[Year]

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

PRACTICA DE LABORATORIO N4:

EFECTOS DE PH Y TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA
CATALASA Y PEROXIDASA EN LOS ALIMENTOS

Ao del Buen Servicio al Ciudadano

ESCUELA: Ingeniera De Alimentos.
PROFESORA: Blga. Ms.C. Alicia Cecilia
Decheco.
ASIGNATURA: Bioqumica.
TEMA: DETERMINACION
FOTOCOLORIMETRICA DE LA
OVOALBUMINA
MESA: 01
GRUPO:90 G

INTEGRANTES:
Asato Arakaki , Yukio Javier 1524110156
Beteta Len, Israel 1524110147
Cuenca Chirinos, Sebastin 1524110183
Guzman Urteaga, Mishelle 1524110227
Mamani Snchez, Lizbeth 1424125069
 PRACTICA DE LABORATORIO N4

Efecto del PH y temperatura sobre la actividad de la catalasa y peroxidasa

en los alimentos
I.- INTRODUCCION

Las clulas llevan a cabo simultneamente una gran cantidad de reacciones qumicas necesarias
para la vida. Muchos de los productos de esas reacciones se necesitan inmediatamente, y si no
fuera por la participacin de las enzimas, algunas reacciones no se produciran tan rpido. Las
enzimas, en su mayora protenas o RNA (riboenzimas), son catalizadores qumicos que agilizan
una reaccin que envuelve la formacin o rompimiento de enlaces qumicos. Las enzimas no se
consumen en las reacciones, ni tampoco se alteran, razn por lo cual no se necesitan en grandes
cantidades. Las enzimas actan sobre los sustratos formando un complejo enzimasustrato; esto
ocurre en un lugar en especfico conocido como el sitio activo de la enzima. Las enzimas son
muy selectivas porque pocas molculas pueden interactuar bien con este sitio

Las enzimas reducen la energa de activacin necesaria para llevar a cabo una reaccin;
es decir, reducen la barrera de energa que hay que sobrepasar para que la reaccin se
lleve a cabo.

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ALIMENTOS 1
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 II.- MARCO TEORICO

CATALASA

Es una enzima que se encuentra en las clulas de

los tejidos animales y vegetales, en los peroxisomas;
cuyo peso molecular es de 250000 (EC 1,11,1,6).
Esta enzima cataliza la descomposicin del perxido
de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua. El perxido
de hidrgeno es un residuo del metabolismo celular
de muchos organismos vivos, pero dada su toxicidad
debe transformarse rpidamente en compuestos
menos peligrosos. Para ello se usa con frecuencia
esta enzima que cataliza su descomposicin en
agua y oxgeno.

COMPOSICION DE UNA CATALASA

El centro activo de la catalasa es una clase de

protenas hemo denominada citocromos. El
hemo de la catalasa es un complejo de hierro
y porfirina de alto giro de protoporfirina IX.

Un citocromo consiste en uno o ms grupos

prostticos de hemo unidos por una
apoproteina hemo compuesta por porfirina
(cuatro anillos pirroles unidos por puentes
=CH) ms un tomo de hierro central que en
la reduccin acepta un nico electrn. El hierro
por lo general forma una coordinacin
compleja octadrica con seis ligandos, cuatro
de estos son tomos de N de los pirroles que
contienen el hierro dentro del plano del anillo
porfirina y los otros dos son tomos adecuados en
los residuos del aminocido adyacente.

Es un tetrmero en el que cada unidad de protena contiene una porfirina con hierro; solo
una de esta reacciona en el proceso cataltico. Los cuatro tomos de hierro es en la
protena hemo estn en el estado oxidado. En las catalasas, el grupo hemo es el radical
orgnico; en el citocromo c peroxidasa y en otras peroxidasas, el radical est situado en
la cadena lateral o en un tomo de azufre de un aminocido.

REACCION CATALITICA

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ALIMENTOS 2
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 El H2O2, si se acumula, es toxico para las bacterias y produce su muerte. La catalasa
puede descomponer el H2O2, u oxidar sustratos secundarios, pero no tiene ninguna
accin contra otros perxidos. El H2O2 se descompone por medio de la accin de dos
enzimas:

Catalasa (perxido de hidrogeno oxidoreductasa)

Cualquier otra peroxidasa, NADH, fosfato de nicotina mina adenina dinucleotido

reducido (NADPH), citocromo c glutatin
.
La descomposicin cataltica de H2O2 involucra la reduccin del hierro trivalente en la
catalasa por H2O2 a su forma reducida y la reoxidacion de este ltimo por el oxgeno.
La catalasa puede funcionar de dos modos distintos: en el catabolismo del H2O2
(REACCION CATALITICA) o en la oxidacin perioxidativa de pequeos sustratos como
el alcohol etlico, el alcohol de metileno o el mercurio elemental (Hg0).

