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ESTANDARIZACIN DEL MTODO ANALTICO PARA LA DETERMINACIN

MERCURIO TOTAL (Hg) EN PECES MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRA DE


ABSORCIN ATMICA (AA) VAPOR FRO (CV)

OBJETIVOS

Objetivo General:

Estandarizar el mtodo analtico para la determinacin del mercurio total presente en peces.

Objetivos Especficos:

Aprender la tcnica de lavado de material del laboratorio adecuada para la


estandarizacin del mtodo
Utilizar la tcnica de Absorcin Atmica Vapor Fro para la determinacin de la
cantidad de mercurio.
Realizar determinaciones de Hg en blancos y en soluciones preparadas con material
de referencia
Comparar los resultados obtenidos utilizando 2 tcnicas de digestin acida; plancha
abierta y microondas

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Materiales

6 tubos TFM tefln, con camisas y tapas


26 tubos de vidrio de 100 ml, con tapones de goma
Cachinas
2 pipetas ( de 2 ml y 10 ml)
Micropipeta (Accumax) con tips descartables
4 matraces aforados de 25 ml
2 matraces aforados de 100 ml
Gotero
2 vasos de precipitado
Piceta
Esptula
Tubos de plstico con tapas

Reactivos

Agua Desionizada
Agua Acidificada (HNO3 3% (v/v))
Agua Acidificada (HCl 5% (v/v))
cido Clorhdrico 37% (v/v) (Merck)
cido Ntrico 65% (v/v) (Merck)
cido Sulfrico 98% (v/v) (Merck)
Perxido de Hidrogeno 30% (v/v) (Merck)
Boro Hidruro de Sodio (Merck)
Hidrxido de Sodio (Merck)
Permanganato de Potasio 5% (p/v)
Solucin Stock de Mercurio 1000 g/ml en 2% de HNO3
Material de Referencia DORM 4
Material de Referencia BCR
Muestras liofilizadas de pescado

Equipos

Digestor Microondas (Ethos 900, Milestone) con rotor MDR- 1000/6S


Digestor de Plancha (Kjeldahl, Quimib)
Espectrofotmetro (Aanalyst 700, Perkin Elmer) acoplado con un generador de
hidruros (FIAS 100, Perkin Elmer)
Balanza Analtica (Kern 0.0001)

METODOLOGA EXPERIMENTAL

En la estandarizacin del mtodo analtico para la determinacin mercurio total (Hg) en


peces mediante espectrofotometra de absorcin atmica (AA) vapor fro (CV) exigi
diferentes condiciones de trabajo las cuales se detallan a continuacin.

Lavado de material

El lavado del material de trabajo para la digestin de las muestras se realiz utilizando una
solucin de cido clorhdrico (HCl) aproximadamente al 5%, en esta solucin se dej el
material durante 24 horas, posteriormente se lo saco y se enjuago con agua desionizada, se
dej secar.

Digestin de muestras de peces

La digestin de las muestras de peces se realiz mediante digestin acida (HNO3:H2O2) en


dos mtodos: digestin en microondas y digestin en plancha, estos mtodos de digestin
se llev a cabo bajo diferentes condiciones

Digestin en microondas

Se pesa la muestra de pescado a digerir (0.25g) en los vasos de digestin utilizando una
balanza analtica (Kern 0.0001) posteriormente se aade 2 ml de perxido de hidrogeno y
6 ml de cido ntrico (HNO3) al 65%, se introduce al microondas (Ethos 900, Milestone)
(Figura 1) y se procede con la digestin como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1:
Programa de digestin asistida por microondas Ethos 900/Milestone para muestras de pescado

Paso Tiempo (min) Potencia (W)


1 1 250
2 5 0

3 5 250
4 5 400
5 5 650

Ventilacin 5

Figura 1:
Digestor microondas Ethos 900/ Milestone (CASA)

La digestin se realiza en un rotor MDR- 1000/6S en vasos de TFM tefln qumicamente


modificado para optimizar sus propiedades mecnicas y su respuesta frente a altas
presiones y temperaturas. La potencia y la temperatura mxima del digestor son 100 Bar y
300 C, respectivamente.

