Practica 2

Mtodos de purificacin de medicamentos biotecnolgicos

Introduccin

Para escribir la introduccin utilice las siguientes preguntas generadoras.

1) Qu es la biotecnologa roja?

ELSEVIER define a la biotecnologa roja como: La investigacin relacionada con la medicina y

los procesos mdicos. El diseo de organismos para fabricar productos farmacuticos como
antibiticos y vacunas, la ingeniera de curas genticas a travs de la manipulacin genmica,
y su uso en ciencias forenses a travs de perfiles de ADN (1). La biotecnologa roja contempla
tambin la produccin de vacunas, antibiticos, descubrimiento de nuevos medicamentos,
terapias de regeneracin, construccin de rganos artificiales y nuevas tecnologas de
diagnstico. Se basa en utilizar el potencial de las ciencias micas, la aplicacin de tecnologas
como secuenciacin y arreglos, y la miniaturizacin de tecnologas. La biotecnologa roja ocupa
un aproximado del 50% de empresas de biotecnologa. Algunos de los productos ya existentes
de la biotecnologa roja son hormonas, clulas madre, anticuerpos monoclonales, siRNA y
tests de diagnosticos. (2)

2) Qu mtodos de purificacin se utilizan en la produccin de medicamentos

biotecnolgicos?
Para los procesos de purificacin de productos de inters que son de origen biotecnolgico
definidos en la NOM 059 cmo toda substancia que haya sido producida por biotecnologa
molecular, tales como protenas recombinantes, anticuerpos monoclonales, entre otros.
suelen usarse tcnicas de purificacin como:
a) Cromatografa de ntercambio inico.
b) Cromatografa de exclusin por tamao
c) Cromatografa de afinidad
d) Inmunopurificacin
e) Cromatografa de filtracin en gel (5)

3) Cul es el fundamento de la cromatografa en columna?

La cromatografa en columna es un mtodo muy utilizado para la separacin/purificacin de
diferentes compuestos orgnicos que se encuentren en estado slido o lquido.

Consiste en una fase estacionaria; un absorbente colocado en el interior de una columna de

vidrio, con una llave para controlar el paso de sustancias, y un eluyente o fase mvil, que
atraviesa el sistema llevando consigo la muestra. Los compuestos disueltos en la fase mvil,
poco a poco saldrn de la columna y son recogidos en fracciones. Las fracciones menos
polares, son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente y son las primeras
en salir. Las ms polares, quedan retenidas por ms tiempo y a menudo es necesario el uso de
diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que sean arrastradas
por estos.
El absorbente mayormente usado es el gel de slice, cuando ste es incompatible con la mezcla
a cromatografiar, se utilizan la almina o el florisil (silicato magnsico).
 4) Qu tipos de fase solida se utilizan para los medicamentos biotecnolgicos?
De manera convencional se utilizan:
Cartuchos o columnas: Cilindros con medio sorbente dentro (absorbente o adsorbente), con
lo cul se eliminan impurezas de bajo peso molecular y sto permite fcilmente a protenas
del resto de componentes celulares, sin embargo, sto no es selectivo para las protenas o
metabolitos de inters. Adems resulta en una elevacin del coste de produccin al requerir
procesos de purificacin posteriores.
Discos: Compuestos de un medio o material sorbente, funcionan de la misma manera que los
cartuchos o columnas, pero stos se diferencian por el tamao de poro (de hasta 8
micrmetros), mientras que el de los cartuchos o columnas es mayor (hasta de 40
micrmetros). Son evidemente ms especficos (por el tamao de poro) sin embargo, siguen
si ser selectivos por un slo tipo de compuesto de inters.
Nanomateriales basados en carbono: Materiales como el grafeno, xido de grafeno y
nanotubos de carbono, son un mtodo muy eficiente y selectivo, sin embargo, el proceso de
recuperacin de la matriz slida de separacin es muy complicado; con lo cual, se encarece el
coste de produccin, adems de tener que renovar la matriz con cada proceso de separacin
para la obtencin del metabolito de inters.
Dendrmeros: Son compuestos esfricos, con un grupo funcionalizado para ser afines hacia
ciertos compuestos, al igual que los nanomateriales, son bastante selectivos, pero presentan
el mismo problema a la hora de su recuperacin, sin embargo se han diseado dendrmeros
magnticos (para poder recuperarlos posterior a la purificacin del analito, o por otra parte
ser inmovilizados a una matriz mesoporosa.
Inmuno sorbentes: Tambin conocidos como anticuerpos mono o policlonales, son una
eleccin muy utilizada para la seleccin de compuestos especficos, sin embargo presentan las
mismas limitantes que los dos anteriores. Una solucin a ste problema es la funcionalizacin
a nanopartculas magnticas o a una superficie mesoporosa. Pero su mayor desventaja es la
estabilidad despus de un nmero de ciclos de purificacin, debido a las condiciones de pH y
temperatura a los que pueden ser expuestos y con ello altera su estructura.