Existen vas metablicas dominantes entre la ferricatalasa y el compuesto I. el H2O2, un

poderoso agente oxidante, es una molcula estable que puede acumularse en una
concentracin alta. La catalasa cataliza la dismutacion del H2O2 de un estado reducido
a un estado oxidado, compuesto I, y regresa a un estado reducido, la catalasa nativa. La
estructura del compuesto I no es un complejo enzima-sustrato de peroxidasa y H2O2. El
compuesto I de catalasa nativa no puede reducirse por los agentes reductores comunes.
El compuesto I es un intermediario comn en la reduccin de perxidos; las proporciones
son independientes del pH. El pH ptimo para la actividad de la catalasa es de 7.0.

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ALIMENTOS 3
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 REACCION PEROXIDATIVA- MODO DE ACCION DE LA CATALASA

Los compuestos I. II y III son derivados perxidos de la enzima. Ni II ni III se producen

en la reaccin cataltica; son inactivos. Las peroxidasas por lo general difieren de las
catalasas en que ningn sustrato orgnico podr convertir directamente el compuesto I
en la enzima nativa.

El radical del compuesto I es ms reactivo que el compuesto II.

La catalasa puede tornarse inactiva por una cancentracion alta de sustrato,
probablemente por la conversin a un derivado tetra perxido, el compuesto III, este no
es reactivo para la mayora de los reductores.

El compuesto I de la catalasa puede reaccionar con un numero limitado de dadores de

hidrogeno como el etanol o el metanol y los oxida utilizando el oxigeno de una nica
molcula de H2O2 en un paso de oxidacin de dos electrones.
La oxidacin ocurre con dos transferencias separadas de un electrn: la reduccin del
compuesto I al compuesto II y la oxidacin de AH2 a AH(las formas reducida y oxidad
de los dadores adecuados del electrn.

Una amplia variedad de compuestos orgnicos puede actuar como AH2 . Adems del
H202, Los sustratos para la catalasa incluyen varios alcoholes. Formaldehido hidratado
(H2C(OH)2), acido nitroso yacido frmico. Asimismo pueden utilizarse sustratos
inespecficos como amina aromtica, fenoles y cidos aromticos. La catalasa puede
usar el H202 para oxidar los alcoholes metlico y etlico a sus aldehdos
correspondientes.

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ALIMENTOS 4
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 PEROXIDASA

Pertenece a la subclase de enzima

oxidoreductasas que catalizan la accin de
sustratos orgnicos con perxido de
hidrogeno, quedando reducida en agua.
Estas enzimas son protenas homo que se
hallan frecuentemente en plantas y
ocasionalmente en vegetales.
Las peroxidasas son enzimas que catalizan
la siguiente reaccin:

La reaccin importante de las peroxidasas es la es la anterior, sin embargo existen 3 tipos

de reacciones en las que puede intervenir reacciones peroxidativas, oxidativas o
hidroxilativas. Para la reaccin peroxidativa se requiere un perxido orgnico o de agua. El
nmero de compuestos que pueden ser aceptores de hidrgeno para algunas peroxidasa es
pequeo. Los compuestos donadores de hidrgeno pueden ser fenoles, aminas y otros
compuestos orgnicos. El mecanismo de la reaccin se basa en la formacin de complejos
de enzima-donador de hidrgeno y dos pasos de oxidacin univalente

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ALIMENTOS 5
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 ACTIVIDAD ENZIMATICA

Una de las propiedades de las enzimas importantes es que derivan del hecho de ser
protenas de actuar como catalizadores. Como protenas, estos poseen una
conformacin natural ms estable que las dems conformaciones posibles. As,
cambios en la conformacin suelen ir asociados en cambios en la actividad cataltica.
Los factores que influyen de manera ms directa sobre la actividad de una enzima
son:

-PH
-Temperatura

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA

De forma general, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente es proporcional

a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo, segn:

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ALIMENTOS 6
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 La velocidad de una reaccin catalizada
enzimticamente es generalmente
proporcional a la cantidad de enzima en la
mezcla de ensayo.

Con algunos sistemas enzimticos, en

especial cuando se trabaja con 3 extractos
enzimticos no purificados se observan
desviaciones respecto al patrn indicado,
debido, entre otros factores a la presencia de
activadores e inhibidores, a enzimas
oligomtricos disociables, etc.

EFECTO DELA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

La velocidad de una reaccin catalizada por una
enzima se incrementa al aumentar la temperatura
a la cual se lleva a cabo la reaccin.

La temperatura ejerce un doble efecto, sobre la

conformacin de la enzima y sobre la propia
reaccin.
En la Fig.3. Se representa la tpica curva actividad-
temperatura.
La velocidad de la reaccin se incremente al
aumentar la temperatura dentro de un determinado
rango, alcanzando un valor mximo a la
denominada temperatura ptima. A valores
superiores la actividad disminuye debido a que la
enzima, como cualquier otra protena, sufre
procesos de desnaturalizacin y, por lo tanto, de
inactivacin.

La relacin entre la actividad y temperatura viene determinada por la ecuacin

de Arrhenius:

DONDE
Ea La energa de activacin
R La K de los gases(2caK-1mol-1)
T La temperatura Absoluta (k)

EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDADENZIMATICA

La actividad de una enzima se ve afectada por el Ph al cual se lleva a cabo la reaccin.

