;UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD E CIENCIAS VETERINARIA

POSTGRADO EN MEDICINA VETERINARIA

MAESTRA EN MEDICINA VETERINARIA

MENCIN MICROBIOLOGA

ESTANDARIZACION DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

PARA EL DIAGNOSTICO DE Coxiella burnetti EN REBAOS DE CAPRINOS

Lcdo. Carlos Rodriguez Leo

Tutora: Dr. Oscar De la Rosa

Maracay, Julio 2016

ESTANDARIZACION DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
PARA EL DIAGNOSTICO DE Coxiella burnetti EN REBAOS DE CAPRINOS
 UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD E CIENCIAS VETERINARIA

POSTGRADO EN MEDICINA VETERINARIA

MAESTRA EN MEDICINA VETERINARIA

MENCIN MICROBIOLOGA

ESTANDARIZACION DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

PARA EL DIAGNOSTICO DE Coxiella burnetti EN REBAOS DE CAPRINOS

Lcdo. Carlos Jose Rodriguez Leo

Asesora: Profa. Dra. Elizabeth Ferrer

Asesora: Profa. Dra. Belkis Vsquez

Asesora: Profa. Dra. Elizabeth Marcano

Maracay, Julio 2016

 CAPTULO I
EL PROBLEMA

La fiebre Q o coxielosis es una zoonosis de distribucin mundial causada por

Coxiella burnetti, esta posee la capacidad de infectar un gran nmero de especies
animales salvajes y domesticadas, siendo el ganado, vacuno, ovino y caprino los que
poseen una mayor frecuencia afeccin clnica (Boriello y Galiero, 2012; National
Association of State Public Health Veterinarians [NASPHV], 2013; Organizacin
Internacional de Epizootias [OIE], 2015). En ganado gestante la coxielosis se asocia
con endometritis, infertilidad, parto prematuro, aborto, bajo peso de las cras al
nacer y en algunos casos lesiones de neumonas (Arricau-Bouvery y Rodolakis,
2005; Astobiza. 2013). Se estima que el microorganismo es liberado en una
proporcin de mil millones de partculas por gramos de placenta, representando uno
de los principales mecanismo de difusin y contaminacin ambiental (Comit de
Expertos Especializados en Salud Animal, 2004; NASPHV, 2013; OIE, [2007, 2010,
2015]).

En este sentido la transmisin de C. burnetti se produce principalmente a

travs de la inhalacin de polvo o aerosoles contaminados por placentas, fluidos
corporales o materia fecal infectados resultantes del parto o aborto (Arricau-
Bouvery y Rodolakis, 2005; NASPHV, 2013). Ha sido descrita la transmisin por
va oral, sexual y transplacentaria (Alarcon, 2007; Astobiza et al., 2012; Czaplicki
et al., 2011; Gwida et al., 2012). C. burnetti puede infectar a ms de 40 especies de
garrapatas (Contreras et al., 2013). Y existe un mayor riesgo de infeccin dentro de
un radio menor a 5 km de la fuente, influenciado por factores ambientales como el
viento, precipitacin, patrones de comportamiento animal, humano. (Schimmer et
al., 2010)

En este sentido C. burnetti posee un elevado potencial de dispersin y

transmisin, baja dosis infecciosa y elevada capacidad de resistencia a las
condiciones ambientales caracterizada por resistir 120 das en polvo, 49 das en
orina y 19 meses en heces de garrapata (Blut, 2013; OIE, 2007; Roest, 2013) El
Centro de Control de Enfermedades la ha clasificado en la categora B y de riesgo
biolgico tipo 3. (Arricau-Bouvery et al., 2006; Berri et al., 2003; NASPHV y
Centers for Disease Control and Prevention [CDC], 2011).

