Formaldehdo: pasado, presente y futuro

Por ms de un siglo el formaldehdo ha sido el fijador ms ampliamente usado en todas las

reas de la histologa, excepto para la microscopia electrnica. En parte, esto ha sido porque la
formalina, la solucin acuosa de formaldehdo, ha sido la opcin ms simple y econmica.
Los fijadores llamados especiales como Zenker, Helly, Bouin y muchos otros contienen
componentes caros, vida de estantera corta, requieren un tiempo limitado de exposicin para
los especmenes, o necesitan pasos extra en el protocolo de tincin para remover precipitado
no deseado. No importa que casi todos produzcan un patrn morfolgico llamativo o colores
vibrantes. El costo y la simplicidad ganan, ya sea hoy o hace 100 aos atrs.

Teniendo en mente que antes de 1980, el ritmo en los laboratorios clnicos era mucho ms
relajado que hoy en da.
Especmenes que llegaron en la maana fueron fijados todo el da y parte de la noche,
mientras que aquellos que llegaron tarde en el da se mantuvieron hasta la maana siguiente
corriendo en el procesador. Muchos laboratorios siguen las recomendaciones de los principales
libros, de fijar como mnimo 24-48 hrs. Haba poca prisa para el diagnostico; cuando el tiempo
era crtico, los cortes congelados era la norma.

La formalina era el rey porque trabajaba muy bien. En los tiempos asignados para la fijacin,
hermosas preparaciones eran rutinariamente archivados en una base consistente; de hecho,
eran esperados por los viejos maestros como Ham, Maximow, Bloom y Fawcett, autores de
libros standard de histologa. Los patrones de cromatina nuclear representados en sus libros
fueron claramente definidos y delicadamente manchado.
El contraste de colores vara en la sombra acorde al tipo de tejido.
Los tricromos eran realmente superfluos para muchos casos, pero el tiempo que estaba
disponible y las tinciones tan especiales fueron ordenados en la cercana de todo (o eso
pareca).

Qumicamente hablando, la virtud formaldehdo es que forma complejos con muchos grupos
terminales en la mayora de las macromolculas de tejidos. Esto es debido a su reactividad. Un
grupo aldehdo (doble enlace de oxgeno) en una molcula con un solo tomo de carbono es
inestable (tiene alta energa) y se unir a cualquier otro grupo que tenga menor nivel de
energa En concreto, el formaldehdo se une a sitios que contienen una tomo de hidrogeno
reactivo, incluyendo amidas, aminas, hidroxilos, pptidos, sulfhidrilos, y posiblemente
carboxilos.

Los hidrgenos pueden compartir su electrn disponible con otros tomos. El carbono tambin
comparte el electrn con el de hidrgeno, es decir, que el electrn pasa la mitad del tiempo
alrededor de cada tomo. Sin embargo, el nitrgeno, azufre, u oxigeno no comparten ese
electrn de la misma forma, por lo que el hidrogeno adquiere una carga parcial de
aproximadamente 0.3. Este es un hidrogeno reactivo. Se puede sacar completamente mediante
enlace covalente, o puede permanecer en enlaces de hidrogeno.

He seguido la secuencia de fijacin de formaldehdo a travs del uso del software de

modelacin de molculas. Para simplificar aqu, modelamos la fijacin y el cross-linking de
pequeos polipptidos que servirn para representar macromolculas del tejido adyacente
(Fig. 3). Mientras ambos tengan numerosos sitios de reaccin potencial (tomos de hidrogeno
activos), usaremos slo los dos marcados con flechas. Cada esfera indica el tamao de la nube
de electrones alrededor de cada tomo. Tenga en cuenta que los tomos de hidrogeno unidos
a nitrgeno, oxigeno y sulfuro son ms pequeos que aquellos unidos a carbono: esos son
hidrgenos activos.
En las siguientes figuras, los colores sern oscuros excepto por los tomos de geranio para la
discusin.

