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Memoria de

Prcticas

1 curso Grado de Biologa


USC
Curso 2009-2010

Coordinadores: scar J. Cordero,


Ana Vias, Jaime Gmez-Mrquez

Autores: Emilia Rebolledo, Rosa Ana


Sueiro, Francisco de la Torre, Mara
Teresa Herrera, Javier Sampedro,
Ftima Adrio, Francisco Salgado,
Jess Aboal, Carmen Leirs, Carmen
Bermejo
NDICE DE CONTENIDOS

1. MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS


BSICOS, PREPARACIN DE SOLUCIONES,
Y BIENESTAR ANIMAL.......................... 1

2. TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS


DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS................................. 19

3. TCNICAS DE CROMATOGRAFA Y
ESPECTROFOTOMETRA........................... 37

4. TCNICAS HISTOLGICAS Y
MICROSCOPIA ............................................ 45

5. TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y
ELECTROFORESIS ............... 53

6. MEDIO FSICO Y TCNICAS DE


CARTOGRAFA ........................................... 65

7. MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE


MUESTREO.................................................. 69

8. CONTENIDOS DE BIBLIOTECA ................ 113


1. MANEJO DE REACTIVOS,
APARATOS BSICOS,
PREPARACIN DE
SOLUCIONES, Y
BIENESTAR ANIMAL

(cdigo calendario de prcticas: FA)


MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,

INSTRUMENTOS BSICOS DE MEDIDA

BALANZAS DE LABORATORIO Y PIPETAS

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prcticas y manejo de una balanza de precisin de calibracin


externa.

1.2 Consideraciones prcticas y manejo de pipetas. Pipetas automticas, fijas y variables.


Pipetas repetitivas

2. Introduccin

La fisiologa y otras ramas de la biologa son ciencias cuantitativas que requieren de un sistema
de medicin estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medicin precisa.

2.1 Balanzas de laboratorio

Uno de los instrumentos de medida ms usados en el laboratorio es la balanza, utilizada para


medir cantidades pequeas de masa.

La masa, propiedad caracterstica de los cuerpos, es la cantidad de materia de una sustancia o


material. Concepto diferente al de peso: fuerza de la atraccin gravitatoria que la Tierra ejerce sobre la
materia.

La balanza compara la masa desconocida de una sustancia con la masa de un patrn o patrones de
referencia (internos o externos), sometidas ambas a la misma aceleracin debida a la gravedad. Al
proceso de comparar masas se denomina pesada.

El rasgo que define a las balanzas de laboratorio es el de la precisin junto al de alta resolucin.
Una vez calibradas, tienen tambin un alto grado de exactitud.

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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,

Exactitud: grado de concordancia entre el valor real y el valor medido.

Precisin: capacidad de dar el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas
condiciones. Grado de concordancia o repetitividad de un resultado.
Una balanza ser precisa cuando diferentes medidas de una misma magnitud sean muy
parecidas. Una medida comn de la variabilidad es la desviacin estndar de las mediciones.

Resolucin: incremento de peso ms pequeo que permite diferenciar una medida de otra

Legibilidad: divisin ms pequea en la pantalla de la balanza

2.1.1 Tipos de balanzas

Las balanzas de laboratorio varan en su capacidad mxima de carga y en su legibilidad, y se clasifican


como

1. Microbalanzas: capacidad de 0,5-3 g; legibilidad de 0,001 mg


2. Balanzas semimicro: capacidad 30-150 g, segn la casa comercial, y legibilidad de 0,01 mg
3. Balanzas analticas: 60 -250 g y legibilidad de 0,1 mg
4. Balanzas de precisin: capacidad de carga de 80 - 600 g; legibilidad 0,001g- 0,1 g

Microbalanza Balanza analtica Balanzas de precisin

Algunas balanzas, del tipo 2-4, tienen capacidad y legibilidad dual: pueden aumentar su
capacidad disminuyendo su legibilidad o disminuir su capacidad y aumentar su legibilidad.

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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,

2.1.2 Consideraciones prcticas en medidas de masa

1. Localizacin de la balanza

a) En una sala con una entrada, el mnimo nmero de ventanas. Evitar la luz directa del sol y corrientes
de aire. Evitar choques y vibraciones.
Si las balanzas estn ubicadas en lugares con alto grado de vibracin, se recomienda
colocarlas sobre mesas antivibraciones (fabricadas en granito masivo, la amortiguacin por aire evita
todo tipo de oscilaciones y vibraciones de una forma efectiva).
b) Mantener la temperatura de la sala constante. Humedad entre 45 - 60%.
c) Realizar las medidas lejos de fuentes de calor y de aparatos que utilicen ventiladores.

2. Cuidados bsicos

a) Comprobar que la cmara de medida y el plato estn limpios


b) Verificar siempre la nivelacin de la balanza
c) Conectar y esperar tiempo de calentamiento. Si se deja en el modo stand by se evita posteriores
esperas
d) Usar siempre un pesasustancias o frasco de la menor medida posible, limpios y secos
e) No usar frascos de plstico cuando la humedad est por debajo del 30 - 40%
f) La temperatura del frasco y su contenido deben de estar a la misma temperatura del ambiente de la
cmara de medida. Las diferencias de temperatura causan corrientes de aire
g) Evitar el contacto directo de los dedos al poner o sacar los pesasustancias o frascos de la cmara de
medida
h) Poner el pesasustancias o frasco en el centro del plato de medida
i) Verificar si el mostrador indica cero al empezar la operacin. Tarar la balanza si fuese necesario
j) Calibrar la balanza regularmente si los patrones de referencia son externos. Las balanzas analticas de
precisin que utilizan patrones internos pueden calibrarse automticamente

Ejercicio 1. Nivelacin, calibracin y precisin de una balanza Denver Maxx


Preparacin de 100 mL de NaCl 1 M

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SOLUCIONES,

2.2 Pipetas

En el laboratorio, la medicin precisa del volumen es tan importante como la medicin precisa de
la masa. La medicin fiable del volumen se realiza con una pipeta, una bureta o un matraz aforado.
Las pipetas permiten la transferencia de volmenes medidos exactamente de un recipiente a otro.

2.2.1 Tipos de pipetas de uso comn en el laboratorio

1. Aforadas: transfieren un slo volumen fijo, las hay desde 0.5 a 200 mL
2. Graduadas: transferencia de 0.1 a 50 mL

Ambas se llenan hasta la marca de calibracin. La superficie alta de un lquido contenido en un


tubo estrecho presenta una marcada curvatura o menisco. Es una prctica comn usar la parte inferior
del menisco de los lquidos acuosos como el punto de referencia en la calibracin y empleo de las
pipetas.

El llenado de las pipetas nunca se debe de hacer aspirando con la boca. Existen accesorios
auxiliares para macropipeteado que facilitan la operacin de carga y descarga.

Aspirador Macro de Brand Aspiradores de seguridad


Pipeta graduada Dentalab
Pipeta aforada

La transferencia se realiza apoyando la pipeta en el borde del recipiente recibidor y nunca se


sopla el lquido residual.

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SOLUCIONES,

Ejercicio 2. Manejo de aspiradores de seguridad de pipetas de la casa Dentalab.

1. Aspiracin: Gire la rueda hacia arriba y aspire, sin producir burbujas, hasta situarse un poco
por encima de la marca de calibracin. Desplace lentamente la rueda en sentido contrario para el ajuste
de la pipeta. Preste atencin al menisco.

2. Vaciado: Presionar la palanca una vez que la pipeta est dentro del tubo o recipiente
recibidor.

3. Pipetas automticas: micropipetas y macropipetas

a) Micropipetas: transferencia de volmenes de microlitros de lquido

- monocanal de volumen fijo: nico volumen de transferencia, existen distintas pipetas que
cubren el intervalo entre 1 L y 1000 L
- monocanal de volumen variable: eleccin del volumen de transferencia mediante
desplazamiento de un micrmetro de ajuste localizado en la parte delantera o superior del
dispositivo. Poseen un indicador del volumen seleccionado
Con un nmero reducido de aparatos se cubre el intervalo entre 0,1 L y 1000 L
- multicanal: igual que la anterior pero dispensando 4, 8 12 veces simultneamente el mismo
volumen. Intervalo entre 0,5-300 L

Micrmetro
Indicador de volumen

Monocanal fija y variable Multicanal y variable

b) Macropipetas: transferencia de volmenes de mililitros de lquido


- monocanal de volumen variable: hasta 2, hasta 5 o hasta 10 mL

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SOLUCIONES,

El uso adecuado de las pipetas automticas est asociado a la eleccin de la punta de pipeta
correspondiente.

N: 0,1 20 L
A: 0,5 20 L
B: 2 200 L
C: 5 300 L
D: 50 1000 L
E: 0,5 5 mL

* Las ms comunes son la B y la D, puntas


amarillas y azules respectivamente

Ejercicio 3. Manejo de carga y descarga de pipetas automticas.

1. Elija una pipeta de volumen variable de las disponibles en el laboratorio


2. Seleccione el volumen deseado girando con cuidado el micrmetro. Nunca supere la
capacidad mxima de la pipeta
3. Inserte la punta desechable adecuada a la pipeta elegida
4. Oprima el botn pulsador situado en la parte superior de la pipeta hasta un primer tope. Esta
operacin desplaza un volumen de aire conocido en la punta desechable
5. Inserte la punta desechable dentro del lquido, agua destilada en nuestro caso, y libere la
presin sobre el botn pulsador. Este hecho aspira el lquido por la punta
6. Coloque la punta sobre la pared del recipiente recibidor y oprima el botn pulsador hasta el
primer tope. Despus de un segundo, oprima el botn hasta un segundo tope para vaciar completamente
la punta.
7. Expulsar la punta desechable
8. Practique hasta conseguir el dominio de la pipeta
9. Cuando est seguro pase al ejercicio siguiente

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SOLUCIONES,

Ejercicio 4. Comprobacin del pipeteo por medida gravimtrica (balanza Denver Maxx).

1. Utilice una pipeta de 1 mL fija o variable


2. Utilizar como lquido de transferencia agua destilada
3. Situar un vaso de precipitados de 25 mL sobre la balanza y ajustarla a cero
4. Pipetear en el vaso un mililitro
5. Anote su masa
6. Vuelva a tarar la balanza y aada 1 mL ms
7. Anote su masa
8. Repita la operacin hasta completar 5 muestras
9. Cambie la pipeta con un compaero e inicie el proceso desde el punto 3- 8

El uso de pipetas automticas exige una comprobacin regular de la exactitud y precisin de las
mismas

Exactitud: indicada por E = diferencia entre el valor medio y el valor nominal referida al valor nominal
en %
El control de la exactitud se realiza mediante control gravimtrico y aplicando un factor de
correccin Z
Z = 1,0032 L/mg si el control se realiza a una temperatura de 21,5 C a una presin
atmosfrica de 1013 mbar y con agua destilada

Precisin: indicada por el coeficiente de variacin y definido ste como la desviacin estandard en %,
referida al valor medio.

Ejercicio 5. Simulacin del control de la exactitud de la pipeta automtica de 1 mL, utilizando


los datos obtenidos en el ejercicio 4

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4. Pipetas automticas repetitivas

En el laboratorio se dispone tambin de pipetas automticas repetitivas para la dosificacin en


serie o para situaciones que requieren transferencia repetida de un volumen particular

Permite dosificar repetitivamente un volumen


determinado con una sola carga

El nmero de repeticiones depende del volumen


Mando selector de volumen seleccionado en el mando deslizante de ajuste y del
Palanca de
dosificacin combitip corespondiente (ver tabla 1)

Palanca de bloqueo y de llenado


combinados

Tabla 1

Ejercicio 6: Manejo de una pipeta repetitiva

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SOLUCIONES,

INSTRUMENTO BSICO DE MEDIDA

PEACHMETRO O PHMETRO

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prcticas, calibracin y manejo de un pHmetro

2. Introduccin

El pHmetro, porttil o de sobremesa, es un instrumento utilizado en los laboratorios qumicos y


biolgicos para medir el pH de las disoluciones. El pH determina muchas de la caractersticas notables
de la estructura y actividad de las biomacromolculas y, por tanto, el comportamiento de clulas y
organismos.

El pHmetro se utiliza tambin para determinar el pH de aguas, suelos, bebidas y alimentos. Los
instrumentos porttiles facilitan la medida en campo.

Al pHmetro, que mide la diferencia de potencial existente entre dos electrodos, se conecta un
electrodo combinado de pH: un electrodo de vidrio (indicador) y un electrodo de referencia montados
ambos en un solo cuerpo. Se constituye as el sistema necesario para la medida de pH, que debe ser
siempre precedida de una calibracin del equipo con disoluciones tampn de pH conocido.

Si el pHmetro ha de ser informado de la temperatura de la muestra se conecta tambin un sensor


de temperatura, a no ser que el electrodo disponga del mismo. La medida del pH se ve afectada por la
temperatura.

Electrodo combinado de pH

En el dibujo se muestran los componentes y ubicacin de las partes esenciales de un electrodo


combinado de pH, con el electrodo indicador en el centro y el de referencia en el exterior.

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SOLUCIONES,

Tipos de elementos de
referencia
Conector

Cable

Cabezal
De penetracin
Para emulsiones

Orificio de relleno

De superficie

Tipos de electrodos Para micromuestras

Electrolito de referencia: (KCl 3M) puente salino entre el electrodo y el exterior. Impide
que los componentes de la disolucin objeto de medida se mezclen con los del electrodo
de referencia.

Elemento de referencia: cristales de AgCl encapsulados y con barrera a iones Ag+

Diafragma: punto de unin entre electrolito y muestra. De cermica porosa, que permite un
pequeo flujo de electrolito hacia el exterior estableciendose el circuito elctrico para medicin

Electrolito interno: HCl 0,1M saturado con AgCl

Membrana de vidrio: sensible a H3O+

Electrodo con sensor de


temperatura

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SOLUCIONES,

3. Consideraciones prcticas

1. Si el electrodo de pH es rellenable, verificar el nivel de electrolito de referencia. ste debe


llegar cerca del orificio de llenado, asegurando un buen flujo de electrolito a travs del
diafragma.
2. Verificar la ausencia de burbujas de aire en la zona de la membrana, si se observa alguna
sacudir el electrodo cuidadosamente
3. Limpiar el electrodo con agua destilada. No secar con un pao, utilizar un papel sin pelusa,
aplicndolo suavemente para evitar cargas electrostticas, y retirar el exceso de agua
4. Si las mediciones se realizan a temperatura ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir como
mnimo el diafragma

5. Si las mediciones se realizan a temperatura distinta de la ambiente sumergir el electrodo


hasta cubrir el sensor de temperatura y el elemento de referencia.

4. Calibracin

1. Se recomienda una calibracin diaria antes de proceder a las mediciones. Si se realizan


muchas es aconsejable repetir la calibracin cada 2 3 horas, para compensar la posible
deriva del electrodo (potencial de asimetra) o una prdida de sensibilidad del mismo
(pendiente)
2. Con el pHmetro conectado, y el electrodo sumergido en disolucin tampn de pH conocido
(7.02 generalmente), esperar el tiempo indicado en las instrucciones del aparato antes de
proceder a la calibracin

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SOLUCIONES,

3. Calibrar siempre con disoluciones tampn frescas. Estas se alteran con el paso del tiempo,
con el calor, la luz y, especialmente, con la contaminacin
4. No devolver al frasco del tampn la disolucin utilizada. Utilizar frascos pequeos para la
calibracin
5. Entre medidas, lavar con agua destilada y utilizar un papel sin pelusa para retirar el exceso
de agua
6. Es recomendable para la calibracin, as como para las mediciones, utilizar agitacin. Un
imn y un agitador magntico proporcionan rapidez y repetibilidad en las lecturas.

Tipos de calibracin

1. En un punto, cuando se miden valores de pH cercanos al valor del tampn utilizado


2. En dos puntos, la habitual. Se recomienda como primer tampn el de pH 7 y como segundo
tampn puede utilizarse el de pH 4 9 dependiendo de si se trabaja en la zona cida o alcalina.
Se corrige el potencial de asimetra y la prdida de sensibilidad del electrodo
3. En tres puntos: si se mide en toda la escala de pH. Primer punto el tampn de pH 7, segundo y
tercer punto dos de los valores restantes (2, 4.01, 9.21, 10.9 a 25C). Se compensa el potencial
de asimetra y sensibilidad tanto en la zona cida como en la alcalina

Ejercicio 1. Calibracin en dos puntos de los equipos, marca CRISON, disponibles en el


laboratorio, y siguiendo el manual de instrucciones del equipo correspondiente.

DISOLUCIONES Y CONCENTRACIONES

DISOLUCIONES STOCK, DISOLUCIONES DE TRABAJO, DISOLUCIONES TAMPN

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prcticas y preparacin de disoluciones usadas en la


experimentacin

1.2 Preparacin de una disolucin tampn y medida del pH

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SOLUCIONES,

2. Introduccin

La experimentacin biolgica utiliza tcnicas de laboratorio que pueden ser de observacin,


analticas y /o bioensayo. El bioensayo puede realizarse in vivo, utilizando organismos intactos, o in
vitro, utilizando rganos, tejidos o suspensiones de clulas aisladas.

El bioensayo es una tcnica muy utilizada en Fisiologa Animal. Los estudios requieren
habitualmente el uso de disoluciones cuya concentracin inica y osmolaridad mantengan la integridad
y funcionalidad celular, y en los in vitro, adems, que la disolucin est tamponada. Es decir, que
contenga un sistema tampn o buffer para amortiguar las variaciones de pH que pudieran producirse a
lo largo de un trabajo experimental, al igual que hace el plasma.

3. Disoluciones y concentraciones

En el laboratorio la concentracin de las disoluciones se expresa de dos formas: concentracin


molar o concentracin porcentual.

