales.
9. Todas las personas deben lavarse las manos al finalizar las 1. Utilizar guantes (preferentemente guantes gruesos, resis-
actividades del laboratorio y quitarse la vestimenta de pro- tentes a las pinchaduras), camisolines y mscaras.
teccin antes de abandonar el lugar. 2. Si existen fragmentos de vidrio u otros objetos, deben eli-
minarse sin tocarlos en forma directa.
Las recomendaciones para el tratamiento de las exposiciones 3. Utilizar protectores de calzado impermeables al agua si el
varan segn el agente; los CDC las revisan regularmente y las derrame es grande.

F
E
G
D
C
B
Aire ambiente
Aire contaminado
A
Aire filtrado a travs de HEPA
Vista lateral Vista frontal
Figura 1-23 Diseo de una cabina de seguridad biolgica de clase II B1. Estas cabinas toman aire del ambiente hacia la cabina a travs de su abertura frontal a
una velocidad de 330 m/min (100 pies lineales por minuto). Luego circula (por lo general el 30%) a travs de un sumidero (A) y por el compartimento (D), pasan-
do a travs de los filtros HEPA (B y E) antes de ser expelido (G), a travs de un filtro HEPA (F), dentro de los conductos con presin negativa hacia el exterior.
Debido a la mnima recirculacin se pueden utilizar cantidades limitadas de sustancias qumicas de bajo nivel y agentes biolgicos. El trabajo puede verse a travs
de un visor de vidrio (C). Adaptada de la referencia99.
D
G
B
E
A
Aire ambiente
Aire potencialmente
contaminado
Aire filtrado
a travs de HEPA
Vista lateral Vista frontal
Figura 1-24 Diseo de una cabina de seguridad biolgica de clase II B2. Estas cabinas toman aire del ambiente hacia la cabina a travs de su abertura frontal (A)
y el aire es llevado al compartimento (E) de la cabina antes de eliminarlo al exterior a travs de un filtro HEPA (C) y un sistema de conductos con presin negati-
va. En forma simultnea el aire del ambiente ingresa en la cabina a travs de una segunda entrada (F) y un filtro HEPA (D), luego de lo cual el aire pasa hacia abajo
a travs del rea de trabajo y luego se junta con la corriente del flujo de salida en el compartimento (E) de la cabina. El trabajo puede verse a travs de un visor de
vidrio (B). Se pueden utilizar sustancias qumicas txicas en esta cabina en la que no recircula el aire. Adaptada de la referencia99.

C
C
A
E
Aire ambiente
Aire potencialmente
contaminado
Aire filtrado
a travs de HEPA
Vista frontal Vista lateral
Figura 1-25 Diseo de una cabina de seguridad biolgica de clase III. Esta cabina funciona como una caja con guantes totalmente cerrada con recirculacin de
aire. Los agentes peligrosos estn contenidos dentro de la caja, de manera que el operador no est expuesto. El mismo efecto se puede lograr si se utiliza una cabina
de clase II junto con un traje de seguridad biolgica conectado a una fuente de aire para el operador, quien virtualmente queda dentro de la cabina. El aire ingresa a
travs de una entrada y un filtro HEPA (D) antes de ser expelido a travs de un filtro HEPA dentro de un sistema de conductos de presin negativa y al ambiente
exterior. El operador manipula las muestras dentro de la caja a travs de un enclavamiento (E). La desventaja de este diseo es la dificultad de realizar manipula-
ciones finas con guantes gruesos de goma, pero los costosos sistemas de traje espacial para la proteccin del operador no son esenciales. Adaptada de la referen-
cia99.
4. Cubrir el derrame con material absorbente y agregar un 8. Descontaminar el sitio con un desinfectante apropiado
desinfectante concentrado. Luego de esperar 10 minutos, (vase cuadro 1-19).
proceder a la limpieza. 9. Absorber el material desinfectante y enjuagar el sitio con
5. Si se hubieran generado aerosoles, por ejemplo, de un tubo agua. Finalmente, secar para evitar resbalarse.
de centrfuga roto, apagar la centrfuga, pero dejarla cerra- 10. Desechar todos los materiales en un recipiente para obje-
da al menos por 30 minutos para permitir que los aeroso- tos biolgicos peligrosos.
les se asienten.
6. Absorber la mayor cantidad del derrame con materiales Si se derram un agente que requiere medidas de bioseguri-
desechables antes de proceder a la desinfeccin. dad de nivel 3 (BSL-3) fuera de la cabina de seguridad biol-
7. Limpiar el sitio de derrame de todos los materiales visi- gica, evacuar el rea durante al menos 60 minutos y notificar a
blemente contaminantes con una solucin acuosa de deter- las autoridades correspondientes.
gente o con una solucin de blanqueador al 10%.
Cuadro 1-22 Riesgos de contraer ciertas infecciones virales transmitidas por va sangunea luego de la exposicin a la sangre por
puncin con una aguja*
VIRUS ESTADO DEL PACIENTE FUENTE DE LA MUESTRA SANGUNEA CONSECUENCIA RIESGO
Hepatitis B Positivo para HBsAg y HBeAg Hepatitis clnica 22-31%

Positivo para HBsAg y negativo para HBeAg Hepatitis clnica 1-6%
Seroconversin 23-37%
Hepatitis C Seropositivo Seroconversin 0-7%
HIV Seropositivo Seroconversin 0,3%
* El riesgo luego del contacto de la sangre con las mucosas no est bien definido, pero es menor que luego de la puncin con una aguja.
Datos tomados de la referencia17.

