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UNIVERSIDAD CATLICA DE SANTA MARA

ESPECTRMETROS DE MASA

Nombre

Sucasaca Cceres, Angela Mara

Facultad

Facultad de Arquitectura e Ingeniera Civil y del Ambiente

Asignatura

Fsica: Electricidad y Magnetismo

Fecha

02 07 - 2017

III SEMESTRE

- Arequipa
Espectrmetros de Masa

INDICE

INDICE .............................................................................................................................................................................. 1
1. INTRODUCCIN ..................................................................................................................................................... 2
2. DESARROLLO ............................................................................................................................................................ 2
2.1 ESPECTOMETRA DE MASAS ........................................................................................................................ 2
2.2 ESPECTMETRO DE MASAS ........................................................................................................................ 3
2.3 TIPOS: MTODOS DE IONIZACIN ......................................................................................................... 5
A. IMPACTO ELECTRNICO (ELECTRON IMPACT EI)............................................................................................ 5
B. IONIZACIN QUMICA (CHEMICAL IONIZATION CI)...................................................................................... 7
C. IONIZACIN DE CAMPO (FIELD IONIZATION FI) ............................................................................................. 7
D. DESORCIN DE CAMPO (FIELD DESORPTION FD) .......................................................................................... 8
E. BOMBARDEO CON TOMOS RPIDOS (FAST-ATOM BOMBARDMENT FAB) ............................................... 9
F. IONIZACIN POR ELECTROSPRAY (ELECTROSPRAY IONIZATION ESI) ........................................................10
G. MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION (MALDI) ..................................................................11
2.4 TIPOS: ANALIZADORES DE MASAS ........................................................................................................12
A. ESPECTRMETRO DE MASAS DE SECTOR MAGNTICO (MAGNETIC SECTOR MASS SPECTROMETER) ......12
B. ESPECTRMETROS DE MASAS DE CUADRUPOLO (QUADRUPOLE) ................................................................13
C. ANALIZADOR DE TIEMPO DE VUELO (TIME-OF-FLIGHT TOF) .....................................................................14
D. ANALIZADOR DE TRAMPA DE IONES (ION-TRAP) ..........................................................................................15
E. ANALIZADOR FT-ICR (FOURIER TRANSFORM ION CYCLOTRON RESONANCE)......................................16
2.5 TIPOS: DETECTORES DE IONES ...............................................................................................................17
A. COPA FARADAY ..................................................................................................................................................17
B. MULTIPLICADOR DE ELECTRONES (ELECTRON MULTIPLIER) ........................................................................17
C. DETECTOR DALY ................................................................................................................................................18
D. DETECTOR DE MICROCANALES ........................................................................................................................18
2.6 APLICACIONES ...............................................................................................................................................19
A. ANLISIS DE ESTRUCTURA Y MASA.......................................................................................................19
B. SISTEMAS ACOPLADOS ...............................................................................................................................20
C. ANLISIS CUANTITATIVOS .......................................................................................................................23
D. ANLISIS DE PPTIDOS................................................................................................................................25
E. IONES DE PPTIDOS .....................................................................................................................................25
F. SECUENCIACIN DE PPTIDOS ..............................................................................................................26
G. IDENTIFICACIN DE PROTENAS ..........................................................................................................27
3. CONCLUSIONES ....................................................................................................................................................28
4. BIBLIOGRAFA..........................................................................................................................................................29

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Espectrmetros de Masa

ESPECTRMETROS DE MASA

1. INTRODUCCIN
El espectrmetro de masas es un dispositivo que permite analizar con gran precisin la composicin
de diferentes elementos qumicos e istopos atmicos, separando los ncleos atmicos en funcin
de su relacin entre masa y carga (m/z). Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos
qumicos que forman un compuesto, o para determinar el contenido isotpico de diferentes
elementos en un mismo compuesto. Con frecuencia se encuentra como detector de un
cromatgrafo de gases, en una tcnica hbrida conocida por sus iniciales en ingls,GC-MS.

El espectrmetro de masas mide razones masa/carga de iones, calentando un haz de material del
compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes tomos. El haz de iones produce un
patrn especfico en el detector, que permite analizar el compuesto.

En la industria es altamente utilizada en el anlisis elemental de semiconductores, biosensores,


cadenas polimricas complejas, frmacos, productos de sntesis qumica, anlisis forense,
contaminacin medioambiental, perfumes y todo tipo de analitos que sean susceptibles de pasar a
fase vapor e ionizarse sin descomponerse.

2. DESARROLLO

2.1 ESPECTOMETRA DE MASAS


La espectrometra de masas, es uno de los medios analticos de aplicacin ms generalizada, aporta
informacin cualitativa y cuantitativa acerca de la composicin atmica y molecular de materiales
orgnicos e inorgnicos. El primer espectrmetro de masas fue desarrollado en Inglaterra por J.J:
Thompson en 1912, y por F. W. Aston en 1919, pero el instrumento que sirvi de modelo para los
equipos actuales fue construido en 1932. En 1963 Williams, Djerassi y Fetizon escribieron los
mecanismos de fragmentacin que siguen las molculas, segn los grupos funcionales, dando as una
mayor amplitud al uso de esta herramienta analtica.

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Espectrmetros de Masa

Los espectros de masa se obtienen por conversin de los componentes de una muestra en iones
gaseosos que se mueven rpidamente y se separan en funcin de su relacin masa/carga. La
espectrometra de masas es probablemente de entre todas las herramientas analticas al alcance del
cientfico la de aplicacin ms general en el sentido que la tcnica es capaz de suministrar informacin
sobre:

I. La composicin cualitativa y cuantitativa tanto de compuestos orgnicos como


inorgnicos en muestras complejas.
II. Las estructuras de una amplia variedad de especies moleculares; y
III. Las relaciones isotpicas de los tomos en las muestras

2.2 ESPECTMETRO DE MASAS


Un Espectrmetro de Masas es un instrumento que mide las masas de molculas individuales que
han sido convertidas en iones. Un espectrmetro de masas no mide la masa molecular
directamente, pero mide la relacin masa/carga de los iones formados de las molculas. Los
espectrmetros de masas tienen siete componentes mayores: un sistema de entrada, una fuente de
iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vaco, un sistema de control y un sistema
de datos. El sistema de entrada, junto con la fuente de iones y el tipo de analizador de masas
definen el tipo de espectrmetro y las capacidades del sistema.

Figura 1: Componentes bsicos de un espectrmetro de masas

Los instrumentos usados estn compuestos de una combinacin de sistemas de entrada, fuentes
de iones, y analizadores de masas (Tabla 1).

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Espectrmetros de Masa

Tabla 1. Variantes de componentes del sistema de espectrometra de masas

Los procesos bsicos asociados con la espectrometra de masas abarcan desde la generacin de
iones en fase gaseosa de un analito, y la medicin de las relaciones masa/carga (m/z) de estos iones.
La formacin de iones de la muestra en fase gaseosa es un prerequisito esencial en el proceso del
espectrmetro de masas en el proceso de verificacin de masas moleculares o anlisis. Aunque
los primeros espectrmetros de masas requeran que la muestra estuviera en forma gaseosa,
nuevos desarrollos han permitido incluir muestras en soluciones lquidas o en una matriz slida.
Dependiendo del tipo de entrada y tcnica de ionizacin usada, la muestra puede ya estar en forma
de iones en solucin, o puede ser ionizada en conjunto con su volatilizacin por otros mtodos en
la fuente de iones.