La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (

En el caso ms general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la

actividad es mxima se denomina pH ptimo; dicho pH no tiene porque coincidir con el

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ALIMENTOS 7
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 pH intracelular. La relacin entre el pH y la actividad va a depender del comportamiento
cido-base de la enzima y el sustrato. El sustrato y la enzima (centro activo) contienen
grupos funciones cidos y bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente del pH,
lo que determinar, entre otros aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad
de unin del sustrato al centro activo de la enzima y la capacidad de transformacin del
sustrato.
La velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente se ve afectada
por el pH.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA

Se representa el efecto de la concentracin de sustrato

sobre la velocidad de una reaccin catalizada
enzimticamente. Aunque no con todas las enzimas se
observa dicho comportamiento (sera el caso de enzimas
alostricas), es el caso ms habitual y sencillo; las
enzimas que se ajustan a dicho modelo se conocen con
el nombre de enzimas michaelianas.

El anterior modelo cintico se ajusta a la

ecuacin:

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ALIMENTOS 8
PRCTICA DE LABORATORIO N4
 Donde Km es la constante de michaelis e indica la
afinidad de la enzima por su sustrato, y V max es la
velocidad mxima e indica la capacidad cataltica.
La determinacin de los parmetros cinticos Km y
Vmax se puede llevar a cabo utilizando la
representacin de Lineweaver-Burk (1/v:1/S)
La correspondiente ecuacin sera:

1/S

III.- OBJETIVOS

Determinar la intensidad de reaccin de la

enzima catalasa de origen animal y vegetal.

Determinar el efecto de temperatura, pH y

concentracin de sales sobre la actividad
cataltica de la catalasa.

Calcular la velocidad mxima de reaccin

peroxidasa.

Determinar la concentracin de sustrato

necesario para alcanzar la mitad de la
velocidad mxima.

Evaluar el efecto de la concentracin de

sustrato sobre la actividad enzimtica.

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ALIMENTOS 9
PRCTICA DE LABORATORIO N4
lll.-MATERIALES, MUESTRAS, REACTIVOS

INSTRUMENTOS

GRADILLA

PIPETA

PROPIPETA

TUBO DE ENSAYO

PISETA

MORTERO

RAYADOR

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0
 MUESTRAS

HIGADO DE RES

MAIZ GERMINADO

PAPA

RABANITO

UVA

REACTIVOS

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1
 HIDROXIDO DE SODIO

CLORURO DE CADMIO

ZINC

BICARBONATO AL 1%

CLORURO DE COBALTO

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2
 CLORURO DE ESTRONCIO

VINAGRE

CLORURO DE BARIO

IV.-PROCEDIMIENTO

BARRIDO

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3
 SE COLOCA EN LA GRADILLA 4 TUBOS DE
ENSAYO DE LAS MISMAS CARACTERISTICAS,SE
TITULA A CADA UNO CON EL NOMBRES DE LAS
MUESTRAS A USAR.

EL MAIZ GERMINADO SERA COLOCADO EN EL

MORTERO CON UN POCO DE AGUA, SE
UTILIZARA EL PILON PARA PODER MOLER EL
MAIZ ,PARA OBTENER LA MUESTRA

SE COLOCA EN CADA TUBO DE ENSAYO 5ML DE

LAS RESPECTIVAS MUESTRAS: HIGADO, MAIZ ,
PAPA,UVA,RABANITO.

SE COLOCA EN LA GRADILLA 4 TUBOS DE

ENSAYO DE LAS MISMAS CARACTERISTICAS,SE
TITULA A CADA UNO CON EL NOMBRES DE LAS
MUESTRAS A USAR.

EL MAIZ GERMINADO SERA COLOCADO EN EL

MORTERO CON UN POCO DE AGUA, SE
UTILIZARA EL PILON PARA PODER MOLER EL
MAIZ ,PARA OBTENER LA MUESTRA

SE COLOCA EN CADA TUBO DE ENSAYO 5ML DE

LAS RESPECTIVAS MUESTRAS: HIGADO, MAIZ ,
TEMPERATURA PAPA,UVA,RABANITO.

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4
 SE COLOCA EN LA GRADILLA 4 TUBOS DE ENSAYO DE
LAS MISMAS CARACTERISTICAS,SE TITULA A CADA UNO
CON EL NOMBRES DE LAS MUESTRAS A USAR.

SE COLOCA EN CADA TUBO DE ENSAYO 5ML DE LAS

RESPECTIVAS MUESTRAS: HIGADO, MAIZ ,
PAPA,UVA,RABANITO.

PONDREMOS LOS TUBOS EN BAO MARA A 80C POR

30 , 1 , 3, 6 Y 9

SE UTILIZARA 5 TUBOS DE ENSAYOS PEQUEOS

PARA COLOCAR 2ML DE AGUA OXIGENADA

SE OBSERVARA LA RX OBTENIDA , LUEGO SE

APUNTARA LOS RESULTADOS(TIPO DE RX,
INTENSIDAD DE RX, TIEMPO DE RX) CON BARRIDO
SE PUDO ENCONTRAR AL A MUESTRA INDICADA
PARA LAS DE MAS PRUEBAS
METALES PESADOS

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5
 SE COLOCA EN LA GRADILLA 4 TUBOS DE ENSAYO DE LAS
MISMAS CARACTERISTICAS,SE TITULA A CADA UNO CON
EL NOMBRES DE LAS MUESTRAS A USAR.

