INGENIERA GENTICA

Profesor: Dr. Job Al Diaz Hernndez

Alumnos:
Chavarra Telles Omar Mauricio
Chi Can Steven Ignacio
Hernndez Hernndez Alvaro
Lpez Cruz Leonardo Daniel
Uitz Can Basti Isabel

PRCTICA #2: SECUENCIACIN DE NUCLETIDOS EN UN

GEN (SISTEMA FASTO) Y ELABORACIN DE PRIMERS (Fast
PCR)

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA 6A
Introduccin
La Ingeniera Gentica (I.G.), conocida como tecnologa del ADN recombinante in vitro, se
caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de
organismos distintos que constituyen la informacin gentica heredable que forman la base
de los programas de desarrollo de los seres vivos (de procariotas, de eucariotas en
el ncleo celular, y en los plsmidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las plantas);
creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que
ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro
provecho. No cabe ninguna duda de que la tcnica ms revolucionaria de los ltimos 15
aos ha sido la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la
propia Ingeniera gentica y a toda la biologa molecular.
Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se van a
unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN de la PCR. La
seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en la reaccin en cadena de la
polimerasa. De este paso depende el xito en el laboratorio.
Las concentraciones ptimas de los primers son generalmente entre 0.1 y 0.5 M. Altas
concentraciones de primer pueden promover mispriming y acumulacin de producto no
especfico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado independiente
llamado dmero de primer. Los productos no especficos y los dmeros de primers son por
si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la enzima, dNTPs
y primers, resultando en un bajo rendimiento del producto deseado.
Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5 o mismatches para incorporar
sitios de enzimas de restriccin, un codn de inicio ATG, o secuencias promotoras en la
secuencia blanco. Pueden ser usados primers degenerados para extraer genes nuevos en
base a su similitud o su secuencia de aminocidos.
La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Los primers deben
ser elegidos de modo que tengan una secuencia nica dentro del DNA que ser amplificado.
Un primer diseado con una secuencia altamente repetida dar lugar a productos no
deseados. Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola
clona de una biblioteca genmica.
Los primers necesitan ser diseados con menos de 3 pares de bases de homologa entre
ellos. Si un primer tiene tal regin de homologa se formarn estructuras parciales de doble
cadena que interferirn con el alineamiento. Si la homologa ocurre en el extremo 3' de
cualquier primer, ocurrir la formacin de dmeros de primer que, a menudo, prevendr la
formacin del producto deseado por competicin.
a composicin base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La secuencia
de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de poliC que
pueden promover el reconocimiento no especfico. Las regiones poliA y poliT deben
tambin ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto puede
bajar la eficacia de la amplificacin. El primer tendr un contenido de G/C del 50% y ~20
bases de largo. Esto pondr los Tm en la gama de 56C - 62C.
Las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido
de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto
Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin
investigadora a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos
genomas de animales, plantas y microorganismos.
Objetivos

Aplicar el uso de herramientas digitales para el desarrollo de cebadores in silico

Reforzar el aprendizaje terico sobre las caractersticas de los primers por medio
de su realizacin

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
SECUENCIACIN DE NUCLETIDOS DEL GEN PITX2 CAUSANTE DE
AMILOBLASTOMAS.
-Homo sapiens PITX2 adyacente no codificante RNA (PANCR), transcripcin
variante 1, largo no codificante RNA:
CCCATCCAGCGAGAGAAACCTAGCTCCCAGAGCCGGTGCAGTCAGTCCCCTCGCCCCTCCCGCCCCTGCA
CGGGTCCCCCTCTAGCCGTCGCTGCAACCACCACCTCGGTTCCACTCAACCGATTTTTGCTGCATGTCAA
CACTTATTACCGATCACTCATTCTGGGAGAAGACAACCGTCATATCATGTCATGAAGATACTCATGCAGT
CCTATGGAGAATTTCATTGGTAAGAAACTGAGCTAGAATGAACTTGACAGCCTTGTGAGAGAGCCATCTT
AGAAGCAGACCTTCAGCCTCAGACAGCTTTCAGAGGATTGTAGCCCCAGCTGAAACATCAACCACAATCT
CATGAGAGACACTGAACCAGAATCACCCAGCCAAGCTGTTCCCAAATTCCTGAGCCATAGAAACTGTGTG
AGATAATAAATGTTTATTGTTGTTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