Terminado el programa de digestin se procede a enfriar las muestras haciendo recircular


agua durante aproximadamente 15 a 20 minutos finalmente se procede a aforar las muestras
digeridas con agua des-ionizada a 25 ml. Terminado este proceso las muestras ya se
encuentran listas para realizar las lecturas en el espectrofotmetro de absorcin atmica.

Digestin en plancha

Para digestin en plancha se utiliz tubos de ensayo de aproximadamente 100ml los


mismos que fueron adaptados especficamente para dicha digestin.

La masa a digerir es la misma que en microondas (0.25g) que se pesa en los mismos tubos
de ensayo para evitar prdidas al pasar de un recipiente a otro, para esto se necesita la
ayuda de un matraz Erlenmeyer para que sostenga el tubo.
El programa que se sigue para la digestin completa de las muestras se presenta en la Tabla
2.
Tabla 2:
Programa para la digestin de muestras de pescado en plancha

Paso Temperatura (C) Tiempo (h)


1 T ambiente 12-16
2 65 1
3 85 1
4 100 1
5 110 1
6 115 1

Figura 2: Figura 3:
Muestras durante la digestin en plancha Muestras una vez terminada la digestin

A la conclusin de este programa las muestras deben estar completamente digeridas,


posteriormente se deja enfriar las muestras durante toda la noche y se enrasa con agua des -
ionizada a un volumen de 25 ml y se deja listo para la lectura con el espectrofotmetro.

Una variante que se puede hacer en la digestin en plancha es utilizar para la digestin una
mezcla acida de cido ntrico cido sulfrico (H2SO4 - HNO3)

La conservacin de las muestras, antes de realizar la lectura, se realiza por refrigeracin a


bajas temperaturas.
Figura 4: Figura 5:
Muestras antes de la digestin Muestras digeridas

Lectura de muestras
Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada.

Para realizar la lectura de las muestras digeridas lo primero que se realizo fue una una curva
de calibracion para lo cual se utiliz una solucin stock de Hg de 1000 g/ml en 2% de
HNO3 (Perkin Elmer N # 9300133) (Figura 6) como solucin stock para preparar una
solucin intermedia de 100g/L utilizando agua desionizada para diluir, a partir de la cual
se prepararon los estndares de la curva de calibracin mediante las diluciones adecuadas.
Las diluciones se hicieron en matraces aforados de 100, 50, y 25 ml con una solucin al
3% v/v de HNO3 (HNO3 65% MERCK), en concentraciones de 5,10, 20 y 50 g/L a los
que posteriormente se adiciono 3 gotas de KMnO4 al 5% (p/v) (KMnO4 Merck) para
preservar el elemento en solucin. Para la operacin se utiliz una micropipeta de marca
Accumax con tips descartables.

Figura 6:
Espectrofotmetro (Aanalyst 700, Perkin Elmer), con
generador de hidruros (FIAS 100, Perkin Elmer)
Preparacin de reactivos

La solucin transportadora fue preparada con 7.5mL de HCl 37% (Merck ) enrasados a un
volumen final de 500 mL con agua desionizada.

La solucin reductora se prepar disolviendo 1 g de NaBH4 (Merck) y 0.25 g de NaOH


(Merck) en 500 mL de agua desionizada.

Una vez concluido con la preparacin de todo el material y los reactivos necesarios se
estandarizo los caudales en el espectrofotmetro tanto de la solucin reductora como
tambin de la solucin transportadora 5 y 10 ml/min, respectivamente. Inmediatamente se
prosigui con la lectura de las muestras estndar donde se ley la absorbancia en funcin
de la concentracin y de esta manera se obtiene la curva patrn.

Finalmente se ley las muestras de peces adicionando previamente 3 gota de KMnO4 al 5%


(p/v) (KMnO4 Merck) donde se obtuvo la concentracin de mercurio de las muestras (en
ppb).