ENVO DE MUESTRAS Y DE AGENTES ETIOLGICOS de tableros de fibra, cartn corrugado o poliestireno. El hielo
Todas las muestras microbiolgicas que deban transportarse seco se considera material peligroso. Una caja de cartn para
a travs del correo de los Estados Unidos deben embalarse bajo envo que contiene hielo seco como refrigerante de una mues-
estrictas reglamentaciones especificadas por el Departamento tra, debe rotularse MUESTRA MDICA CONGELADA
de Transporte (DOT) y la International Air Transport Associa- CON HIELO SECO. El embalaje debe hacerse de tal mane-
tion (IATA). Los organismos aislados (agentes etiolgicos) que ra que pueda escaparse el dixido de carbono gaseoso para evi-
no sean de nivel de bioseguridad I (vase cuadro 1-20) y las tar la acumulacin de presin que pueda ocasionar la rotura del
muestras para diagnstico, las cuales se espera razonablemen- recipiente. El hielo seco debe ubicarse afuera del recipiente
te que contengan agentes etiolgicos, deben embalarse y rotu- secundario junto con un material que amortige los golpes para
larse en forma apropiada. que el segundo recipiente no quede suelto dentro del recipien-
Las muestras se deben preparar para que soporten choques o te externo a medida que el hielo seco se sublima.
cambios de presin que puedan tener lugar durante la manipu- Adems de la etiqueta con la direccin, el recipiente externo
lacin y ocasionar el derrame del contenido. Un recipiente con debe tener pegada una etiqueta que indique los agentes etiol-
una filtracin no slo predispone a la muestra a una posible gicos/materiales biomdicos (con su logotipo en rojo contra
contaminacin, sino que puede tambin exponer a quienes lo fondo blanco) y tambin una advertencia para el transportador,
manipulan y al personal de recepcin a agentes patgenos. En como se muestra en la figura 1-27.
la figura 1-26 se ilustra el embalaje y el rtulo adecuados de los
agentes etiolgicos. El recipiente primario (tubo para el anli-
sis, frasco ampolla) debe estar tapado con una tapa hermtica y PELIGROS NO BIOLGICOS
rodeado por suficiente material de embalaje para absorber los Sustancias qumicas
lquidos en caso de que ocurra una filtracin. A su vez, se lo
debe colocar en un recipiente secundario hermtico, preferen- 1. Debe realizarse un plan de higiene qumico para el labora-
temente de metal y con tapa de rosca. Los recipientes primario torio.73 Se encuentran disponibles las guas para el trata-
y secundario se colocan luego en una caja externa de embalaje miento de los desechos del laboratorio.83
Recipiente
primario
que contiene
el cultivo
Material
de embalaje
absorbente
Tapa
Recipiente
secundario Cinta
resistente
al agua
Registro Tapa
de la muestra
(HSM 3 203)
Recipiente
de envo
Cultivo
Material
Etiqueta EA de embalaje
absorbente
Etiqueta
de direccin SECCIN TRANSVERSAL
DE UN EMBALAJE APROPIADO
Figura 1-26 Tcnica adecuada para embalar materiales con peligro biolgico.

2. Punto de inflamabilidad: las sustancias combustibles volti- Disposiciones previas requeridas por el IATA
les liberan vapores sobre la superficie del lquido. El punto Se realizaron las reglamentaciones para mercancas peligrosas 1.3.3.1
de inflamabilidad es la temperatura ms baja posible a la
cual se produce una suficiente concentracin de vapores
para que se enciendan. Las sustancias voltiles se conocen
en forma conjunta como inflamables. La clasificacin basa-
da en el punto de inflamabilidad y el punto de ebullicin es:
a. Inflamables
1) Clase IA: punto de inflamabilidad, < 22 C; punto de
ebullicin, < 38 C
2) Clase IB: punto de inflamabilidad, < 22 C; punto de
ebullicin, > 38 C
3) Clase IC: punto de inflamabilidad, > 21 C; punto de
ebullicin, < 38 C
b. Combustibles SUSTANCIA INFECCIOSA
1) Clase IIIA: punto de inflamabilidad, > 60 C y < 94 C EN CASO DE DAO O FILTRACIN NOTIFQUESE
INMEDIATAMENTE A LAS AUTORIDADES
2) Clase IIIB: punto de inflamabilidad, > 94 C
DE SALUD PBLICA
En el laboratorio de microbiologa se pueden encontrar EN USA NOTIFQUESE
diversos materiales combustibles, aunque no en las canti- AL DIRECTOR DEL CDC
dades que se utilizan en algunas otras reas. Un peligro ATLANTA, GA
800/232-0124
particular es el dietil ter, que puede formar perxidos
explosivos luego de su exposicin al aire. El ter se utiliza
en algunos procedimientos de concentracin de parsitos.
6
Hoy se dispone de otras alternativas a este procedimiento
para evitar tal peligro. Si es necesario utilizar ter, debe Sustancia infecciosa, que afecta a seres humanos ( ), UN2814
almacenarse en la menor cantidad posible y de manera Cantidad neta: ( )
adecuada.
3. Las sustancias qumicas corrosivas se definen como agentes Figura 1-27 Logotipo del agente etiolgico y aviso al transportador que
que tienen un pH < 2,1 o > 12,5 o que pueden corroer el debe colocarse en el exterior de cualquier paquete que contenga materiales
acero (SAE1020) ms de 0,6 cm por ao a una temperatura peligrosos o infecciosos.
de 54,4 C. En el laboratorio, los corrosivos ms comunes
son los cidos fuertes, como el cido clorhdrico. Se deben
utilizar transportadores de botellas que contienen cidos
concentrados en cantidades mayores de 500 mL. f. Para derrames de lquidos inflamables y txicos, utilizar
4. Las sustancias qumicas incompatibles (identificadas de ese absorbentes para reducir la presin de vapor y evitar la
modo en las hojas de informacin sobre la seguridad del ignicin del lquido.
material) no deben utilizarse o almacenarse juntas. 8. Desecho de las sustancias qumicas:
5. Las latas y cabinas de almacenamiento seguro deben ubicar- a. Utilizar guantes de goma, delantal de goma y gafas.
se lejos de las fuentes de calor, llama, chispas y salidas. Las b. Eliminar todos los objetos presentes en el lavabo desig-
reas de almacenamiento deben estar ventiladas en forma nado para descarte. Dejar correr agua fra de modo que
adecuada y ser de acceso limitado al personal. no salpique dentro del lavabo.
6. Todos los recipientes deben estar claramente rotulados con: c. Verter lentamente el lquido lo ms cerca como sea posi-
a. Contenido ble del drenaje, sin salpicar. Slo se pueden descartar en
b. Advertencias de peligro el drenaje del lavabo cantidades menores de 500 mL.
c. Precauciones especiales d. Luego de finalizar el descarte, dejar que contine corrien-
d. Fecha de recibido/preparado do agua limpia durante varios minutos.
e. Fecha de apertura/puesta en uso e. Descartar los solventes orgnicos solubles en agua (meta-
f. Fecha de vencimiento nol, acetona) como ya se describi. Para los lquidos org-
g. Fabricante nicos insolubles, slo se pueden descartar de esta forma
7. En caso del derrame de una sustancia qumica lquida:83,73 cantidades menores de 100 mL. Para cantidades mayores,
a. Determinar la naturaleza del peligro, si es necesario conse debe consultar con la oficina de seguridad del hospital
sultar la hoja de informacin sobre la seguridad del mate- o con la oficina de seguridad y salud ambiental local.
rial. Si el derrame es una emergencia evacuar el rea. Si 9. Peligros radiactivos: en el pasado, los laboratorios utiliza-
el material presenta peligro de encenderse, eliminar todas ban sustancias radiactivas, en especial, para los inmunoa-
las fuentes de ignicin. nlisis. Estos procedimientos han sido reemplazados casi
b. Notificar al personal apropiado y obtener ms ayuda si por completo por los enzimoinmunoanlisis. Si en el labo-
fuera necesario. Identificar cualquier necesidad de dispo- ratorio se utiliza algn material radiactivo, se deben seguir
sitivos de proteccin personal. las reglamentaciones apropiadas de manera estricta. Casi
c. Confinar el derrame en un rea lo ms pequea posible. siempre hay un oficial de seguridad institucional para los
d. Neutralizar los cidos con carbonato disdico. Neutralizar materiales radiactivos, a menudo en el Departamento de
los lcalis con cido brico al 1%. Para grandes cantida- Radiologa.
des de cidos o bases enjuagar con abundante agua luego 10. Carcingenos: se debe prestar especial atencin a los temas
de la neutralizacin. de seguridad para este tipo de sustancias qumicas que se
e. Limpiar cualquier rea salpicada por el derrame. ha demostrado que tienen cierto potencial neoplsico, a