El estudiar el analito como un ion en fase gaseosa le dan dos caractersticas fundamentales. La
primera caracterstica fundamental es que el movimiento de los iones en fase gaseosa puede ser
controlado en forma precisa en campos electromagnticos que contienen los iones a estudiar y
pueden ser manipulados para probar el movimiento del ion en el campo. Debido a que el
movimiento de los iones es proporcional a la relacin m/z del ion, esto justifica la medicin de la
m/z y por lo tanto la masa del analito. Los detalles concernientes a diferentes tipos de tcnicas de
anlisis de masas y tcnicas de ionizacin utilizadas determinan factores tales que la precisin y
exactitud de la medicin de m/z, la resolucin, y el rango de m/z del analizador. La segunda
caracterstica fundamental es que el uso de iones en fase gaseosa incrementa la sensibilidad del
espectrmetro de masas. El movimiento preciso de iones en campos electromagnticos que
permiten medir m/z tambin les provee contencin y enfoque.

Durante el proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los
detectores de partculas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con

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gran sensibilidad debido a una combinacin de seales de bajo fondo y la eficiente generacin de
electrones secundarios que pueden subsecuentemente ser multiplicados por factores de 105
o mayores. El mantenimiento de la precisin y exactitud de estos movimientos y por lo tanto
de la sensibilidad del anlisis requiere operacin experta del sistema de espectrometra de
masas.

Algunas desventajas del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de generacin de los iones y
colocarlos en la fase gaseosa, adems de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo
de experimentos. El desarrollo de la ionizacin por electrospray y MALDI han aportado dos
importantes mtodos para la produccin de iones de pptidos y protenas en fase gaseosa. Otra
consecuencia de la complejidad de los instrumentos es el alto precio de tales instrumentos en
trminos su adquisicin y costos de mantenimiento. Sin embargo, en general y considerando la
sofisticacin, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados, se puede
justificar que el costo de la espectrometra de masas es proporcional con los costos asociados con
otros componentes en los proyectos de investigacin que requieren este tipo de anlisis.

2.3 TIPOS: MTODOS DE IONIZACIN


Un reto fundamental en la espectrometra de masas de cualquier tipo de analitos es la produccin
de iones en fase gaseosa de estas especies, y dificultades en la produccin de estos iones en fase
gaseosa pueden impedir el anlisis por espectrometra de masas de ciertas clases de molculas. Esta
situacin fue el caso de protenas y pptidos. Las primeras tcnicas que fueron aplicadas,
ionizacin electrnica (electron ionization EI) e ionizacin qumica (chemical ionization CI),
son procesos de dos etapas en los cuales los analitos son vaporizados con calor y la
ionizacin ocurre una vez que el analito esta en fase gaseosa. Esta etapa de vaporizacin limit
los experimentos de anlisis por espectrometra de pequeos pptidos, usualmente a
mximo 4 o 5 aminocidos. Adicionalmente, estos pptidos tenan que ser derivatizados para
minimizar su polaridad y darles suficiente volatilidad. El anlisis de protenas no era
simplemente posible, y problemas similares se encontraban en otras clases de molculas
polares. La ionizacin por bombardeo con tomos rpidos (fast atom bombardment FAB) fue
el primer mtodo de ionizacin que hizo posible analizar rutinariamente por espectrometra
de masas a molculas polares, tambin fue fundamentalmente diferente de otros mtodos de
ionizacin tal como ionizacin electrnica (IE) debido a que los iones en fase gaseosa fueron
generados directamente de una solucin del analito en fase lquida. Como resultado, las diferentes
formas de vaporizacin y de ionizacin del analito se convirtieron en una etapa estrechamente
ligada en el proceso total de anlisis por espectrometra de masas.

A. Impacto Electrnico (Electron Impact EI)

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Espectrmetros de Masa

El Impacto Electrnico (Electron Impact EI) o comnmente llamado Ionizacin Electrnica


(Electron Ionization EI) es un mtodo clsico de generacin de iones en espectrometra de
masas utilizado an en muchas aplicaciones. El analito es introducido dentro de la fuente
de ionizacin que esta al vaco (<10-6 mbar) y sebsecuentemente ionizado por
colisiones con un flujo de electrones (a 70 eV).

M + e- _ M+. + 2 e-

Los electrones para este proceso son generados por emisin trmica de un filamento
caliente. El filamento esta tpicamente hecho de tungsteno o de renio. Los electrones son
subsecuentemente acelerados al aplicar un potencial entre el filamento y la muestra. El rayo
de electrones cruza la fuente de iones, afectando las molculas neutras que provienen de la
muestra. La corriente tpica del filamento es de 1x10-4 Amp.

La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) operada de 20 a
500C o por medio de un cromatgrafo de gases. Las muestras deben ser de polaridad baja
o media y con cierta estabilidad trmica, adems de que deben ser evaporadas antes de su
ionizacin. El proceso de EI causa mucha fragmentacin de las molculas lo cual puede tener
ventajas en la deduccin de su estructura.

El mecanismo de formacin de iones para la especie AB es el siguiente:

1. AB + e-* _ A+ + B- + e-

2. AB + e-* _ A+ + B + 2e-

3. AB + e-* _ [AB+*] + 2e- seguido de [AB+*] _ AB+

4. AB + e-* _ [AB2+*]" + 3e- seguido de [AB2+*]" _ A+ + B+ - (muy baja


abundancia)

5. AH + e-* _ AH* + e- seguido de AH* + AH _ [AH+H]+ + A-

Donde:

* = Especies de alta energa.

= Radicales.

" = Intermediarios de vida corta.

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En 1 y 2 se indican las especias de mayor abundancia las cuales sufren de fragmentacin


instantnea. En 3 indica especias de abundancia media.

En 4 indica especies de abundancia muy baja.

En 5 son especies que pueden formarse a altas presiones

B. Ionizacin Qumica (Chemical Ionization CI)


La Ionizacin Qumica (Chemical Ionization CI) es un mtodo de ionizacin relativamente
suave, y es el primer mtodo de ionizacin suave introducido a la espectrometra de masas.
La ionizacin es afectada por reacciones sobre la molcula con iones de un reactivo gaseoso
generados por medio de ionizacin de impacto electrnico (EI) con molculas del analito
neutras.

El reactivo gaseoso es empleado con un exceso de 103-104 veces la molaridad del. Esto
puede ser logrado al usar volumen de iones bastante pequeo en comparacin a las
condiciones de EI. El volumen de reactivo gaseoso se controla por medio de una vlvula.

C. Ionizacin de Campo (Field Ionization FI)


La Ionizacin de Campo (Field Ionization FI) es un mtodo de ionizacin suave. La muestra es
introducida por las mismas tcnicas que en EI y CI. La ionizacin de campo lleva el riesgo de
descomposicin trmica de la muestra.

Las molculas son ionizadas por medio de ionizacin de campo (FI) en los bordes del campo
del nodo emisor. El emisor consiste de un alambre de tungsteno de 10-13mm de dimetro
que es activado por un procedimiento especial creando miles de microagujas en su
superficie. Un voltaje alto de 10-12 kV es aplicado al emisor causando polarizacin y
finalmente ionizacin de las molculas que estn cerca de las puntas de las
microagujas donde el campo elctrico alcanza una gran fuerza. Este proceso tiene una
eficiencia de ionizacin muy baja y por lo tanto, FI produce una corriente de iones muy baja.
FI produce iones del tipo M+. y/o [M+H]+, dependiendo del analito. Aunque los iones
generados pueden estar casi libres de fragmentacin, se prefiere la ionizacin CI en lugar de
FI no puede ser utilizada debido a la volatilidad del analito.