Concentracin molar, es el n de moles de una especie contenida en un litro (1L) de disolucin.


Unidad de concentracin molar = molaridad (M), dimensiones mol.L-1 o mmoles.mL-1 de disolucin.
1 mmol = 10-3 mol

Concentracin porcentual (partes por cien): tres formas de expresarla


a) tanto por ciento en peso (p/p): peso del soluto . peso de la disolucin -1. 100
b) tanto por ciento en volumen (v/v): volumen del soluto . volumen de disolucin-1. 100
c) tanto por ciento en peso/volumen: peso del soluto (g) . volumen de la disolucin (mL)-1.100

Ejercicio 1. - Preparar 100 mL de NaCl 154 mM


- Preparar una disolucin de NaCl 0.9% (p/v)
Qu observacin destacara?.............................................................................

4. Disoluciones madre y disoluciones de trabajo

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MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS BSICOS, PREPARACIN DE
SOLUCIONES,

En el laboratorio, es habitual preparar las disoluciones de trabajo a partir de disoluciones


concentradas, a las que se les llama disoluciones madre o disoluciones stock.

Las disoluciones stock, adems de proporcionar rapidez, disminuyen los posibles errores que se
produciran durante continuas pesadas de los componentes de las disoluciones de trabajo.
Para preparar disoluciones diluidas a partir de las concentradas se utiliza la siguiente ecuacin,
la cual se basa en que el n de moles de soluto de la disolucin diluida es igual al de moles en el
reactivo concentrado.

Vconcentrada . Moles/L concentrada = Vdiluida . Moles/Ldiluida, , es decir

V1.C1 = V2.C2

Volumen en litros y concentracin molar en moles/L


O volumen en mL y concentracin molar en mmoles/mL

Ejercicio 2. Tomando como disolucin stock la de NaCl 1 M, calcular el volumen que habra
que tomar para preparar 10 mL de NaCl 150 mM

5. Disoluciones tampn

Sistemas tampn o buffers son aquellas disoluciones cuya H+ apenas vara al aadir cidos o
bases fuertes. Suelen ser mezclas binarias de un cido dbil y una sal del mismo cido con base fuerte, o
bien una base dbil y la sal de esa base con un cido fuerte.

La eficacia amortiguadora del sistema depende de la proporcin relativa de las formas disociada y
sin disociar, siendo mxima cuando el cociente sal /cido es prximo a la unidad. Esta proporcin est
relacionada con el pH por la ecuacin de Henderson-Hasselbach.

pH = pK + log sal / cido

El Tris-HCl es un tampn para medios biolgicos de uso habitual en el laboratorio. Est compuesto
de la base Tris-aminometano (Tris), y su sal cloruro de Tris. Sin embargo, no se suele comprar la sal,
sino slo la base, que se disuelve y se lleva al pH requerido aadiendo HCl. La cantidad de HCl no se
suele medir con precisin, sino que es la necesaria para llevar la solucin al pH deseado.

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SOLUCIONES,

Ejercicio 3. Preparar 100 mL de Tris-HCl 0.1M a pH = 8, midiendo en el pHmetro a temperatura


ambiente

6. Disolucin isotnica

Una disolucin en la que se pueden introducir las clulas sin que se vea alterado su volumen celular
se denomina isotnica. Son disoluciones isotnicas (moleculares, electrolticas o mixtas) las que tienen
la misma osmolaridad que el plasma.

Osmolaridad /L = M .
M = concentracin molar del soluto
= n de partculas en que se disocia el soluto cuando est en disolucin
Osmolaridad/L de una disolucin constituida por un conjunto de solutos = suma de osmolaridades parciales

Osmolaridad
El movimiento pasivo de agua a travs de una membrana semipermeable, y a favor de su gradiente de
concentracin, se denomina smosis. El grado de presin necesario para interrumpir completamente la smosis
recibe el nombre de presin osmtica.
La presin osmtica es proporcional al nmero de partculas disueltas / unidad de volumen lquido. La
concentracin de las disoluciones osmticas en base al n de partculas, se expresa en osmoles. Un osmol es la
cantidad de soluto no disociado cuya presin osmtica corresponde a un mol.
Cuando los no electrolitos se disuelven en un litro de agua, las molculas individuales entran en solucin
separadamente, y cada una constituye una partcula disuelta. Como un mol de soluto tiene el mismo nmero de
molculas (n de Avogadro), una disolucin de glucosa 0.1M tiene el mismo n de partculas que una disolucin
de urea 0.1M. Y ambas la misma presin osmtica = 0.1 osmoles.
Cuando los electrolitos se disuelven en un litro de agua, las molculas individuales se disocian en dos o ms
iones, cada uno de los cuales constituye una partcula disuelta. As 0.1 mol de ClNa, que se disocia en Cl- y Na+,
da lugar a dos partculas y, por lo tanto, ejerce una presin osmtica = 0.2 osmoles.
Una disolucin que contiene 1 osmol de soluto disuelto por litro de agua se dice que tiene una osmolaridad de
1 osmol/L.

Ejercicio 4. Si la osmolaridad plasmtica es de 0.3 Osmoles/L, una disolucin de NaCl 0.15M es


isotnica? Y una de Na2PO4 1M?

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SOLUCIONES,

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2. TCNICAS DE
ESTERILIZACIN Y
MEDIOS DE CULTIVO Y
CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

(cdigo calendario de prcticas:


MICRO)
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

PRCTICA 1. Preparacin de medios de cultivo y soluciones. Esterilizacin

Esterilizacin
La esterilizacin es la eliminacin de todos los organismos presentes en un material, incluidas las
esporas y otros agentes infecciosos. La metodologa utilizada depende de la naturaleza del material que
se va a esterilizar. Los principales mtodos para destruir o eliminar microorganismos son los siguientes:

1. Calor hmedo. Esterilizacin por vapor


Es el mtodo ms comn, eficaz y cmodo de esterilizacin. El vapor de agua a elevadas temperaturas
mata los microorganismos porque degrada los cidos nucleicos y desnaturaliza las protenas. El tiempo
y la temperatura necesarios para la esterilizacin de los medios de cultivo y del material dependen de
los microorganismos que se pretenden destruir, de la composicin qumica de los medios, de la cantidad
de material y del volumen de medio que se esteriliza.

La esterilizacin por vapor se realiza en un autoclave, aparato similar a una olla a presin en la que el
aire presente inicialmente en la cmara se expulsa quedando completamente llena de vapor de agua. La
presin de vapor interna asciende hasta que se alcanzan 121 C de temperatura y 1,1 Kg/cm2 de presin.
En estas condiciones todas las formas vegetativas y endosporas se destruyen en 10-12 minutos, aunque
el tiempo estndar de esterilizacin es de 15 minutos. Por lo general, el autoclave se emplea para
esterilizar medios de cultivo y soluciones acuosas no termolbiles, material de vidrio, plstico y metal.

2. Calor seco
Es menos efectivo que el calor hmedo, necesitndose temperaturas ms altas y tiempos ms largos que
con el calor hmedo para matar a los microorganismos. La muerte celular se produce debido a la
oxidacin de los componentes celulares y la desnaturalizacin de protenas. Este tipo de esterilizacin
se realiza en hornos especiales de esterilizacin y requiere un tiempo de exposicin largo del material
(por ejemplo, 2 horas a 160 C o 1 hora a 180 C). Se utiliza principalmente para la esterilizacin de
material de vidrio (placas de Petri no desechables, pipetas, etc.) y metal, y en algunos casos para
esterilizar productos en polvo, aceites y materiales similares.

Una alternativa de esterilizacin con calor seco es la incineracin, que se utiliza para la destruccin de
material hospitalario contaminado, animales de experimentacin, etc. En el laboratorio, la incineracin
se emplea para la esterilizacin de las asas de siembra metlicas antes y despus de ponerlas en contacto
con los cultivos.

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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

3. Filtracin
Es el mtodo alternativo a la esterilizacin por calor cuando se esterilizan lquidos termosensibles o
gases. La filtracin no destruye los microorganismos, sino que los elimina mecnicamente, combinando
un proceso de retencin y absorcin. La tcnica consiste en hacer pasar el lquido o gas a travs de un
material poroso, el filtro, con tamao de poro demasiado pequeo para que pasen los microorganismos,
pero suficientemente grandes para permitir el paso del lquido. Estos filtros retienen las bacterias, pero
dejan pasar los virus.

Los filtros que se utilizan normalmente en la esterilizacin de lquidos son el filtro de membrana de
acetato de celulosa o nitrato de celulosa con un tamao de poro de 0,45 y 0,22 m. stos ltimos son
los que garantizan la eliminacin de las bacterias, ya que las bacterias ms pequeas conocidas miden
alrededor de 0,3 m. Para facilitar el paso de las soluciones a travs de los filtros de membrana se aplica
presin o se hace vaco, teniendo presente que los recipientes de recogida de la solucin filtrada deben
estar estriles. Hay un tipo de filtro, denominado filtros de alta eficacia de retencin de partculas de
aire (HEPA, high-efficiency particulate air) que se utilizan en las cabinas de flujo laminar y de
seguridad biolgica porque permiten eliminar el 99,9 % de las partculas mayores de 0,3 m presentes
en el aire.

4. Radiaciones
4.1. Radiaciones no ionizantes. Luz UV. La radiacin ultravioleta no produce ionizacin al incidir
sobre una molcula, pero s excitacin de sus electrones, haciendo que reaccione de forma anmala. La
accin bactericida ms efectiva de la luz UV se produce a 260 nm, que es el mximo de absorcin del
DNA. La capacidad de penetracin de la luz UV es muy baja, no pudiendo atravesar el vidrio o
lquidos, por lo que slo se utiliza para la esterilizacin de superficies (las cmaras de flujo laminar) o la
esterilizacin de aire en quirfanos o salas aspticas. En algunos casos especficos tambin puede usarse
para la esterilizacin de agua.

4.2. Radiaciones ionizantes. Rayos gamma y rayos X. Debido a su elevada energa, causan la
ionizacin de las molculas y la aparicin de radicales libres altamente reactivos que destruyen
componentes celulares como el DNA y las protenas. Las radiaciones ionizantes, adems de tener un
mayor poder microbicida que la radiacin ultravioleta, presentan un mayor poder de penetracin,
pudiendo esterilizar el interior de material empaquetado. Aunque son altamente efectivas contra formas
vegetativas y endosporas, no siempre lo son contra virus. Debido a la peligrosidad del equipo de
radiacin, este tipo de esterilizacin se limita a las aplicaciones industriales a gran escala, emplendose
para esterilizar material plstico, material farmacutico (antibiticos, hormonas), etc.

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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

5. Esterilizacin con agentes qumicos


La mayor parte de los agentes qumicos antimicrobianos se utilizan en la desinfeccin y no destruyen
las esporas, por lo tanto no son esterilizantes Sin embargo, en condiciones apropiadas, compuestos
como el xido de etileno o el glutaraldehido eliminan formas vegetativas y esporas, por lo que deben
clasificarse dentro de los agentes esterilizantes. Estos compuestos se emplean en la esterilizacin de
instrumentos y material de plstico.

Medios de cultivo y soluciones


Los medios de cultivo son las soluciones nutritivas que se usan en el laboratorio para el crecimiento y
mantenimiento de los microorganismos. Tambin se pueden emplear para demostrar una caracterstica
fisiolgica o bioqumica del microorganismo (utilizacin de una fuente de carbono, produccin de
cido, produccin de gas, etc). Antes de su empleo, tanto los medios de cultivo como las soluciones y
todo el material utilizado para la manipulacin de los microorganismos deben estar estriles para evitar
la entrada de microorganismos contaminantes.

Tipos de medios de cultivo


En funcin de su composicin qumica se pueden dividir en:
Medios definidos: se conocen la composicin qumica exacta del medio. Permite conocer los
compuestos que metaboliza el microorganismo estudiado.
Medios complejos o no definidos: contienen algunos componentes cuya composicin qumica se
desconoce. En su preparacin se suelen emplear peptonas (hidrolizados parciales de protenas de la
leche, carne, soja, levaduras), extractos de carne, de levadura u otras sustancias muy nutritivas pero
no definidas qumicamente. Resultan muy tiles y son los ms utilizados porque un nico medio
puede satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos.

Tanto si se trata de medios definidos como complejos, hablamos de medios de cultivo lquidos o
caldos y medios slidos. Para pasar un medio lquido a medio slido tan solo es necesario aadir un
agente gelificante que permita al medio lquido solidificar: la adicin de agar al 1,5 % al medio lquido
es el procedimiento comnmente empleado.

Existen una serie de medios de cultivo cuya composicin ayuda a establecer o poner de manifiesto
determinadas propiedades de los microorganismos que pueden servir para su aislamiento y/o
clasificacin. En este caso hablamos de:
Medios generales: permiten el crecimiento de la mayora de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos (ej: Triptona Soja agar, Agar Nutritivo, etc).

21
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

Medio de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en concreto


pero sin inhibir el crecimiento del resto de la flora acompaante. Se utilizan para favorecer el
crecimiento de microorganismos exigentes.
Medios selectivos: Incorporan en su composicin compuestos qumicos que inhiben el crecimiento
de determinados grupos de microorganismos mientras permite el crecimiento de otros, facilitando
as su aislamiento. Se utilizan para aislar grupos especficos de bacterias.
Medios diferenciales: permiten distinguir tipos diferentes de microorganismos que se encuentran
generalmente relacionadas bien morfolgica o bioqumicamente. Incorporan compuestos qumicos
que tras la inoculacin e incubacin producen un cambio caracterstico en el aspecto del
crecimiento bacteriano y/o el medio que los rodea, lo que permite su diferenciacin (ej. Agar
Citrato de Simons).

En numerosos casos, un mismo medio puede ser a la vez selectivo y diferencial (ej. Agar Eosina-Azul
de Metileno Levine, Agar Xilosa Lisina Desoxicolato, etc.), o de enriquecimiento y diferencial (ej. Agar
Sangre).

Es importante tener en cuenta que distintos microorganismos pueden tener requerimientos nutricionales
muy diferentes. Por tanto, para el cultivo correcto de un microorganismo determinado es necesario
conocer sus exigencias nutritivas y suministrarlas en los medios de cultivo con los nutrientes esenciales
en la forma y proporcin adecuados.

Por otro lado, las soluciones salinas no son medios de cultivo, puesto que no permiten el crecimiento de
los microorganismos. Su funcin consiste en mantener los microorganismos en suspensin sin que se
vea afectada su viabilidad, debido a que son soluciones isotnicas.

Objetivo
Conocer las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo y soluciones empleadas en el
crecimiento, aislamiento e identificacin de diversos microorganismos.

Material y Procedimientos
Numerosas casas comerciales suministran a los laboratorios los medios de cultivo deshidratados, que se
reconstituyen con la adicin de agua destilada. Para su preparacin, se siguen las indicaciones
realizadas por las propias casas comerciales sobre el medio de cultivo.

Los medios lquidos se hidratan con agua destilada, se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos
de ensayo, matraces, botellas, etc) y se tapan con un tapn metlico, de PVC o de algodn hidrfugo.

22
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

La mayora de ellos se deben esterilizar y, una vez esterilizados, se mantienen a temperatura ambiente
para que enfren. Cuando la temperatura del medio de cultivo es igual a la temperatura ambiental, ya se
pueden utilizar.
Los medios slidos, una vez hidratados, se hierven para que el agar pueda formar un gel homogneo
con el medio cuando se enfre. La mayora de los medios se esterilizan en autoclave. Si se van a
preparar tubos con medio slido, el medio se distribuye en los tubos antes de esterilizarlo. Si la
finalidad es la preparacin de placas, el medio se deja enfriar en un bao o a temperatura ambiente una
vez estril. Cuando la temperatura del medio alcanza aproximadamente los 50 C se reparte
aspticamente en placas de Petri estriles a razn de 15-20 mL de medio por placa. El medio se debe
dejar solidificar antes de su empleo.

Algunos medios de cultivo contienen componentes altamente selectivos y no es necesario esterilizarlos.


Por lo general, los medios de cultivo que no se utilizan se mantienen a 4 C hasta su empleo.

Para la preparacin de las soluciones salinas, se disuelven las sales en el agua destilada, se distribuyen
en los recipientes adecuados y se esteriliza en el autoclave.

A continuacin se indican los medios de cultivo y soluciones que se van a preparar as como el material
necesario y el procedimiento a seguir en su preparacin. Para esta prctica, los alumnos formarn 4
grupos.

23
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

GRUPO I
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 100 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 5-10 mL de capacidad.

1. Triptona Soja Agar (TSA)


- Medio de cultivo para verter en placa.
- Cantidad a preparar: 250 mL.
- Repartir en 10-12 placas de Petri.
- Componentes/L:
- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)
- Agar 15 g
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver la Triptona Soja Agar en el agua destilada calentando hasta ebullicin.
Esterilizar a 121C/15 min. Verter en placas a razn de unos 20 mL por placa.

2. Agar Citrato de Simons (Agar Citrato)


- Medio de cultivo para preparar en tubos inclinados.
- Cantidad a preparar: 50 mL.
- Repartir en 10 tubos (5 mL/tubo).
- Componentes/L:
- Agar Citrato de Simons Cantidad fabricante (24,2 g/L)
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver el Agar Citrato de Simons en el agua destilada calentando hasta
ebullicin. Repartir en tubos y esterilizar a 121C/15 min. Dejar solidificar en forma inclinada.

24
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

GRUPO II
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 100 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 5-10 mL de capacidad.

1. Triptona Soja Agar (TSA)


- Medio de cultivo para verter en placa.
- Cantidad a preparar: 250 mL.
- Repartir en 10-12 placas de Petri.
- Componentes/L:
- Triptona Soja caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)
- Agar 15 g
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver la Triptona Soja Agar en el agua destilada calentando hasta ebullicin.
Esterilizar a 121C/15 min. Verter en placas a razn de unos 20 mL por placa.