Recientemente se ha descrito a la extraccin de fase slida de impresin molecular (MISPE).

Un polmero con impresin molecular (MIP) es un polmero que se ha procesado usando la
tcnica de impresin molecular que deja cavidades en matriz polimrica con afinidad a una
molcula elegida de molde.

Figura 1 Esquema de la sntesis de MIP para un tipo especfico de molcula.

El procedimiento generalmente implica iniciar la polimerizacin de monmeros en presencia
de una molcula molde que se extrae posteriormente, dejando as atrs cavidades
complementarias. Con ello se logra una elevada selectividad, adems de poder funcionalizar
qumica dichas matrices para poder llevar a cabo la separacin por peso, tamao y carga neta
de la protena (en caso de ser protena) o por afinidad (en caso metabolitos de inters
teraputico). La figura 1 ilustra el proceso de impresin molecular de polmeros.

An cuando esta tecnologa es selectiva para un slo tipo de compuesto, pudiendo descartar
as, isoformas incluso, el costo es muy elevado. Una consulta rpida en la pgina de SIGMA-
ALDRICH nos muestra el anti MIP (o templado) para anticuerpos producido en conejo, el costo
es para 100 microlitros de MIP, lo que evidencia que an no es viable para su uso en la
industria. (figura 2).

Figura 2 Consulta de un tipo de MIP para anticuerpo, producido en conejo. El costo es para
100 microlitros de compuesto.

Bibliografa:

Justyna Potka-Wasylka, Natalia Szczepaska, Miguel de la Guardia, Jacek Namienik, Modern

trends in solid phase extraction: new sorbent media, Trends in Analytical Chemistry (2015).
http://dx.doi.org/doi: 10.1016/j.trac.2015.10.010

L.M. Madikizela, N.T. Tavengwa, L. Chimuka, Applications of molecularly imprinted polymers

for solid-phase extraction of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and analgesics from
environmental waters and biological samples, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis (2017). http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2017.04.010
 5) Con los medicamentos biotecnolgicos Qu mtodos para purificacin de protenas se
pueden utilizar?
- Columnas cromatogrficas
- Cromatografa de intercambio de iones
- Cromatografa de interaccin hidrofbica
- Cromatografa de exclusin de tamao
- Separacin magntica por anticuerpos o protenas con afinidad.
- Purificacin por afinidad con antgenos o anticuerpos.
- Purificacin por cola de Histidinas o cromatografa de afinidad de metal inmovilizado
(IMAC)
- Uso de aptmeros va SELEX (systematic evolution of ligands by exponential
enrichment). (3)
6) Qu son los Mab?
Los anticuerpos monoclonales por sus siglas en ingls (monoclonal antibodies). Los
anticuerpos monoclonales estn formados por una nica clona de clulas B a diferencia de
las policlonales, donde se utilizan diferentes clonas de clulas B (4).
7) Qu caractersticas tiene un anticuerpo monoclonal contra uno policlonal?
Caractersticas Policlonales Monoclonales
Produccin Inmunizacin repetida de un Hibridomas(fusin de
adecuado animal. linfocitos B con cultivos de
clulas inmortales).
Sitios de Mltiples epitopes. Solo un epitope.
reconocimiento
Variabilidad Muchos anticuerpos Multiples copias del mismo
diferentes anticuerpo exacto
Tolerancia Presentan tolerancia a El epitope del antgeno
pequeos cambios en la siempre debe ser el mismo y
naturaleza del antgeno. no presentar ningn tipo de
cambio.
Usos - Deteccin de - Anticuerpos primarios
protenas en un ensayo.
desnaturalizadas. - Para detectar
- Cuando la naturaleza antgenos en un
del antgeno en una tejido.
especie no estudiada - Purificacin por
no se conoce. afinidad.

(1) https://www.elsevier.com/life-sciences/biotechnology

(2) CHEMIK 2012, 66, 8, 811-816

(3) Mayank Saraswat, Luca Musante, Alessandra Ravid, Brian Shortt, Barry Byrne,
and Harry Holthofer, Preparative Purification of Recombinant Proteins: Current
Status and Future Trends, BioMed Research International, vol. 2013, Article ID
312709, 18 pages, 2013. doi:10.1155/2013/312709
(4) http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf

(5) Pandey, A. (2017). Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. Amsterdam:

Elsevier.