La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) a una temperatura
de operacin de 20 a 500C (para slidos y lquidos de baja volatilidad, as como lquidos y
gases), el uso de un cromatgrafo de gases acoplado al espectrmetro de masas es
complicado ya que las condiciones son difciles de estabilizar en las corridas de las

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muestras. Mientras que FI genera iones con muy baja energa interna y casi nula
fragmentacin, la evaporacin del analito antes de su ionizacin es la etapa crtica.

D. Desorcin de Campo (Field Desorption FD)


La Desorcin de Campo (Field Desorption FD) es un mtodo de ionizacin muy
suave utilizado en espectrometra de masas. Este mtodo esta basado en el de Ionizacin
de Campo (Field Ionization FI), FD ha sido desarrollado al combinar la desorcin y la
ionizacin del analito, pero no hay necesidad de evaporacin antes de la ionizacin,
generando iones con muy baja energa interna y casi nula fragmentacin.

Molculas neutras son ionizadas principalmente por FI en el borde del campo del nodo
emisor, los cationes son desorbidos tal cual. Un alto voltaje de 10-12 kV es aplicado al
emisor causando polarizacin y finalmente ionizacin de las molculas que estn cerca de las
puntas de las microagujas donde el campo elctrico alcanza una enorme fuerza. Un ligero
calentamiento de la muestra ayuda a mantener el equipo limpio al evitar su acumulacin.

Usualmente, se pasa una corriente de 50 mA sobre el emisor (un alambre de 10mm) o


incluso hasta 80-100 mA en emisores de 13mm. Esto incrementa la movilidad de las
molculas sobre la superficie del emisor, ayudando a la migracin hacia las puntas de las
agujas. El emisor puede resistir hasta 800C.

La muestra es introducida dentro de la fuente de iones por medio de una sonda directa que
lleva el emisor de campo en su punto, el alambre activado entre las dos puntas de acero
inoxidable es de 5mm de longitud. Este par de alfileres de acero estn aislados
elctricamente mutuamente por medio de una pieza de cermica. La sonda transfiere el
emisor FD dentro de la muestra y se suministra un alto voltaje para la
desorcin/ionizacin y ocurre el calentamiento del emisor.

El emisor FD consiste de un alambre central de tungsteno de 10-13m m de dimetro. La


activacin a alta temperatura est basada en una descomposicin trmica de la superficie
del alambre de tungsteno caliente al vaco. La activacin crea miles de microagujas en la
superficie del emisor.

La muestra es introducida como una solucin (1 a 2 ml a 0.1-1.0 mg/ml en solventes


voltiles) hacia el emisor. Durante este proceso una solo gota colgante en la punta de
una jeringa de un microlitro puede tocar la superficie del emisor, de otra manera se
rompera el emisor.

Es preferible que la muestra sea soluble en solventes voltiles, se pueden analizar


compuestos de baja o alta polaridad, inclusive es posible analizar mezclas de compuestos,
aunque solo se pueden cuantificar compuestos puros. Si la muestra esta contaminada con

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sales inorgnicas puede ocurrir dao en los componentes del sistema. Se pueden analizar
muestras de 1-5000 amu.

E. Bombardeo con tomos Rpidos (Fast-Atom Bombardment FAB)


Los mtodos de desorcin de partculas fueron desarrollados en los 70s y 80s, y a
diferencia del mtodo de desorcin de campo (field desorption), evito complicaciones en
diseo de equipo y preparacin de la muestra.

FAB es un mtodo de ionizacin suave, resulta de la combinacin de desorcin del analito


desde una fase condensada (mezcla de analito slido+matriz) con su subsecuente
ionizacin. La matriz est formada de molculas orgnicas (glicerol o 3-nitrobencil
alcohol) que mantienen una superficie homognea para el bombardeo. Ocurre el
bombardeo de la muestra con tomos rpidos (Ar o Xe de 3-10 keV) o iones rpidos (Cs+
arriba de 35 keV). Si se utilizan iones rpidos la tcnica se conoce tambin como liquid
secondary ion mass spectrometry (LSIMS o liquidSIMS). En la prctica, no hay una
diferencia significativa entre los espectros obtenidos por FAB o LSIMS.

El rayo primario de tomos rpidos es librado por una pistola de tomos rpidos (FAB gun)
(Figura 12) o por una pistola de iones Cs+ que utiliza un horno conteniendo CsI como
fuente de Cs+. La pistola FAB est localizada fuera de la fuente de iones, a travs de ella
pasa un flujo de Xe neutro, los iones Xe son generados por EI. Los iones son acelerados,
enfocados y neutralizados por intercambio de cargas con Xe neutro al haber colisin. El rayo
de tomos pega con una gota de muestra y debido a colisiones y disrupciones se forman
iones secundarios que son expulsados de la superficie de la muestra, los iones
generados son acelerados y enfocados al analizador.

La muestra es introducida por medio de una sonda directa. Bsicamente la sonda FAB
consiste de una simple barra con un contenedor para la muestra donde se dirigen los tomos
rpidos que soporta la gota de la solucin de analito contenida en una matriz. Este
contenedor de la muestra est aislado elctricamente.

La funcin de la matriz es absorber energa de las partculas primarias que la impactan, actuar
como solvente para el analito, refrescar la superficie de la gota y ayudar en el proceso de
ionizacin, ya que puede ser aceptor/donador de protones o electrones. Para que una
matriz lleve a cabo todas sus funciones es necesario que la muestra sea 100% soluble en ella,
solo aquellos solventes con baja presin de vapor pueden ser usados fcilmente, el solvente
debe tener una viscosidad suficientemente baja que permita la difusin de los solutos a la
superficie, ser qumicamente inerte.

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Las muestra que pueden ser analizadas por FAB deben ser altamente solubles, e incluso
altamente polares (pptidos, oligosacridos), ionicos (sales), o apolares (compuestos
neutros, oligomeros sintticos). FAB puede ser utilizado para deteccin directa de iones
positivos o negativos. El rango de masa es desde 300 amu hasta

5000 amu, en compuestos de menor masa resultan algunas complicaciones en la deteccin


de los picos del espectro y en molculas mayores se presentan problemas en la desorcin.
Los iones secundarios generados pueden permanecer estables por varios minutos, ya que
poseen baja energa interna y exhiben un bajo nivel de fragmentacin.

F. Ionizacin por Electrospray (Electrospray Ionization ESI)


La Ionizacin por Electrospray (ESI) es uno de los mtodos de ionizacin mas recientemente
desarrollados en espectrometra de masas. El diseo y operacin de fuentes de ionizacin
por electrospray usadas comnmente en los espectrmetros de masas estn basados en
diseos descritos por Fenn y colaboradores en 1985. Este mtodo es llevado a cabo a
presin atmosfrica a diferencia de otros mtodos, por lo que se le conoce tambin como
un mtodo de ionizacin a temperatura ambiente (atmospheric pressure ionization
API). ESI es ampliamente utilizado en aplicaciones de ciencias bioqumicas y biomdicas
debido a su capacidad de analizar molculas altamente polares tales como pptidos,
oligonucletidos y oligosacridos.