2. Agar semislido
- Medio de cultivo para repartir en tubos.
- Cantidad a preparar: 50 mL.
- Repartir en 10 tubos (5 mL/tubo).
- Componentes/L:
- Agar Nutritivo Cantidad fabricante (8 g/L)
- Agar 7,5 g
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver los componentes en agua destilada calentando hasta ebullicin. Repartir
en tubos y esterilizar a 121C/15 min. Dejar solidificar los tubos en vertical.

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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

GRUPO III
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 100 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 5-10 mL de capacidad.

1. Medio Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD)


- Medio de cultivo para verter en placa.
- Cantidad a preparar: 250 mL.
- Repartir en 10-12 placas de Petri.
- Componentes/L:
- Medio XLD Cantidad fabricante (55 g/L)
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver el medio XLD en el agua destilada calentando hasta ebullicin. NO
ESTERILIZAR. Verter en placas a razn de unos 20 mL por placa.

2. Triptona Soja Caldo (TSB)


- Medio de cultivo para repartir en tubos.
- Cantidad a preparar: 50 ml.
- Repartir en 10 tubos (5 mL/tubo).
- Componentes/L:
- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver el TSB en el agua destilada. Repartir en tubos. Esterilizar a 121C/15 min.

26
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

GRUPO IV
Material
- Rotulador.
- Pipetas de vidrio de 10 mL de capacidad.
- Dispensador para pipetas de vidrio.
- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.
- Matraces o botellas de vidrio de 250 mL de capacidad.
- Placas de Petri de 90 mm de dimetro vacas y estriles.
- Tubos de tapn de rosca de 10 mL de capacidad.

1. Agar Eosina-Azul de Metileno Levine (Agar EMB Levine)


- Medio de cultivo para verter en placa.
- Cantidad a preparar: 250 mL.
- Repartir en 10-12 placas de Petri.
- Componentes/L:
- EMB Levine Cantidad fabricante (37,4 g/L)
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver el medio EMB Levine en el agua destilada calentando hasta ebullicin.
Esterilizar a 121C/15 min. Verter en placas a razn de unos 20 mL por placa.

2. Solucin Salina
- Solucin para repartir en tubos.
- Cantidad a preparar: 200 mL.
- Repartir en 20 tubos (9 mL/tubo).
- Componentes/L:
- NaCl 8,5 g
- Agua destilada 1.000 mL
Procedimiento: Disolver el NaCl en el agua destilada. Repartir en tubos y esterilizar a 121C/15
min.

Cuestiones
A.- Indica los medios de cultivo asignados a tu grupo de trabajo y los clculos realizados para la
preparacin de la cantidad especificada.

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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

PRCTICA 2. Cultivo de microorganismos en el laboratorio. Recuento de


microorganismos viables

Primera parte. Cultivo de microorganismos en el laboratorio


Una vez preparado un medio de cultivo, se puede inocular (es decir, aadir los microorganismos) y a
continuacin incubar en las condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. Para la adecuada
manipulacin de los microorganismos es esencial el uso de la tcnica asptica. Esta tcnica consiste en
una serie de procedimientos que evitan la entrada de organismos no deseados o contaminantes durante
la manipulacin de los cultivos y de los medios de cultivo estriles (ver como ejemplo Figura 1). El
problema ms comn en el laboratorio de microbiologa es la contaminacin a travs del aire. As pues,
cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de modo que los contaminantes del aire no
penetren.

Figura 1. Transferencia asptica. Procedimiento se toma de


muestra a partir de un medio lquido. Imagen tomada de
Madigan et al., 2004. Brock, Biologa de los
Microorganismos.

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TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

En numerosas ocasiones, la finalidad del cultivo es obtener y mantener un nico tipo de


microorganismo para poder estudiarlo en detalle. Cuando el cultivo contiene un nico tipo de
microorganismo se denomina cultivo axnico o puro. Si, por el contrario, el cultivo contiene varios
tipos de microorganismos se denomina cultivo mixto. La pureza de los cultivos bacterianos se puede
verificar mediante la observacin de las caractersticas de las colonias sobre una placa sembrada porque
las distintas especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto caracterstico.

Objetivos
Conocer diferentes mtodos de siembra empleados para el aislamiento, identificacin y
mantenimiento de los microorganismos. Aprender a diferenciar entre cultivos puros y cultivos
mixtos.
Conocer y comprender las ventajas que supone la utilizacin de distintos tipos de medio de cultivo
para el aislamiento e identificacin de los microorganismos.

En esta prctica se emplearn diferentes mtodos de siembra para el cultivo de microorganismos:

1. Siembra en placa
1.1. Siembra en placa en estras o por agotamiento
Es un mtodo cualitativo de aislamiento de microorganismos procedentes de una muestra o de un
cultivo de laboratorio. Consiste en arrastrar con el asa de siembra un nmero cada vez ms
pequeo de clulas sobre la superficie de un medio de cultivo slido en placa de Petri. Las clulas
aisladas se multiplicarn formando colonias independientes. Una colonia es una formacin o
agrupacin macroscpicamente visible de microorganismos en un medio slido. Es importante
indicar que cada colonia es un cultivo puro (poblacin de clulas que procede de una nica
clula).

Material y medios de cultivo


- Rotulador
- Asa de siembra curva o de bucle
- 2 placas de medio TSA
- 1 Placas de medio XLD
- 1 placas de Agar EMB Levine

Muestra
- Cultivos lquidos: N 1 y N 2

29
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

Procedimiento:
Se emplearn 2 cultivos lquidos:
- Cultivo N 1: se debe sembrar para aislamiento en estra en una placa de TSA y en una placa de
Agar EMB Levine
- Cultivo N 2: se debe sembrar en una placa de TSA y en una placa de XLD.

Para realizar la siembra se seguirn los siguientes pasos:


1. Rotular la base de las placas para poder identificarlas.
2. Esterilizar el asa de siembra en el mechero Bunsen y dejarla enfriar.
3. Tomar una alcuota del cultivo lquido con el asa de siembra y hacer estras paralelas, pero no
superpuestas, en un extremo de la placa de Petri sobre una parte del medio de cultivo slido.
4. Esterilizar el asa de siembra y dejarla enfriar.
5. Realizar una nueva serie de estras perpendiculares a las anteriores, de forma que se arrastren
parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior.
6. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso indicado en el punto 4 una vez ms. Esta
tercera serie de estras no debe superponerse a la primera.
7. Esterilizar el asa de siembra antes de depositarla en la mesa de trabajo.
8. Incubar las placas sembradas en estufa a 37 C durante 24 horas.

Cuestiones
B.- Observa y anota si en las placas de TSA, Agar EMB Levine y XLD sembradas para
aislamiento en estra a partir de los cultivos lquidos suministrados se obtienen cultivos puros o
mixtos.
C.- Considerando que el medio TSA es un medio general y los medios Agar EMB Levine y XLD
son medios selectivos y diferenciales la obtencin de cultivos puros o mixtos en estos medios de
cultivo a partir de los cultivos lquidos sembrados es coherente con lo que cabra esperar y por
qu?

1.2. Siembra en placa por inclusin o en profundidad


Se trata de un mtodo cuantitativo empleado para el recuento y aislamiento de microorganismos,
por lo que se explicar en el apartado correspondiente a recuento de microorganismos.

2. Siembra en tubo con medio slido


2.1. Siembra en tubo en estra
Mtodo utilizado para el mantenimiento de cultivos puros, as como para la determinacin de
algunas caractersticas fisiolgicas y bioqumicas de un cultivo puro de microorganismos.

30
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

Consiste en arrastrar la suspensin microbiana procedente de un cultivo puro sobre la superficie


inclinada del medio de cultivo, haciendo una estra en zig-zag desde la base a la parte alta.

Material y medios de cultivo


- Rotulador
- Asa de siembra curva o de bucle
- 1 tubo de Agar Citrato de Simons (tubo con agar inclinado)
- 1 tubo de TSA (tubo con agar inclinado)

Muestra
1 cultivo puro en medio slido

Procedimiento
El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en estra en los 2 tubos
con agar inclinado, tanto en el que contiene el medio TSA como el que contiene Agar Citrato.
Para ello, se seguirn los siguientes pasos:
1. Rotular los tubos para poder identificarlos.
2. Esterilizar el asa de siembra de bucle y dejarla enfriar.
3. Cargar el asa de siembra estril con la porcin del cultivo que se va a transferir.
4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estril.
5. Flamear la boca del tubo e introducir el asa de siembra cargada con el inculo bacteriano
dentro del tubo y realizar estras en zig-zag sobre la superficie inclinada del medio de cultivo,
desde la base a la parte alta del tubo.
6. Flamear la boca del tubo y taparlo.
7. Esterilizar el asa de siembra.
8. Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas.

Cuestiones
D.- Observa y anota si en los dos medios de cultivo slidos en tubo sembrados en estra hay
crecimiento continuo o se distinguen colonias aisladas. Se observa cambio de coloracin en
alguno de ellos?

2.2. Siembra en tubo en picadura


Mtodo utilizado para la determinacin de algunas caractersticas fisiolgicas y bioqumicas de un
cultivo puro de microorganismos. En este caso se emplean asas de siembra de picadura. Se basa

31
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

en introducir un inculo bacteriano procedente de un cultivo puro en un medio slido o


semislido.
Material y medios de cultivo
- Rotulador
- Asa de siembra de picadura
- 1 tubo de agar semislido

Muestra
1 cultivo puro en medio slido

Procedimiento
El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en picadura en el tubo
con agar semislido. Para ello, se seguirn los siguientes pasos:
1. Rotular los tubos para poder identificarlos.
2. Esterilizar el asa de picadura y dejarla enfriar.
3. Cargar la punta del asa con el cultivo puro que se va a transferir.
4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estril y flamear la boca del tubo.
5. Introducir todo el filamento del asa de picadura dentro del medio de cultivo, en direccin
perpendicular a la base del tubo pero sin llegar a tocar el fondo.
6. Flamear la boca del tubo y taparlo.
7. Esterilizar el asa de picadura.
8. Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas.

En el medio de cultivo semislido en tubo se debe observar crecimiento en la zona de inoculacin,


zona por la que ha pasado el filamento del asa de picadura con el cultivo bacteriano.

Cuestiones
E.- En el medio de cultivo semislido en tubo sembrado en picadura se observa desplazamiento
en el crecimiento con respecto a la lnea de siembra? Qu indica el resultado obtenido?

Segunda parte. Recuento de microorganismos viables. Mtodo de siembra en placa por


inclusin o en profundidad
En ocasiones, es necesario realizar recuentos de microorganismos en una muestra (por ejemplo, en
muestras de agua, alimentos suelo, orina, sangre, etc.) para estimar el nmero de clulas viables
presentes. Una clula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una
descendencia. El mtodo habitual para realizar una determinacin de clulas viables se basa en contar el

32
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

nmero de clulas de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio de cultivo adecuado.
Por esta razn, el recuento de clulas viables tambin se llama recuento en placa o recuento de colonias.
En este procedimiento se supone que cada clula viable puede formar una colonia.

Hay dos mtodos para realizar un recuento en placa de microorganismos viables: el mtodo de siembra
por extensin, en el que un determinado volumen de la muestra diluida se extiende sobre la superficie
de una placa con medio slido y el mtodo de siembra por inclusin o en profundidad, en el que se
pipetea un volumen conocido (normalmente 1 mL) del cultivo en una placa Petri estril sobre la que se
aade el medio con agar fundido (Figura 2).

Figura 2. Metodos de siembra para realizar un recuento de clulas viables en placa: siembra por
extensin y siembra por inclusin o vertido en placa. Imagen tomada de Madigan et al., 2004.
Brock, Biologa de los Microorganismos.

Antes de proceder a la siembra de la muestra hay una serie de consideraciones importantes. Por un lado,
el recuento se puede realizar tanto en muestras lquidas como en slidas, pero en este ltimo caso ser
necesario preparar una suspensin o dilucin inicial con la muestra empleando una solucin isotnica
estril. Adicionalmente, el nmero de colonias presentes en las placas no debe ser demasiado grande,
pues algunas colonias se podran fusionar y las estimaciones obtenidas seran errneas. Tambin es
importante no obtener un nmero de colonias demasiado bajo, para que el clculo sea ms preciso y no
se arrastren errores asociados con la preparacin de excesivas diluciones. En general, se considera que
el nmero de colonias por placa apropiado para el recuento oscila entre 30 y 300. Para conseguirlo, casi
siempre se diluye la muestra (Figura 3). Teniendo en cuenta que raramente se sabe de antemano el
nmero de clulas viables, se suelen hacer varias diluciones decimales sucesivas de la muestra. Tanto la
preparacin de la suspensin inicial (muestras slidas), como de las diluciones decimales sucesivas,
forman parte de la preparacin de la muestra para el anlisis.

En esta prctica se emplear una muestra lquida que contiene una concentracin desconocida de
microorganismos. Por ello, antes de proceder a su siembra, se deben preparar una serie de diluciones

33
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

decimales sucesivas y posteriormente se sembrarn en placa. Se va a emplear un medio de cultivo


general para la siembra, por lo tanto se realizar un recuento de la totalidad de los microorganismos
viables presentes en la muestra lquida de partida.

Figura 3. Procedimiento para la determinacin de clulas


viables usando diluciones seriadas de la muestra y el mtodo de
siembra por inclusin o vertido en placa. Imagen tomada de
Madigan et al., 2004. Brock, Biologa de los Microorganismos.

Objetivo
Realizar el recuento de microorganismos viables presentes en una muestra problema.

34
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

Material, soluciones, medios de cultivo y muestra a emplear


1. Preparacin de diluciones decimales sucesivas
Material y soluciones
- Rotulador
- Pipeta automtica con capacidad para 1 mL
- Puntas de pipeta estriles con capacidad para 1 mL
- 3 tubos con 9 mL de solucin salina estril
Muestra
- Cultivo bacteriano lquido
2. Siembra en placa por inclusin o en profundidad
Material y medios de cultivo
- Rotulador
- Pipeta automtica con capacidad para 1 mL
- Puntas de pipeta estriles
- 4 placas de Petri vacas y estriles
- 1 botella con 100 mL de TSA licuado y mantenido en un bao a 45 C

Muestras
- Las diluciones 1/100 y 1/1000 obtenidas a partir de la muestra de partida.

Procedimiento
1. Preparacin de diluciones decimales sucesivas
A partir de la muestra lquida suministrada, se prepararn tres diluciones de la muestra: diluciones
1/10, 1/100 y 1/1000. Para ello, se seguirn los siguientes pasos:
1. Rotular los tubos con las distintas diluciones que se van a realizar
2. Preparacin de dilucin 1/10: usando una punta de pipeta estril, se toma 1 mL de la
muestra y se transfiere a un tubo con 9 mL de solucin salina estril. A continuacin, se
agita el tubo por rotacin (nunca por inversin) para una homogenizacin completa del
inculo incorporado con el diluyente.
3. Para hacer diluciones sucesivas (diluciones 1/100 y 1/1000), se usa una nueva punta de
pipeta estril en cada paso de la dilucin, se toma 1 mL de la dilucin precedente y se lleva
a un tubo con 9 mL de solucin salina estril, recordando que se debe agitar siempre el tubo
una vez incorporado el inculo.

35
TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIN DE
MICROORGANISMOS

2. Siembra en placa por inclusin o en profundidad


1. Coger las dos placas de Petri vacas y rotularlas en la base para poder identificarlas. Indicar
tambin la dilucin que se va a sembrar.
2. Tomar una alcuota de 1 ml de la dilucin 1/100, utilizar para ello una punta de pipeta estril.
3. Depositar la alcuota sobre el fondo de las placas de Petri.
4. Verter sobre las placas inoculadas unos 20 ml de TSA fundido y mantenido a 45C.
5. Agitar las placas suavemente mediante movimientos circulares y de traslacin.
6. Dejar solidificar, invertir las placas e incubar en estufa a 37 C durante 24 horas.
7. Proceder de la misma forma para la dilucin 1/1000 empleando una nueva punta de pipeta
estril.
Cuenta las dos placas de la dilucin que contengan entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias
(UFC) y calcula la media aritmtica. El resultado obtenido se multiplicar por el inverso de la dilucin
y se referir como UFC/mL de muestra.

Cuestiones
F.- Indica los clculos realizados para obtener el recuento de microorganismos viables presentes en la
muestra suministrada, especificando el recuento obtenido en placa y la dilucin empleada. Anota
tambin el resultado final.

36
3. TCNICAS DE
CROMATOGRAFA Y
ESPECTROFOTOMETRA

(cdigo calendario de prcticas: FV)


TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA

TCNICAS ESPECTROFOTOMTRICAS

Objetivos:

a) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo del pH.
b) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo de la
concentracin.

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones


qumicas y biolgicas.

La mayora de los problemas analticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la
cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o ms componentes de la misma. Se pueden
plantear las siguientes cuestiones: una, de carcter cualitativo (de qu componente se trata?), y otra de
carcter cuantitativo (cunto hay de ese componente?). Para ello, se puede utilizar el mtodo
instrumental de anlisis, como es la espectrofotometra para medir la absorcin de radiacin
ultravioleta y visible que interacta con la materia (tomos y molculas), la misma es considerada una
tcnica cualitativa y cuantitativa basndose en la medicin del color o de la longitud de onda de una
radiacin e intensidad de la misma.

Fundamento de la espectrofotometra

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, incluso el vidrio que parece ser
transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible y el agua
que absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioletas,
visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas y es caracterstica para cada sustancia
qumica.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida y la energa radiante no
puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben
ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo las longitudes de onda no
absorbidas pueden ser visualizadas.