EN CADA TUBO DE ENSAYO SE COLOCA 5ML DE HGADO

ACTO SEGUIDO PONEMOS LOS METALES PESADOS

A LOS TUBOS MEDIANOS COMO NOS INDICA LA
TABLA

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6
 LO DEJAMOS REPOSAR POR 7
MINUTOS A LOS TUBOS

ACTO SEGUIDO SE COLOCARA LOS 2 ML DE AGUA

OXIGENADA A CADA UNO DE RESPECTIVOS TUBOS
DE ENSAYOS.

SE OBSERVARA LA RX OBTENIDA , LUEGO SE APUNTARA LOS

RESULTADOS(TIPO DE RX, INTENSIDAD DE RX, TIEMPO DE
RX) CON BARRIDO SE PUDO ENCONTRAR AL A MUESTRA
INDICADA PARA LAS DE MAS PRUEBAS

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7
 MUESTRA INTENSIDAD TIEMPO DE REACCION
REACCION
HIGADO ++++ 3.6 segundos Completa
MAIZ ++++ 13.46 segundos Completa
PAPA ++ 16.2 segundos Completa
RABANITO - - Incompleta
UVA - - Incompleta

V.-RESULTADOS

Representar los valores de velocidad enzimtica frente a la cantidad de extracto

enzimtico presente en las muestras.

BARRIDO:

Indicar en qu rango de Ph el enzima es activo y el valor del Ph ptimo.

Representar los valores de la velocidad enzimtica frente a la temperatura de ensayo.

Indicar de la temperatura ptima.

TABLA DE MAIZ (temperatura):

TUBO TIEMPO DE INTENSIDAD REACCION

REACCION
1 30 3 minutos ++++ Completa
2 1 13 minutos +++ Completa
3 3 20 minutos + Completa

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8
 4 6 - - Incompleta
5 9 - - Incompleta

Representar los valores de velocidad enzimtica frente al ph.

TABLA DE PH:

MUESTRA pHi pHf TIEMPO DE REACCION

REACCION
MANDARINA 4 5 1.3 segundos Completa
LIMON 4 4 22 segundos Completa
VINAGRE 4 3 1.56 segundos Completa
BICARBONATO 4 6 1.18 segundos Completa
NaOH 4 8 0.83 segundos Completa
AGUA 4 5 0.72 segundos Completa

Representar los valores de velocidad enzimtica frente a los metales pesados.

METALES PESADOS:

METALES TIEMPO REACCION INTENSIDAD

PESADOS
1 10 segundos Completa ++++
2 43.9 segundos Completa ++++
3 37.1 segundos Completa ++++
4 41.3 segundos Completa ++++

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9
 5 20.9 segundos Completa +++
6 10 segundos Completa ++++

En todos los casos estudiados, dar una respuesta razonada al por qu de las
variaciones de la velocidad de la reaccin (actividad enzimtica) observadas cuando
cambiamos el tiempo de la incubacin, cantidad de extracto aadido, Ph, temperatura
y concentracin de sustrato.
EFECTOS DE LOS ACTIVADORES ENZIMATICOS

Los activadores son sustancias que por variados mecanismos incrementan la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas.

Como activadores enzimticos se definen a las pequeas molculas, generalmente iones

inorgnicos, que son requeridos o al menos estimulan la actividad cataltica de una enzima, y al
contrario de los cofactores, no son participantes explcitos de la reaccin. Aun cuando pueden
plantearse diferentes formas de actuar, nos limitaremos a los dos casos mejor conocidos: la
interaccin obligatoria con la enzima libre y la interaccin obligatoria con el sustrato libre. En el
primer caso se encuentran muchas enzimas que poseen iones metlicos en su centro activo,
como la carboxipeptidasa que contiene Zn2+; otras enzimas parecen requerir la presencia de un
ion para estabilizar su conformacin de mxima actividad cataltica.

La reaccin general puede ser descrita de la forma siguiente:

Donde A representa la concentracin del activador.

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PRCTICA DE LABORATORIO N4
0
En el segundo caso se encuentran enzimas que catalizan reacciones en las cuales intervienen
nuclesidos di y trifosfatados, que requieren de la participacin simultnea de un catin divalente
(especialmente Mg2+) en cantidades estequiomtricas. Las investigaciones sobre estas
reacciones han mostrado que un mecanismo probable para esta activacin es la combinacin
del ion con el sustrato, previo a su interaccin con la enzima. El verdadero sustrato de la reaccin
sera el complejo sustrato-catin; el esquema de reaccin sera:

Explique cmo actan los activadores y los venenos enzimticos.

EFECTOS DE LOS VENENOS ENZIMTICOS

Los inhibidores son sustancias que por variados mecanismos disminuyen la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas.

Los inhibidores enzimticos son sustancias que tienen en comn la propiedad de disminuir la
velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas. Casi siempre se distinguen dos tipos
generales de inhibicin, la reversible y la irreversible, en el primer caso el inhibidor forma con la
enzima un complejo enzima-inhibidor (EI), unido por fuerzas no covalentes y que, por tanto,
puede disociarse; en el segundo se producen modificaciones covalentes de la enzima que no
pueden eliminarse fcilmente. En este captulo solo se tratarn los primeros.