veces slo en animales de laboratorio. En el laboratorio de dimiento del simulacro de incendio y la ruta de evacuacin
microbiologa, el compuesto que ms probablemente se de su rea del laboratorio.
encuentra en esta categora es el formaldehdo. La formali-
na es una solucin estabilizada comercial de formaldehdo, Bioterrorismo
utilizada como solucin al 10% en buffer (4% formaldeh-
do). El formaldehdo es combustible y un carcingeno La probabilidad de que los terroristas utilicen agentes qu-
potencial. Las reglamentaciones locales para el almacena- micos, biolgicos o radiactivos ha sido real durante muchos
miento, uso y desecho del formaldehdo difieren. El rea de aos, pero adquiri un nuevo significado luego de: 1) la trage-
trabajo debe estar bien ventilada; se debe utilizar preferen- dia en el World Trade Center y 2) el descubrimiento de cartas
temente una campana de escape para sustancias qumicas. enviadas a travs del servicio postal que contenan esporas de
El College of American Pathologists exige el control de los ntrax. En la actualidad se requiere que todos los laboratorios
vapores de formaldehdo en el rea de trabajo; si se en- limiten ciertos agentes a un uso absolutamente esencial y que
cuentran niveles aceptables, no se necesita repetir la prue- le proporcione al gobierno un inventario de ellos. Adems, cada
ba, a menos que cambien las condiciones. laboratorio debe preparar un plan de contencin para ocuparse
11. Mercurio: el mercurio elemental es un importante peligro del bioterrorismo. Muy pocos laboratorios de diagnstico tie-
para la salud. En el laboratorio de microbiologa se lo nen a mano alguno de estos agentes seleccionados (vase
encuentra en los termmetros y en algunos reactivos fija- recuadro 1-23). La responsabilidad principal de ocuparse de la
dores para los frotis de parasitologa. A pesar de que slo mayora de estos microorganismos recae sobre los laboratorios
se hallan involucradas pequeas cantidades, muchas insti- de referencia, los laboratorios de salud pblica y otros labora-
tuciones han elegido, de manera voluntaria o debido a leyes torios del gobierno. El principal trabajo de un laboratorio diag-
locales, eliminarlo por completo. nstico es reconocer la posibilidad de estar ante uno de estos
agentes mencionados durante el procedimiento normal de ruti-
Incendios na al realizar su tarea; luego se lo enva a una dependencia de
apoyo designada y se notifica a las autoridades correspondien-
1. Cada empleado del hospital es responsable de evitar los tes. Si se sospecha terrorismo, la investigacin tomar carcter
incendios y de ayudar a reducir al mnimo los siniestros que delictivo. En el cuadro 1-23 se resumen las categoras de los
los ocasionan. posibles agentes de bioterrorismo.13
2. Mantener las reas de trabajo libres de basura acumulada y En los Estados Unidos, el plan nacional de preparacin para
de materiales inflamables. Los corredores, los pasillos y las el terrorismo contempla una categorizacin de los laboratorios
escaleras deben mantenerse sin obstrucciones que puedan en niveles mltiples con una responsabilidad gradual para eva-
impedir la salida o agregar combustible a un incendio. luar las posibles amenazas. La clasificacin de los laboratorios
3. Conocer las fuentes de ignicin, las llamas abiertas, los ele- se detalla en el cuadro 1-24. Las cuatro categoras originales se
mentos de calor y los generadores de chispas (motores, inte- compendiaron en tres.13
rruptores de luz, friccin y esttica). Ms del 22% de los
incendios de los hospitales son causados por instalaciones Aseguramiento de la calidad
elctricas defectuosas.
4. El personal debe estar instruido acerca de las diferencias y el El sello de los buenos laboratorios clnicos es prestar cons-
uso de los extintores para las cuatro clases de incendios: tante atencin a la calidad del trabajo. El aseguramiento de la
a. Clase A: incendios que involucran materiales combustibles calidad es el amplio paraguas que cubre muchas actividades. A
ordinarios, como madera, papel, tela y plsticos; utilizar veces, parece que los nombres de los programas cambian con
un extintor de agua a presin (tipo A). tanta frecuencia como los de las bacterias. Las denominaciones
b. Clase B: incendios que involucran lquidos inflamables, de mejoramiento de la calidad o mejoramiento total de la cali-
como alcohol, nafta, querosn y grasa; utilizar un extintor dad han dado paso al aseguramiento de la calidad, pero en
de dixido de carbono (tipo B). todos los casos el mensaje bsico es que los microbilogos
c. Clase C: incendios que involucran equipos elctricos en deben mirar constantemente lo que estn haciendo y mejorar
los cuales puede existir peligro de electrocutarse debido a los procesos. El control de la calidad es un procedimiento tra-
la conductividad elctrica; no utilizar nunca un extintor de dicional y se analizar por separado.
agua; utilizar un extintor de sustancias qumicas secas El aseguramiento de la calidad puede lograrse en forma
(tipo C). interna o realizarse como parte de un programa externo. Se
d. Clase D: incendios que involucran metales combustibles encuentran disponibles las guas nacionales de consenso.84,77
como magnesio y potasio. Se requieren tcnicas especia- Debe comprender todas las fases del ciclo de diagnstico.84
les. Llamar de inmediato a la estacin de bomberos local. En la seccin de acreditacin del laboratorio se discuten
5. Las mantas para incendios se utilizan para sofocar la vesti- muchas de las caractersticas de un programa de aseguramien-
menta incendiada, envolviendo a la vctima con ellas. Si la to de la calidad, que incluye los programas de calidad como un
vestimenta se incendia, deber ser arrojada al piso y apisona- aspecto crtico. Las actividades internas abarcan la documenta-
da para sofocar el fuego contra el piso. No corra en busca de cin del desempeo clnico de las ensayos (que deber reali-
una manta; la corriente de aire slo ventilar las llamas y zarse para cada prueba nueva que se introduzca en el laborato-
dar como resultado un accidente ms serio. De manera rio) o la documentacin de la utilizacin del laboratorio por
similar, una manta para incendios debe utilizarse con la vc- parte de los mdicos. Se debe documentar el desempeo del
tima sobre el piso; envolver a la persona parada con una personal tcnico en cada tarea de la que son responsables. Se
manta slo crear una chimenea para las llamas. debe evaluar la equivalencia de las observaciones morfolgicas
6. Cumpla con todas las reglamentaciones locales para los entre los tcnicos que realizan las mismas tareas. Se requiere la
incendios. Participe en los simulacros peridicos que se rea- evaluacin formal de las competencias de todo el personal que
lizan en el hospital. Cada empleado debe conocer el proce- realiza las pruebas de laboratorio (incluidos los enfermeros y