Se denomina espectro electromagntico a la distribucin energtica del conjunto de ondas


electromagnticas

39
TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA

La espectrofotometra ultravioleta-visible usa haces de radiacin del espectro electromagntico,


en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente el comprendido entre 200 y 400 nm y en el de la luz
visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la regin
ultravioleta y visible del espectro. Al campo de luz UV comprendido entre 200 y 400 nm se le conoce
tambin, como rango de UV cercano, la espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo
electromagntico de la luz visible, de 400 a 800 nm.

El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o


transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia.

Las tcnicas espectrofotomtricas permiten determinar la identidad y la concentracin de


componentes disueltos en una muestra incgnita. El espectro de absorcin de un material muestra la
fraccin de la radiacin electromagntica incidente que un material absorbe dentro de un rango de

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TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA

longitudes de onda, aportando informacin sobre la molcula, puesto que est relacionado con su
estructura molecular.

Practica 1. Efecto del pH sobre el espectro de absorcin

Los cambios en las condiciones ambientales de una molcula pueden provocar cambios en su
estructura molecular. As, un cambio en el pH puede provocar alteraciones en su espectro de absorcin.
El compuesto que se usar en la prctica ser el naranja de metilo, que es un colorante que se utiliza
como indicador de pH.

Se realizar el espectro de absorcin entre 350 y 650 nm de distintas soluciones de naranja de


metilo a la misma concentracin pero con distintos pHs en el medio.

Naranja de metilo

Procedimiento

En primer lugar se preparan las siguientes soluciones de trabajo, a partir de las cuales
prepararemos las soluciones a analizar:

1) Solucin de naranja de metilo. Para ello se pesa en la balanza de precisin 1 mg de naranja de


metilo empleando para ello una esptula y un tubo de centrfuga. Posteriormente se disuelve en 5 mL de
H2O.

2) Solucin de cido ctrico 0.1 M. Se determinar la cantidad a pesar para preparar 30 mL de


solucin.

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TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA

3) Solucin de ortofosfato bisdico 0.2 M. Se determinar la cantidad a pesar para preparar 15 mL de


solucin. Esta sal tarda ms en disolverse que el cido ctrico, es recomendable comenzar por ella y
ayudarse de agitacin mecnica.

Una vez preparadas las tres soluciones madre, se proceder a mezclar las soluciones 2 y 3
siguiendo la tabla siguiente, para preparar las soluciones tampn:

pH aproximado Sol. Na2HPO4 (mL) Sol. cido ctrico (mL)


3.0 1.0 4.0

3.4 1.3 3.7

3.8 1.8 3.2

4.2 2.1 2.9

4.6 2.3 2.7

En este punto tendremos 5 tubos de ensayo que formarn un gradiente de pH. A continuacin se
aaden con una micropipeta 0.1 mL de la solucin stock de naranja de metilo a cada una de las
soluciones tampn y se agitan las soluciones. Una vez comprobado que se genera un gradiente de color,
se realizan los espectros de absorcin entre 350 y 650 nm de las distintas muestras.

Cuestiones:

1. Comentar los resultados. Describir la grfica obtenida, observando las variaciones en los
espectros de absorcin y comentando como aumenta o disminuye la absorbancia en funcin de la
longitud de onda y el pH del medio.

2. Se observa un punto isosbstico cuando en una solucin coinciden dos especies absorbentes en
equilibrio. Observa la grfica. Puedes localizar algn punto isosbstico? Existe algn punto en
el que la absorbancia no dependa del pH del medio?

3. En cada uno de los tubos el pH es distinto. Por qu vara el espectro de absorcin del naranja
de metilo al variar el pH?

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TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA


Practica 2. Efecto de la concentracin sobre el espectro de absorcin.

Introduccin:

La ley de Beer-Bougher-Lambert predice que para una molcula en disolucin, un cambio en su


concentracin provocar un cambio proporcional en la absorbancia.

El aumento en la concentracin de los compuestos aumenta las interacciones entre sus


molculas, cambiando su espectro de absorcin. Aunque en la mayor parte de los casos este efecto
puede despreciarse, no ocurre as en el caso del azul de metileno.

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TCNICAS DE CROMATOGRAFA y ESPECTROFOTOMETRA

Las condiciones en las que se encuentra una molcula pueden determinar cambios estructurales
que afecten a sus propiedades. En esta prctica observaremos como un aumento en la concentracin de
una sustancia puede desencadenar un cambio estructural que cambie notablemente sus propiedades de
absorcin de luz.

Procedimiento

Se preparan 10 mL de una solucin stock de azul de metileno 1 mM (1x10-3 M) en agua


destilada. A partir de la solucin stock se preparan 10 mL de las siguientes diluciones: 1x10-4, 1x10-5, y
1x10-6 M.

Se realiza un espectro de absorcin entre 400 y 700 nm de las soluciones 1x10-4 y 1x10-6 M. A
continuacin se mide la absorbancia de las tres soluciones a 610 y a 663 nm.

Cuestiones:

1. Representar grficamente la absorbancia a las dos longitudes de onda frente a la concentracin,


calculando el coeficiente de correlacin lineal para cada una de las longitudes de onda.

2. Calcular la ratio entre la absorbancia a 610 y la absorbancia a 663 de las tres soluciones.

3. Comentar los resultados obtenidos tanto para los espectros de absorcin realizados en el
laboratorio como para las grficas del apartado 1. Se observa alguna desviacin de la Ley de
Beer-Bougher-Lambert? Cul podra ser la explicacin de estos resultados?

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4. TCNICAS HISTOLGICAS
Y MICROSCOPIA

(cdigo calendario de prcticas: BC)


TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

INTRODUCCIN

El procesado de una muestra histolgica (animal o vegetal) para su estudio al microscopio


conlleva la realizacin de una serie de pasos y protocolos cuyo fin es poner de manifiesto las
estructuras tisulares de una forma lo ms parecido posible a como se encuentran en estado vivo. Cada
uno de estos pasos puede presentar variaciones particulares dependiendo de las caractersticas de la
muestra biolgica objeto de estudio, de las estructuras tisulares y celulares que se van a observar, y del
tipo de microscopio en el que se quieran observar (ptico (MO) o electrnico (ME)).
Los pasos generales que se siguen en este procesado son:
1.- Fijacin. El objetivo de la fijacin es preservar el tejido con las caractersticas estructurales
y de composicin qumica que presentaba en el estado vivo. La fijacin evita la alteracin de la
morfologa del tejido deteniendo los procesos de degradacin que tienen lugar tras la muerte celular,
como la autolisis o la putrefaccin. Adems, endurece el material, confirindole proteccin frente al
dao que pudiera ocasionar la manipulacin del tejido en los pasos siguientes a la fijacin, y hace
insolubles los constituyentes celulares que se pretenden estudiar que, sin la fijacin, se disolveran
durante el manejo posterior. No existe ningn fijador que haga insolubles todos los componentes
tisulares, por lo que la eleccin del fijador es importante dependiendo del, o de los componentes objeto
de estudio. Los lpidos son los componentes tisulares ms difciles de fijar, ya que la mayora de los
fijadores los disuelven.
Normalmente se utilizan fijadores lquidos que pueden utilizarse solos (fijador simple) o
mezclados (mezcla fijadora). El fijador simple ms utilizado es el formaldehdo (o formol), pero otros
ejemplos son el etanol, cido pcrico, cido actico, paraformaldehdo, glutaraldehdo, tetrxido de
osmio, etc La mezcla fijadora ms utilizada es el lquido de Bouin [cido pcrico, formol y cido
actico], que es considerado como el fijador universal porque conserva muy bien la estructura tisular.
Para fijar el tejido se introduce la pieza en un bote con fijador durante un tiempo limitado (fijacin por
inmersin) o se aprovecha el sistema circulatorio del animal para hacer pasar el fijador (fijacin por
perfusin). En la fijacin por inmersin hay que tener en cuenta el tiempo de fijacin, ya que una
fijacin excesiva puede provocar, adems de un excesivo endurecimiento, la aparicin de aspectos
citolgicos que no existan in vivo observndose imgenes artificiales o artefactos debidos a
distorsiones, alteraciones morfolgicas, cristalizacin de compuestos amorfos, desplazamientos de
sustancias, etc El tiempo de fijacin depender del tamao de la pieza de tejido y del fijador
empleado.
Hay muchos tipos de fijadores y su eleccin depende de una serie de propiedades que poseen:
velocidad de penetracin, velocidad de fijacin, grado de endurecimiento y variaciones de volumen
que producen, etc Tambin hay que tener en cuenta las caractersticas qumicas del tejido que

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TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

vamos a estudiar, el mtodo de seccionado que vamos a utilizar y la tcnica que vamos a aplicar sobre
las secciones obtenidas.
Si la muestra se procesa para su observacin al ME, se realiza una doble fijacin, de forma que
primero se fija con paraformaldehdo o glutaraldehdo (o con una mezcla de ambos), y a continuacin
con tetrxido de osmio.
2.- Inclusin. Permite darle consistencia a los tejidos y facilitar su seccionado con una cuchilla.
Consiste en rodear la pieza de un material, llamado medio de inclusin, que sea lo suficientemente
rgido que permita su seccionado Tras llevar a cabo la inclusin, obtendremos un bloque compacto de
la pieza de tejido rodeada por el medio de inclusin. En el procesado para la observacin en el MO se
utilizan medios de inclusin hidrfobos (por ejemplo, la parafina), que requieren la deshidratacin
previa del tejido, o medios de inclusin hidrfilos (por ejemplo, la gelatina), que son miscibles con el
agua. El uso de medios de inclusin hidrfilos permite un procesado ms rpido y menos daino para
el tejido. En ocasiones, la inclusin no es un paso imprescindible, ya que la consistencia se logra con
la fijacin o con la congelacin del tejido, sin necesidad de utilizar un medio de inclusin.
En la inclusin para la observacin al ME se utilizan plsticos especiales (resinas) que
proporcionan una mayor dureza que los medios de inclusin para microscopa ptica, lo que permite la
obtencin de secciones muy finas. En este caso la inclusin es imprescindible para lograr la
consistencia de la muestra.
3.- Seccionado. Para la mayora de los procedimientos y estudios histolgicos, se requieren
secciones de tejidos lo suficientemente delgados para que pase la luz y puedan observarse al MO, o
para que penetren los electrones y puedan observarse al ME. Los microtomos son instrumentos que
con la ayuda de una navaja o cuchilla permiten obtener cortes finos de los materiales a estudiar. Los
microtomos constan de un portabloques donde se coloca la muestra, una cuchilla y un sistema de
avance regulado del bloque (o de la cuchilla) que permite controlar el grosor de los cortes. En
microscopa ptica las cuchillas utilizadas son de acero y se obtienen secciones de varias micras (m)
de grosor, mientras que en microscopa electrnica las cuchillas son de vidrio o de diamante y se
obtienen secciones de varios nanmetros (nm) de grosor, es decir, mil veces ms finos que para el
MO, debido a que el poder de penetracin de los electrones es muy inferior al de los fotones. Hay
muchos tipos de microtomos y el uso de uno u otro tipo depende de si el material se ha incluido o no,
y, en su caso, del medio de inclusin que se haya utilizado. Los microtomos ms utilizados hoy en da
son los siguientes:
* Microtomo de rotacin o de tipo Minot. Se utiliza para seccionar piezas de tejido incluidas en
parafina y se obtienen secciones de entre 5 y 30m de grosor. En este microtomo la cuchilla
permanece fija y perpendicular al portabloques, en posicin vertical. El movimiento rotatorio de una
manivela hace que el bloque con la muestra se desplace hacia la cuchilla una distancia fija que
determina el grosor del corte.

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TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

* Criostato o criotomo. Requiere la congelacin previa de la pieza de tejido. Se utiliza para


seccionar material no incluido, o incluido en un medio de inclusin especial para criostato (medio de
inclusin hidrfilo). Se obtienen secciones de entre 5 y 60m de grosor. El funcionamiento es similar
al microtomo de rotacin pero en este caso el portabloques y la cuchilla se encuentran en una cmara
en la que podemos controlar la temperatura del bloque y de la cuchilla (suele estar entre -20 y -25C).
* Vibroslice o Vibratomo. Se utiliza para seccionar piezas de tejido fresco, de tejido fijado sin
incluir (la fijacin ya proporciona la dureza necesaria para su seccionado), o de tejido incluido en un
medio blando como, por ejemplo, la gelatina. Ello conlleva la ventaja de que el procesado es ms corto
y se evitan el proceso de inclusin en parafina (largo y daino para el tejido) o la congelacin (implica
que la pieza de tejido sufra cambios de temperatura), por lo que se conservan mejor las caractersticas
estructurales y funcionales del tejido. La desventaja es que no permite obtener secciones finas, ya que
el grosor mnimo obtenido es de 25m. El funcionamiento se basa en que la cuchilla vibra mientras
avanza sobre la pieza de tejido y eso facilita el seccionado del material.
* Ultramicrotomo. Es el microtomo que se utiliza en microscopa electrnica. Se pueden
realizar cortes semifinos (1m) que se usan para microscopa ptica, o para seleccionar la zona de la
que queremos obtener cortes ultrafinos (10-100nm) para su estudio al ME. El funcionamiento es
similar al microtomo de rotacin pero en este caso las cuchillas son de vidrio o de diamante para poder
obtener secciones muy finas de material incluido en medios de inclusin muy duros (resinas).
4.- Procesado de las secciones. Sobre las secciones obtenidas podemos aplicar muchas tcnicas
dependiendo de lo que se quiera estudiar (tincin, tcnica histoqumica, tcnica inmunohistoqumica,
hibridacin in situ,). Previamente a cualquier tcnica que vayamos a realizar sobre las secciones de
un tejido que hemos incluido y seccionado debemos extraer el medio de inclusin, con el fin de que
dicho medio no interfiera con los reactivos utilizados en cada caso.
Como ejemplo de procesado de las secciones veremos cmo se lleva a cabo una tincin para la
observacin de las secciones en un MO. Normalmente los tejidos son incoloros y, debido a que el
ndice de refraccin de la luz de los distintos componentes celulares es similar, es necesario
colorearlos para aumentar el contraste entre las distintas estructuras y poder as diferenciarlos al
observarlos en el MO. Los mtodos de tincin son muy numerosos y reciben el nombre del, o de los
colorantes que se utilizan. Se utiliza uno u otro mtodo dependiendo del tejido u orgnulo que se
quiera teir, ya que, cada colorante tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a unas estructuras
del tejido y no a otras. Los colorantes se clasifican en colorantes bsicos que tienen afinidad por los
componentes cidos de la clula (ncleos, hidratos de carbono, cidos nucleicos), colorantes cidos
que tienen afinidad por componentes bsicos de la clula (citoplasma, colgeno); y colorantes neutros,
que suelen ser mezclas de varios colorantes.
En el caso del procesado del material para su observacin en el ME no se realizan tinciones con
colorantes, sino que se llevan a cabo tcnicas de contraste que agregan tomos de metales pesados

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TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

(osmio, uranilo, plomo) que harn las estructuras celulares ms o menos densas a los electrones
permitiendo as la obtencin de una imagen. En el ME se obtienen imgenes en blanco y negro.
5.- Montaje. Consiste en colocar un cubreobjetos sobre las secciones para protegerlas durante la
observacin en el MO. Cuando no queremos conservar la preparacin podemos aadir, entre el
cubreobjetos y las secciones, una gota de agua, de tampn (agua con una mezcla de sales) o de
glicerina. En este caso, tras la observacin se desecha la preparacin. Cuando nos interesa conservar la
preparacin, es necesario utilizar un medio entre las secciones y el cubreobjetos, llamado medio de
montaje, que debe ser transparente, asegurar lo mximo posible la conservacin de las preparaciones y
asegurar la adherencia entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Hay medios de montaje hidrfilos y
medios de montaje hidrfobos. El montaje slo se lleva a cabo en el procesado para el MO, ya que, en
el caso del procesado para el ME las secciones se sitan sobre rejillas metlicas especiales y no
necesitan esa proteccin.
6.- Observacin al microscopio ptico o electrnico. Las muestras biolgicas o las clulas, en
general, son difciles de observar a simple vista debido a su reducido tamao y a su transparencia a la
luz visible, por lo que para su observacin, necesitamos los microscopios, que son instrumentos de
ptica que nos permiten ver objetos muy pequeos o detalles estructurales imposibles de distinguir a
simple vista.
A) El microscopio ptico utiliza la luz comn (luz blanca, emitida por una fuente de luz situada
en la base del microscopio) que atraviesa la muestra biolgica e ilumina el campo de observacin.
Cuenta con tres sistemas de lentes: a) el condensador, que concentra la luz emitida sobre la muestra;
b) los objetivos que aumentan la imagen X veces, normalmente en los microscopios utilizados en
prcticas hay cuatro objetivos de 4, 10, 40 y 100 aumentos; y c) los oculares que aumentan la imagen
10 veces (los hay de mayor aumento) y permiten la visualizacin directa de la muestra. Los aumentos
finales se obtienen multiplicando los aumentos del objetivo por los del ocular (por ejemplo, en un
microscopio de prcticas el mayor aumento que obtendramos sera: [objetivo 100X] x [ocular de 10X]
= 1000 aumentos). Sin embargo, en un microscopio ptico lo importante no son los aumentos sino su
poder de resolucin (PR), es decir, la capacidad de distinguir como separados dos puntos que se
encuentran muy cercanos. Y el PR depende del lmite de resolucin (LR, distancia mnima a la cual
dos objetos pueden ser diferenciados) y, de hecho, el PR es inversamente proporcional al lmite de
resolucin (PR =1/LR).
El lmite de resolucin de un microscopio se calcula mediante la frmula de Abbe:
Limite de resolucin (LR) = 061 x / n x sen
En esta frmula: 061 es una constante, es la longitud de onda de la luz utilizada (luz blanca,
550nm), y n x sen es la apertura numrica (AN) de la lente objetivo. La AN depende del ndice de
refraccin del medio situado entre la muestra y el objetivo (n) y del ngulo de apertura del objetivo
utilizado (). Normalmente el medio situado entre la muestra y el objetivo es aire (n=1), aceite de