5'-GCTGCATGTCAACACTTATT-3'
3'-CGACGTACAGTTGAGAATAA-5'
PrimerID Sequence(5'-3') Length(nt) Tm(C) dG(kcal/mol) Tm_3'end(C)
CG(%) Linguistic_Complexity(%) Primer_Quality(%)
1
1F1_1_10-31 cgagagaaacctagctcccaga 22 57.0 -27.6 36.0 54.5 80 80
1F2_1_104-124 cctcggttccactcaaccgat 21 58.3 -27.6 35.6 57.1 87 86
1F3_1_108-131 ggttccactcaaccgatttttgct 24 58.1 -29.9 33.9 45.8 90 80
1F4_1_116-140 tcaaccgatttttgctgcatgtcaa 25 58.2 -31.1 37.7 40.0 81 80
1F5_1_144-168 ttattaccgatcactcattctggga 25 54.9 -28.8 33.2 40.0 84 80
1F6_1_161-183 ttctgggagaagacaaccgtcat 23 57.2 -28.6 36.1 47.8 93 87
1F7_1_163-187 ctgggagaagacaaccgtcatatca 25 57.9 -30.5 33.0 48.0 91 80
1F8_1_190-214 tcatgaagatactcatgcagtccta 25 54.7 -28.7 34.3 40.0 86 84
1F9_1_194-218 gaagatactcatgcagtcctatgga 25 55.5 -29.0 32.3 44.0 93 79
1F10_1_197-221 gatactcatgcagtcctatggagaa 25 55.5 -29.0 30.5 44.0 93
75
1F11_1_239-263 tgagctagaatgaacttgacagcct 25 57.5 -30.4 37.3 44.0 81
81
1F12_1_242-266 gctagaatgaacttgacagccttgt 25 57.3 -30.2 37.9 44.0 84
84
1F13_1_247-270 aatgaacttgacagccttgtgaga 24 56.2 -28.9 36.9 41.7 81
75
1F14_1_258-279 cagccttgtgagagagccatct 22 58.1 -28.2 35.4 54.5 75
75
1F15_1_260-283 gccttgtgagagagccatcttaga 24 57.8 -29.6 31.9 50.0 76
76
1F16_1_269-292 gagagccatcttagaagcagacct 24 57.5 -29.4 36.3 50.0 81
80
1F17_1_272-295 agccatcttagaagcagaccttca 24 57.1 -29.3 36.9 45.8 83
83
1F18_1_275-299 catcttagaagcagaccttcagcct 25 58.1 -30.6 38.0 48.0 79
79
1F19_1_306-328 gctttcagaggattgtagcccca 23 58.4 -29.1 36.6 52.2 90
87
1F20_1_313-334 gaggattgtagccccagctgaa 22 58.1 -28.1 43.1 54.5 88
80
1F21_1_315-337 ggattgtagccccagctgaaaca 23 58.9 -29.4 36.1 52.2 90
87
1F22_1_319-340 tgtagccccagctgaaacatca 22 57.6 -28.1 32.9 50.0 88
80
1F23_1_360-381 cactgaaccagaatcacccagc 22 57.9 -27.9 36.9 54.5 75
75
1F24_1_370-390 gaatcacccagccaagctgtt 21 57.3 -27.0 38.9 52.4 87
87