RESULTADOS Y DISCUSIN

Curva de Calibracin

En la Figura 7 se muestra la curva de calibracin usada para la determinacin de la


concentracin de las muestras. En la grfica se puede ver la absorbancia que tienen las
soluciones estndar preparadas.
Figura 7
Curva de Calibracin, Absorbancia vs. Concentracin
de Hg de las Soluciones Estndar

0,7

0,6

0,5
Absorbanci

0,4

0,3
a

0,2

0,1

0
0 10 20 30 40 50 60

Conc. de Hg (ppb)
r = 0.999994
A = 0.00128
B = 0.01246

La muestra estndar de Hg 20 ppb no fue incluida en la curva debido a que no presentaba


una absorbancia que permita una buena correlacin, debido a algn error al momento de la
preparacin.
Lectura de muestras

Los valores de concentracin de Hg encontrados para las muestras se detallan en la Tabla 4,


expresados de forma puntual para cada muestra. Las muestras se encuentran ordenadas
segn la especie. El clculo se realiz utilizando la siguiente formula:

=
Tabla 4:
Valores de concentracin de las muestras

Concentracin de
Nmero Especie Cuenca Lugar
Hg [g/g]

1 Colossoma macropomum Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,31

2 Colossoma macropomum Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,04

3 Colossoma macropomum Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,48

4 Colossoma macropomum Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,06

5 Colossoma macropomum Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,24

6 Colossoma macropomum Madre de Dios Laguna Santa Mara 0,05

7 Colossoma macropomum Beni Laguna Espejos 0,28

8 Hoplias malabaricus Madre de Dios Limon 2,42

9 Hoplias malabaricus Madre de Dios Limon 2,12

10 Hoplias malabaricus Madre de Dios Limon 2,11

11 Hoplias malabaricus Beni Laguna Espejos 0,62

12 Mylossoma duriventre Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,07

13 Mylossoma duriventre Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,17

Potamorhina
14 Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,42
altamazonica/latior
Potamorhina
15 Madre de Dios Laguna Mentiroso 1,35
altamazonica/latior
Potamorhina
16 Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,35
altamazonica/latior
Potamorhina
17 Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,34
altamazonica/latior
Potamorhina
18 Madre de Dios Limon 0,07
altamazonica/latior
Potamorhina
19 Madre de Dios Limon 0,77
altamazonica/latior
Potamorhina
20 Beni Laguna Espejos 0,05
altamazonica/latior