El primer paso de la fijacin es la penetracin (Fig.4). El formaldehdo se une a un sitio activo,

un grupo hidroxilo (-OH) (Fig. 5). En una secuencia de silla musical, el carbono del formaldehdo
reemplaza al hidrogeno activo que se une con el oxigeno del formaldehdo.
Este grupo hidroxilo recin creado a partir del carbono del formaldehdo tambin es reactivo
(note como el pequeo tomo de hidrgeno aparece), y se combinar con un segundo
hidrgeno reactivo si uno est convenientemente disponible.

Ahora tenemos molculas entrecruzadas.

En esta reaccin de puente final, el grupo hidroxilo de la antigua molcula de formaldehdo y el
hidrgeno reactivo en la molcula de azufre se separan para formar una molcula de agua.
Lo que queda del fijador original es un solo tomo de carbono (con dos hidrgenos, solo uno
de los cuales es visible en el modelo) acortando la brecha entre las molculas del tejido. Esto es
llamado puente de metileno (metil denota un tomo de carbono).

El software me dejo dibujar las estructuras de cualquier manera que yo quiera, incluso si la
conformacin espacial tridimensional no es natural. El computador ha sido programado con
longitudes y ngulos preferidos por cada clase de unin, sin embargo, y puede corregir
cualquier deficiencia en mis representaciones. Como dibujo inicial, algunos tomos pueden
estar en el camino de otros. tomos vecinos pueden tener cargas que repelen fuerzas o cargas
opuestas que causan atraccin. El computador considera todas esas necesidades elctricas y
espaciales, balancendolas con longitudes y ngulos de lazos ptimos. A travs de un complejo
proceso iterativo, encuentra la posicin ms cmoda para la poblacin de tomos dentro de la
molcula. Al final, los clculos llegan en la mejor conformacin, e.g., uno de los ms probables
que exista en la naturaleza.

Para apreciar esto en nuestro ejemplo, compare cuidadosamente la posicin del poli pptido
azul en la figura 6 y 7. He mantenido estacionado el poli pptido violeta. La figura 6
representa el entrecruzamiento de poli pptidos antes de la conformacin de la opzonizacion.
De bajo el puente de metileno son 2 aminas primarias sobre el poli pptido violeta, cada
uno compuesto de un tomo de nitrgeno (azul) con 2 hidrgenos reactivos. Estos llevan una
carga de de 0.3.

Mas a la derecha hay un carbono y un oxigeno unido con un doble enlace al poli pptido azul.
Este lleva una carga parcial de -0.5. La distancia entre el nitrgeno ms lejano y el oxigeno es
de 6.3. Las cargas y distancias de los centros atmicos son determinadas por el programa.
Ahora observe la figura N7. Fuerzas de atraccin negativas entre el carbono y positivas en
las aminas han unido los poli pptidos cerrando el espacio a 2.8. Esto produce varios
cambios sutiles pero importantes. Primero, las cargas parciales en los sitios ya mencionados
esencialmente han sido neutralizadas. Esto cambia las caractersticas de la carga de la
molcula. Segundo, 2 enlaces de hidrogeno se forman. Aunque estos sean dbiles, ellos
completan el puente transversal (crossbridge) del metileno, y as refuerzan la conexin total
que une los poli pptidos anteriormente libres (sueltos, solos, no se). La molcula se ha
hecho ms rgida. Tercero, el encogimiento del tejido ocurre por el movimiento de las
molculas juntas. Por ltimo, los antiguos poli pptidos han cambiado de forma, y no
simplemente mediante la unin.
Algunas partes estn torcidas en relacin con las conformaciones originales. Debido a que las
enzimas microbianas y endgenas dependen del modelo de llave cerradura es decir que los
sustratos se unan, la decadencia y la autolisis se inhiben. Debido a que las enzimas
microbianas y endgenos dependen de llave en la cerradura se adapte a sus sustratos, el
deterioro y la autolisis se inhiben. En resumen, la muestra se ha desnaturalizado, o fijado.