1F25_1_386-408 ctgttcccaaattcctgagccat 23 57.0 -28.3 36.7 47.8 80
80
1F26_1_387-411 tgttcccaaattcctgagccataga 25 57.4 -30.3 33.2 44.0 86
81
1R1_1_401-425 tatctcacacagtttctatggctca 25 55.1 -28.9 32.5 40.0 77 77
1R2_1_397-421 tcacacagtttctatggctcaggaa 25 57.4 -30.3 36.7 44.0 86 81
1R3_1_385-406 ggctcaggaatttgggaacagc 22 58.4 -28.2 36.4 54.5 82 77
1R4_1_379-400 ggaatttgggaacagcttggct 22 57.7 -27.9 38.9 50.0 75 75
1R5_1_369-389 acagcttggctgggtgattct 21 57.8 -27.3 33.7 52.4 85 75
1R6_1_361-382 ggctgggtgattctggttcagt 22 58.5 -28.3 33.2 54.5 78 78
1R7_1_329-351 gagattgtggttgatgtttcagc 23 54.8 -27.1 32.9 43.5 76 76
1R8_1_318-340 tgatgtttcagctggggctacaa 23 58.0 -29.1 37.8 47.8 90 75
1R9_1_315-336 gtttcagctggggctacaatcc 22 57.9 -27.9 35.6 54.5 90 87
1R10_1_310-330 gctggggctacaatcctctga 21 57.7 -27.1 32.3 57.1 82
79
1R11_1_299-323 ctacaatcctctgaaagctgtctga 25 56.1 -29.4 34.0 44.0 84
80
1R12_1_280-301 tgaggctgaaggtctgcttcta 22 56.5 -27.5 33.6 50.0 75
75
1R13_1_269-292 aggtctgcttctaagatggctctc 24 57.5 -29.4 34.1 50.0 81
81
1R14_1_257-278 gatggctctctcacaaggctgt 22 58.4 -28.3 37.9 54.5 78
78
1R15_1_249-271 ctctcacaaggctgtcaagttca 23 56.7 -28.2 31.6 47.8 76
76
1R16_1_206-230 ccaatgaaattctccataggactgc 25 56.0 -29.2 35.3 44.0 91
86
1R17_1_202-226 tgaaattctccataggactgcatga 25 55.6 -29.2 37.1 40.0 91
82
1R18_1_199-223 aattctccataggactgcatgagta 25 54.9 -28.8 33.3 40.0 95
81
1R19_1_196-220 tctccataggactgcatgagtatct 25 55.9 -29.3 30.4 44.0 88
75
1R20_1_161-183 atgacggttgtcttctcccagaa 23 57.2 -28.6 33.0 47.8 93
80
1R21_1_158-180 acggttgtcttctcccagaatga 23 57.2 -28.6 33.2 47.8 93
81
1R22_1_114-137 acatgcagcaaaaatcggttgagt 24 57.9 -30.0 34.2 41.7 86
78
1R23_1_108-130 gcaaaaatcggttgagtggaacc 23 57.4 -28.6 34.8 47.8 90
80
1R24_1_14-34 ggctctgggagctaggtttct 21 57.3 -26.9 32.1 57.1 79 79
1R25_1_4-26 gagctaggtttctctcgctggat 23 57.8 -28.9 38.2 52.2 83 80