Cuadro 1-23 Clasificacin de los agentes biolgicos y qumicos con potencial para terrorismo
CATEGORA DEL AGENTE DESCRIPCIN DE LA CATEGORA EJEMPLOS
Categora A Fcilmente diseminado o transmitido persona a persona Viruela (virus de la viruela)

Causa alta mortalidad con potencialidad para un gran Bacillus antracis (carbunco)
impacto en la salud pblica Yersinia pestis (peste)
Puede causar pnico pblico y alteracin social Y Toxina de Clostridium botulinum (botulismo)
Requiere especial accin para la preparacin de la salud Francisella tularensis (tularemia)
pblica Filovirus (virus Marburg y virus bola)
Arenavirus causantes de fiebre hemorrgica
Categora B Moderadamente fcil de diseminar Coxiella burnetii (fiebre Q)

Moderada morbilidad y baja mortalidad Especies de Brucella (brucelosis)
Requieren un incremento en la vigilancia de enfermedades Burkholderia mallei (muermo)
Alfavirus (p. ej., virus de la encefalomielitis del Este
y del Oeste)
Toxina ricina de Ricinus communis (semilla de ricino)
Toxina de Clostridium perfringens
Enterotoxina B de estafilococos
Especies de Salmonella
Shigella dysenteriae
Escherichia coli (O157:H7)
Vibrio cholerae
Cryptosporidium parvum
Categora C Agentes emergentes con: Virus Nipha

Disponibilidad Hantavirus
De fcil produccin y diseminacin Virus de la fiebre hemorrgica transmitida por garrapatas
Potencial de alta morbilidad, mortalidad e impacto en la Virus de la encefalitis transmitida por garrapatas
salud pblica Virus de la fiebre amarilla
Mycobacterium tuberculosis multirresistente
los mdicos) para todos los ensayos que no sean de exencin. participacin en los ensayos de aptitud.78,109 En un comienzo, el
El examen puede ser de diferentes maneras: observacin direc- College of American Pathologists proporcionaba estos ensayos
ta, exmenes escritos o pruebas de campo utilizando mues- como una herramienta de educacin para el mejoramiento del
tras del laboratorio. Se han publicado las guas de consenso desempeo de los laboratorios. Luego de la reglamentacin de
nacional para implementar estos programas.86 las dos leyes de CLIA, pasaron a ser una parte obligatoria para
La evaluacin del desempeo del laboratorio se puede mejo- el funcionamiento del laboratorio.
rar comparando el desempeo propio con el de los pares
mediante un programa externo. El College of American Control de calidad
Pathologists ofrece dos programas de este tipo.122,102 El par-
metro que se elige para la evaluacin se denomina indicador. El control de calidad en un sentido estricto consiste en la
El primer programa, llamado Q-Probes, consiste en estudios evaluacin continua y sistemtica del trabajo para asegurar que
transversales sobre un tema en particular, como la frecuencia el producto final se encuentra conforme a los lmites de preci-
en la que un microorganismo propio de la piel se halla en los sin y de exactitud tolerados previamente establecidos.3 Los
hemocultivos. Cada laboratorio participante enva sus resulta- directores y supervisores de los laboratorios actuales deben
dos del estudio que se han realizado de acuerdo con un proto- darse cuenta de que el control de calidad es slo una faceta del
colo definido. Estos resultados se analizan con cuidado y se amplio terreno del aseguramiento de la calidad. Los interesa-
elabora un informe que se entrega a todos los laboratorios par- dos pueden acceder a los requerimientos del College of Ame-
ticipantes. rican Pathologists para el control de calidad (y tambin para la
Por el contrario, el programa de Q-tracks es el control reite- seguridad y otros temas importantes dentro de la gestin de la-
rado de un nmero limitado de indicadores definidos como ti- boratorios) obteniendo la Lista de Comprobacin General de
les para establecer el desempeo de un laboratorio. Por ejem- Laboratorios del sitio de Internet del College of American
plo, el tiempo global de respuesta de un laboratorio para un Pathologists (http//www.cap.org).
determinado analito puede analizarse a lo largo del tiempo. Por El control de calidad en microbiologa es ms un arte que
lo tanto, es posible graficar el desempeo en relacin con sus una ciencia; involucra elementos intangibles, como el sentido
pares. comn, el buen criterio y la atencin constante a los detalles.
Como ya se dijo, un laboratorio puede tambin evaluar su Los programas se deben organizar teniendo en cuenta objetivos
desempeo en comparacin con el de sus pares a travs de la bien definidos.