En el proceso general de electrospray, que ocurre en la punta del emisor (capilar o aguja),
una solucin acuosa cida o bsica (dependiendo de la muestra) diluida del analito (10-4-10-5
molar) es rociada desde la punta del emisor en el cual se aplica un potencial de 3-4 kV, la
solucin debe proveer conductividad elctrica que puede ser obtenida por el uso de analitos
inicos o aditivos inicos tales como buffers o por algn grado de disociacin electroltica
del solvente. El lquido comienza a salir de la aguja, incrementa su carga y asume una
forma cnica, llamada cono de Taylor, en honor a G.I. Taylor quien describi este fenmeno
en 1964 (Figura 13). El lquido asume esta forma cuando incrementa su carga ya que una
forma cilndrica puede retener ms carga que una esfera. En la punta del cono, el lquido
cambia de forma a una lnea fina, que se vuelve inestable ya que es forzado a retener ms y
ms carga, y finalmente llega a un punto crtico donde no puede soportar ms carga elctrica
y la solucin entonces se dispersa en forma de niebla de pequeas gotas (de menos de 10
mm de dimetro) altamente cargadas que vuelan buscando una superficie de carga opuesta.
Debido a que las gotas estn altamente cargadas con la misma carga elctrica se repelen
fuertemente, las gotas vuelan y se dispersan cubriendo un rea cada vez mayor y se van
reduciendo de tamao ya que las molculas de solvente se evaporan en su superficie, y la
distancia entre las molculas cargadas disminuye dramticamente. Si la gota no encuentra
donde disipar su carga, las cargas elctricas llegan a un estado crtico y la gota

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explota violentamente. Este proceso fue originalmente observado por el fsico John Zelany
en 1914.

El proceso termina con molculas cargadas que pueden todava llevar molculas de solvente.
El proceso de evaporacin y rompimiento de gotas se repite hasta que el tamao y carga de
las gotas desorba molculas protonadas dentro de la fase gaseosa, donde pueden ser dirigidas
en el espectrmetro de masas por medio de campos elctricos apropiado. El proceso de
evaporacin puede ser suplementado con un flujo de gas (tpicamente nitrgeno) y calor.

Una caracterstica de ESI es que debido a las condiciones cidas usadas para producir las
gotas cargadas positivamente se tienden a protonar todos los sitios bsicos en las molculas
de analito. Una segunda caracterstica de ESI es la eficiencia del proceso de ionizacin y,
como resultado, la sensibilidad de los experimentos basados en esta forma de ionizacin,
la eficiencia en la protonacin de estos sitios bsicos en ambientes cidos parece contribuir
a la sensibilidad. Una tercera caracterstica es su compatibilidad con los solventes de
HPLC de fase reversa (reverse-phase high-performance liquid chromatography), ya que
las mezclas agua/solvente tienen excelentes propiedades compatibles con ESI.

G. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)


Esta tcnica de ionizacin, comnmente llamada MALDI, fue descrita por Karas y Hillenkamp
en 1988. En este mtodo de ionizacin los analitos son disueltos en una solucin de un
compuesto que absorbe UV, llamado matriz (matrix), y colocado dentro del espectrmetro
de masas. Debido a que los solventes se van secando, los compuestos de la matriz cristalizan
y los analitos quedan contenidos dentro de la matriz de cristales.

Pulsos de lser de luz UV (3-5 ns, 337 nm, 107 W/cm2) son utilizados para vaporizar
pequeas cantidades de la matriz donde se incluyen los iones del analito y llevados a fase
gaseosa en el proceso (Figura 19). La ionizacin ocurre por protonacin en el ambiente cido
producido por los compuestos de la matriz y por la adicin de cido diluido en la muestra. La
protonacin de pptidos es particularmente eficiente en ambientes cidos, haciendo de
MALDI, un mtodo efectivo para producir pptidos protonados. Debido a que con la
desorcin por lser la produccin de iones es discreta y es pequeos paquetes, el MALDI
est comnmente combinado con un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un
sistema de alta sensibilidad.

Mientras que ESI es afectado por especies contaminantes, MALDI puede tolerar niveles
variables de algunos contaminantes.

Cada pulso lser genera una pequea cantidad de plasma que se expande en vaco, del cual se
extraen los iones (positivos o negativos) del analito que son acelerados por un potencial de
10-30 kV y controlados por medio de campos electromagnticos. Debido a diferencias de

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Espectrmetros de Masa

velocidades que resultan de sus diferencias en masas los iones llegan al detector en
diferentes tiempos. Los tiempos de vuelo son del rango de 10-100 ms.

Una muestra de 1 ml de la solucin del analito o de la solucin analito/matriz es aplicada en


un contenedor y se seca, formando una capa delgada y cristalina. Los contenedores son de
acero pulido, plata o cromo plateado.

La funcin de la matriz es en primer lugar absorber la energa del lser. Por lo que las
matrices para MALDI estn formadas de compuestos aromticos (Figura). La ionizacin del
analito puede ser afectada por deprotonacin, al aceptar o ceder un electrn, por unin de
cationes o fotoionizacin, por lo que los iones generados por MALDI son de una amplia
variedad de molculas, ya que dependiendo de la combinacin entre el analito y la matriz
ser el tipo de iones predominantes en el espectro obtenido.

2.4 TIPOS: ANALIZADORES DE MASAS


Todos los espectrmetros de masas combinan la formacin de iones, el anlisis de masas, y la
deteccin de iones. Los analizadores de masas llevan a cabo la separacin de los iones producidos
por diferentes mtodos en una fuente de iones, de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z) para
que puedan llegar al detector. La unidad para m/z es el Thomson (Th).

En los experimentos de espectrometra de masas aparecen dos clases principales de iones, el ion
molecular, que es la molcula completa del analito, y fragmentos inicos, los cuales contienen
solo una parte de la estructura. El peso molecular de una molcula puede ser calculado de la m/z
del ion molecular, si la carga (z) es conocida, la informacin estructural se obtiene a partir de las
m/z de los fragmentos del ion. Una variedad de analizadores de masas estn disponibles para
realizar estas mediciones, incluyendo cuadrupolo (quadrupole), trampa de iones (ion-trap), tiempo
de vuelo (time-of-flight), sector magntico (magnetic sector), ciclotrn (ion cyclotron resonance)
y otros.

Cada tipo de analizador posee caractersticas y aplicaciones especiales, as como beneficios y


limitaciones. La seleccin del tipo de analizador a utilizar es en base a que aplicacin se le dar, el
costo y el rendimiento deseado, ya que el analizador determina varias caractersticas del
resultado del experimento, entre estas la resolucin y el rango de m/z de los iones que pueden
ser medidos.

A. Espectrmetro de masas de sector magntico (Magnetic Sector Mass


Spectrometer)

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Espectrmetros de Masa

En un espectrmetro de masas de defleccin magntica, los iones que llegan de la fuente


de iones son acelerados a una gran velocidad. Los iones entonces pasan a travs de un
sector magntico (magnetic sector) en el cual se aplica un campo magntico en una direccin
perpendicular al movimiento de los iones. Cuando se aplica aceleracin perpendicular al
movimiento de los iones, su velocidad permanece constante, pero se mueven en
direccin circular, es por esto que el sector magntico tiene forma de arco, el radio y el
ngulo del arco varan de acuerdo a diferentes diseos.