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TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

inmersin (n=1,5) o agua (n=1,3). El uso del aceite de inmersin (impide la desviacin de los rayos
ms oblicuos) aumenta el PR porque aumenta la AN. El ngulo es la mitad del ngulo formado por
el cono de rayos recogidos por la lente objetivo sobre un punto de la muestra. Como la mxima
anchura es de 180, el valor de sen (90) es como mximo 1 (0.93 en los microscopios actuales).
Por tanto, el PR del microscopio depende de la de la luz utilizada y de la AN, de forma que,
cuanto menor sea y mayor sea la AN, ms pequeo es el LR y mayor el PR. Los objetivos de mayor
aumento tienen mayor AN debido a que el ngulo aumenta al disminuir la distancia de la muestra a
la lente, por tanto, al subir el aumento aumentamos el PR.
El lmite de resolucin de un MO, en las condiciones ms ptimas, es decir, utilizando el
objetivo de 100 aumentos con aceite de inmersin es LR = 0.61 x 550nm/1,5 x 0.93= 240nm = 0,24
m. Es decir, que en un MO podemos observar como separadas estructuras que tienen como mnimo
ese dimetro, o que estn separadas como mnimo por esa distancia (bacterias, mitocondrias, ncleo,
plastos,...). Con el MO distinguiramos la forma de estas estructuras pero no sus detalles internos.
Estructuras celulares de menor tamao (cidos nucleicos, ribosomas,) tendramos que observarlas al
ME, cuyo LR es mil veces menor que el del MO (LR=2-5A=0.2nm=0.0002m) debido a que la de
los electrones es muy pequea (= 0.004nm). Por tanto, el PR de un ME es mil veces mayor que el del
MO y nos permite observar la ultraestructura celular. Teniendo en cuenta que el LR del ojo humano es
de 100-200m (0.1-0.2 mm), el MO ha aumentado unas mil veces el LR de nuestro ojo, y el ME lo ha
aumentado un milln de veces.
El diafragma del condensador (o de apertura) es otro dispositivo importante que se encuentra
situado debajo del condensador y con l podemos graduar la cantidad de luz que llega a la muestra.
Cuando cerramos el diafragma la muestra recibe menos luz, de forma que aumentamos el contraste y
la profundidad de campo pero disminuimos la resolucin.
El MO que se usa habitualmente es el MO de campo claro o fotnico, utilizado para la
observacin de preparaciones teidas de clulas o de secciones de rganos o tejidos. Existen otros
tipos de MO, como el MO de campo oscuro, el MO de contraste de fases o el MO de contraste
diferencial de interferencia (DIC) o de Nomarski, que presentan dispositivos especiales
(condensadores, objetivos, prismas) que permiten la observacin de secciones de tejidos sin teir y de
clulas vivas y mviles (bacterias, espermatozoides, protozoos, cultivos celulares, clulas en mitosis o
en migracin,). El MO de fluorescencia y el MO de barrido confocal presentan dispositivos
especiales que permiten la observacin de muestras fluorescentes.
El MO invertido se utiliza para la observacin de muestras que se encuentran en frascos o placas
de fondo plano, como por ejemplo, los cultivos celulares o en la manipulacin de gametos y embriones
vivos in vitro en tcnicas de fecundacin asistida. Su nombre se debe a que la fuente de luz est en la
parte superior del microscopio y los objetivos en la parte inferior, bajo la platina. El hecho de que est
invertido permite acercar los objetivos a las clulas, ya que en un MO convencional la distancia entre

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TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

los objetivos y el fondo de la placa sera muy grande. Independientemente de que el microscopio sea
convencional o invertido puede presentar los distintos dispositivos de las distintas pticas.
B) El microscopio electrnico no utiliza la luz visible (fotones), sino electrones acelerados.
Hay dos tipos de ME:
B1.- El microscopio electrnico de transmisin (MET) consta de una columna hueca donde se
hace el vaco para que los electrones, emitidos por un can de electrones situado en lo alto de la
columna, no se dispersen. Consta, adems, de distintas lentes electromagnticas (condensadora,
objetivo y proyectora) y distintos diafragmas. La muestra se sita entre la lente condensadora y la
lente objetivo. Es importante destacar que en el MET las secciones ultrafinas no se colocan sobre
portaobjetos, ya que los electrones no son capaces de atravesar el vidrio, sino sobre rejillas de cobre o
nquel que no impiden el paso de los electrones.
Los electrones pasan por la lente condensadora, que concentra el haz de electrones procedente
del can sobre la muestra, llegan a la lente objetivo que origina y enfoca la imagen, y por ltimo la
lente proyectora magnifica la imagen obtenida. La imagen se observa directamente en una pantalla
fluorescente, o indirectamente mediante la obtencin de una imagen fotogrfica o digitalizada. Para
visualizar la imagen debe tener lugar la dispersin de los electrones al atravesar la muestra y deben
producirse interacciones de esos electrones con los tomos de esa muestra. En la imagen final veremos
zonas claras (estructuras claras o transparentes a los electrones), por las que los electrones han
atravesado la muestra, y zonas oscuras (estructuras densas a los electrones o electrondensas) que
corresponden a las regiones donde los electrones han sido desviados.
B2.- El microscopio electrnico de barrido (MEB) se utiliza para observar la superficie de una
muestra que no ha sido seccionada (rganos o partes de rganos, pequeos organismos, granos de
polen, clulas enteras, orgnulos,). En este caso el haz de electrones no est fijo, sino que se mueve
y va rastreando la superficie de la muestra, que est recubierta de una capa de un material metlico con
gran capacidad de transmisin de energa elctrica (generalmente se utiliza oro). La presencia de ese
material hace que la superficie de la muestra, al ser barrida por el haz de electrones, emita a su vez
otros electrones que son recogidos por un detector y originan una imagen en relieve de la superficie de
la muestra que se observa en un monitor de televisin. Al igual que en el MET, en este microscopio
las imgenes se obtienen en blanco y negro.
OBJETIVO
Que el alumno se familiarice con la metodologa que se lleva a cabo en el procesado de tejidos
para su observacin en el microscopio ptico. Para ello, en estas prcticas haremos secciones de
tejidos animales, previamente fijados, utilizando dos tipos de microtomos: un vibroslice (o vibratomo)
para seccionar piezas de tejido sin incluir; y un microtomo de rotacin para seccionar piezas de tejido
incluido en parafina. A continuacin, teiremos las secciones obtenidas, las montaremos, y las
observaremos al microscopio ptico de campo claro. Adems, observaremos preparaciones sin teir en

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TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

otros tipos de microscopios pticos (campo oscuro y contraste diferencial de interferencia (DIC) o de
Nomarski).
MATERIAL
Microtomo de rotacin, bloques de tejidos incluidos en parafina, vibroslice, placas Petri,
pinceles, placas con pocillos, cristalizadores con puente, cubetas de vidrio verticales, portaobjetos y
cubreobjetos, colorantes, agua destilada, etanol (70, 96, 100), lquido intermediario (histo-clear),
medio de montaje (Eukitt), microscopio ptico.
MTODOS:
Prctica 1: Seccionado, tincin y montaje.
A.- Seccionado (microtoma). Manejo de un vibroslice y obtencin de cortes de tejido animal
previamente fijado y sin incluir. Manejo de un microtomo de rotacin y obtencin de cortes de tejido
animal previamente fijado e incluido en parafina.
B.- Tincin. B1.- Tras la obtencin de secciones de un tejido animal en el vibroslice se procede
a realizar la tincin. Estas secciones flotantes (llamadas as porque debido a su grosor (50-80 m) no
se colocan en un portaobjetos para su procesado) se tien en placas con pocillos. Cada pocillo se llena
con un reactivo y las secciones flotantes se van cambiando cuidadosamente de pocillo en pocillo con
la ayuda de un pincel.
Con estas secciones llevaremos a cabo la tincin con Tionina de Laskey, que es un colorante que
tie de azul los componentes celulares que contienen cido ribonucleico (ARN). El protocolo de esta
tincin es el siguiente:
1.- Lavar en agua destilada, 2 minutos.
2.- Etanol de 70, 5 minutos.
3.- Lavar en agua destilada, 2 minutos.
4.- Teir con tionina de Laskey durante 10 segundos. CUIDADO!! hay que mantener con el
pincel las secciones para no perderlas de vista, ya que el colorante es muy oscuro y tie muy rpido.
5.- Paso rpido por agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
6.- Lavar en agua destilada, 2 minutos.
7.- Etanol de 96, tres baos de 1 minuto hasta que deje de eliminar colorante.
8.- Etanol 100, 2 minutos.
9.- Histo-clear, 2 minutos.
10.- Montaje. Se colocan las secciones en un portaobjetos, se estiran bien con el pincel, se
cubren con una gota de medio de montaje (Eukitt) y se pone el cubreobjetos encima evitando que se
formen burbujas de aire.
Prctica 2: Tincin, montaje y observacin
B.- Tincin. B.2.- Tras la obtencin de secciones de un tejido animal en el microtomo de
rotacin se procede a realizar la tincin. Previamente debemos proceder a la eliminacin de la parafina
que impregna el tejido (desparafinado) e hidratar de nuevo el tejido (hidratacin) que se haba

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TCNICAS HISTOLGICAS Y MICROSCOPIA

deshidratado en el proceso de inclusin. Para desparafinar e hidratar las secciones tenemos que
pasarlas por los siguientes lquidos: histo-clear (10 min); etanol 100 (5min); etanol 96 (5min); etanol
70 (5min) y agua destilada (5 min).
Una vez rehidratado el tejido procedemos a realizar la tincin, en este caso sobre el
cristalizador. Para ello, se colocan los portaobjetos sobre el puente y se van echando los diferentes
lquidos con una pipeta Pasteur de plstico (cada reactivo con su pipeta correspondiente) hasta cubrir
las secciones. Una vez transcurrido el tiempo de tincin se vaca cada lquido en el cristalizador y se
escurre cada porta sobre un papel de filtro antes de aadir el siguiente reactivo.
Con estas secciones llevaremos a cabo la tincin con hematoxilina-eosina que es una tincin
clsica y general muy utilizada en estudios de morfologa tisular y en anatoma patolgica. Se utilizan
dos colorantes: la hematoxilina de Mayer, que es un colorante bsico y teir de azul los componentes
cidos de las clulas (cidos nucleicos: ncleo), y la eosina es un colorante cido y teir de rojo o de
rosa los componentes bsicos (protenas: citoplasma, matriz extracelular). El protocolo de esta tincin
es el siguiente:
1.- Teir con hematoxilina de Mayer, 10 minutos.
2.- Lavar con agua corriente (cubeta debajo del grifo), 4 minutos.
3.- Teir con eosina, 35 segundos.
4.- Lavar con etanol de 96 hasta eliminar el exceso de colorante. Para ello, echaremos el etanol
sobre los cortes con una pipeta inclinando un poco el portaobjetos para que el etanol caiga al
cristalizador. A continuacin, pasamos el portaobjetos con las secciones teidas a la batera de
deshidratacin.
5.- Cubeta de etanol 100, 5 minutos.
6.- Cubeta de histo-clear, 3 minutos.
7.- Montaje. Se aaden unas gotas de medio de montaje (Eukitt) sobre las secciones y se pone el
cubreobjetos encima evitando que se formen burbujas de aire.
C.- Observacin. Observacin de las preparaciones obtenidas en el microscopio ptico de
campo claro. Observacin de preparaciones sin teir en el microscopio ptico de campo oscuro y en el
microscopio ptico de contraste diferencial de interferencia (DIC) o de Nomarski.
CUESTIONES
1.- En nuestro laboratorio de tcnicas histolgicas pretendemos estudiar la estructura del
msculo esqueltico de ratn mediante la realizacin de una tincin hematoxilina-eosina sobre
secciones de 10 micras de grosor.
a.- Describe con detalle los diferentes pasos del proceso que va desde que extraemos el tejido
del animal hasta que lo observamos al microscopio ptico.
b.- Tras realizar la tincin sobre las secciones de msculo esqueltico qu componentes
celulares se teiran y por qu?
c.- En qu tipo de microscopio podramos observar las preparaciones obtenidas?

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5. TCNICAS DE
CENTRIFUGACIN Y
ELECTROFORESIS

(cdigo calendario de prcticas: BQ)


TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

Introduccin

Centrifugacin y fraccionamiento subcelular


La mayora de los laboratorios de Biologa disponen de centrfugas, de las cuales existen varios
tipos. As, en funcin del de rotor tenemos centrfugas con rotores basculantes o con rotores de ngulo
fijo, y en base a la velocidad que alcanzan tendremos centrfugas (hasta ~3,000 xg), centrfugas de alta
velocidad (2,000-20,000 xg) y ultracentrfugas (15,000-600,000xg). Todas ellas se emplean para
separar sustancias de masas o densidades distintas, como por ejemplo partculas slidas (clulas,
orgnulos, etc) de un lquido o bien lquidos con diferentes densidades. Los rotores basculantes
mantienen los tubos en posicin vertical cuando el rotor est en reposo, pero dicha posicin se vuelve
horizontal durante la centrifugacin de modo que las partculas sedimentan uniformemente en el fondo
del tubo. En los rotores de ngulo fijo, en cambio, los tubos estn situados en ngulo (25-52), y las
partculas van sedimentando tanto en el fondo como en los laterales de los tubos. Debido a su diseo
ms aerodinmico, este ltimo tipo de rotores alcanzan mayores velocidades. Las microcentrfugas que
vamos a emplear esta prctica tendrn rotores en ngulo fijo y nos permitirn operar a 11,000-15,000
revoluciones por minuto (rpm). Finalmente, las ultracentrfugas se caracterizan por ser capaces de
alcanzar altas velocidades (por ejemplo, 100,000 rpm), tanto con rotores de ngulo fijo como
basculantes.
Todas las centrfugas disponen de un motor elctrico y de un rotor conectado a ste a travs de
un eje. Tanto el eje como el rotor estn colocados dentro de una cmara de seguridad; dicha cmara est
cerrada mediante una tapa. En el panel de control aparecen botones de encendido/apagado, de seleccin
de velocidad, de nivel de frenado, y en algunas de temperatura de trabajo (entre -15C y 25C). El
control de la temperatura evita incrementos debido a la friccin que podran desnaturalizar las protenas
o lisar las clulas. Las centrfugas disponen de tacmetros para conocer la velocidad (rpm) de
funcionamiento, y en el caso de las de alta capacidad y ultracentrfugas de alarmas de aviso de posibles
desequilibrios. En las ultracentrfugas, la velocidad extrema (ms de 100000 rpm) hace necesaria la
existencia de sistemas de vaco en la cmara para evitar el calentamiento de rotor y muestras.
Los tubos empleados en centrifugacin pueden ser de vidrio o de plstico (poliestireno,
polipropileno), siendo ms resistentes los ltimos. Los tubos pueden tener formas (fondo cnico, fondo
redondo; sin tapa o con tapa, etc) y capacidades diversas. El equilibrado y colocacin de los tubos en el
rotor es crucial, ya que si este proceso se realiza incorrectamente el proceso de centrifugacin puede
pararse o generar sedimentos poco compactados.
Aparte de la velocidad de giro, expresada en rpm, tambin se emplea como unidad de medida la
fuerza de aceleracin, fuerza centrfuga relativa (RCF) o nmero de veces que la fuerza de gravedad,
expresada en x g, se est aplicando a la muestra. Existe una relacin directa entre RPM y RCF: RCF=
1.12 x10-5 x r x (rpm)2, en donde r es el radio del rotor (cm). Los valores en velocidad expresados en x g
son constantes entre las distintas centrfugas, pero no as los valores de rpm para un valor fijado de

55
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

RCF, pues es dependiente del radio del rotor. No obstante, la mayora de las centrfugas actuales
permiten especificar tanto RPM como RCF. Adems, en los libros de instrucciones de las centrfugas
aparecen tablas o nomogramas para determinar las rpm que debemos seleccionar para un valor fijo de
RCF cuando rotor y radio son conocidos.
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de mtodos que permiten obtener fracciones
enriquecidas en orgnulos (ej., mitocondrias, ncleos), fracciones de membrana (ej., membrana total,
membrana plasmtica) o complejos multiproteicos (ej., citoesqueleto) mediante dos etapas. En la
primera tiene lugar la rotura celular (lisado) mediante procedimientos mecnicos suaves que pueden
emplear o no detergentes (sonicacin, homogenizadores, etc). En esta prctica realizaremos una lisis
hipotnica sin detergentes, al emplear una solucin con una osmolalidad muy inferior al citoplasma de
las clulas; esto genera la entrada de agua y la lisis celular. En la segunda etapa se separa la fraccin
deseada mediante diversos criterios, como por ejemplo diferencias en densidad (ej., centrifugacin
diferencial). La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la
suspensin que difieren, entre s y con el medio, en cuanto a su densidad. Si se centrifuga en
condiciones suaves (poco tiempo, baja velocidad) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas.
Cuando el sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones ms
intensas sedimentarn las partculas ms densas; el proceso se puede continuar indefinidamente.
En la prctica de hoy vamos a emplear un protocolo de centrifugacin
diferencial con un modelo celular muy sencillo: el eritrocito humano. Los
eritrocitos han perdido su ncleo, membranas internas y mitocondrias, de modo
que pueden ser utilizados para la produccin de fantasmas, vesculas obtenidas
despus de liberar el contenido citoplasmtico mediante hemolisis y que
constituyen un preparado casi puro de membrana plasmtica. Dentro de esta
membrana plasmtica existen tanto protenas integrales como perifricas; las
primeras, embebidas en la membrana plasmtica, y las segundas, unidas a su
cara interna formando un entramado de protenas perifricas denominado
citoesqueleto. Dentro de las integrales tenemos la protena transportadora de
aniones, el transportador de glucosa y las glicoforinas, y dentro de las
citoesquelticas la espectrina, la actina y la protena de la banda 4.1 (Figura 1).