Cuadro 1-24 Clasificacin de los laboratorios involucrados en la investigacin de terrorismo biolgico o qumico
NIVEL DESCRIPCIN EJEMPLOS
A Deteccin temprana de la diseminacin intencional de agentes biol- Laboratorios de hospitales o de salud pblica
gicos o qumicos Instalaciones con bajo nivel de bioseguridad
Procesamiento inicial de las muestras clnicas
B (antes B y C) Capacidad central para el aislamiento y la caracterizacin de agentes Laboratorios de salud pblica locales y estatales
de bioterrorismo seleccionados Laboratorios estatales de alto nivel
Presta servicios para reducir la sobrecarga de muestras de los labora- Centros mdicos acadmicos
torios de un nivel mayor
Capacidad avanzada para la identificacin rpida de agentes selec-
cionados, mediante tcnicas de cultivo y moleculares
Participa en el desarrollo de pruebas y en la evaluacin
C (antes D) Niveles ms altos de contencin y sofisticacin Grupo selecto de laboratorios estatales

Capacidad para detectar agentes diseados Laboratorios acadmicos que operan en un alto nivel de
contencin bajo contrato estatal
COMPONENTES DE UN PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD El coordinador debe controlar que todas las actividades estn
Un programa bsico de control de calidad para microbiolo- claramente descritas en un manual de control de calidad, en el
ga enumera varios elementos especficos que se deben consi- cual tambin se deben esquematizar:
derar al implementar las diversas fases de un programa.
Bartlett5 ide y analiz diferentes niveles de actividades, que 1. Los detalles de todas las prcticas de control de calidad,
comprenden desde las ms bsicas hasta las ms avanzadas. como los procedimientos y los esquemas para controlar el
Utilizando su esquema, un supervisor puede seleccionar el funcionamiento de los equipos.
nivel de actividad que es apropiado para el personal y el volu- 2. El control de todos los medios y reactivos en cuanto a su
men de trabajo en un laboratorio determinado. reactividad, fecha de vencimiento y patrones de reaccin
La comisin de acreditacin e inspeccin de los laboratorios apropiados frente a los organismos de prueba.
del College of American Pathologists (CAP) ha establecido los 3. Todos los resultados de los ensayos de aptitud.
estndares para la acreditacin de los laboratorios clnicos,
entre ellos una lista de comprobacin para la inspeccin de los Se deben disear los formularios adecuados para recolectar
laboratorios de microbiologa. Esta lista le brinda a los super- los datos con un formato de columnas de nmeros, grficos o
visores una valiosa gua para realizar la evaluacin punto por diagramas, de modo de poder detectar con rapidez cualquier
punto de las necesidades de control de calidad. Las reglamen- elemento que est fuera de los valores esperados. El coordina-
taciones estatales de la CLIA 88 incluyen muchos de estos dor debe revisar tambin todos los registros de control y verifi-
requerimientos. car que todas las mediciones que se encuentran fuera de los
Las reglamentaciones estn en constante revisin y pueden valores esperados y que las acciones correctivas resultantes
ser modificadas. Por ejemplo, en enero de 2004, el CMS publi- estn claramente anotadas. A continuacin, se realiza un breve
c la modificacin a las reglamentaciones sobre control de repaso de los numerosos componentes de un programa de con-
calidad equivalente. Esta modificacin permite reducir la fre- trol de calidad.
cuencia de ciertas tareas de control de calidad luego de la vali-
dacin de un laboratorio que ha cumplido con un criterio defi-
nido. Algunos de los cambios son ms exigentes que los que CONTROL DE LOS APARATOS DEL LABORATORIO
solicitan algunas calificadas agencias de acreditacin, como el En todos los laboratorios de microbiologa se debe esta-
CAP; otros lo son menos. Por ley, las agencias calificadas blecer un programa de mantenimiento preventivo para ase-
deben tener estndares que son al menos tan exigentes como el gurar el funcionamiento adecuado de los equipos elctricos y
CMS, pero sus estndares pueden serlo an ms. mecnicos. Los aparatos deben revisarse a intervalos prees-
En un comienzo, se debe seleccionar un coordinador de tablecidos; se deben reemplazar ciertas partes de ellos luego
control de calidad. Se deben establecer con claridad las obli- de un tiempo de uso especificado, a pesar de que no parez-
gaciones del coordinador y conferirle la autoridad apropiada can gastadas. En el cuadro 1-25 se muestra una lista breve de
para que pueda tratar en forma eficiente los problemas cuando algunos aparatos, el procedimiento de control que se debe
stos surjan. Es responsabilidad del coordinador establecer los llevar a cabo y la frecuencia y los lmites de tolerancia. Se
estndares mnimos de control de calidad que el laboratorio deben asignar las tareas entre los miembros del personal del
debe alcanzar y esquematizar los diversos pasos que se deben laboratorio para asegurarse de que todas las inspecciones se
seguir para monitorizar y vigilar a diario todas las facetas del lleven a cabo y que se registren todos los datos de manera
programa. exacta en cuadros o en el manual de mantenimiento. Es

Cuadro 1-25 Procedimientos de vigilancia del control de calidad del equipamiento microbiolgico usados comnmente
EQUIPAMIENTO PROCEDIMIENTO CRONOGRAMA LMITES DE TOLERANCIA
Refrigeradores Registro de temperatura* Diario o continuo 28 C

Congeladores Registro de temperatura* Diario o continuo 8 a 20 C
60 a 75 C
Estufas Registro de temperatura* Diario o continuo 35,5 1 C
Estufas (CO2) Medicin del contenido de CO2 Diario o dos veces por da 510%
Uso de un analizador de gases san-
guneos o un dispositivo Fyrite
Baos de agua Registro de temperatura* Diario 3638 C

termostatizados 5557 C
Bloques de calentamiento Registro de temperatura* Diario 1 C del fijado