Un sector magntico por s mismo es capaz de separar iones de acuerdo a su relacin


masa/carga, pero su resolucin se ve limitada ya que no todos los iones que llegan de la
fuente de iones tienen la misma energa ni la misma velocidad. Para tener una mejor
resolucin se aade un sector elctrico (electric sector) que enfoca los iones de acuerdo a
su energa cintica, esto se realiza aplicando una fuerza perpendicular a la direccin del
movimiento de los iones, tambin en forma de arco.

La configuracin de este aparato es tambin llamada de geometra reversa, ya que el sector


magntico esta antes del sector elctrico.

La operacin del espectrmetro de masas se logra manteniendo constantes el potencial


de aceleracin y el potencial del sector elctrico y variando su campo magntico. Los
iones que tienen una energa cintica constante, pero una relacin m/z diferente son
captados por el detector a diferentes fuerzas de campo magntico.

El analizador de masas de sector magntico es un modelo clsico que posee varias ventajas:
alta reproducibilidad, alto desempeo en anlisis cuantitativos, alta resolucin,
sensibilidad y rango dinmico. Algunas limitaciones son que no pueden adaptarse a algunos
mtodos de ionizacin (por ejemplo: MALDI), costos mayores que otros analizadores.
Son ampliamente usados en anlisis de compuestos orgnicos, realizan mediciones
exactas de masas, en cuantificacin y en mediciones de istopos.

B. Espectrmetros de masas de cuadrupolo (quadrupole)


El analizador de masas de cuadrupolo (quadrupole) es probablemente el analizador de masas
ms utilizado, ya que adems de su alto desempeo analtico combina facilidad de uso. Este
tipo de analizador est compuesto de cuatro barras organizadas paralelamente como dos
grupos de dos barras conectadas elctricamente. Una combinacin de voltajes de
radiofrecuencia (rf) y corriente directa (dc) son aplicados a cada par de barras, este arreglo
simtrico permite producir campos hiperblicos. Superficies diagonalmente opuestas estn
conectadas juntas a fuentes de voltajes rf y dc. Los iones se extraen de la fuente de iones y
son acelerados (5-15 V) dentro del espacio central formado por el cuadrupolo a lo largo del
eje longitudinal hacia el detector. Miller y Denton describieron el concepto de filtro de masas

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Espectrmetros de Masa

cuadrupolo como la combinacin o superposicin de filtros de pase bajo y pase alto. Al


menos para iones relativamente ligeros (<300 Da), el anlisis m/z no es afectado por la
estructura del ion.

El filtro cuadrupolo m/z es examinado al modificar la magnitud de la amplitud de voltaje de rf


y manteniendo dc a una proporcin fija. El poder de resolucin es establecido por la
relacin de los voltajes rf y dc . Las trayectorias de los iones a travs del espacio central
de las barras es complicado, y para cada par de voltajes dc y rf solo iones de un valor m/z
especfico evitaran colisionar con las barras y pasaran el filtro cuadrupolo a travs del eje Z
hasta alcanzar el detector, todos los dems iones chocarn con las superficies del cuadrupolo
a estos valores de rf y dc. El espectro de masas completo puede ser examinado ya que se
hace un barrido desde un valor de voltaje mnimo preestablecido hasta un mximo, pero
manteniendo la relacin dc/rf constante.

El analizador cuadrupolo ofrece alta reproducibilidad, adems de costos relativamente


bajos de manejo y mantenimiento del sistema, pero puede llegar a tener una resolucin
limitada, puede no adaptarse a algunos mtodos de ionizacin. Este analizador esta
frecuentemente acoplado a sistemas de cromatografa de gases/espectrmetro de masas
(GC/MS) y cromatografa lquida/espectrmetro de masas (LC/MS).

C. Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight TOF)


El principio de operacin del analizador de tiempo de vuelo (time-of-flight TOF) involucra la
medicin del tiempo requerido por un ion para viajar desde la fuente de iones hasta el
detector localizado a 1-2m de la fuente. Todos los iones reciben la misma energa cintica
durante la aceleracin instantnea (3000 eV), pero debido a que tienen diferentes valores
de m/z, se separan en grupos de acuerdo a su velocidad (por lo tanto m/z) como van
recorriendo la regin libre de campo entre la fuente de iones y el detector. Los iones chocan
secuencialmente en el detector en forma de un incremento de m/z. Los iones de baja m/z
llegan al detector antes que aquellos con m/z alta debido a que entre ms m/z tengan los
iones tendrn una velocidad menor.

El analizador TOF es el analizador de masas ms rpido, puede adaptarse a los mtodos de


ionizacin por pulsos (MALDI), tiene alta transmisin de iones y el rango de masas ms
grande de todos los analizadores de masas. Algunas limitantes son que en muchas ocasiones
requieren exclusivamente de un mtodo de ionizacin por pulsos y que la selectividad de los
iones puede limitarse en algunos experimentos. Casi todos los sistemas MALDI estn en
conjunto con un analizador de TOF, los sistemas GC/MS con TOF poseen una alta velocidad
de anlisis.

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Espectrmetros de Masa

D. Analizador de trampa de iones (Ion-Trap)


El espectrmetro de masas de trampa de iones cuadrupolo (quadrupole ion-trap), as como
el filtro cuadrupolo, utilizan campos elctricos oscilantes para atrapar los iones en
forma controlada. En la trampa de iones cuadrupolo, los iones son atrapados en un
espacio tridimensional, mientras que en el filtro de masas cuadrupolo solo es en un espacio
bidimensional.

La trampa de iones cuadrupolo atrapa los iones en un pequeo volumen entre tres
electrodos, uno circular (ring electrode) y dos electrodos hiperblicos en los extremos (end-
cap electrodes), por medio de campos elctricos oscilantes.

La trampa de iones es operada al aplicar un potencial sinusoidal (rf a una frecuencia


determinada) al electrodo circular, mientras que los de los extremos se mantienen
constantes (frecuentemente en cero), o mantenidos a un potencial oscilante. La variedad
de potenciales posibles que pueden aplicarse a los electrodos de los extremos permite
atrapar los iones dentro de un rango m/z especfico, es decir atrapar iones por encima de un
valor m/z especfico, atrapar iones solo de un valor m/z seleccionado, o expulsar iones
de un valor m/z especfico.

Como fue originalmente concebido, la trampa de iones puede ser ajustada para almacenar
iones de un valor m/z dado. Al cambiar las condiciones de operacin, iones de un valor
m/z especificado podrn salir o ser expulsados de la trampa. Stafford y colaboradores
establecieron el modo de operacin de la trampa de iones, en el cual los iones los iones que
tienen un valor m/z por encima de un valor predeterminado son almacenados, pero
eventualmente son expulsados de acuerdo a valores secuenciales de m/z al cambiar los
parmetros de operacin para permitir un examen analtico.

El movimiento dentro de la trampa de iones, al igual que en el filtro cuadrupolo, puede ser
descrito por las ecuaciones de Mathieu. Debido a que potenciales dc pueden ser
aplicados a la trampa, puedes usarse diagramas de estabilidad basados en a y q para
indicar cuales iones de acuerdo a su valor m/z permanecen estables dentro de la trampa de
iones y cules sern expulsados bajo unas condiciones especficas.

Durante la operacin del espectrmetro de trampa de iones, las oscilaciones de los


iones atrapados son reducidas por colisiones con helio a alta presin (10-3 torr). Durante
el proceso de deteccin, los potenciales de los electrodos son alterados para producir una
rampa de amplitud de radio frecuencia en las trayectorias de los iones y as expulsar los iones
en direccin axial. Los iones son expulsados en orden de decrementos de m/z, enfocados a
la salida de la trampa y detectados por el sistema de deteccin de iones.