PrimerID Sequence(5'-3') Tm(C) Primer_Quality(%) PCR_Fragment_Size(bp)

Topt(C)
1F6_1_161-183 ttctgggagaagacaaccgtcat 57.2 87
1R9_1_315-336 gtttcagctggggctacaatcc 57.9 87 176 62

1F6_1_161-183 ttctgggagaagacaaccgtcat 57.2 87

1R16_1_206-230 ccaatgaaattctccataggactgc 56.0 86 70 60

1F2_1_104-124 cctcggttccactcaaccgat 58.3 86

1R9_1_315-336 gtttcagctggggctacaatcc 57.9 87 233 63

1F2_1_104-124 cctcggttccactcaaccgat 58.3 86

1R16_1_206-230 ccaatgaaattctccataggactgc 56.0 86 127 61

1F12_1_242-266 gctagaatgaacttgacagccttgt 57.3 84

1R9_1_315-336 gtttcagctggggctacaatcc 57.9 87 95 62

1F8_1_190-214 tcatgaagatactcatgcagtccta 54.7 84

1R9_1_315-336 gtttcagctggggctacaatcc 57.9 87 147 60

1F17_1_272-295 agccatcttagaagcagaccttca 57.1 83

1R9_1_315-336 gtttcagctggggctacaatcc 57.9 87 65 61

1F6_1_161-183 ttctgggagaagacaaccgtcat 57.2 87

1R17_1_202-226 tgaaattctccataggactgcatga 55.6 82 66 60

1F6_1_161-183 ttctgggagaagacaaccgtcat 57.2 87

1R18_1_199-223 aattctccataggactgcatgagta 54.9 81 63 59

1F19_1_306-328 gctttcagaggattgtagcccca 58.4 87

1R2_1_397-421 tcacacagtttctatggctcaggaa 57.4 81 116 62

DISCUSIN
La PCR se ha convertido en una herramienta indispensable en el arsenal de la ciencia
biolgica. PCR ha alterado el curso de la ciencia que permite a los bilogos acceder hacia
el poder sobre los genomas, y hacer que los genes hbridos tengan nuevas funciones,
permitiendo que las pruebas clnicas sean mucho ms especficas y precisas, obteniendo
nuevos conocimientos sobre los genomas y la diversidad, as como el saber acerca de los
genes de clonacin para el anlisis bioqumico. La aplicacin de la PCR est limitada slo
por la imaginacin de los cientficos que ejercen su poder total. Hay muchos libros y
artculos que describen los nuevos usos especializados de la PCR, y muchos ms que se
desarrollar en la prxima generacin de la ciencia biolgica. Sin embargo,
independientemente de los enfoques previstos, el marco fundamental se ha mantenido el
mismo. PCR, en toda su grandeza, es una aplicacin in vitro para generar grandes
cantidades de un segmento especfico de ADN. Y, por ltimo, tenemos que tener en cuenta
que, el diseo experimental de los primers para PCR requiere de pensar muy bien cada
etapa de la elaboracin y tener por supuesto paciencia, ya que cuando un parmetro de la
PCR cambia puede afectar todo lo ya hecho con anterioridad, y solo hay que seguir
rediseando los cebadores e intentar de nuevo.
CONCLUSIN
A lo largo de esta prctica se pudo aprender acerca de la importancia de la PCR en las
distintas disciplinas de la investigacin, de la salud, entre otras; tales disciplinas usan la
PCR para:
1. Usar secuencias repetidas en genoma como marcadores genticos
2. Generar sondas hibridas especficas para cromosoma
3. Estudiar evolucin de secuencias de gen y efectos de variabilidad de secuencia en
funcin del cromosoma
4. Amplificar e identificar secuencias blanco in situ.
Y a esto recae la ineludible importancia de elaborar primers que inicien la PCR, ya que, si
se logra crear dichos primers a la perfeccin segn lo enseado, la accin es hibridar la
regin complementaria del ADN molde, que se desea amplificar y que propician el inicio de
la reaccin de elongacin por la Taq ADN polimerasa.
Por tanto, s cree que, dado que los resultados obtenidos para Homo sapiens PITX2
adyacente no codificante RNA (PANCR), transcripcin variante 1, largo no codificante RNA,
se logr aplicar el uso de estas herramientas digitales para su desarrollo y amplificacin
digital y en ipso facto, el reforzar el aprendizaje terico sobre las caractersticas de los
primers al elaborarlos in slico.
Bibliografa
1. Bustin S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription
polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 2000.
20/06/2017
2. "Electronic PCR". NCBI - National Center for Biotechnology Information. 20/06/2017
3. S. Patricia, Stock; John, Vanderberg; Itamar, Glazer; Noel, Boemare
(2009). "Primers development and virus identification strategies". Insect Pathogens:
Molecular Approaches and Techniques. CAB International. 21/06/2017