(5 bloques trmicos)
Autoclaves Prueba con tira de espora (Bacillus Por lo menos semanalmente Sin crecimiento de esporas en los subcultivos indica
stearothermophilus) un ensayo estril
Medidores de pH Prueba con soluciones de calibra- Con cada uso 0,1 unidades de pH del estndar que se us
cin de pH
Jarras de anaerobiosis Tira con indicador azul de metileno Con cada uso Un cambio de color de la tira de azul a blanco indica
baja tensin de O2
Caja plstica anaerobia Cultivo de Clostridium novyi tipo B Realizarlo peridicamente El crecimiento indica muy baja tensin de O2. Esto se
utiliza slo cuando se requiere un tensin de O2
extremadamente baja
Solucin con indicador azul de Continuo o diario Las soluciones permanecen incoloras si la tensin de
metileno O2 es baja
Aparato rotatorio para Medicin de las revoluciones por Con cada uso 180 10 RPM
serologa minuto
Centrfugas Control de revoluciones con un Mensualmente Dentro del 5% del fijado en el dial indicador
tacmetro
Cabinas de seguridad Medicin de la velocidad del aire a Semestral o cuatrimestral 50 ft de flujo de aire por minuto 5 ft/min
travs de la apertura frontal
* Cada termmetro de monitorizacin debe ser calibrado contra un termmetro estndar.

Bacharach Instrument Co., Pittsburgh, PA.

Velometer Jr., Alnor Instrument Co, Chicago, IL.
importante detectar de inmediato las tendencias ascendentes CONTROL DE LOS MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS E INSUMOS
o descendentes, para que se puedan tomar las acciones co- Todos los medios y reactivos se deben revisar frente a los
rrectivas antes de que se produzcan errores serios. Se debe controles apropiados para establecer su correcta reactividad. Se
determinar y registrar en forma diaria con un termmetro reconoce que muchos de los medios comerciales modernos se
calibrado por la Bureau of Standards o con uno que se haya realizan con un alto grado de calidad o confiabilidad. Se han
controlado con un termmetro calibrado, la temperatura de creado recomendaciones de consenso para las necesidades
las estufas de incubacin, refrigeradores, congeladores, ba- locales del control de calidad.74 Los pocos medios que pueden
os de agua termostatizados y los bloques de calentamiento tener problemas ocasionales (p. ej., agar chocolate, el medio
(bloques trmicos). Se debe determinar tambin en forma para Campylobacter jejuni y el agar de ThayerMartin) deben
diaria la concentracin de CO2 en las estufas con atmsfera someterse a pruebas de control en cada laboratorio. No existe
de CO2. Se debe establecer la causa de cualquier lectura que necesidad de probar muchos otros medios si el fabricante pro-
se encuentre fuera del rango estipulado por el control de cali- porciona la documentacin que demuestra que se observ en
dad y corregir de inmediato el defecto. ellos una correcta reactividad.

Cuadro 1-26 Control de calidad de los medios utilizados con mayor frecuencia: organismos de control sugeridos y reacciones
esperadas
MEDIO MICROORGANISMOS DE CONTROL REACCIONES ESPERADAS
Agar sangre Streptococcus del grupo A Crecimiento adecuado, -hemlisis

S. pneumoniae Crecimiento adecuado, -hemlisis
Agar bilis-esculina Especies de Enterococcus Crecimiento adecuado, negro

-hemolticos Sin crecimiento; sin cambio de color del medio
Streptococcus, no del grupo D
Agar chocolate Haemophilus influenzae Crecimiento adecuado

Neisseria gonorrhoeae Crecimiento adecuado
Agar urea de Christensen Proteus mirabilis Completamente rosa (positivo)

Klebsiella pneumoniae Pico de flauta rosa (positivo parcial)
Escherichia coli Amarillo (negativo)
Agar citrato de Simmons K. pneumoniae Crecimiento o color azul (positivo)

E. coli Sin crecimiento, permanece verde (negativo)
Agar cistina tripticasa (CTA) N. gonorrhoeae Amarillo (positivo)

Dextrosa Branhamella catarrhalis Sin cambio de color (negativo)
Sacarosa Escherichia coli Amarillo (positivo)

N. gonorrhoeae Sin cambio de color (negativo)
Maltosa Especies de Salmonella, o N. meningitidis Amarillo (positivo)

Lactosa N. lactamicus Amarillo (positivo)

Lisina descarboxilasas K. pneumoniae Azulado (positivo)

Enterobacter sakazakii Amarillo (negativo)
Arginina (dihidrolasa) E. cloacae Azulado (positivo)

Proteus mirabilis Amarillo (negativo)
Ornitina P. mirabilis Azulado (positivo)

K. pneumoniae Amarillo (negativo)
Desoxirribonucleasa (DNasa) Serratia marcescens Zona de clarificacin (adicionar HCl 1 N)

E. cloacae Sin zona de clarificacin
Agar eosina-azul de metileno E. coli Crecimiento adecuado, brillo verde metlico

K. pneumoniae Crecimiento adecuado, colonias violetas, sin brillo
Shigella flexneri Crecimiento adecuado, colonias transparentes (lactosa negativo)
Agar entrico de Hektoen Salmonella typhimurium Colonias verdes con centros negros
S. flexneri Colonias verdes transparentes
E. coli Crecimiento levemente inhibido, colonias naranjas
Indol (de Kovac) E. coli Rojo (positivo)

K. pneumoniae Sin color rojo (negativo)
Agar hierro de Kligler E. coli Pico de flauta cido/fondo cido

Shigella flexneri Pico de flauta alcalino/fondo cido
Pseudomonas aeruginosa Pico de flauta alcalino/fondo alcalino
Salmonella typhimurium Pico de flauta alcalino/fondo negro
Agar-lisina-hierro S. typhimurium Pico de flauta y fondo violeta, H2S +

Shigella flexneri Pico de flauta violeta, fondo amarillo
P. mirabilis Pico de flauta rojo, fondo amarillo
(Contina)

Cuadro 1-26 Control de calidad de los medios utilizados con mayor frecuencia: organismos de control sugeridos y reacciones
esperadas (cont.)
MEDIO MICROORGANISMOS DE CONTROL REACCIONES ESPERADAS
Agar de MacConkey E. coli Colonias rosadas (lactosa positivo)