Para estudiar el efecto y el tipo de los inhibidores se realiza una experiencia igual a la
determinacin del efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad, pero ahora en cada
uno de los tubos de ensayo se ha aadido un inhibidor en una concentracin fija. Como en los
casos anteriores, los resultados se llevan a una grfica y de acuerdo con esta se clasifican los
inhibidores; solo se estudiarn los casos ms tpicos.

v.-DISCUSION

En el BARRIDO se pudo observar que el higado (catalasa) tuvo una intensidad

elevada en un tiempo de 3 segundos llevndolo a ser una reaccin COMPLETA;
proseguido de la maiz (peroxidasa) en un tiempo de 13 segundos tambin

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1
llevndolo a una reaccin COMPLETA. Es decir, el hgado posee una de las
enzimas con mayor actividad.
En la prctica de temperatura (70C) en bao mara se observ al tubo 1
estando este durante 30 segundos sumergido en bao mara, un tiempo de
reaccin 3 segundos haciendo esta con mayor intensidad y un tipo de reaccin
COMPLETA; prosiguiendo del tubo 2 sumergida durante 1 minuto obtuviendose
un tiempo de reaccin de 13 minutos.
En la prctica de metales pesados se observ que el ClNa tuvo un tiempo de
reaccin de 10 segundos con una intensidad alta y un tipo de reaccin COMP

Vl.-CONCLUCIONES

Las frutas no cuentan con una cantidad considerable de

peroxidasa, por esa razn es que no reacciona rpidamente a
comparacin de las muestras que cuentan con una cantidad
considerable de peroxidasa.

Efectivamente; el pH y la temperatura influyen ptimamente

en la velocidad de reaccin de las enzimas.

La velocidad de reaccin se da por condiciones de

Temperatura, pH, Cofactores (activadores de enzimas
inactivas), concentracin de enzima en la mezcla, etc.

La peroxidasa influye en una reaccin conocida que permite que el perxido de

hidrogeno (H2O2) se divida en agua y oxigeno (H2O + O).

EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA Y PEROXIDASA EN LOS

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2
 La velocidad de una reaccin enzimtica depende de varios factores. Entre
stos est el pH. Cada enzima tiene un rango de pH en el que su actividad
enzimtica es ptima. Fuera de este rango la enzima por ser una protena
empieza a desnaturalizarse por la protonacin o desprotonacin de sus
aminocidos constituyentes.

Vll.-CUESTIONARIO

1-Explique los procesos de separacin y purificacin de enzimas.

Microfiltracin, Cromatografa de gel y diafiltracin

Procesos de separacin y purificacin de enzimas.

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PRCTICA DE LABORATORIO N4
3
 Para la separacin del tejido se debe sacar
de l las enzimas de las clulas que contiene
por medio de un homogeneizador, un
tratamiento muy enrgico lo comprende la
molienda de tejido con arena realizando
vibraciones ultrasnicas, congelamiento y
descongelamiento, la autolisis entre otros.

La purificacin de las enzimas se realiza a una

baja temperatura para as disminuir la perdidas
por desnaturalizacin en algunos casos esta
puede ser calentada durante unos minutos sin
embargo este no tendr ninguna prdida de su
actividad enzimtica. Para poder realizar la
pureza de una enzima es necesario realizar la
tcnica de purificacin de una protena algunas
de estas son: el anlisis por ultracentrfuga, el
electrofortico y otros.

2 Explique los mtodos de

determinacin y caracterizacin de las actividades enzimticas
de microorganismos
Congelacin.

La congelacin detiene el crecimiento de todos los microorganismos.

Los superiores (Hongos, levaduras, etc.).

A temperaturas mucho ms bajas (30C aproximadamente) la

supervivencia de las bacterias es mayor que en temperaturas de
congelacin ms altas (de -1a -9C), sin embargo estas temperaturas
tambin daan el alimento.

Durante el proceso de congelacin, la cantidad de

microorganismos contina disminuyendo. Sin embargo, la
actividad enzimtica de dichos microorganismos pueden
continuar, dando lugar a ms deterioro.

Elevadas temperaturas.

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PRCTICA DE LABORATORIO N4
4
Las temperaturas que son superiores a las de crecimiento optimo prducen inevitablemente la
desaparicin del microorganismo o le producen lesiones letales. Las clulas lesionadas pueden
permanecer vivas, pero incapaces de
multiplicarse hasta que la lesin sea superada.

La velocidad de termo destruccin se ve

afectada por factores intrnsecos (diferencia de
resistencia entre esporas y clulas
vegetativas), factores ambientales que influyen
el crecimiento de los microorganismos (edad,
temperatura, medio de cultivo) y factores
ambientales que actan durante el tratamiento
trmico (pH, tipo de alimento, sales).