FIGURA 1: Patrn electrofortico de las protenas presentes en los


fantasmas de membrana de eritrocitos (Tomado de B.W. Shen y cols,
1986): Bandas 1 y 2: Cadenas y de la Espectrina. Bandas 2.1, 2.2 y 2.3:
Ankirina. Banda 3: protena transportadora de aniones. Banda 4.1: Protena del
citoesqueleto. Banda 4.2: Paladina. Banda 4.9: Demantina. Banda 5: Actina.
Banda 6: Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa.

56
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

Electroforesis

La electroforesis se basa en el movimiento que provoca el establecimiento de un campo


elctrico sobre una molcula con carga y que permite la separacin, por ejemplo, de protenas, ADN o
ARN. Segn la expresin v= Ez/f, la velocidad de migracin (V) de estas molculas dentro de un
campo elctrico depende de la fuerza del campo (E), de la carga de la protena (z) y del coeficiente de
friccin (f). Este ltimo, a su vez, vara con la forma de la molcula, su tamao y la viscosidad del
medio. Esto hace que una sustancia anfotrica como las protenas, en un tampn de pH determinado
(que no se corresponda con el punto isoelctrico de sta), presente una carga elctrica neta. De este
modo, diferentes protenas con una relacin carga/masa distinta y en estado nativo (no denaturalizado)
puedan ser separadas al establecerse un campo elctrico mediante la electroforesis nativa.
Sin embargo, en las electroforesis desnaturalizantes como la de la prctica, la carga de la
protena no va a ser la endgena, sino que viene dada por el dodecil sulfato sdico (SDS) del tampn de
muestra. El SDS es un detergente aninico que se une con una estequiometra de aproximadamente un
molcula de SDS por cada dos aminocidos. Esto le confiere a la protena una carga negativa
proporcional a su masa; es decir, iguala la relacin carga/masa de las protenas. Adems, la repulsin de
las cargas del SDS destruye las interacciones no covalentes lo que, junto con el calor, produce el
desplegamiento proteico. De este modo, al aplicar un campo elctrico a la muestra, los complejos
protena:SDS migrarn hacia el polo positivo y se separarn segn el peso molecular (las protenas ms
pequeas migrarn ms rpidamente que las grandes). Aparte del SDS, el tampn de muestra tambin
contiene -ME o DTT, molculas que rompen los puentes disulfuro, glicerol o sacarosa, para que la
muestra tenga una mayor densidad que el tampn de electroforesis y caiga dentro de los pocillos del
gel, y azul de bromofenol, un colorante con carga negativa con la movilidad electrofortica de un
pequeo polipptido y cuya funcin es la de ir por delante de las protenas (frente de electroforesis).
Las separaciones electroforticas se realizan habitualmente sobre distintos medios de soporte,
que evitan las corrientes de conveccin y sirven como tamices moleculares. Estos son habitualmente de
tipo continuos, como los geles de almidn, agarosa o los polmeros qumicos (poliacrilamida). Los geles
de poliacrilamida son producidos mediante la polimerizacin de acrilamida y su derivado bifuncional,
la bisacrilamida. Esta ltima molcula establece los enlaces cruzados que permiten generar poros con
un tamao controlado. Se emplean como catalizadores de la reaccin persulfato de amonio y TEMED.
Los geles de poliacrilamida son descritos en funcin de dos parmetros, que son la concentracin total
de monmero o %T [(gramos de acrilamida +gramos de bisacrilamida/volumen total en mL) x 100], y
el porcentaje en peso de crosslinker o %C [(gramos de bisacrilamida/gramos de acrilamida +gramos de
bisacrilamida) x 100]. Valores de %C del 2.6% (ratio 37.5:1), como en esta prctica, o 3.3% (ratio 29:1)
son apropiados para separaciones de protenas, mientras que %C del 5% (ratio 19:1) son adecuados para
secuenciacin de DNA.

57
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

La SDS-PAGE puede realizarse horizontalmente o verticalmente, y puede ser continua o


discontinua; la ms empleada, y utilizada en la prctica, es la discontinua. En sta se preparan 2 geles:
el gel separador (pH 8,8), donde se resuelven las protenas y que tiene un %T elegido en funcin del
peso molecular de las protenas a separar (menor cuanto mayor sea el peso de la protena), y el gel
concentrador (%T = 4%, pH 6,8), situado sobre el primero. Bajo la accin del campo elctrico
aplicado a la solucin a travs de dos electrodos con distinta carga (positiva/nodo & negativa/ctodo),
los iones (en este caso, la mezcla proteica con carga negativa -y por tanto aniones- colocada sobre el gel
de concentrador) migran hacia el electrodo de carga opuesta (el nodo). Cuando las protenas llegan al
gel separador se concentran, de manera que todas inician la separacin en el mismo momento; esto
mejora la resolucin de la electroforesis.
En cualquier sistema elctrico, la intensidad de la corriente producida es directamente
proporcional al voltaje aplicado e inversamente proporcional a la resistencia (Ley de Ohm, V=IR). La
electroforesis puede ser llevada a cabo fijando un valor de voltaje (por ejemplo, 100-200 V, como en
esta prctica) o de intensidad, pero en cualquier caso debe de realizarse lo ms rpidamente posible para
evitar la difusin y maximizar la resolucin. Si bien muchas electroforesis se realizan a RT, como la de
la prctica, en ocasiones los elevados voltajes implican mucha generacin de calor, lo que hace
necesario el uso de geles muy delgados y sistemas de enfriamiento.
Una vez la electroforesis termina y las bandas de protenas han sido resueltas en el gel
separador stas deben de ser visualizadas. Para ello se emplean diversos mtodos de tincin con
molculas afines a las protenas, tales como el azul de Coomassie (como el R-250, o el G-250 de la
prctica), con el que se pueden visualizar 0.1-0.5 g de protena/banda. Otro mtodo de tincin son las
sales de plata, con elevada sensibilidad (hasta 0.1 ng protena/banda) pero baja reproducibilidad.
Mtodos de tincin con sensibilidades comparables a la plata, pero ms reproducibles son los
compuestos fluorescentes, como el SYPRO Ruby, Flamingo Ruby, Deep Purple, Pro-Q Emerald.
Finalmente, varias son las aplicaciones de la SDS-PAGE, como por ejemplo analizar el grado
de pureza de una protena, determinar su peso molecular (o cambios en este por proteolisis), o conocer
la concentracin de una protena en la muestra.

Objetivos:
Utilizar un protocolo sencillo de fraccionamiento diferencial para purificar membranas
plasmticas de eritrocitos humanos para que los/as alumnos/as se familiaricen con las tcnicas
de centrifugacin.
Que el/la estudiante ponga en prctica los fundamentos tericos adquiridos en el seminario
sobre electroforesis y que conozca una de sus aplicaciones: el anlisis de mezclas de protenas y
los datos que se pueden extraer de dicho anlisis.

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TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

Instrumental:

Equipo de electroforesis MiniProtean de la casa comercial BioRad (ver foto superior), que
trabaja con un sistema de mini geles que requiere poca muestra, es ms rpido y mantiene una
alta resolucin en la separacin de las protenas. Incluye un juego de cristales (pequeos y
grandes), separadores, peines de 10 pocillos, marcos para sujetar los cristales y casting stands
para generar 8 geles de SDS-PAGE. Tanque y tapa (ver foto superior).
Microfuga Bata y guantes (medianos y
Fuente de alimentacin (capacidad pequeos)
200V, 500 mA) Contenedor de residuos biolgicos
Agitador magntico con capacidad y qumicos
para hervir muestras. Bandeja con cristal para la tincin
Microondas de los geles

Micropipetas: p1000, p200 y p20 8 kitasatos

Puntas azules y amarillas + cajas 8 pipetas vidrio 10 mL +chupones

Tubos eppendorf de 1.5 mL, 10 mL

blancos

Reactivos
Cloruro sdico Solucin de tincin basada en azul
Cloruro potsico de coomassie G-250 Biosafe
Fosfato de sodio monobsico Marcadores de peso molecular
Fosfato de sodio dibsico Acrilamida
Bisacrilamida

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TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

Tris Glicerol
SDS (sodio dodecil sulfato) Azul de bromofenol
TEMED Glicina
Persulfato de amonio EDTA
2-mercaptoetanol ( -ME) cido clorhdrico (HCl)

Soluciones
Solucin 1: Tris/HCl 1,5 M pH 8,8, 100 mL. Pesar 18,15 g de Tris. Disolver el Tris en
50 mL de agua destilada. Aadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a
8,8. Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL). Estable por meses a
4C.
Solucin 2: Tris/HCl 1 M pH 6,8, 100 mL. Pesar 12,1 g de Tris. Disolver el Tris en 50
mL de agua destilada. Aadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a 6,8.
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL). Estable por meses a
4C.
Solucin 3: SDS 10% (w/v), 100 mL. Pesar 10 g de SDS. Aadir agua destilada hasta
completar el volumen de 100 mL. El SDS es un polvo fino neurotxico, por lo tanto se
debe usar mscara, guantes y gafas de proteccin. Almacenar a RT.
Solucin 4: Glicerol 50% (v/v), 100 mL. Mezclar un volumen de 50 mL de glicerol al
100% con 50 mL de agua destilada. Almacenar a RT.
Solucin 5: Azul de Bromofenol 1% (w/v), 10 mL. Pesar 100 mg de azul de
bromofenol. Completar con agua destilada hasta 10 mL y mezclar hasta disolver. Filtrar
la solucin en papel Whatman No 1 para eliminar el colorante no disuelto. Almacenar a
RT.
Solucin 6: Acrilamida 30% (100 mL). La solucin de acrilamida al 30% (w/v) es una
mezcla de acrilamida (29,2 g) y bisacrilamida (0,8 g). Pesar ambos reactivos y aadir
agua destilada hasta 100 mL. Filtrar en papel de filtro Whatman N1 La acrilamida en
polvo y en solucin es neurotxica, por lo tanto se debe usar mscara, guantes y lentes
de proteccin para su manipulacin, o mejor comprarla ya preparada. Estable por meses
a 4C.
Solucin 7: Persulfato de amonio al 10% (w/v), 5 mL. Pesar 0,5 g de persulfato de
amonio. Disolver en 5 mL de agua destilada. Almacenar a -20C.
Solucin 8: Tampn de electroforesis 1X, 1 L. Pesar 3 g de Tris (25 mM), 14,4 g de
glicina (192 mM) y 1 g de SDS (0,1%). Aadir agua destilada hasta completar 1 L. El
pH debera ser de aproximadamente 8,3. Se puede preparar una solucin 10 veces

60
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

concentrada y diluir el volumen necesario en el momento de la electroforesis. Esta


solucin puede almacenarse indefinidamente a RT.
Solucin 9: Tampn de muestra 5X, 10 mL. 0,6 mL de Tris/HCl 1M pH 6,8 (solucin
2; 60 mM), 5 mL de Glicerol 50% (solucin 4; 25%), 2 mL de SDS 10% (solucin 3;
2%), 0,5 mL de 2-mercaptoetanol (14,4 mM), 1 mL de azul de bromofenol (solucin 5;
0,1%), 0,9 mL de agua destilada. Almacenar a -20 C.
Solucin 10: Tampn fosfato salino o PBS, 1L. Pesar 8 g de cloruro de sodio (NaCl),
0,2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,24 g de fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) y
1,44 g de fosfato de sodio dibsico (Na2HPO4). Llevar hasta 1L con agua destilada. No
ajustar el pH. Almacenar a 4C.
Solucin 11: 1 M tampn fosfato pH 7.0, 200 mL. Preparamos primero las soluciones
madre: solucin A: 2 M fosfato de sodio monobsico (2,76 g NaH2PO4 H2O en 10 mL);
solucin B: 2 M fosfato sodico dibsico (2,84 g de Na2HPO4 en 10 mL). Mezclar 3,9
mL de solucin A y 6,1 mL de solucin B. Diluir hasta 20 mL con agua para generar
una solucin 1M.
Solucin 12: 0.5M EDTA pH 8.0. Pesar 18,612 g de EDTA disdico 2 H2O y disolver
en 70 mL de agua destilada. Ajustar a pH 8.0 con 10 N NaOH (el EDTA no se
disolver a menos que se alcance pH 8.0) y completar hasta 100 mL con agua destilada.
Guardar a 4C.
Solucin 13: Tampn de lisis hipotnico, 100 mL. 5 mM fosfato sdico pH 7.0, 0.5
mM EDTA. Mezclar 0,5 mL de 1M tampn fosfato pH 7.0 (solucin 11) con 0,1 mL de
0.5M EDTA pH 8.0 (solucin 12). Completar con agua destilada hasta 100 mL.
Guardar a 4C.

Protocolo:

1er da, 2h 30 min


Obtencin de los eritrocitos:
1. Coger 500 l sangre humana tratada con EDTA y la depositamos en un tubo eppendorf
de 1.5 mL. Centrifugar a 1000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
2. Eliminar el plasma sanguneo y la primera capa de leucocitos (que est sobre los
eritrocitos empaquetados). Lavar con 500 l de PBS pH 7.4, que es isotnico con el
citoplasma de las clulas rojas.
3. La suspensin se centrifuga a 1,000 xg durante 10 min a RT.
4. Descartar el sobrenadante y repetir el lavado con 500 l de PBS pH 7.4 dos veces ms
para eliminar todas las protenas del suero.

61
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

Lisis hipotnica de los eritrocitos:


5. Utilizamos un protocolo de lisis hipotnica descrito por G. Fairbanks y colaboradores
en 1971. Las clulas se rompen tomando una fraccin del volumen empaquetado (por
ejemplo, 150 l) y aadiendo aproximadamente 10 volmenes (1,35 mL) del tampn
hipotnico fro (5 mM fosfato sdico pH 7.0, 0.5 mM EDTA).
6. Dejar lisar durante 15 minutos en hielo.

Fraccionamiento del lisado mediante centrifugacin:


7. La suspensin se centrifuga a 12,000 xg durante 10 minutos. Cuidado con la colocacin
de los tubos!!!!!
8. El sobrenadante se retira por aspiracin y se guarda etiquetado como citosol.
9. El precipitado, que contiene los fantasmas de membrana, se resuspende en 5 mM
fosfato sdico pH 7.0 fro para la realizacin de varios lavados ms (tpicamente 3),
hasta que los fantasmas de membrana sean blancos (es decir, hasta que no contengan
hemoglobina).
10. Las protenas de membrana se disuelven incubando los fantasmas con 25 l de tampn
de muestra de electroforesis 1X.
11. Del sobrenadante citoslico (paso 8) se toman 20 l y se le aaden 5 l de tampn de
muestra de electroforesis 5X.
12. Las tapas de los eppendorf que contienen los dos tipos de muestras son perforadas con
una aguja. Las muestras se hierven durante 15 minutos, se centrifugan a 12,000 xg
durante 5 minutos a RT para eliminar las protenas precipitadas y los sobrenadantes se
guardan en tubos eppendorf nuevos etiquetados (tubo 1: citosol; tubo 2: protena de
membrana) a -20 C hasta el da siguiente.

2 da. 2h 30 min. SDS-PAGE y tincin.


1. Ensamblar el molde formado por los soportes, vidrios y los separadores.
2. Preparacin de los geles: Cada grupo va a preparar un minigel, aunque al final
solo dos sern los requeridos para cargar las muestras de todos los grupos.
3. Se prepara el gel separador con un porcentaje de acrilamida del 12% mezclando
en un kitasato y en este mismo orden 4 mL de agua, 2,5 mL de Tris HCL 1.5 M
pH 8,8, 100 l de 10% SDS y 2.5 mL de 30% acrilamida/0.8 % bisacrilamida.
Se aaden 100 l de persulfato amnico al 10% y 4 l de TEMED.
4. Utilizando una micropipeta p1000 se llena el sandwich formado por los cristales
y los separadores con dicha solucin; no se deben formar burbujas. Dejar

62
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

aproximadamente 1,5 cm entre la solucin de acrilamida y el vidrio pequeo. Se


completa con agua con mucho cuidado para evitar que el borde del gel
polimerice de manera irregular y se deja polimerizar durante 30 minutos a RT.
5. Una vez polimerizado el gel separador, descartar el agua de la superficie del
mismo y preparar 4 mL de gel concentrador (4%) mezclando 2,7 mL de agua
destilada, 0,67 mL de solucin 30%Acrilamida/0.8%bisacrilamida, 0,5 mL de
Tris/HCl 1 M pH 6,8, 40 l de 10%SDS, 40 l de 10% persulfato amnico y 4
l de TEMED. Utilizando una micropipeta p1000 se deposita sobre el gel
separador ya polimerizado y se inserta finalmente el peine con cuidado de no
formar burbujas. Dejar polimerizar durante 30 minutos a RT.
6. Durante el transcurso de esta ltima polimerizacin se descongelan las muestras
de protena tanto del tubo 1 (citosol) como del tubo 2 (protena de membrana)
para ser cargadas en el gel (20 l de cada una; 4 grupos por gel). Se preparan
tambin los marcadores de peso molecular.
7. Electroforesis: colocar dos de los geles (los que hayan quedado mejor) en el
tanque de electroforesis con aproximadamente 500 mL de tampn de
electroforesis 1X (solucin 8). Quitar cuidadosamente el peine para que queden
libres los pocillos del gel. Los pocillos deben de ser limpiados con tampn de
electroforesis con micropipeta para eliminar el monmero de acrilamida no
polimerizado.
8. Las muestras de todos los grupos y los marcadores de peso molecular son
cargados en los dos geles. La unidad de electroforesis se conecta a la fuente de
alimentacin y se aplica un voltaje constante de 100-200V.
9. Tincin: Finalizada la electroforesis se extraen los geles de la unidad de
electroforesis y se deposita en una cubeta de cristal. Los geles se fijan y lavan
dos veces con 50 mL por gel de 20% etanol en agua destilada en el microondas
(de 45 segundos a 1 minuto; 50-70C). Agitar 5 minutos.
10. Lavar una vez con 100 mL de agua destilada/gel a ~80C en el microondas,
agitar durante 2 minutos y repetir el lavado.
11. Teir con 25 mL de solucin de tincin Biosafe por gel, suficiente como para
cubrir los geles. Tapar con parafilm la cubeta y meter en el microondas.
Calentar a 70-80C a mxima potencia (dos pulsos de 20 segundos; parar si
empieza a hervir). Sacar y dejar en agitacin suave durante 10 minutos.
12. Eliminar la solucin de tincin. Lavar con 100 mL de 10% etanol en agua
destilada por gel en microondas a 50-70C. Sacar de microondas y poner papel
adsorbente. Agitar 15 minutos (o hasta que se destia correctamente).

