INTRODUCCIN:

E.coli forma parte de la familia Enterobacteriaceae.Est integrada por bacilos Gram negativos no
esporulados.Incluye grmenes generalmente mviles, que producen cido y gas a partir de la
glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azcares.

Son mviles con flagelos peritricos o inmviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de

crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y
oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos,
reductores de nitratos a nitritos.

Producen reaccin positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por
KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como nica fuente de carbono y energa, pero s
en caldo acetato. Son H2S, ureasa y fenilalanina negativos, pero en general son indol positivos y
decarboxilan la lisina.

Se encuentra comnmente en el sistema digestivo de los seres humanos y animales de sangre

caliente. Debido a su alta presencia en el intestino, la E. coli se utiliza como el indicador principal
para detectar y medir la contaminacin fecal en la evaluacin de la inocuidad del agua y de los
alimentos.

Integran tambin esta familia otros gneros por su asociacin con infecciones intestinales, como
son Salmonella, Shigella y Yersinia.

Staphyloccocus aureus pertenece a la familia microccaceae, utiliza la glucosa por fermentacin a

diferencia de los miembros del gnero microccocus que utiliza la va oxidativa. Son cocos Gram
positivos, miden de 0.1-1.5 mm de dimetro, se dividen en ms de un plano y forman agregados
celulares que parecen racimos de uvas. Son inmviles, aerobios o aerobios facultativos, su
temperatura ptima de crecimiento es de 30-37C y su pH ptimo es de 7-7.5. El gnero
staphylococcus cuenta con varias especies, de las cuales la ms importante como patgena es s.
aureus. Esta especie tiene una enzima que provoca la coagulacin del plasma (coagulasa) lo cual
facilita su diferenciacin de otros que no tienen la enzima (especies coagulasa negativa).

JUSTIFICACIN:

El queso Oaxaca tradicional goza de gran reconocimiento y consumo a nivel nacional, al ser
elaborado con leche cruda de vaca es considerado como factor de riesgo para la salud, sin
embargo, contiene flora natural no patgena como las bacterias lcticas (BAL), que le proporciona
caractersticas extraordinarias y su reconocida tipicidad siendo importante su caracterizacin.

Entre la flora patgena existen diversos alimentos asociados a las toxiinfecciones de E. Coli, pero
la fuente ms frecuente es la carne de vacuno y los productos crnicos de vacuno (hamburguesas,
carne picada, etc) que hayan sido poco cocinados, as como la leche cruda y los productos
elaborados con ella (queso, nata, etc.).

De igual forma el crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos tiene gran importancia por
tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina que al ingerirse causa
intoxicaciones alimentarias. Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en
alimentos estn: confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de una
enfermedad de origen alimentario.

Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de
pastelera y productos de leche, son los ms comnmente asociados con intoxicacin
estafilocccica.

OBJETIVOS:
 Llevar a cabo las pruebas especficas para identificar E.coli y Staphyloccocus aureus
Realizar la deteccin, aislamiento e identificacin de E.coli y Staphyloccocus aureus en Queso
Oaxaca.
Determinar la contaminacin por E.coli y Staphyloccocus aureus en Queso Oaxaca y compararlo con
la Norma.
Mediante la presencia de Staphyloccocus aureus ver si se manipul de manera correcta la
elaboracin de Queso Oaxaca.
MATERIALES GENERALES:

PREPARACIN DE LA MUESTRA:

Materiales:

4 frascos
Una probeta
Cuchillo
Tenedor
Cuchara
Caja para pesar la muestra
Tabla para picar
3 pipetas de 10 mL
Agua destilada
* Se pone a esterilizar el cuchillo, caja para pesar, tenedor, tabla, cuchara, las pipetas. En el horno de calor
seco utilizando 120C por lo menos 90 minutos.
 CUENTA MESOFILICA VIABLE

Materiales:

9 cajas Petri esterilizadas.

3 pipetas de 1mL.
Medio de cultivo.
Nota: Todo el material a utilizar se debe de esterilizar previo a su uso.

Metodologa:

Preparar 180 mL de
A cada caja estril agregarle
medio de cultivo
1mL
(3 cajas para cada dilucin)

Esterilizar

Dejar enfriar, hasta Agregar 20 mL de

que lo tolere la medio a cada caja ya
palma de la mano. inoculada.

Llevar a incubacin a
37C por 24 horas.

COLIFORMES TOTALES

Materiales:

18 Cajas Petri
3 pipetas de 1mL
3 Varillas en L
Medio de cultivo Rojo Violeta Bilis
Nota: Todo el material a utilizar se debe de esterilizar previo a su uso.