21 Prochilodus nigricans Madre de Dios Laguna Bombolito 0,11

22 Prochilodus nigricans Madre de Dios Laguna Bombolito 1,18

23 Prochilodus nigricans Madre de Dios Laguna Santa Mara 0,40

24 Prochilodus nigricans Beni Beni 0,08

25 Prochilodus nigricans Beni Beni 0,82

26 Prochilodus nigricans Beni Beni 0,18

27 Prochilodus nigricans Beni Beni 0,04

28 Pseudoplatystoma tigrinum Madre de Dios Arroyo San Miguel 1,01

29 Pseudoplatystoma tigrinum Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,87

30 Pseudoplatystoma tigrinum Madre de Dios Laguna Mentiroso 2,36

31 Pseudoplatystoma tigrinum Madre de Dios Limon 1,48

32 Pseudoplatystoma tigrinum Beni Beni 0,58

33 Pseudoplatystoma tigrinum Beni Beni 0,17

34 Pseudoplatystoma tigrinum Beni Beni 0,49

35 Pseudoplatystoma tigrinum Beni Beni 0,96

36 Piaractus brachypomus Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,38

37 Piaractus brachypomus Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,32

38 Piaractus brachypomus Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,26


39 Schizodon fasciatus Madre de Dios Arroyo San Miguel 0,16

40 Triportheus angulatus Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,33

41 Triportheus angulatus Madre de Dios Laguna Mentiroso 1,20

42 Triportheus angulatus Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,30

43 Triportheus angulatus Madre de Dios Laguna Mentiroso 0,74

44 Triportheus angulatus Madre de Dios Limon 0,29

45 Triportheus angulatus Madre de Dios Limon 0,24

46 Hypopthalmus endentatus Beni Beni 0,54

47 Hypopthalmus endentatus Beni Beni 0,43

48 Pseudoplatystoma punctifer Beni Beni 1,05

49 Pseudoplatystoma punctifer Beni Beni 1,33

50 Pseudoplatystoma punctifer Beni Beni 0,16

51 Pseudoplatystoma punctifer Beni Beni 0,55

52 Pseudoplatystoma punctifer Beni Beni 3,73

53 Pseudoplatystoma punctifer Beni Beni 0,92

54 Pygocentrus nattereri Beni Beni 0,96

55 Pygocentrus nattereri Beni Beni 1,53

56 Pygocentrus nattereri Beni Beni 1,20

57 Pygocentrus nattereri Madre de Dios Laguna Santa Mara 0,48

Puede notarse que se presenta variacin en los niveles de concentracin de las muestras de
la misma especie, esto se da debido a muchos factores como la edad del pez, el tamao, el
peso, el lugar donde viven, etc.

En la Tabla 5 se muestra los intervalos de concentracin que presentan las especies, su


nivel trfico, y el lugar de donde se extrajeron las muestras.
Tabla 5:
Intervalo de concentraciones para cada especie segn al lugar

Nombre Cientfico Nivel Trfico Intervalo de


Nombre Comn Tipo de Alimentacin Lugar N Media
(trophs) Conc. [g/g]
Colossoma macropomum Pac 2,0 Herbvoro Laguna Mentiroso 5 0,04 - 0,48 0,23

Hoplias malabaricus Bentn 4,5 Piscvoro Limon 3 2,11 - 2,42 2,21

Mylossoma duriventre Pacupeba 2,0 Herbvoro Laguna Mentiroso 2 0,07 -0,17 0,12

Piaractus brachypomus Tambaqu 2,5 Herbvoro Beni 3 0,26 - 0,38 0,32


Potamorhina
Sabalina 2.0 Detritvoro Laguna Mentiroso 4 0,34 - 1,35 0,61
altamazonica/latior
Prochilodus nigricans Sbalo 2.4 Detritvoro Beni 4 0,04 - 0,82 0,28

Pseudoplatystoma punctifer Surub 4,5 Piscvoro Beni 6 0,16 - 3,75 1,29

Pygocentrus nattereri Piraa roja 3,7 Piscvoro Beni 3 0,96 - 1,53 1,23

Schizodon fasciatus Boga 2,0 Herbvoro Arroyo San Miguel 1 0,16 0,16

Triportheus angulatus Sardina 2,7 Invertvoro Laguna Mentiroso 4 0,30 - 1,20 0,64

Pseudoplatystoma tigrinum Simicuyo 4,5 Piscvoro Beni 4 0,17 - 0,96 0,55

Hypophthalmus sp Pez Vela 3,1 Zooplanctvoro Beni 2 0,43 - 0,54 0,49


Debido a la variabilidad de concentraciones, se trabaja con intervalos y con una media para
expresar el nivel de contaminacin a la q est expuesta cada especie, como se muestra en la
Figura 8.
Figura 8:
Concentracin Promedio de Hg, segn especie
2,5
Conc. de Hg (ug/g)

1,5

0,5

a a o b ja o
c
t
n
eb qu lin al ro ga na uy
la
Pa n p a a b u ru
a Bo rdi ic Ve
Be acu b b S S Sa Sim z
P Ta
m Sa i ra Pe
P
Especie

Puede notarse que las especies con mayor concentracin promedio de mercurio son
aquellas que tienen el nivel trfico mas alto (Carnvoras), y va bajando a medida que el
nivel trfico disminuye (Herbvoras), esto es debido a la bioacumulacin que se da en las
especies. Esto puede apreciarse mejor en la Figura 9, donde se muestra el aumento de la
concentracin promedio de Hg en funcin del nivel trfico para las especies del Ro Beni.
Figura 9:
Relacin entre el Nivel Trfico y la Concentracin de
Hg en peces del Ro Beni en la Cuenca Beni

1,4
4,5; 1,29
3,7; 1,23
1,2
1
Conc. de Hg

0,8
(ug/g)

0,6
3,1; 0,49

0,4
2,4; 0,28

0,2
0
2,4 2,9 3,4 3,9 4,4
Nivel Trfico
Ro Beni Nivel Permitido Nivel Mximo
Se observa que el 58% de las especies analizadas presentan valores promedio que exceden
el lmite permitido por la OMS, y que el 25% excede el lmite mximo. Esto indica que las
explotaciones mineras en la cuenca del Amazonas tiene un efecto altamente peligroso para
las especies que habitan estas aguas y para las poblaciones que viven de la pesca.