Algunos investigadores han demostrado gran resolucin y rango de masas en sistemas de


trampas de iones diseadas especialmente. Sin embargo, estas caractersticas no son

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Espectrmetros de Masa

aplicables a todos los sistemas de trampa de iones disponibles comercialmente. Este


sistema posee alta sensibilidad adems de ser equipos relativamente compactos, pero
ofrecen poca capacidad en anlisis cuantitativos, pueden sufrir de efectos por cargas y
reacciones de los iones, muchos parmetros influyen la calidad del espectro obtenido por
este mtodo (excitacin, atrapado y deteccin de los iones) por lo que debe contarse con
sistemas de control sumamente precisos. Puede acoplarse a sistemas cromatogrficos.

E. Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)


El analizador FT-ICR (Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) es probablemente el
mtodo ms complejo de anlisis de masas. Esta tcnica fue desarrollada en los 50s, es
altamente sensible, pero tiene limitaciones de resolucin de masas (>106 Da). Este tipo de
espectrmetros consisten principalmente de tres secciones, la primera es la fuente de iones
(ESI y MALDI son las ms comunes), despus la regin de transferencia de iones donde los
iones producidos son captados, enfocados y transferidos a una regin de alto vaco antes de
entrar al analizador, y finalmente el analizador.

El arreglo estndar para el analizador FT-ICR, es una trampa de iones localizada


dentro de un campo magntico especialmente uniforma de una fuerza B0. El efecto del
campo magntico es obligar a los iones incidentes a circular en una rbita, la frecuencia es
determinada por la masa (m), la carga (z) y velocidad (v) del ion, por accin de la ley de
Lorentz, ecuacin. El ion es llevado a una trayectoria circular en un plano perpendicular al
campo magntico. El sentido contrario de rotacin es experimentado por iones de carga
opuesta.

La presencia de iones entre el par de electrodos (en trampa) no producir ninguna seal
medible, por lo que es necesario excitar los iones de una m/z dada como un paquete a un
radio orbital mayor al aplicar barrido de potencial rf de milisegundos. Una frecuencia
excitar una m/z particular (la transformacin de Fourier permite medir simultneamente
todas las frecuencias). La medicin de la frecuencia angular (wc) lleva a valores de m/z y al
espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede ser medida ms exactamente que otras
propiedades fsicas, esta tcnica de anlisis tiene una gran resolucin. Despus de la
excitacin, los iones regresan a su estado normal.

Este tipo de analizadores poseen la resolucin de masas mas alta, alta capacidad, y
acoplamiento a mtodos de ionizacin por pulsos (MALDI), es un mtodo no destructivo,
pero posee un rango de masa limitado, puede sufrir de efectos por cargas y por reacciones
entre los iones, se deben cuidar muchos parmetros para tener buenas mediciones. Se
acopla bien a MALDI y ESI.

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Espectrmetros de Masa

2.5 TIPOS: DETECTORES DE IONES


Sensibilidad, precisin, y tiempo de respuesta son criterios importantes que distinguen los
diferentes sistemas de deteccin de iones. Alta precisin y rpido tiempo de respuesta son
caractersticas mutuamente excluyentes.

Idealmente, la sensibilidad debe definir explcitamente la corriente de ion recibida por el detector.
La definicin debe incluir: (1) el nombre del compuesto de calibracin, (2) el valor m/z del ion
medido, (3) el poder de resolucin del instrumento, (4) la cantidad de compuesto de calibracin
consumido por minuto, (5) la intensidad de la corriente de electrones y presin de la fuente de
iones (para CI), (6) la corriente del ion que llego al detector. Estas unidades de sensibilidad
permiten comparar instrumentos, que en ocasiones es difcil ya que las diferentes compaas usan
diferentes criterios.

A. Copa Faraday
Este es un detector elctrico convencional, iones positivos que impactan sobre el colector
son neutralizados por electrones despus de pasar a travs de una resistencia. La cada de
voltaje en la resistencia de acuerdo a un estndar es la medicin de la corriente del ion. La
seal del voltaje de la resistencia es entonces amplificada por un amplificador DC o por un
electrmetro. El pequeo electrodo de metal que intercepta los iones positivos est
montado en una jaula de Faraday.

La corriente del ion medida y amplificada es directamente proporcional al nmero de


iones y al nmero de cargas de los iones. La respuesta de la copa faraday es independiente
de la energa, la masa, o la naturaleza qumica de los iones. Este tipo de detector es
simple, barato, resistente y fiable. Posee alta precisin, sensibilidad y produce poco
ruido de salida. La principal desventaja es que tiene un gran retraso inherente a la
simplificacin del sistema. Por esto es que se utiliza para mediciones precisas o de
corrientes de iones poco cargados y no debe ser usado para realizar examinaciones rpidas
(por ejemplo en sistemas GC/MS).

B. Multiplicador de Electrones (Electron Multiplier)


El multiplicador de electrones (electron multiplier) utiliza el principio de emisin secundaria
de electrones para afectar la amplificacin. En el dinodo discreto (discrete-dynode) los iones
provenientes del analizador de masas son enfocados sobre un dinodo que emite electrones
en proporcin directa al nmero de iones bombardeados hacia l. Los electrones

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Espectrmetros de Masa

secundarios del dinodo (iones en electrones) son acelerados y enfocados hacia un segundo
dinodo, el cual tambin emite electrones secundarios (electrones en electrones). De este
modo, la amplificacin es llevada a cabo a travs de un efecto cascada de electrones
secundarios de dinodo a dinodo, ya que el nmero de electrones que llegan a un dinodo es
menos al que sale del mismo. Cada etapa es un dinodo de cobre-berilio conectado a un
potencial sucesivamente mayor por un divisor de voltaje.

Este tipo de detectores son de amplio uso, ya que adems de ser sistemas confiables, baratos
y que pueden captar casi todos los electrones poseen sistemas electrnicos y mecnicos
simples, aunque pueden no ser tan sensibles (al no tener amplificacin de seal) y un tiempo
de respuesta lento debido a alta impedancia en el amplificador.

Un diseo alternativo de multiplicador de electrones utiliza un dinodo continuo en forma


de cuerno hecho de vidrio cubierto con plomo. Este vidrio cubierto es elctricamente
resistente y provee un gradiente elctrico que est conectado a una fuente de poder. Hacia
el final del cuerno se ajusta el ngulo para poder captar todos los iones y convertirlos en
electrones secundarios. Estos electrones secundarios son atrados a lo largo de un
gradiente elctrico positivo en el cuerno, estos electrones chocan con la pared y ms
electrones secundarios son expulsados, provocando amplificacin. La forma de dinodo
continuo (frecuentemente llamado channeltron) es curva para prevenir que iones positivos
causen seales de ruido debido a ionizacin secundaria de molculas residuales de gas.

C. Detector Daly
Una corriente de iones positivos pasan por la hendidura del detector y son atrados hacia un
ctodo de aluminio (el botn Daly) teniendo un gran potencial negativo (-15000 V). Ocurre
el impacto con el botn Daly, el cual esencialmente sirve como un dinodo de conversion
que produce ms de ocho veces electrones secundarios que son atrados hacia un
aparato centelleante, los electrones secundarios generan fotones que son amplificados
en un fotomultiplicador.

El detector Daly tiene la ventaja de que no opera bajo vaco, puede detectar iones de masas
grandes, y puede detectar iones estables y metaestables, pero solo es capaz de detectar
iones de alguna m/z especfica ya es un detector de canal simple.