3. Explique los mtodos de extraccin y ensayo de actividades enzimticas en vegetales

Muchos organismos pueden descomponer el perxido de hidrgeno (H2O2) por la accin de las
enzimas. Las enzimas son protenas globulares responsables de la mayor parte de la actividad
qumica de los organismos vivos. Actan como catalizadores, que son sustancias que aceleran
las reacciones qumicas sin ser destruidas o alteradas durante el proceso. Las enzimas son
extremadamente eficientes y se pueden utilizar una y otra vez repetidamente. Una enzima puede
catalizar miles de reacciones en cada segundo. Tanto los valores de pH como de la temperatura
a los que trabaja la enzima son extraordinariamente importantes. La mayora de los organismos
tienen un intervalo de temperatura preferente en el cual sobreviven y sus enzimas funcionan
mejor dentro de dicho intervalo de temperatura. Si el ambiente donde se encuentra la enzima es
demasiado cido o demasiado bsico, la enzima puede desnaturalizarse de forma irreversible o
transformarse de modo que su forma no le permita ms realizar su funcionamiento apropiado. El
H2O2 es txico para la mayora de los organismos vivos. Muchos organismos son capaces de
destruir el H2O2 mediante la accin de enzimas antes de que pueda realizar mucho dao. El
H2O2 se convierte en oxgeno y agua segn la siguiente reaccin: 2 H2O2 2 H2O + O2

Puede ser determinada por los mtodos espectrofotomtricos basados en la formacin de

compuestos coloreados que ocurre durante la reaccin con el hidrgeno y el sustrato donador.
Tambin puede ser estimada por la actividad residual despus de un tratamiento por
calentamiento, as como por la composicin de las isoenzimas.

Espectofometra:

Es la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un sistema qumico en funcin de

la longitud de onda; es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones

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PRCTICA DE LABORATORIO N4
5
bioqumicas y sntesis qumicas. El espectrofotmetro es un instrumento que cuantifica la
cantidad de energa absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Actividad residual

Las enzimas son protenas, y por tanto pueden desnaturalizarse por los mismos mecanismos
generales que las dems protenas. La forma ms habitual de controlar la actividad enzimtica
en un alimento es mediante su tratamiento trmico.

Cintica de inactivacin

Cuando se representa la actividad de un enzima frente al tiempo de calentamiento, se obtiene

una grfica como la de la figura:

Teniendo en cuenta que los enzimas se comportan desde el punto de vista cintico de forma
semejante a los microrganismos, el efecto del calentamiento se puede analizar matemticamente
por los mismos procedimientos.

Representando en forma semilogartmica la actividad residual de enzima frente al tiempo, para

cada temperatura:

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Se obtienen una serie de rectas, y de cada una de ellas se puede calcular el valor D, que se
define como el tiempo necesario para destruir el 90% de la actividad de un enzima calentndolo
a una temperatura dada. Evidentemente, un enzima tiene distintos valores de D a distintas
temperaturas (y en distintas condiciones del medio). El valor de D se calcula como la inversa de
la pendiente de la recta obtenida representando el logaritmo de la actividad enzimtica en funcin
del tiempo.

Una vez obtenidos los valores de D a distintas temperaturas, se pueden representar los valores
de sus logaritmos frente a las temperaturas correspondientes

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La grfica obtenida permite calcular el valor de Z, como inversa de la pendiente, y que se define
como el nmero de grados centgrados que es necesario aumentar la temperatura para que el
valor de D se reduzca en un 90%.

Evidentemente, estos valores sern para unas condiciones del medio dadas, especialmente en
lo que respecta al pH y a la fuerza inica. Tambin pueden influir otros factores, como la actividad
de agua, la presencia de ligandos, cofactores o sustratos, etc.

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4.-Defina: Residuos Catalticos, Mutasas, Inmunoadsorbentes, Constantes de disociacin,
Actividad molecular

RESIDUOS CATALITICOS
Se pueden definir las siguientes reglas para clasificar los residuos de sitios activos como
catalticos:

Estn directamente involucrados en el mecanismo cataltico

Ejercen un efecto en otro residuo o molcula de agua la cual est
directamente involucrada en el mecanismo cataltico.
Ejercen efecto en un sustrato o cofactor (molculas no
proteicas) que
ayudan a la catlisis.
Estabilizacin de un estado intermedio de transicin.
La siguiente figura muestra la estructura 3D de la protena
1T0K_B, donde se

aprecia en color rojo el sitio activo o de unin de la misma. La

forma en que se

pliega la protena depende de los enlaces entre aminocidos.

Sitio activo de la protena 1T0K_B

MUTASAS
La fosfoglicerato mutasa (PGAM) (EC 5.4.2.1) es
una enzima isomerasa que cataliza la octava etapa de
la gliclisis. Cataliza la transferencia interna de un
grupo fosfato desde el carbono C-3 al carbono C-2 que
resulta en la conversin de 3-fosfoglicerato a 2-
fosfoglicerato a travs del compuesto intermedio 2,3-
bisfosfoglicerato. La reaccin implica a dos grupos fosfato
diferentes, es decir el grupo fosfato final del 2-
fosfoglicerato no es el mismo que el grupo fosfato inicial
del 3-fosfoglicerato.