OBSERVACIONES

Durante el desarrollo de la estandarizacin del mtodo analtico para la determinacin del


mercurio total en peces en el laboratorio se observ diferentes situaciones que pueden ser
de mucha importancia para desarrollar los prximos anlisis con este mtodo es por eso que
sealamos lo ms importante y relevante:

- El lavado del material de trabajo es de especial cuidado puesto que si no se tiene un


lavado correcto esto influir directamente en el resultado de los anlisis, pues se
pudo observar que cuando se utiliz un tubo de plstico sin antes haber sido lavado
con cido para hacer una dilucin de una muestra la lectura en el espectrofotmetro
en vez de disminuir la concentracin este aumento hasta tres veces respecto a la
lectura anterior, por lo tanto se puede decir que el mtodo es muy sensible, tambin
se pudo observo que la lectura de los blancos salan con una concentracin bastante
grande, lo que cambio completamente al cambiar el agua del lavado donde todas las
lecturas sali como no detectable.

- Se observ que la digestin en microondas es muy eficiente ya que la muestra


digerida es completamente homognea, no se nota partculas grandes en solucin
esto por las condiciones que da el microondas adems como la solucin se
encuentra tapada y adems sometida a presin, creemos que bajo estas condiciones
no se tiene perdida de muestra ya que previo al lavado se hace enfriar durante un
tiempo bastante considerable.
- Se observa que al poner en contacto el cido ntrico y el perxido de hidrogeno se
produce inmediatamente la reaccin qumica que desprende gas, por lo tanto se
debe tener mucha precaucin y trabajar siempre bajo campana.

- Las primeras muestras que se digirieron fue las muestras estndar BCR Y DORM-4
los mismos que se digirieron completamente en el microondas sin embargo el
DORM-4 no digiri bien en plancha esto por la cantidad de grasa que tiene, por lo
que esto ayudo a separar los peces que seran digeridos tanto en plancha como en
microondas segn el nivel trfico y haciendo un estimacin que tan grasoso podra
ser.

- Para realizar la digestin en plancha como ya se mencion antes se utiliz tubos de


ensayo de 100 ml y para tapar al principio se utiliz cachinas sin embargo se vio
que no era lo ms adecuado ya que se pierde bastante muestra debido a esto se
despus se utiliz tapones de goma, en este sentido se observ que el material no es
conveniente ya que al poco tiempo que se introdujo la solucin acida a la muestra
aun a temperatura ambiente los tapones empezaron a saltar esto producto de la
presin que se ejerce dentro de los mismos, esto puede causar contaminacin a las
muestras, adems puesto que el mercurio es muy voltil puede volatilizarse y por lo
tanto provocar prdidas importantes que nos conducira a cometer errores muy
significativos .

- Durante la digestin de las muestras de peces en plancha se observ diferentes


situaciones: La digestin no es homognea en todos los tubos, esto podra ser
debido a que la temperatura no est distribuida uniformemente en el equipo, a
medida que se aumenta la temperatura los tapones saltan de los tubos y escapa el
gas de las muestras, y con seguridad tambin el mercurio, al finalizar la digestin se
observa una solucin homognea sin embargo cuando las soluciones se enfran se
ve que existe partculas bastante grandes incluso en algunos tubos se observa un
capa superior de grasa que no fue digerida completamente.

- En algunas muestras de digestin en plancha se elev la temperatura hasta 120C


durante dos horas ms, esto para mejorar la digestin sin embargo la mejora no fue
apreciable.