P. mirabilis Colonias incoloras, sin dispersin
Especies de Enterococcus Sin crecimiento
Malonato E. coli Sin crecimiento

K. pneumoniae Crecimiento adecuado, azul (positivo)
Movilidad (agar semislido) P. mirabilis Medio turbio (positivo)

K. pneumoniae Sin bordes plumosos en la estra de siembra (negativo)
Caldo o agar nitrato E. coli Rojo al agregar los reactivos

Acinetobacter lwoffi Sin color rojo (negativo)
Agar sangre feniletil alcohol Especies de Streptococcus Crecimiento adecuado

E. coli Sin crecimiento
o-nitrofenol--galactopiransido (ONPG) Serratia marcescens Amarillo (positivo)

Salmonella typhimurium Incoloro (negativo)
Fenilalanina desaminasa P. mirabilis Verde (adicionar 10% FeCl3)

E. coli Sin color verde (negativo)
Agar Salmonella-Shigella (SS) S. typhimurium Colonias incoloras, centro negro

E. coli Sin crecimiento
Voges-Proskauer K. pneumoniae Rojo (adicionar reactivos)

E. coli Sin desarrollo (negativo)
Agar xilosa-lisina-dextrosa (XLD) Especies de Salmonella Colonias rojas (lisina positivo)

E. coli Colonias amarillas (azcares positivo)
Especies de Shigella Colonias transparentes (negativo)
* Tomado de Microbiology Checklist, Collage of American Pathologist, Revisado 14 de octubre de 2003.
Cuadro 1-27 Control de calidad de reactivos y medios seleccionados*
MEDIOS O REACTIVOS FRECUENCIA CONTROLES
Tincin de Gram Cada nuevo lote de colorantes y al menos semanalmente Organismos grampositivos y gramnegativos
Otras tinciones no inmunolgicas, no inmuno- Cada da que se utiliza y cada nuevo lote, nmero de lote Reactividad apropiada
fluorescentes o envo
Tinciones fluorescentes Cada vez que se utiliza Reactividad apropiada
Sistemas de identificacin de catalasa, coagu- Cada nuevo lote, nmero de lote o envo Controles positivos y negativos
lasa, oxidasa, bacitracina, optoquina ,
ONPG, discos X o V o XV
Antisueros (Salmonella y Shigella) Cada nuevo lote, nmero de lote o envo cuando se prepa- Controles positivos y negativos
ra o abre y una vez cada 6 meses en lo sucesivo
-lactamasa (otras diferentes de nitrocefina) Cada da que se utiliza Controles positivos y negativos
-lactamasa (nitrocefina) Cada nuevo lote, nmero de lote o envo Controles positivos y negativos
Sondas de cidos nucleicos Cada da que se utiliza Controles positivos y negativos
Tinciones AFB Cada da que se utiliza Controles positivos y negativos
Antibiograma Diariamente o semanalmente si cumple con el criterio Organismos apropiados
(vase cap. 17)
* Tomado de Microbiology Checklist, Collage of American Pathologist, Revisado 14 de octubre de 2003.

12. Centers for Disease Control. Guidelines for prevention of transmission of human
En el cuadro 1-26 se listan los organismos sugeridos y los immunodeficiency virus and hepatitis B virus lo health-care and public-safety wor-
resultados aceptables para los medios de cultivo utilizados con kers, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1989;38:1-37.
mayor frecuencia en los laboratorios clnicos. En los laborato- 13. Centers for Disease Control. Biological and chemical terrorism: strategic plan for
preparedness and response. Recommendations of the CDC strategic planning work-
rios se pueden mantener organismos de reserva para control de group. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000;49(RR-4):1-14.
calidad a travs del subcultivo de las cepas bacterianas que se 14. Centers for Disease Control. Appendix A. Practice recommendations for health-care
aslan como parte del trabajo de rutina. Como alternativa, y facilities implementing the U.S. public health service guidelines for management of
occupational exposures to bloodborne pathogens. MMWR Recomm Rep 2001;50
ms conveniente, se pueden comprar microorganismos de (RR-11):43-44.
reserva en colecciones de cultivos, como ATCC (American 15. Centers for Disease Control. Appendix B. Management of occupational blood expo-
Type Cultere Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville MD) o sures. MMWR Recomm Rep 2001;50(RR-11):45-46.
16. Center for Disease Control. Appendix C. Basic and expanded HIV postexposure
promotores comerciales. El fabricante o el laboratorio local prophylaxis regimens. MMWR Recomm Rep 2001;50(RR-11):47-52.
debe controlar en cada lote de medios de cultivo, su reactividad 17. Centers for Disease Control. Updated U.S. public health service guidelines for
correcta y su capacidad como sustrato adecuado para el creci- the management of occupational exposures lo HBV, HCV, and HIV and recom-
miento bacteriano. nendations for postexposure prophylaxis. MMWR Recomm Rep 2001;50(RR-
11):1-42.
Los tubos de cultivo, las placas con medio y los reactivos 18. Centers for Disease Control Appendix A. Regulatory framework for disinfection and
deben presentar una etiqueta que indique en forma clara el con- sterilants MMWR Morbid Mortal Wkly Rep 2003;52(RR-17):62-64.
tenido y las fechas de preparacin y de vencimiento. Se debe 19. Centers for Disease Control. Appendix C. Methods for sterilizing and disinfecting
patient-care items and environmental surfaces. MMWR Morbid Mortal Wkly Rep
hacer referencia a los tubos de cultivo, placas con medio y 2003;52(RR-17):66.
reactivos codificados de manera que an el personal que no 20. Chaslre J, et al. Prospective evaluation of the protected specimen brush for the diag-
pertenece al laboratorio pueda interpretar el cdigo. Se deben nosis of pulmonary infections in ventilaled patients. Am Rev Respir Dis 1984;130:
924-929.
definir en forma precisa las reglas de control de calidad que se 21. Cherry WB, Moody MD. Fluorescent-antibody techniques in diagnostic bacterolo-
aplican a los antibiogramas. logy. Bacteriol Rev 1965;29:222-250.
Cada lote de medio en tubos o en placas debe ser sometido 22. Conomy JP, et al. Airborne rabies encephalitis: demonstration of rabies virus in the
human central nervous system. Neurology 1977;27:67-69.
a un control de esterilidad, sobre todo aquellos a los cuales se 23. Cotran RS, Kumar V, Collins T, Robbins SL. Robbins Pathologic Basis of Disease.
les agregan componentes luego de su esterilizacin. El control 6th Ed. Philadelphia: WB Saunders, 1999.
de esterilidad debe realizarse en forma visual y por subcultivo. 24. Crain EF, Gershel JC. Urinary tract infection in febrile infants younger than 8 weeks
of age. Pediatric 1990;86:363-367.
Por ejemplo, ciertos medios selectivos pueden suprimir el cre- 25. Curl JH, et al. A primer on cytokines: sources, receptor, effects, and inducers. Clin
cimiento visible de ciertas bacterias; sin embargo, pueden apa- Microbiol Rev 1997;10:742-780.
recer microorganismos viables en el subcultivo. El medio pre- 26. Davidson A, Diamond B. Autoimmune diseases. N Engl J Med 2001;345:340-350.
parado tambin debe ser observado en cuanto a la presencia de 27. Delvies PJ, Roitt IM. The immune system: first of two parts. N Engl J Med
2000;343:37-49.
otros signos de deterioro, como cambio de color, turbidez, evi- 28. Delvies PJ, Roitt IM. The immune system: first of two parts. N Engl J Med
dencia de congelado/descongelado y estado de hidratacin. 2000;343:37-49.
La frecuencia con la que se deben realizar las pruebas de 29. Delvies PJ, Roitt IM. The immune system: second of two parts. N Engl J Med
2000;343:108-117.
control de calidad sobre los medios y los reactivos (incluidos 30. Dinarello CA, Cannon JF, Wolff SM. New concept on the pathogenesis of fever. Rev
los reactivos para serologa) est claramente definida por varias Infect Dis 1988;10:168-189, 1988.
agencias de acreditacin. En el cuadro 1-27 se muestran algu- 31. Fine MJ, et al. Evaluation of housestaff physicians preparation and interpretation of
sputum Gram stains for community-acquired pneumonia. J Gen Intern Med
nas de las reglas para el control de calidad de medios y reacti- 1991;6:189-198.
vos. Las recomendaciones para el control de calidad no son 32. Flynn PM, et al. Differential quantitation with a commercial blood culture tube for
estticas. Es importante seguir las recomendaciones actuales, al diagnosis of catheter-related infection. J Clin Microbiol 1988;26:1045-1046.
33. Fraser DW, et al. Legionnaires disease: description of an epidemic of pneumonia. N
menos en parte, porque es probable que los cambios represen- Engl J Med 1977;297:1189-1197.
ten menos trabajo en lugar de ms trabajo. 34. Friedly G. Importance of bacterial slain in the diagnosis of infectious disease. J Med
Technol 1985;1:823-833.
35. Fung JC, et al. Growth of coagulase-negative staphylococci on colistin-nalidixic acid
agar and susceptibility to polymyxins. J Clin Microbiol 1984;19:714-716.
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toneal dialysis effluent by use of BacT/Alert FAN bottles. J Clin Microbiol control of nosocomial infections. Pathol Case Rev 2003;8:163-171.
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CAPTULO