D. Detector de Microcanales
Un arreglo de capilares de vidrio huecos (de 10-25mm de dimetro), unidos a un material
emisor de electrones, formando un microcanales. Manteniendo estos microcanales a un
alto voltaje permite a los iones golpear el material y expulsar electrones, esto causa una

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Espectrmetros de Masa

avalancha, creando electrones secundarios con una ganancia de103-104. Estos detectores son
tiles en seales de baja intensidad.

Los microcanales pueden tambin emitir electrones a travs de pantallas fosforescentes. Un


detector de arreglo de fotodiodo es usado para convertir los fotones liberados en seales
elctricas.

2.6 APLICACIONES

A. ANLISIS DE ESTRUCTURA Y MASA


En el anlisis de estructura por medio de espectrometra de masas de la acetona
(C3H6O) se observan diferentes fragmentos de iones y el ion molecular en m/z=58 (Figura
2).

Figura 2: Espectro de masas de la acetona (C3H6O)

Los iones ms intensos han sido marcados con su m/z . Los fragmentos de ion son
usados por los espectrometristas de masas para deducir las estructuras moleculares.
Algunas veces los smbolos [+] y [-] son usados para indicar los iones radicales, esta
informacin es til para determinar los patrones de fragmentacin. Se observa que la prdida
de 15 Da del ion molecular de la acetona da un ion de m/z=43 indicando la presencia de un
grupo metil (CH3) en la molcula original, la prdida de 28 Da da un ion con m/z= 15
sugiriendo la presencia de CO. Al analizar estas prdidas y organizando las posibles
estructuras a partir de los iones obtenidos, se puede deducir la estructura del compuesto
original. Algunas prdidas comnmente observadas son de agua (H2O 18 Da), amonio (NH3
17 Da) y grupo fenil (C6H5 77 Da).

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Espectrmetros de Masa

Otra aplicacin de la espectrometra de masas es la determinacin de masas. Cada istopo


de cada elemento (excepto para carbono al cual se le asigno un valor de 12.00000 Da)
tiene una masa no entera nica. La determinacin de mediciones de masa permite
determinar composicin qumica. En el espectro de masas (Figura 3) es posible distinguir
entre monxido de carbono (CO, m/z=27.995) y nitrgeno (N2 m/z=28.006) por
mediciones exactas de sus masas

Figura 3: Espectro de masas CO y N2.

B. SISTEMAS ACOPLADOS
La espectrometra de masas es un sistema de deteccin til en tcnicas de
separacin tales como cromatografa de gases (G C), cromatografa lquida (LC ),
electroforesis capilar y otras, debido a que es altamente sensible y es capaz de
identificar compuestos qumicos en forma precisa. El reto al acoplar el espectrmetro de
masas a un sistema de separacin es el mantener el vaco necesario al introducir la muestra
desde el cromatgrafo. Interfaces que restringen o reducen el flujo de gas de entrada al
espectrmetro permiten acoplar el cromatgrafo de masas y el espectrmetro de masas
(GC/MS) (Figura 4).

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Espectrmetros de Masa

Figura 4: Sistema GC/MS

Al vaporizar el solvente de una cromatografa lquida este representara un volumen de


100-100 veces ms grande que el gas usado en cromatografa de gases. Se han
desarrollado interfaces que resuelven este problema al eliminar este exceso de gas usando
calor y vaco, en algunos casos con ayuda de una corriente de gas que ayuda a secar. Los
sistemas acoplados LC/MS utilizan ionizacin qumica (CI) o electrospray (ESI) como
mtodos de ionizacin.

Tabla 2. Compuestos aptos para anlisis LC/MS

Figura 5: Sistema LC/MS

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Espectrmetros de Masa

En GC/MS y LC/MS, los datos obtenidos consisten en una serie de espectros de masas que
son adquiridos secuencialmente en tiempo. Para generar esta informacin, el
espectrmetro de masas examina un rango de masas (por ejemplo m/z de 30 a 500)
repetitivamente durante la corrida cromatogrfica. Si se realiza un examen cada segundo y se
hace una corrida de 30 minutos, se obtendrn 1800 espectros.

La informacin obtenida puede ser analizada en diferentes formas. En primer lugar, las
intensidades de todos los iones en cada espectro son sumadas, y esta suma graficada como
funcin del tiempo de retencin cromatogrfico (TIC ) cuya apariencia es similar a los
datos de salida de un detector cromatogrfico convencional (Figura 6 parte superior).
Otra forma es desplegar cualquiera de los espectros obtenidos (Figura 6 parte central), cada
pico en TIC representa un compuesto eluido que puede ser identificado al analizar su
espectro de masas obtenido es ese punto. La intensidad a una m/z especfica en el
transcurso de la corrida cromatogrfica puede ser desplegada para producir un perfil de
corrientes de iones seleccionados o un cromatograma de masas (Figura 6 parte inferior).
Esta tcnica puede ser usada para encontrar componentes en una mezcla compleja sin tener
que examinar cada espectro en forma individual.

Figura 6: Anlisis de espectros en sistemas acoplados.

Acoplando dos etapas de anlisis de masas (MS/MS) puede ser muy til en la identificacin de
compuestos en mezclas complejas y en la determinacin de sustancias no conocidas. El
examen de iones producidos es el modo MS/MS mas frecuentemente usado, se generan los
espectros de masas de iones producidos de un valor m/z especfico.

De una mezcla de iones generados o colectados, se seleccionan aquellos iones que tengan
un valor m/z particular, esta es la primera parte del anlisis. Estos iones son fragmentados
y los productos de la fragmentacin de estos iones son analizados es una segunda etapa

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Espectrmetros de Masa

del anlisis de masas. Si la muestra es un compuesto puro y se realiza fragmentacin de los


iones producidos, los espectros producidos de esta fragmentacin proveern informacin
adicional respecto la estructura del analito. Si la muestra original es una mezcla y se usa
ionizacin suave, la segunda etapa de MS puede usarse para obtener un espectro de masas
para cada componente en la mezcla. MS/MS puede tambin usarse para eliminar
interferencias en experimentos SIM donde se producen varias seales de iones de una m/z
especfica.

C. ANLISIS CUANTITATIVOS
Cuando ya se conoce el espectro de masas de un compuesto especfico, se puede confirmar
la presencia de sustancias especficas o medir la cantidad presente en la muestra. Este
tipo de anlisis son rutinarios en mediciones de contaminantes ambientales y estudios
farmocinticos donde se requiere cuantificar analitos en concentraciones muy bajas y
adems en mezclas complejas. El espectrmetro de masas se ajusta para monitorear
solo valores especficos de m/z representativos de las molculas a analizar. El tipo de
ionizacin utilizado puede favorecer la produccin de ciertos tipos de iones, incrementando
la sensibilidad y manteniendo la seal de ion en su valor de m/z.

Figura 7: Sistema MS/MS

En la Figura 45, se muestra un espectro en el cual se monitorearon solo los valores de


m/z=158 y m/z=160 durante una corrida cromatogrfica. Este proceso se conoce como
monitoreo selectivo de iones (SIM).