63
TCNICAS DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

EJERCICIOS DE LA PRCTICA DE CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS

Pregunta 1:
Representar el logaritmo del peso molecular de los marcadores en el eje Y frente a
la movilidad relativa de dichos marcadores (distancia migrada por el
marcador/distancia migrada por el frente de azul de bromofenol) en el eje X.
Calcular el peso molecular de las bandas 1, 2, 3, 4.1 y 4.2. Empleando el Atlas
Proteico Humano (http://www.proteinatlas.org) obtener los pesos moleculares de
dichas protenas y comparar los resultados obtenidos en la prctica con los de la
base de datos.

Pregunta 2:
La protena representada a continuacin es la protena transportadora de aniones
de eritrocitos (banda 3). Imagine que ha purificado dicha protena en estado
oxidado y que las cistenas 317 y 201 estn implicadas en la formacin de puentes
disulfuro intra- e intermoleculares (entre diferentes monmeros). Dibuje un
esquema del patrn de bandas, con sus pesos moleculares correspondientes, que
esperara tras una SDS-PAGE de esta protena en presencia y ausencia de -ME.

64
6. MEDIO FSICO Y TCNICAS
DE CARTOGRAFA

(cdigo calendario de prcticas:


EDAFO)
MEDIO FSICO Y TCNICAS DE CARTOGRAFA

PRCTICA

Se realizar una salida a una zona prxima a la ciudad para hacer el estudio del medio fsico de un
emplazamiento, mediante la caracterizacin de los distintos factores del medio y de sus interrelaciones

Para cubrir por el alumnado:

Fecha de la salida
rea de estudio
Cartografa utilizada
Datos do emplazamiento
Posicin fisiogrfica
Coordenadas geogrficas
Pendiente
Altitud
Estudio del relieve. Corte topogrfico

Materiales geolgicos

Morfologa de los suelos

Estudio del clima. Diagrama de Thornthwaite

Vegetacin y uso del suelo

Interpretacin conjunta de los factores del medio fsico en ese emplazamiento

67
MEDIO FSICO Y TCNICAS DE CARTOGRAFA

68
7. MTODO CIENTFICO Y
TCNICAS DE MUESTREO

(cdigo calendario de prcticas:


ECO)
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

1. INTRODUCCIN

1.1. DESARROLLO DE LA PRCTICA.


La prctica consistir en tres fases bien diferenciadas que se realizarn en tres sesiones consecutivas.
En la primera sesin se realizar en el campo (en este caso en el Campus Sur de la USC). La sesin se
efectuar en parejas a las que a cada una les corresponder su respectivo receptor GPS. El lugar en el
que se iniciar la prctica ser la puerta principal de la Facultad de Biologa. Es posible que durante las
horas de la prctica existan precipitaciones o condiciones atmosfricas adversas, que en principio no
supondrn suspensin de la prctica a no ser que sean extremas. Os recomendamos la lectura del
apartado recomendaciones generales para el trabajo en el campo para que acudis convenientemente
preparados. Del mismo modo es necesario que previamente se haya ledo el documento sobre los
Sistemas Satelitales de Navegacin Global, que se podr descargar de la pgina de la USC Virtual,
correspondiente a esta asignatura.
Durante, esta prctica primeramente se realizar una breve introduccin a cerca de las recomendaciones
generales para el trabajo en el campo. Posteriormente se explicar el empleo de los diferentes modelos
de GPS que se van a utilizar durante el desarrollo de la misma, prosiguiendo con la asignacin del GPS
correspondiente a cada pareja. A continuacin se proceder a la captura de datos, tal y como se
especifica en el correspondiente apartado de esta memoria (Seccin 2.2).
La segunda sesin se realizar en la sala de informtica. Se comenzar con un tiempo para la aclaracin
de dudas sobre el documento de Sistemas Satelitales de Navegacin Global. A continuacin se os
explicar como configurar un puerto USB como un puerto COM, y como importar los datos de un GPS
a un PC, a travs de un software especfico de la casa de los GPS empleados. Realizareis una
importacin de datos desde el GPS que se os haba asignado en la sesin anterior. A continuacin
aprenderis a exportar (a un archivo de texto sin formato) desde dicho software los archivos de datos
que previamente habis importado. Estudiaremos el contenido del archivo exportado y lo
modificaremos para que pueda ser empleado en un Sistema de Informacin Geogrfica (GIS). A
continuacin desde un GIS (ArcMap 9.2 Esri) se importar dicho archivo y aprenderemos unas
mnimas nociones de edicin de datos que nos permitan crear archivos de puntos, lneas, polilneas y
polgonos a partir de puntos, as como a modificar archivos de puntos. Por ltimo aprenderemos a
disear muestreos desde un GIS mediante Hawth's Analysis Tools for ArcGIS, creando archivos de
puntos. Una vez creado estos archivos aprenderemos a exportarlos desde el ArcMap y a importarlos al
GPS.
La ltima sesin se realizar en el campo (de nuevo en el Campus Sur de la USC). La prctica se
efectuar en parejas a las que a cada una les corresponder su respectivo receptor GPS. El lugar en el
que se iniciar la prctica ser la puerta principal de la Facultad de Biologa. Las recomendaciones
climatolgicas de la primera sesin vuelven a ser aplicables. Se comenzar con la expiacin del uso del
GPS en navegacin, tras lo cual procederis a buscar en este modo las coordenadas de los muestreos

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generados en la sesin anterior. Una vez lleguis a estas coordenadas procederis a la adquisicin de
datos inmediatos (i.e. orientacin, pendiente, altitud, pedregosidad, estima de la cobertura vegetal por
estratos), para proseguir a el muestreo de rboles en parcelas de radio de 20 metros.

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1.2. RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL CAMPO


Aunque para la prctica que vamos a realizar no abandonaremos el Campus Sur de la USC, es
conveniente que conozcis algunos aspectos y medidas de seguridad importantes a la hora de realizar el
trabajo de campo. No desdees estos consejos, si trabajas en el campo con el paso del tiempo acabars,
desgraciadamente, conociendo a personas que lo han pasado muy mal por desatenderlos.

1.2.1. Recomendaciones generales


No salgis nunca solos al campo. Por cuestiones de seguridad, es necesario salir como mnimo en
parejas. No te tomes esta recomendacin a la ligera. Informad siempre a una persona cercana de
vuestras intenciones sobre la ruta que vais a seguir.
Cuando vayamos con personas con diferente forma fsica, el que tiene la peor forma marca el ritmo del
grupo al que nos adecuaremos con paciencia. Dosificad los esfuerzos y descansad cuando lo necesitis.
Si sudis, no olvidis abrigaros al descansar.
No olvidis nunca el telfono mvil con la batera cargada (aunque en muchas zonas no tendris
cobertura) ni el GPS (cuando lo tengis). Si no conoces perfectamente la zona consulta antes cartografa
y lleva siempre un mapa.
No comis frutos u hongos que no sepis con seguridad que son comestibles. No bebis agua que no sea
potable de forma verificada. Ojo con las aguas de alta montaa; en ocasiones las altas concentraciones
minerales pueden causar problemas gstricos.

1.2.2. Condiciones meteorolgicas


Consultad siempre una prediccin meteorolgica fiable (i.e. http://meteogalicia.es) antes de salir al
campo. Si las condiciones son adversas o hay riesgo de las mismas, siempre que sea posible aplazad la
salida. De no ser as tomad las mayores precauciones posibles.
En los das calurosos, empezad la actividad con el tiempo necesario para acabarla antes de la hora de
ms calor. Cuidado con la cada de la noche, consultad previamente la hora del ocaso y tened en cuenta
que dentro de cubiertas vegetales y/o en vaguadas y/o en pendientes con orientacin este y/o con el
cielo encapotado la luz se extingue antes. Calculad con un amplio margen de seguridad - siempre puede
haber imprevistos - el tiempo del camino de retorno.

1.2.3. Recomendaciones sobre la ropa y calzado


Hay que llevar la ropa y el calzado adecuado y dependiendo de la poca del ao. Selecciona siempre
ropa cmoda. Para una salida sencilla (p.e. caminos, pistas, etc.) es suficiente un chndal y unos
deportivos. Si se trata de un trabajo en campo ya tendremos que llevar buena ropa y calzado.
La ropa debe de ser ligera, que permita el trabajo fsico y que transpire. Que la ropa se pueda quitar por
capas es una buena opcin cuando hace fro y vamos a realizar trabajo fsico. En cuanto a la proteccin
de la lluvia en el mercado hay una gama muy amplia de tejidos impermeables. Si no vais a trabajar con

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asiduidad en el campo un impermeable y un pantaln plstico son una opcin ptima (lo venden en
cualquier ferretera a un precio muy razonable). El problema del plstico es la falta de transpiracin, por
ello si pensis salir con frecuencia al campo o trabajar en all en el futuro es posible que os compense
realizar una inversin en otras opciones. Como dijimos existe una gama amplsima de tejidos donde
elegir, adems de las caractersticas previamente comentadas (ligeras, cmodas y que transpiren) tened
en cuenta la resistencia a la abrasin y a las posibles roturas ocasionadas por la vegetacin. Tanto el
plstico como algunas prendas de alta montaa no estn diseadas para trabajar entre vegetacin que
posea pinchos o espinas (lo que es habitual en nuestra geografa, p.e. Ulex sp. o Rubus, sp.), que se
rasgarn rpidamente perdiendo su impermeabilidad. Los cortavientos encerados renen todas estas
caractersticas y resultan muy difciles de rasgar (pudiendo ser reparados cuando esto ocurre), en el
mercado existen multitud de marcas y precios tanto de chaquetas como de cubrepantalones. Es
interesante que las chaquetas tengan bolsillos externos de rpido acceso as como bolsillos carpeteros,
etc. Cuando hay lluvia o riesgo de la misma llevad siempre una muda completa.
En cuanto al calzado llevadlo resistente y cmodo. Comprad botas que se ajusten a vuestras
necesidades, prestando atencin a los diferentes tipos de suelas, que son la parte ms importante de la
bota, deben dar agarre al tiempo que ser duraderas. La seleccin de una bota de cualquier marca que
tenga suela Vibram es acertada. Si optis por botas con membrana de Goretex, sed conscientes que si
se os llega a romper la membrana, al tener que impermeabilizar externamente la bota, los tejidos
interiores dan peores resultados que en botas sin membrana. Independientemente de la opcin escogida,
las polainas de cordura son muy aconsejables cuando llueve, protegen tanto la bota como la parte baja
del pantaln, que en ocasiones queda al descubierto del cubrepantaln. No uses nunca calzado nuevo
para una salida al campo. Cuidaos los pies, prestad atencin a que no tengis arrugas en los calcetines
para evitar las ampollas. Los calcetines con tefln son una correcta solucin al problema de las
ampollas. Lleva siempre unos calcetines de repuesto.
Una solucin de emergencia, o para ahorrar inversiones, que sirve tanto para tejidos de algodn (p.e. un
pantaln vaquero) como para cualquier calzado de piel (p.e. unos deportivos) es el uso de sprays
impermeabilizantes que podris encontrar en cualquier tienda de deportes o armera.
Aunque haga buen tiempo es siempre aconsejable llevar un chubasquero. En los das de sol no olvides
una gorra o sombrero y las gafas de sol. En los das de fro un cuello de tejido polar es un buen aliado, y
con fro extremo un pasamontaas.

1.2.4. Recomendaciones sobre el equipamiento


Llevad una pequea mochila impermeable con una navaja, un cordn, una linterna o frontal, cerillas,
una bolsa de plstico y papel higinico. Si tenis cmara de fotos llevadla con vosotros.
Es conveniente llevar una botella de agua, frutos secos, galletas y fruta. Durante la jornada bebe agua y
toma algn alimento de vez en cuando.

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Llevad con vosotros un pequeo botiqun con desinfectante, gasas, esparadrapo, apsitos adhesivos,
tijeras, pinzas, analgsicos, pomada antiestamnica, pomada para las quemaduras, vaselina, proteccin
solar y repelente de insectos.

1.2.5. Recomendaciones en caso de que nos perdamos


Procura no alejarte nunca del grupo o pareja. Si por cualquier razn debes apartarte, avisa al resto para
que te esperen. Si alguna vez te pierdes, espera, en cuanto alguien observe que faltas volver a por ti. Es
ms fcil encontrarte por donde ya se ha pasado, as que es mejor esperar y no empezar a andar sin
saber dnde ir. Cuando alguien se pierde los equipos de bsqueda suelen hacer seales con un silbato
(se oye ms lejos que la voz), procura contestar gritando.

1.2.6. Recomendaciones en caso de accidente


El nmero de emergencias internacional es el 112. No obstante en ocasiones os encontrareis en zonas
sin cobertura o en las que la asistencia mdica puede tardar mucho en llegar por ello es conveniente que
tengis formacin en primeros auxilios (atragantamiento, cuerpos extraos, esguinces, luxaciones,
fracturas, trasporte de accidentados, heridas, hemorragias, mareo, lipotimia, picaduras y mordeduras y
RCP bsica). De no ser as busca donde hacer un curso (consultad en el Servicio de Vixilancia da Sade
da USC).

1.2.7. Recomendaciones para como tomar notas en el campo


Es conveniente que llevis siempre una carpeta o un portafolios duro (de plstico o metal) que os sirva
de soporte a la hora de escribir. Tomad notas siempre con lpiz y sobre papel de alto gramaje, ya que en
el caso de que la hoja se moje la impresin no se borra, a diferencia de la tinta de un bolgrafo o un
rotulador. Cuanto mayor sea el gramaje menor ser la posibilidad de que se rompa o deshaga si se moja.
Para prevenir la lluvia en el mercado existen protectores plsticos para papel normal o papel
plastificado con calco.

1.2.8. Recomendaciones para los desplazamientos


Cumple siempre las recomendaciones generales sobre seguridad al volante. Al menos uno de los
acompaantes debe conducir. Los desplazamientos en el campo se realizan usualmente en todoterreno.
Adquirir conocimientos en conduccin off-road, empleo de cabestrantes (i.e. winch) os ser
necesario si pensis trabajar en el campo en el futuro. Cuando empleis un todoterreno no olvidis
equiparlo con una pala, guantes, planchas y cabestrante manual, cuando el coche no lo tenga elctrico.

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2. MATERIAL Y MTODOS

2.1. SESIN PRIMERA


El profesor te asignar una de las zonas del croquis adjunto para que comiences la prctica. Debes
dirigirte a esa zona y buscar en las pginas siguientes el cdigo correspondiente a dicha zona para
realizar la captura de datos que se seala en la correspondiente tarea para esa zona. Posteriormente
dirgete a la siguiente zona (de la zona 1 a la 26 en bucle cerrado) y realiza la correspondiente tarea y
as sucesivamente hasta agotar el tiempo de la prctica. Los mapas individuales de cada zona no estn
orientados ni tienen norte, as que utiliza el adjunto para orientar cada uno.

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ZONA: 01 Facultade de Qumica


TAREA: Polgono de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 20 vrtices
(de forma ordenada y consecutiva) del edificio que estn marcados en el plano adjunto.
Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 01) seguido de un guin bajo y el nmero de cada
vrtice indicado en el plano (sitate con atencin para no confundir el 01 con cualquiera de las
otras esquinas), p.e. 01_01.

NOTAS: Guate para establecer los vrtices por las esquinas del edificio

01 20 17 13
16
12
15 14
19 18

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

03 08 10
02 05
11
04 09
06 07

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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ZONA: 02 Entrada Principal Campus Sur


TAREA: Polgono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras
para hacer un polgono que comprenda la masa de rboles compuesta principalmente por varias
especies diferentes cedros, tullas, criptomerias, magnolios, adelfas, etc. (Cedrus deodara,
Euonymus japonicus, Magnolia grandiflora, Prunus cerasifera var. Pisardii, Nerium oleander,
Criptomeria japonica, Cedrus atlantica, Camellia japonica, Thuja orientalis y Salix babilonica)
que est marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el cdigo 02_I (letra I de
inicio). A continuacin pulsa tantas veces como necesites la tecla mark o anloga, sin incluir
ningn cdigo de forma que se le asigne el cdigo por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de
inicio marcando el ltimo punto introducido en el GPS como 02_F.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.
NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No
incluyas los rboles de la acera.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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ZONA: 03 Facultade de Dereito


TAREA: Polgono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras
para hacer un polgono que comprenda la masa de rboles compuesta por cedros, lamos y un
ciprs (Cedrus deodara, Cedrus atlantica, Populus alba y Cupressus lusitanica) que est
marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el cdigo 03_I (letra I de inicio). A
continuacin pulsa tantas veces como necesites la tecla mark o anloga, sin incluir ningn
cdigo de forma que se le asigne el cdigo por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio
marcando el ltimo punto introducido en el GPS como 03_F.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No
incluyas los tejos ni el pino.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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ZONA: 04 CESGA, CSIC, Biblioteca C.A. y Guardera


TAREA: Lnea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 10 nodos del camino
marcado en el plano adjunto (de forma ordenada y consecutiva). Identifcalos con el cdigo de
la zona (i.e. 04) seguido de un guin bajo y el nmero de cada nodo indicado en el plano (sitate
con atencin para no confundir el 1 con el 10), p.e. 04_01.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera

01 02
04 10

05
03

07
06

08 09 Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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ZONA: 05 Viviendas de funcionarios e antigas casas de catedrticos


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 16 platanos (Platanus orientalis)
que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 05) seguido
de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 16), p.e. 05_01.

NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.

02 04 06 08 10 12 14 16

01 03 05 07 09 11 13 15

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

81
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 06 Pistas de deportes


TAREA: Polgono de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 18 vrtices
(de forma ordenada y consecutiva) del estanque que estn marcados en el plano adjunto (todos
los vrtices y 3 puntos por cada circunferencia). Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 06)
seguido de un guin bajo y el nmero de cada vrtice indicado en el plano (sitate con atencin
para no confundir el 01 con cualquiera de las otras esquinas), p.e. 06_01.
Para los 5 primeros vrtices (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada vrtice, y posteriormente
pulsa 9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le
asigne un cdigo por defecto.

NOTAS: Camina y toma las coordenadas por el borde de piedra del estanque.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

15
16 14
17 13
01 11
18 12

0310
02 09
04 08
05 07
06

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 07 Facultad de Polticas


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada una de las 12 camelias (Camellia japonica)
que estn marcadas en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 07) seguido
de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 12), p.e. 07_01.

NOTAS: Toma la coordenada en el centro de los pies de cada una de las cepas de camelia.

01
02 03
04
05
06
07
08
09
10
11
12

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 08 Xardn entre Fac. de Farmacia e Fac. Polticas


TAREA: Lnea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 19 nodos del camino
marcado en el plano adjunto (de forma ordenada y consecutiva). Identifcalos con el cdigo de
la zona (i.e. 08) seguido de un guin bajo y el nmero de cada nodo indicado en el plano (sitate
con atencin para no confundir el 1 con el 19), p.e. 08_01.
Para los 5 primeros nodos (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada nodo, y posteriormente pulsa
9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne el
cdigo por defecto.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

02 03 14 15
05 16
04 12 13 17

06 10 11 18
01
07 19

08 09

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

84
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 09 Facultad de Farmacia


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 9 robles americanos (Quercus
rubra) que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 09)
seguido de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin
para no confundir el 01 con el 09), p.e. 09_01.

NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.

09
08
07
06
05
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html 04
03
02

01

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 10 Auditorio y Observatorio Astronmico


TAREA: Polgonos mltiples de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los
28 vrtices (de forma ordenada y consecutiva) del seto de aligustre (Ligustrum ovalifolium) que
estn marcados en en la ampliacin del plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e.
10) seguido de un guin bajo y el nmero de cada vrtice indicado en el plano (sitate con
atencin para no confundir el 01 con cualquiera de las otras esquinas), p.e. 10_01.
Para los 5 primeros vrtices (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada vrtice, y posteriormente
pulsa 9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le
asigne un cdigo por defecto.

NOTAS: Toma las coordenadas sobre los setos en su punto medio.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

21 20 10
09
24 19 11 12
22 23 25 26 07 08
14 13 27 28 05 04
18 17 01 06
15 16 02 03

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

86
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 11 Colexios Maiores


TAREA: Lnea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 19 nodos del camino
marcado en el plano adjunto (de forma ordenada y consecutiva). Identifcalos con el cdigo de
la zona (i.e. 11) seguido de un guin bajo y el nmero de cada nodo indicado en el plano (sitate
con atencin para no confundir el 1 con el 19), p.e. 11_01.
Para los 7 primeros nodos (i.e. 01-07) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada nodo, y posteriormente pulsa
9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne el
cdigo por defecto.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

12 11 16 15

10
13 14
09

18 17 06
05
07
04
19 08 03
01 02

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

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MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 12 Capela Universitaria e campo de hockey herba


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 14 castaos de indias (Aesculus
hippocastanum) que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona
(i.e. 12) seguido de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con
atencin para no confundir el 01 con el 14), p.e. 14_01.

NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

88
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 13 Piscina
TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 8 robles (Quercus robur) que
estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 13) seguido de
un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 08), p.e. 13_01.
Para los 8 rboles (i.e. 01-08) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos. Slo es
necesario que identifiques la primera coordenada de cada rbol, y posteriormente pulsa 9 veces
seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne un cdigo
por defecto.

NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles. En el plano se representan tres rboles que ya no existen.
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

02
07 04 01
08

06 03
05

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

89
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 14 Campo de ftbol e CIBUS


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 15 abedules (Betula alba) que
estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 14) seguido de
un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 13), p.e. 14_01.
Para los 5 primeros rboles (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada rbol, y posteriormente pulsa
9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne
un cdigo por defecto.

NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles.

01 03 05 07 09 11 13 15
02 04 06 08 10 12 14

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

90
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 15 Pavilln Estidiantil, Facultades de Bioloxa e de Matemticas


TAREA: Polgono de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 16 vrtices
(de forma ordenada y consecutiva) del edificio que estn marcados en el plano adjunto.
Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 15) seguido de un guin bajo y el nmero de cada
vrtice indicado en el plano (sitate con atencin para no confundir el 01 con cualquiera de las
otras esquinas), p.e. 15_01.

NOTAS: Guate para establecer los vrtices por la proyeccin de las terrazas ms salientes.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

04 05
16 01

02 03
15 14 07

12 13 09 06
08
11 10

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

91
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 16 Casa Gradn e Pavilln de Servicios


TAREA: Polgono de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 20 vrtices
(de forma ordenada y consecutiva) del edificio que estn marcados en el plano adjunto.
Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 16) seguido de un guin bajo y el nmero de cada
vrtice indicado en el plano (sitate con atencin para no confundir el 01 con cualquiera de las
otras esquinas), p.e. 16_01.

NOTAS: Guate para establecer los vrtices por las esquinas del edificio.

13
15 12
17 14
16 10
18 19 11
01 06 09 08 Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
20
04
02 05 07
03

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

92
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 17 Estadio de atletismo


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 14 perales chinos (Pyrus callery
var. Cumbre nevada) que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la
zona (i.e. 17) seguido de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate
con atencin para no confundir el 01 con el 14), p.e. 17_01.

NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles. En el plano se representa un rbol que ya no existe.

02 01
03
04
05
06
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html
07
08
09
10
11
12
13
14

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

93
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 18 FEUGA
TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 13 pltanos (Platanus orientalis)
que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 18) seguido
de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 13), p.e. 18_01.

NOTAS: Cuidado con los coches, trabaja siempre sobre la isleta. Elige una orientacin del
tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el resto de los rboles.

01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

94
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 19 Fac. de Enxeera Qumica e Informtica


TAREA: Polgono de lados regulares. Registra las coordenadas de cada uno de los 11 vrtices
(de forma ordenada y consecutiva) del edificio que estn marcados en el plano adjunto.
Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 19) seguido de un guin bajo y el nmero de cada
vrtice indicado en el plano (sitate con atencin para no confundir el 01 con cualquiera de las
otras esquinas), p.e. 19_01.
Para los 5 primeros vrtices (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada vrtice, y posteriormente
pulsa 9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le
asigne un cdigo por defecto.

NOTAS: Guate para establecer los vrtices por la proyeccin de las terrazas.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

11 01

09 10

03
02
08 07 04

06 05

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

95
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 20 Invernadoiros, CACTUS e Institutos de Investigacins


TAREA: Polgono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras
para hacer un polgono que comprenda la masa de rboles compuesta principalmente por arces,
pltanos y robles americanos (Acer saccharinum, Acer platinoides y Quercus rubra) que est
marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el cdigo 20_I (letra I de inicio). A
continuacin pulsa tantas veces como necesites la tecla mark o anloga, sin incluir ningn
cdigo de forma que se le asigne el cdigo por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio
marcando el ltimo punto introducido en el GPS como 20_F.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa. No
incluyas los rboles de la acera.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

96
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 21 Animalario de Bioloxa e Ampliacin de Psicoloxa


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 25 camelias (Camellia japonica)
que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 21) seguido
de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 1 con el 25), p.e. 21_01.
Para los 5 primeros rboles (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada rbol, y posteriormente pulsa
9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne
un cdigo por defecto.

NOTAS: Al registrar las coordenadas, localiza el GPS sobre el centro de la parte superior de
cada una de las camelias

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

15 17 19 21 23 25
14 16 18 20 22 24

01 03 05 07 09 11 13
02 04 06 08 10 12

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

ZONA: 22 Residencia Monte da Condesa

97
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

TAREA: Polilneas. Registra las coordenadas de cada uno de los 15 nodos que estn marcados
en la ampliacin del plano adjunto que corresponden a una escultura. La escultura tiene tres
partes, le corresponden 5 a cada parte (dos extremos, el centro y dos intermedio). Identifcalos
con el cdigo de la zona (i.e. 22) seguido de un guin bajo y el nmero de cada nodo indicado
en el plano (sitate con atencin para no confundir el 1 con el 5), p.e. 22_01.
Para los 5 primeros nodos (i.e. 01-05) toma 10 veces las coordenadas para cada uno de ellos.
Slo es necesario que identifiques la primera coordenada de cada rbol, y posteriormente pulsa
9 veces seguida la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne
un cdigo por defecto.

NOTAS:

15

03
14 02 04
06
07
11
01
13
12 08 05
10 09

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

ZONA: 23 Pavilln Polideportivo e Monte da Condesa


TAREA: Lnea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 16 nodos del camino
marcado en el plano adjunto(de forma ordenada y consecutiva). Identifcalos con el cdigo de la
zona (i.e. 23) seguido de un guin bajo y el nmero de cada nodo indicado en el plano (sitate
con atencin para no confundir el 1 con el 23), p.e. 23_01.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

98
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.

01

11
15

12 07
16 14 08
10
02
13 09

06

04
03 05
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

99
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 23B Pavilln Polideportivo e Monte da Condesa


TAREA: Polgono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras
para hacer un polgono que comprenda la masa de rboles compuesta por acacias (Acacia
melanoxylon) que est marcado en el plano adjunto. Identifica el primer punto el cdigo 23B_I
(letra I de inicio). A continuacin pulsa tantas veces como necesites la tecla mark o anloga,
sin incluir ningn cdigo de forma que se le asigne el cdigo por defecto, hasta llegar de nuevo
al punto de inicio marcando el ltimo punto introducido en el GPS como 23B_F.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

100
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 24 Facultade de Fsicas


TAREA: Puntos. Registra las coordenadas de cada uno de los 15 madroos (Arbutus unedo)
que estn marcados en el plano adjunto. Identifcalos con el cdigo de la zona (i.e. 24) seguido
de un guin bajo y el nmero de cada rbol indicado en el plano (sitate con atencin para no
confundir el 01 con el 15), p.e. 24_01.

NOTAS: Elige una orientacin del tronco del rbol para tomar la coordenada y mantenla en el
resto de los rboles. En el plano se representan dos rboles que ya no existen. No confundas los
madroos con los tejos.
Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

08
07
06
09 05
10 04
11 03
12 02
01
13
14
15

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

101
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 25 Facultades de Filosofa, Psicoloxa e CC. Da Educacin


TAREA: Lnea (camino). Registra las coordenadas de cada uno de los 10 nodos del camino
marcado en el plano adjunto(de forma ordenada y consecutiva). Identifcalos con el cdigo de la
zona (i.e. 25) seguido de un guin bajo y el nmero de cada nodo indicado en el plano, p.e.
25_01.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Camina y captura las coordenadas por el centro del camino y/o acera.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

01 10

04 05 08
09

02
03 06 07

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

102
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ZONA: 26 Almacn, Servicios e Animalario


TAREA: Polgono de lados irregulares. Registra tantas coordenadas de puntos como quieras
para hacer un polgono que comprenda la masa de rboles compuesta por acacias, pinos y
robles (Acacia melanoxylon, Pinus pinaster y Quercus robur) que est marcado en el plano
adjunto. Identifica el primer punto el cdigo 26_I (letra I de inicio). A continuacin pulsa tantas
veces como necesites la tecla mark o anloga, sin incluir ningn cdigo de forma que se le
asigne el cdigo por defecto, hasta llegar de nuevo al punto de inicio marcando el ltimo punto
introducido en el GPS como 26_F.
Realiza el mismo tiempo un track o anlogo.

NOTAS: Emplea la proyeccin ortogonal de las copas para establecer el borde de la masa.

Fuente de la cartografa: http//www.usc.es/flora/index.html

PROBLEMAS OBSERVADOS (prdida de cobertura, baja disponibilidad de satlites,


dudas, etc.)

103
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

2.2. SESIN SEGUNDA:


Sigue las indicaciones del profesor en el aula de informtica.

2.3. SESIN TERCERA:


Dirgete mediante el empleo del GPS en navegacin a cada una de las coordenadas del archivo que se
habr cargado previamente. Dicha coordenada ser el centro de una circunferencia de radio 20m en la
que se establecer como parcela de trabajo. Seala la localizacin de dicha coordenada en el plano del
apartado 3.3. Si la coordenada coincide con un edificio o zona no practicable nicamente localzala en
el mapa de la seccin 3.3 y busca la siguiente coordenada.
Cuando sea posible, en las parcela proceders a tomas los datos inmediatos, y contars el nmero de
rboles con un DBH (dimetro del tronco del rbol a la altura del pecho, i.e. 130cm) mayor de 7 cm (22
cm de dimetro). Cuando una cepa se bifurque a una altura inferior a la del DBH se contarn todos los
pies superiores a 7 cm de DBH.

104
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

3. RESULTADOS

3.1. SESIN PRIMERA:


Los resultados de la primera parte de la prctica sern los archivos obtenidos al descargar el GPS tras
realizar las tareas sealadas en la seccin 2.1.

3.2. SESIN SEGUNDA:


Los resultados de la segunda parte de la prctica sern los archivos requeridos tras editar los archivos
obtenidos con el GPS en la primera parte de la prctica. Dichos archivos se enviarn como un tranajo a
la USC Virtual, y consistirn en temas de ArcGis (.shp) correspondientes los diferentes tipos de
elementos empleados: polgono de lados regulares, polgonos de lados irregulares, polgonos mltiples,
lneas, polilneas y puntos. Del mismo modo se crear un archivo de puntos que ser utilizado en la
ltima sesin de la prctica.
Adems en la pgina de la USC Virtual se colgarn dos trabajos referidos a los errores de los GPS, que
sern explicados durante esta sesin. Para ello el alumno deber de consultar la informacin que se le
proporcione en dicha pgina.

3.3. SESIN TERCERA:


Cuando sea posible, de acuerdo con lo especificado en el material y mtodos, rellena uno de los
estadillos adjuntos para cada parcela.
Adems en la pgina de la USC Virtual se colgar un trabajos referido a la estima del nmero de
rboles del campus, calculado de acuerdo al muestreo realizado (para ello en la segunda sesin
necesitars calcular la extensin del campus).

105
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106
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust. (%):
Est. Cob.herbac. (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

107
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

108
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

109
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

110
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

111
MTODO CIENTFICO Y TCNICAS DE MUESTREO

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

ID Parcela: Tamao parcela:


Fecha:
Coordenada X: Coordenada Y:
Pendiente: Orientacin:
Altitud: Est.Pedregos. (%):
Est.Cob.arbrea (%): Est.Cob.arbust (%):
Est. Cob.herbac (%):
N de rboles: N de pies ha-1:

112
8. CONTENIDOS DE
BIBLIOTECA

(cdigo calendario de prcticas: BIB)


CONTENIDOS DE BIBLIOTECA

PRCTICAS

CATLOGO DE LA BUSC
1. Haz una bsqueda en el Catlogo de la BUSC de libros de Botnica general.

1. N de registros:

2. Limita por ubicacin Biologa y lengua castellano.


1. N de registros:

3. Selecciona y guarda los registros que respondan a libros de botnica general publicados despus del ao
2000
1. N de registros:

4. Busca un artculo de revista sobre lquenes de Portugal escrito por Graciela Paz Bermdez y Regina
Carballal Durn y publicado en la revista Nova Hedwigia

1. Seleccinalo y gurdalo.
2. Exporta los registros guardados a tu correo electrnico.
3. Tenemos el artculo en papel, dnde?
4. Busca en SFX si tenemos acceso al texto completo del artculo

5. Elabora una bibliografa con los documentos previamente seleccionados libros y artculos- empleando el
formato de cita bibliogrfica Harvard o Vancouver y lo envas a la USC Virtual

6. Busca en el Catlogo cuntas ediciones tenemos de esta obra en la BUSC

Hickman, Cleveland P. Principios integrales de zoologa

115
CONTENIDOS DE BIBLIOTECA

BASES DE DATOS
7. Entra en la base de datos del CSIC ICYT, y expn los pasos que diste para entrar.

8. Busca artculos sobre algas de agua dulce relacionados con Galicia a partir del ao 1998

1. N de registros:
2. tienen enlace al texto completo? Cuntos?
3. Tenemos las revistas en la Biblioteca Universitaria, dnde?
4. Si queremos consultar los artculos en papel cmo tenemos que hacer?

Nota:

116