- La curva de calibracin para la lectura de muestras puede realizarse a diferentes


concentraciones de mercurio stock es decir, con concentraciones bajas o elevadas,
sin embargo si la curva es a concentraciones bajas muchas de las lecturas de las
muestras se salen de la curva de calibracin y por lo tanto se tiene que realizar
diluciones lo cual puede conducir a cometer errores y pedida de tiempo.

- A toda las muestras antes de realizar la lectura se le aade tres gotas de KMnO4 , se
observ que para las muestras digeridas por microondas era suficiente las 3 gotas ya
que se apreciaba claramente el cambio de color, sin embargo en las muestras
digeridas en plancha no fue suficiente ya que no se not ningn cambio de color, en
algunos casos se le aadi hasta 12 gotas y recin se observ el cambio en mientras
que en otras muestras no se not ningn cambio, este tambin es un factor muy
importante para la lectura ya que se vio que a medida que se aade ms KMnO4 la
lectura se hace ms grande, esto es debido a que existe demasiada materia orgnica
que no fue digerida y en ella existe mercurio atrapado.

- En la lectura en s, se tuvo algunos inconvenientes principalmente en el manejo del


espectrofotmetro ya que en muchos casos no funcionaba correctamente, sin
embargo el mayor inconveniente se produjo al realizar las muestras digeridas en
plancha ya que debido a las partculas existentes en las soluciones estas produjeron
que se tranque en alguna parte del sistema, ya que no succionaba la cantidad de
muestra necesaria y por lo tanto la lectura en algunos casos fue muy sospechosa sin
embargo esto se pudo mejorar al hacer que la solucin vuelva hacia atrs, de esta
manera se destap, posteriormente con un filtrado se pudo eliminar dichas
partculas.

- En cuanto a la lectura de las muestras digeridas en microondas no se tuvo


inconvenientes grandes.

- El valor de las lecturas de las diferentes muestras fue completamente variable y se


puede relacionar entre especies o del mismo lugar, esto es debido a que existen
muchas variable que intervienen en la concentracin de mercurio en los peces como
ser la edad del pez la alimentacin, etc.

CONCLUSIONES

Se logr estandarizar el mtodo para la determinacin de mercurio total en


muestras de pescado, obteniendo los valores certificados para los materiales
de referencia, utilizando la tcnica de absorcin atmica/vapor fro.
Se not la importancia del lavado adecuado del material a utilizar durante la
experimentacin, y la importancia que tiene la pureza del agua y de los
reactivos a utilizar, debido a que influye directamente en los resultados
obtenidos, presentando desviaciones considerables, principalmente en los
blancos
Haciendo una comparacin entre la digestin por plancha y por microondas,
se notaron diferencias muy grandes en los valores obtenidos, puesto que en
plancha no se da una buena digestin de las muestras quedando partculas
en suspensin, especialmente grasa, lo cual influye en la lectura y adems
puede ser causante de daos en el equipo, debido a obstrucciones que podra
causar en los conductos.
Concluimos que resulta ms recomendable utilizar digestin en microondas
para la digestin de muestras de pescado, ya que no presenta inconvenientes
en su desarrollo y ofrece respuestas ms confiables, y muestras ms
analizables para el equipo, con esto no decimos que la digestin en plancha
no sea eficiente pero necesita condiciones ms apropiadas y un mayor
control por parte del analista, consumiendo mayor cantidad de horas-
hombre, energa elctrica, lo cual hace que se eleve el costo del mtodo.
Los resultados obtenidos de las muestras analizadas, de la misma especie,
presentan cierta variabilidad en cuanto a los valores de concentracin de
Hg, esto podra ser debido a muchos factores que influyen como ser la edad,
el tamao, el peso, el lugar donde viven, etc.
Universidad Mayor de San Simn
Facultad de Ciencias y Tecnologa
Departamento de Qumica

TUTOR:
Dra. Carla Oporto P.
ESTUDIANTES:
Flores Pardo Bruno Alexandre
Garnica Nieves Javiel
ASIGNATURA:
Modulo Experimental

Cochabamba - Bolivia