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 MECANISMO DE REACCION

En el estado inicial de la enzima, el sitio activo contiene un complejo fosfohistidina formado por la
fosforilacin de un residuo especfico de histidina. Cuando el 3-fosfoglicerato entra en el sitio
activo, el complejo fosfohistidina se posiciona para facilitar la transferencia del grupo fosfato desde
la enzima al carbono 2 del fosfoglicerato formndose as el compuesto intermedio 2,3-
bisfosfoglicerato. La defosforilacin del residuo de histidina efecta un cambio alostrico local en
la configuracin de la enzima que alinea el grupo fosfato del carbono 3 del bisfosfoglicerato con la
histidina del sitio activo de la enzima y facilita la transferencia del grupo fosfato. De esta forma se
devuelve a la enzima a su estado inicial fosforilado y se libera el producto 2-fosfoglicerato.

ISOZIMAS

La enzima se encuentra en organismos tan simples como las levaduras o tan complejos
como el homo sapiens. Su estructura ha sido bien conservada a travs de la evolucin.
As, el 74% de los residuos de la fosfoglicerato mutasa de las levaduras coincide con los
residuos de la fosfoglicerato mutasa humana. En las levaduras la fosfoglicerato mutasa
es una protena tetramrica. En los mamferos la fosfoglicerato mutasa se presenta como
un dmero de dos subunidades idnticas o casi idnticas de 32 kDa. Las subunidades
pueden ser:
PGAM-M. Llamada fosfoglicerato mutasa 2 o del msculo.
PGAM-B. Llamada fosfoglicerato mutasa 1 o de otros tejidos, aunque el nombre -PGAM-
B proviene de cerebro (B brain) que fue de donde se aisl por primera vez.
En forma de dmero, la enzima entonces se presenta en 3 isozimas dependiendo de que
subunidades forman la molcula (MM, BB o MB). El tipo MM se encuentra
exclusivamente en el msculo liso. El tipo MB se encuentra en el msculo cardiaco y
esqueltico

INMUNOADSORBENTES

Se trata de una tcnica de laboratorio que fue diseada por cientficos suecos y
holandeses en 1971, que permite detectar pequeas partculas llamadas antgenos, que
habitualmente son fragmentos de protenas. Para poder identificar los antgenos se
utilizan molculas con dos componentes acoplados: un anticuerpo (que se une al
antgeno de forma especfica) y una enzima (que se activa y seala la unin al antgeno).
Antes del descubrimiento del ELISA se utilizaban molculas radioactivas en vez de
enzimas, lo que supona un riesgo aadido innecesario en el laboratorio y un mayor
costo.

Es un ensayo de bioqumica analtica que permite detectar y cuantificar cantidades muy

pequeas de analitos en solucin, por medio de un anticuerpo conjugado a una enzima
. Los ensayos de ELISA se utilizan como una potente herramienta de control de calidad

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 en diversos sectores y de diagnstico en enfermedades humanas y animales (por
ejemplo, metablica o cardiovascular); deteccin de toxinas, drogas o contaminantes en
los alimentos. Se basan en la interaccin antgeno-anticuerpo, que es analizada a travs
del marcaje con una enzima (en la mayora de los casos con HRP). Esta enzima cataliza
una reaccin en la que un sustrato se transforma generando un producto coloreado que
puede cuantificarse mediante un espectrofotmetro.

Se usa en muchos laboratorios para

determinar si un anticuerpo particular
est presente en la muestra de
sangre de paciente

Aunque el procedimiento es rutinario y

sencillo, involucra a un gran nmero de
variables, tales como:

Seleccin de reactivo, temperatura,

medicin de volumen y tiempo, que si no
se ajusta correctamente pude afectar los
resultados de la prueba.

FASES DE UN ENSAYO ELISA

Conjugacin del El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e

anticuerpo o del antgeno
con una enzima
Unin del antgeno (o del
anticuerpo) a los pocillos
indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de
competicin de antgeno.
La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie
de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas. Si se usa
mucho antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se
usa poco antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa.

En el caso del antgeno unido a la placa, se puede detectar mediante un

Formacin de una o ms anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un
capas de anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti-primario marcado
(ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal
inmunocomplejos al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo
primario.

Revelado de la reaccin Despus de un lavado para eliminar todas las molculas marcadas no fijadas en
forma de inmunocomplejos; se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se
enzimtica deja reaccionar y se lee la densidad ptica mediante espectrofotometra

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 TIPOS DE ELISA

COMPETITIVO NO COMPETITIVO

En este mtodo, el anticuerpo de

la muestra va a competir con el
conjugado por un numero
limitado de sitios de unin del
antgeno.
Consiste en enfrentar la muestra
con el antgeno o anticuerpo que
esta en la fase solida.

Habr ausencia de color en una Si una muestra es positiva se

muestra positiva debido a que el
sustrato no encontrara a la
enzima porque el conjugado ha
sido desplazado por anticuerpo
presente en la muestra.
formara el complejo antgeno-
anticuerpo y al agregar el
conjugado reaccionara con el
respectivo sustrato desarrollando
color.