Metodologa:

1.- Preparar 180 mL 2.- Agregarle a cada 3.- Etiquetar 3 cajas para
del medio caja 20 mL del medio las ltimas 3 diluciones.

6.- Se lleva a inocular a 5.- Se le extiende con la 4.- Cada tres cajas se le
35C varilla en L. agrega 0.1 mL de muestra
TINCIN DE GRAM

Materiales:

Portaobjetos
Cubreobjetos
Yodo
Safranina
Cristal violeta
Lugol
Asa bacteriolgica

Metodologa:

1. Frotis + cristal violeta (1 minuto)

2. Eliminar el exceso de colorante con agua
3. Agregar lugol (1-2 minutos)
4. Eliminar lugol (sacudir frotis) y decolorar
5. Decolorar con alcohol-acetona o alcohol gota a gota
6. Agregar safranina(30 segundos)
7. Lavar con agua y sacudir ( secar al aire)
Identificacin de E.coli
McConkey

Colonias Rosas
 La presencia de E.coli debido a las caractersticas en las que se desarrolla nos indicara la
presencia de Salmonella.
Aislamiento

McConkey Agar

Fundamento:

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del
color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales
biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Materiales:

3 cajas Petri
Asa bacteriolgica
Medio de cultivo
Metodologa:
1.- Esterilizar las cajas Petri.
2.- Preparar 60 mL de medio de cultivo y esterilizar.
3.- Agregarle a cada caja 20 mL de medio de cultivo.
4.- Inocular mediante estra cruzada.
Identificacin:

Las Colonias de E.coli son rojas con halo turbio.

Pruebas de Identificacin:

Siembra medio TSI:

Fundamento:

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentracin 10 veces mayor de
lactosa. Las Entero bacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este
azcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa estn presentes como constituyentes de las
bacterias, y stas pueden obtener mayor energa por utilizacin del azcar ms simple

Interpretacin:

1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradacin aerbica de glucosa. Amarillo en

capa profunda: cido; degradacin anaerbica de la glucosa.
2. Amarillo en pico: cido Amarillo en capa profunda: cido
3. Rojo en pico de flauta: alcalino Sin cambio de color en capa profunda: alcalina.
4. Produccin de H2S: precipitado negro
5. Produccin de gases: Produccin de burbujas, descomposicin del medio, ligera muesca del
medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre.

Presencia de E.coli:

Siembra medio TSI

Degradacin de Negativo
FIN
la glucosa (Rojo)

Positivo
(Amarillo)

Produccin de Gas

Positivo FIN
(Rompe el medio)

Produccin de cido Positivo (Medio

Sulfhdrico color negro).

(Medio
 FIN
Negativo (Medio color
Amarillo).

E.coli

Citratos

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de
enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de
cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del
medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a
pH 7,6.
El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de
un viraje del indicador al azul. La prueba es negativa para E. Coli.

Materiales:

Medio de cultivo Citrato Simmons

Microorganismo
Asa microbiolgica
3 Tubos de ensayo

Metodologa:

1. Se prepara 45 mL el medio de cultivo y llevarlo a esterilizacin.

2. Vaciarlo en los tubos de manera inclinada.
3. Sembrar el medio de cultivo en el pico de la flauta.
4. Llevar a incubacin por 24 horas a 35C.

Interpretacin de presencia de E.coli:

Agar Citrato
FIN
Color verde

Color azul
 E.coli

Prueba de Indol

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las
bacterias que poseen la triptfanos son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica
importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est
basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-
dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio
de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Procedimiento:

Materiales
9 tubos de ensayo con campanas de Durham 180 mL de Medio de cultivo agua de peptona
Reactivo de Kovacs
20 mL de ter o xileno

Mtodo
1. Preparar el medio de cultivo y agregar 20 mL a cada tubo de ensayo.
2. De cada dilucin tomar un mililitro y agregar a los tubos de ensayo
3. Poner en incubacin por 24 h
4. Agregar 1mL de eter a cada tubo ,esto para extraer y concentrar el indol producido
5. Llevar a incubacin a 35C.
6. Despus de la incubacin aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del
tubo.

Interpretacin de los resultados

El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus
de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Observar el color desarrollado al agregar el reactivo revelador:

Positivo: color rojo en la interface del reactivo y el medio de cultivo.
Negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.
Bibliografa:

http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf
http://www.bvsops.org.uy/pdf/coli.pdf

Bibliografa:

http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf
http://www.bvsops.org.uy/pdf/coli.pdf