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Espectrmetros de Masa

Figura 8: Monitoreo selectivo de iones (SIM)

Este espectro es un anlisis cuantitativo de un derivado de 5-fluorouracil en plasma,


la respuesta de la sustancia de inters es medida relativamente en comparacin con un
estndar interno aadido a la muestra. En la parte superior de la Figura se muestra el perfil
SIM del ion a una m/z=158, el compuesto de inters produce el pico central, dos pequeos
picos aparecen y corresponden a compuestos que tambin producen iones a m/z=158.
En la parte inferior de la Figura es el perfil SIM de la misma molcula teniendo el N15
sustituido por N14 normal en dos posiciones, debido a que ambos nitrgenos estn
sustituidos, la seal de este ion es a m/z=160, 2 Da mas pesado. Aunque la muestra y es
estndar tienen el mismo tiempo de retencin, son detectados en forma separada ya
que tienen masas diferentes. Los estndares pueden ser sustancias altamente
relacionadas o qumicamente idnticas pero sintetizadas sustituyendo un istopo de uno
de los elementos como en este caso.

La medicin de istopos es til en diferentes reas tales como estudios metablicos que
utilizan sustancias marcadas isotpicamente, en estudios climticos al usar istopos de
oxgeno y carbono que son temperatura dependientes, en clculo de edades de materiales
(por ejemplo rocas) al medir plomo, neodimio o estroncio. La relacin de istopos de un
elemento puede ser determinada en forma precisa y exacta por medio de espectrometra de
masas, pero es necesario reducir los compuestos a molculas simples antes de la medicin,
los compuestos orgnicos son reducidos a CO2, H2O y N2.

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Espectrmetros de Masa

D. ANLISIS DE PPTIDOS
Para realizar anlisis de pptidos, una vez obtenida la protena o extracto de protenas, se
realiza una digestin proteoltica para obtener pptidos, esta mezcla de pptidos son
separados y purificados por medio de cromatografa de gases (GC), HPLC u otras tcnicas
de separacin (Figura 9). Los pptidos separados y purificados son sometidos a
espectrometra de masas para obtener los espectros de las diferentes fracciones. Se analizan
los espectros obtenidos, la relacin m/z y la intensidad de los iones obtenidos en los
diferentes espectros son usados para identificar los pptidos de las muestras.

Figura 9: Anlisis de pptidos por medio de espectrometra de masas.

E. IONES DE PPTIDOS
Cuando un pptido es fragmentado por colisin con molculas un de gas neutro, la
fragmentacin es inducida por transferencia de energa cintica de las molculas del gas al
pptido. Cuando un pptido es fragmentado en un enlace peptdico particular entre
carbonilo (-CO-) y nitrgeno (-NH-), se forman dos fragmentos, un fragmento del
pptido retiene la carga positiva en el C terminal del pptido ionizado y es llamado in-y, el
otro fragmento retiene la carga positiva en el N terminal y es llamado in-b. Un in-b
generalmente tiene un in-y complementario. Cuando un pptido que tiene una sola carga
es fragmentado, la carga se mantiene solo en un fragmento y solo aquel que tenga la carga
podr ser detectado mientras que el otro permanecer como fragmento neutro no
detectable. Pptidos doblemente cargados producirn dos iones cargados.

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Espectrmetros de Masa

Figura 10: Iones formados durante fragmentacin de pptidos.

Durante la fragmentacin de pptidos pueden formarse otros tipos de iones adems de los
iones-y y los iones- b. Los iones-a y los iones-x, los iones-c y los iones-z, siendo
complementarios entre a-x y c-z. Los iones a-x se forman por rompimiento entre el
pptido y el carbonilo en el extremo N terminal. Los iones c-z se forman al haber un
rompimiento entre el nitrgeno (-NH-) y el resto del pptido. Los iones a, x, c y z se
forman en condiciones de alta energa y los b-y en baja energa.

F. SECUENCIACIN DE PPTIDOS
La secuenciacin de novo de pptidos es llevada a cabo al determinar la secuencia
directamente del espectro de masas sin consulta de bases de datos. Las diferencias entre
m/z sucesivas se usan para determinar la secuencia aminoacdica del pptido. Se asume que
solo ocurre formacin de iones b-y durante el proceso de fragmentacin del pptido, se
forman iones-b ascendentes desde el extremo N terminal mientras que se forman iones-y en
forma descendente desde el C terminal. Se determinan las m/z de los fragmentos
aminoacdicos. Al comparar las diferencias entre masas sucesivas de cada serie y
comparndolos con las masas conocidas de residuos de aminocidos, se puede determinar la
secuencia de un pptido. Tanto los iones de la serie b como de la serie y indican la misma
secuencia.

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Figura 11: Secuenciacin de novo de un pptido AVAGCAGAR

La precisin de la secuencia deducida es limitada por las caractersticas del equipo. La calidad
de la reaccin de fragmentacin, ya que en ocasiones no ocurre el corte y los
fragmentos obtenidos diferirn en algn aminocido que no podr deducirse, por ejemplo,
en presencia de prolina la fragmentacin puede no ocurrir y causar errores en la secuencia.

G. IDENTIFICACIN DE PROTENAS
Para identificar protenas se utilizan las huellas de masas de pptidos (peptide mass
fingerprinting) o huellas peptdicas, este mtodo utiliza los pptidos obtenidos de la digestin
enzimtica de la protena para obtener sus espectros de masas. Los pptidos son
identificados por comparacin contra una base de datos, ya que las masas de los pptidos
forman en conjunto la huella peptdica de la protena, es posible identificar la protena de
inters. Factores importantes que deben ser considerados en este procedimiento es la
pureza de la protena y la precisin de los datos obtenidos, la precisin de los datos
disponibles en las bases de datos y el tipo de algoritmos usados al comparar las masas de los
pptidos (Figura 12).

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Espectrmetros de Masa

Figura 12: Proceso de identificacin de pptidos por medio de huellas peptdicas.

El resultado de este anlisis puede sufrir algunos problemas al tener presencia de seales
provenientes de pptidos que no estn presentes en la protena de inters debido a que la
purificacin dejo algunas protenas que contaminaron la muestra o presencia de pptidos
contaminantes. Es posible adems obtener resultados falsos positivos al comparar los
espectros obtenidos contra las bases de datos, o que la protena de estudio tenga
modificaciones postraduccionales desconocidas que podran alterar el anlisis, algunas
veces es difcil distinguir entre protenas que son muy similares o que podran tener las
mismas huellas peptdicas.

3. CONCLUSIONES
Los espectrmetros de masas tienen una capacidad de identificacin inequvoca de casi
cualquier tipo de sustancia, desde tomos hasta molculas de peso molecular elevado.
Un espectrmetro de masas es importante debido a que se usa industrialmente para analizar
compuestos, identificarlos, cuantificarlos y proveer de esta informacin. Tambin lo usan por
ejemplo, para localizar depsitos petroleros, monitorear fermentaciones en lnea (industria
biotecnolgica), detectar contaminantes orgnicos en el aire, agua y suelo.
Debido a las variedades que tiene, tambin tiene una amplia gama de usos, as como posibles
y futuras mejoras en su diseo para potenciarlo, hacerlo ms rpido y verstil, entre otros.

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Espectrmetros de Masa

4. BIBLIOGRAFA
https://es.slideshare.net/SoniaMLemus/espectrometria-de-masas-2012

Espectrometra de Masas Germn Plascencia Villa. Universidad Autnoma de Mxico

https://es.wikipedia.org/wiki/Espectr%C3%B3metro_de_masas

https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8249/4/T5masas.pdf

Espectrometra de Masas MNCN

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/4.1InstrumentacionEspectrometriadeMasas_2462.pdf

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Espectrmetros de Masa

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