CONSTANTE DE DISOCIACION

Cuando un cido fuerte se disuelve en agua, se disocia casi completamente, es decir, en

prcticamente de todas sus molculas se separa un protn, que se libera al medio. Cuando el
cido es dbil, el cido no se disocia completamente al disolverse en agua, sino que slo algunas
molculas liberan un protn, mientras que otras no lo hacen. La forma disociada y sin disociar
del cido dbil permanecen en equilibrio qumico en el medio acuoso.

constante de disociacin cida K se puede definir como una relacin entre las concentraciones
de cido disociado y sin disociar.

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En los cidos fuertes K adquiere mayor valor, dado que las concentraciones de A y B sern altas
y la concentracin AB (cido sin disociar) ser baja. Si el valor de K para un cido es bajo, esto
significa que es un cido dbil, se disocia escasamente, por lo tanto las concentraciones de A y
B sern bajas, y la concentracin de AB ser elevada.

Por lo tanto, podemos decir que la constante de disociacin cida K, es una medida cuantitativa
de la fuerza de un cido.

Tambin se le llama constante de disociacin cida al pKa, que es el resultado de -log10 Ka.
De esta manera, para los cidos fuertes, con valor elevado de Ka, el pKa es pequeo, mientras
que en cidos dbiles, con Ka de poco valor, es pKa es elevado.

Segn la definicin de Arrhenius, un cido es una sustancia que presenta disociacin en

solucin acuosa, liberando un protn al medio. Sin embargo, como este protn liberado tiende
a unirse a la molcula de agua, formando el in hidronio (tambin denominado oxonio),
Arrhenius indic que la reaccin de disociacin de un cido debera ser escrita como una
reaccin cido-base, como vemos a continuacin:

Tomemos por ejemplo el cido actico. Cuando se encuentra en solucin acuosa, este cido
puede perder el protn de su grupo carboxilo, para dar lugar a su base conjugada (acetato). Su
pKa a 25C es de 4.8, lo que significa que en un medio con pH 4,8, ms o menos la mitad de
sus molculas se encontrarn disociadas. Es un cido dbil, y su constante de disociacin Ka a
20 grados Celsius es 1,7510-5.

5) Aplicacin de la biotecnologa enzimtica y biocatli

La biotecnologa enzimtica, utiliza catalizadores biolgicos, entre ellos clulas y enzimas, para
garantizar una actividad ms ecolgica en los procesos industriales. Estos biocatalizadores
presentan ventajas tales como alta especificidad, eficiencia, reduccin de la contaminacin y
ahorro de energa, caractersticas que los hacen aptos para ser empleados en el desarrollo de
nuevos procesos de produccin sostenible, lo que ha representado un incentivo importante para
el desarrollo de la biocatlisis y la tecnologa enzimtica.

A continuacin se ofrece una visin rpida de los procesos enzimticos que actualmente ya se
utilizan en muchos sectores para reducir la carga qumica eliminando, de la produccin industrial,
sustancias agresivas y txicas o simplemente contaminantes

Industria de detergentes:
Degradacin enzimtica de protenas, almidn y manchas de grasa en el lavado de ropa.
Utilizacin de enzimas lipolticas en las sustancias lavaplatos.
Utilizacin de enzimas como tensioactivos.

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 Industria textil:
Lavado a la piedra de tejidos tipo vaquero.
Desencolado enzimtico de tejido a la plana de algodn.
Blanqueado ecolgico.
Descrudado enzimtico de tejidos de algodn.
Desengomado enzimtico de la seda.

Industria del almidn:

Produccin enzimtica de dextrosa, fructosa y jarabes especiales para pastelera,
confitera e industrias de refrescos.

Industria cervecera:
Degradacin enzimtica del almidn, protenas y glucanos procedentes de la mezcla de
cereales utilizados en la elaboracin de cerveza.

Industria de productos para pastelera y horneado:

Modificacin enzimtica de hidratos de carbono y protenas de los cereales para mejorar
las propiedades del pan.

Industria de vinos y zumos:

Degradacin enzimtica de la pectina de la fruta, en la elaboracin de zumos y vinos.

Industria del alcohol:

Degradacin del almidn en azcares para, posteriormente, someterlos a fermentacin
y obtener alcohol.

Industria alimentaria y de aditivos:

Mejora de las propiedades nutritivas y funcionales de las protenas animales y vegetales.
Conversin de la lactosa de la leche y del suero de leche en azcares ms dulces y de
mejor digestin.
Produccin de aromas de queso.

Industria de alimentacin animal:

Hidrlisis enzimtica de la materia proteica procedente de mataderos para obtener
harinas con alto valor nutritivo destinadas a alimentacin animal.

Industria cosmtica:
Produccin biotecnolgica de colgeno y otros productos de aplicacin en cremas de
belleza.

Industria papelera:
Disolucin enzimtica de los pitchs.
Blanqueo ecolgico de la pasta de papel.
Control enzimtico de la viscosidad de los estucados con almidn.

Industria del curtido:

Preparacin de la piel y eliminacin del pelo y la grasa.

Industria de aceites y grasas:

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 Hidrlisis enzimtica de las grasas y la lecitina y sntesis de esteres.

Industria de qumica fina:

Sntesis de sustancias orgnicas.
Vlll.-BIBLIOGRAFIA

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