Introduccin Fases del ciclo diagnstico

Aspectos administrativos del laboratorio Envo de muestras y de agentes etiolgicos

Regulacin estatal Bioterrorismo

Gestin de riesgos Aseguramiento de la calidad

Seguridad del laboratorio Control de calidad

tanto agentes infecciosos como depredadores; por ejemplo, los

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

1977 Virus bola Fiebre hemorrgica del bola

* Con las contribuciones de Joseph McDade.

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

RELACIN AGENTES INFECCIOSOS EJEMPLOS

Independencia La mayora de las bacterias, hongos Staphylococcus,

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

Por el contrario, un organismo que no causa enfermedad o El ambiente

Cuadro 1-3 Factores de virulencia seleccionados

CATEGORA FACTOR DE VIRULENCIA EJEMPLO

Supervivencia en el medioambiente Replicacin intracelular en amebas de vida libre Especies de Legionella

Resistencia a la desecacin Virus de la viruela

Destruccin de tejidos Proteasas de Pseudomonas aeruginosa

Destruccin de tejidos Invasin de los vasos sanguneos por Aspergillus fumigatus

Destruccin de linfocitos Virus de la inmunodeficiencia humana

Localizacin intracelular en macrfagos Mycobacterium tuberculosis

Resistencia a los antibiticos Resistencia a los desinfectantes Pseudomonas aeruginosa y antispticos

Resistencia a los fijadores Priones y formaldehdo

Resistencia a los agentes antiinfecciosos Staphylococcus aureus y meticilina

Resistencia a los agentes antivirales Virus de la inmunodeficiencia humana; citomegalovirus

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

FUENTE DEL AGENTE MECANISMO DE ENTRADA PUERTA DE ENTRADA EJEMPLO

Ser humano infectado Aerosoles Respiratoria Virus influenza

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

SIGNOS Y SNTOMAS CLNICOS DE INFECCIN

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

El paciente con signos y sntomas

Se recolecta(n) la(s) muestra(s) Se prepara el informe final

Se transcriben las rdenes

Luego de la recepcin en el Luego de la incubacin,

Las muestras se procesan.

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

incluso perjudiciales en el caso de que el tratamiento se dirija

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

momentos (fig. 1-2). La bacteria causal puede aislarse en forma

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

Sistema con un hisopo

Sistema con dos hisopos

Cuadro 1-5 Recipientes para el transporte de muestras anaerobias

RECIPIENTE FUNDAMENTO O DESCRIPCIN

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

do. La educacin se puede realizar mediante instrucciones de

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

Utilice el nombre completo del paciente y evite las iniciales.

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

Cuadro 1-6 Relacin costo-eficacia en la fase preanaltica de las pruebas

ACCIN FUNDAMENTO COMENTARIOS

No utilizar pruebas de antgenos Escasa sensibilidad y especificidad que limitan su

Limitar la frecuencia de pruebas Rendimiento luego de dos exmenes negativos como

LCR = lquido cefalorraqudeo.

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

grupo 5 se consideran clnicamente relevantes. En un estudio

Koneman. Diagnstico microbiolgico 2012. Editorial Mdica Panamericana

Cuadro 1-7 Tcnicas para el anlisis directo de muestras no teidas

MTODOS Y MATERIALES PROPSITO TCNICAS