En realidad, las molculas fijadas estn unidos por muchos enlaces cruzados e incluso un
mayor nmero de otros tipos de enlaces (inico, de hidrgeno, y fuerzas van der Waals). Que
queda demostrado en este modelo de poli pptido simple. Esto produce desnaturalizacin a
gran escala. Tenga presente, sin embargo, que crosslinking es un proceso lento, y hay muchos
otros modos de efectuar desnaturalizacin.
Desnaturalizacin inducida por formalina es buena para la morfologa, pero mala para
histoqumica por la participacin de enzimas y reactivos inmunolgicos.
El calor y disolventes como el alcohol son eficaces desnaturalizantes, pero cambian la forma
molecular, que por lo general se traduce en pobres patrones morfolgicos.

Molculas de tejido fijado en formalina durante 24-48 horas adquieren tantos reticulaciones y
otras conexiones que no son capaces de ser alterado por otros agentes qumicos o fsicos que
se encuentran normalmente en el procesamiento y la tincin. En contraste, dbilmente las
muestras fijadas se pueden volver a desnaturalizaron por el alcohol y el calor, que es la razn
por lo que muchos tejidos hoy espectculo sorprendente artefactos. Nuclear y citoplasmtica
burbujeante (fig. 8) se produce cuando cromatina moderadamente fija (24.07 horas) en
formalina, luego ms desnaturalizado durante el resto de procesamiento. Ncleos Menos fijos-
(0-7 horas en formalina) sufren una mayor alteracin del alcohol y el calor:
Las molculas del tejido fijadas en formalina durante 24 -48 horas adquieren tatos
entrecruzamientos y otras conexiones que ellos son incapaces de ser cambiados por otros
agentes qumicos o fsicos normalmente encontrados en el procesamiento y la tincin . Al
contrario especmenes dbilmente fijados pueden ser re desnaturalizados por el alcohol y
el calor, que es la razn porque tantos tejidos hoy muestran artefactos asombrosos. Burbujas
que se observan en el ncleo y la cromatina ocurren cuando la cromatina modernamente
fijada (7- 24 horas) en formalina, se re desnaturaliza durante el resto del tratamiento.
Ncleos menos bien fijos (0-7 horas en la formalina) sufren una mayor alteracin del alcohol y
el calor: los patrones de la cromatina se pierden. En total, con algunos ncleos tomando
colores extraos (Fig. 9). Debido a que en la carrera diaria de muestras en un laboratorio puede
incluir muestras con poca o nula fijacin, as como los tejidos con un da o ms de la
exposicin de formalina, variacin en la apariencia de las diapositivas es desenfrenado por
causas ajenas a las manchas o los tcnicos.

Hoy en da existe una intensa presin para resultados ms rpidos de los especmenes. Los
laboratorios han sacrificado tiempo de fijacin para obtener esta velocidad en un profundo
desprecio por la qumica de fijacin con formol. Lamentablemente, la realidad consiste en que
pocas instalaciones histopatolgicas tienen el lujo de fijacin de 24-48 horas. Evidentemente, la
formalina neutra es ms conveniente para nuestras necesidades desde ese punto de vista, no
importan las cuestiones de seguridad y la inmunohistoqumica

La formalina es uno de los peores fijadores para inmunohistoqumica. Es cierto que la mayor
parte de inmunotincin se realiza sobre tejido fijado en formol, pero mira hasta qu extremos
vamos a obtener resultados. La literatura sobre el reclamo de la antigenicidad es abrumadora,
con enzimas y calor que compiten por un estado preferido. Incluso el mtodo de calefaccin y
la consiguiente recuperacin las soluciones son muy diversas. Ningn mtodo sirve para todo.
Diferentes anticuerpos requieren diferentes tcnicas, y diferentes laboratorios usualmente
usan diferentes mtodos para el mismo anticuerpo debido a las variaciones locales de fijacin.
Siempre me he preguntado por qu gastamos tanto tiempo tratando de salvar un espcimen
arruinado cuando es tan fcil tener una excelente preservacin y mantencin de la estructura
total de inmunoreactividad. Dicho de otra forma, por qu comprometer un tejido fijado en
formalina solo porque tenemos productores que pueden recuperar los antgenos? Nosotros
usamos esa tcnica para evitar reacciones de falsos negativos pero en cambio a veces nosotros
creamos falsos positivos.