C. burnetti es una bacteria pleomorfica que exhibe un complejo ciclo

intracelular caracterizado por la formacin de una espora infectante que posee dos
formas, una metablicamente inactiva o endospora (SCV) por sus siglas en ingls
(Small-Cell Variant) y otra metablicamente activa (LCV) por sus siglas en ingls
(Large-Cell Variant) (Roest, 2013). A nivel gentico posee un cromosoma circular
de aproximadamente 2Mb, la mayora de los aislados presentan en su genoma de
uno a cuatro plsmidos de 32-51kb que suponen el 2% de la informacin del
genoma. Las cepas que no contienen ningn tipo de plsmido, sin embargo, tienen
integrada en el cromosoma una secuencia de 16kb parecida a la de un plsmido
(Mallavia, 1991). Los cuatro plsmidos se denominan QpH1, QpRS, QpDG y
QpDV, y la secuencia que se encuentra insertada en el genoma de la cepa sin
plsmidos, se denomina QpRS-like plasmid (Astobiza, 2012; Borriello y Galiero,
2012; OIE, 2015).
 Presenta numerosas secuencias de insercin (IS) y de repeticiones
palindrmicas.. Se han identificado genes implicados en la adhesin, invasin y
detoxificacin, genes que codifican los componentes para llevar a cabo un sistema
similar de secrecin de tipo IV Icm/Dot, y genes que codifican para las enzimas
catalasa, superoxido dismutasa y cido fosfatasa. Estos genes junto con el LPS de la
membrana y los plsmidos presentes en el genoma representaran los principales
factores de virulencia de C. burnetii (Astobiza, 2012; Borriello y Galiero, 2012;
Ghigo et al., 2009).

Debido al elevado nivel de virulencia que posee C. burnetti genera limitantes

al momento de establecer el mtodo diagnstico, el cultivo celular posee un elevado
riesgo de contaminacin y se necesita de personal con alta experticia. Por ello la
escogencia de un mtodo de identificacin depender del tipo de muestra y el
propsito de la investigacin (Borriello y Galiero, 2012; OIE, [2010, 2015]). La
OIE, (2015). Establece que no existe un mtodo de referencia para el diagnstico de
coxielosis, pero que la Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) y los mtodos
serolgicos, como Ensayo por inmunoadsorcin ligado a enzimas (ELISA)
representan una excelente herramienta diagnostica en la deteccin de C. burnetti.

Los mtodos serolgicos han sido utilizados a nivel mundial para el

diagnstico epidemiolgico de coxielosis. Entre las diversas tcnicas que pueden
emplearse, las tres ms usadas han sido: la tcnica de inmunofluorescencia indirecta
(IFI), el mtodo ELISA y la prueba de fijacin de complemento (FC). (Astobiza et
al., 2012; Roest et al., 2013). La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria
(EFSA), (2011) recomienda el ELISA como mtodo diagnstico para la coxielosis.
Por ello Vanderburg et al., (2014), realizaron una revisin sistemtica de la
epidemiologia de C. burnetti en frica demostrando que existe una seroprevalencia
de 18-55% en ganado de frica Occidental y Oriental y una variacin de 11 33%
en pequeos rumiantes. En Espaa Fernndez et al., (2016), reportaron una
seroprevalencia en fauna silvestre de 1,1 al 6,8%, en ovejas domesticas oscilo entre
10 25% mientras que en el ganado bov0ino fue 10%.

De este modo se comprueba la utilidad de los ensayos serolgicos

permitiendo comprender la epidemiologia de C. burnetti en distintas poblaciones de
animales, y distintas localizaciones. Pero a pesar de estos beneficios estos mtodos
presenta limitaciones para el entendimiento de las diferencias de seroprevalencia
entre distintas grupos de animales, como lo reflejan Fernndez et al., 2016 quienes
recomiendan la caracterizacin molecular de las cepas de C. burnetti que infectan a
las ovejas y la fauna silvestre y as descartar la existencia un ciclo selvtico
independiente. Cooper et al., (2011). Detecto un mayor porcentaje de
seropositividad contra ambas fases antignicas de anticuerpos en muestras de sangre
de ganado bovino en matadero, en comparacin con las novillas, de modo que no
pudo determinar si estos se encontraban en fase aguda o crnica de la infeccin.

Astobiza., (2012) seala que los animales pueden permanecer seropositivos

durante varios aos despus de una infeccin aguda, algunos pueden liberar C.
burnetii y generar un riesgo de infeccin antes de desarrollar anticuerpos, ademan
otros animales infectados no parecen sufrir seroconversin., Rousset et al., (2009),
estiman que alrededor del 24% de cabras seronegativas tienen la capacidad de
eliminar partculas infectantes del microorganismo. Es importante mencionar que la
deteccin de la bacteria, an en etapas en la que el animal se encuentre eliminando
baja carga bacteriana, es necesario para el control de infecciones agudas y crnicas
en los distintos grupos de animales (Kim et al, 2005). Al ser suficientes alrededor
de 10 microorganismos infectantes para generar la enfermedad (Cornelis et al,
2011), el uso de una metodologa de alta sensibilidad y rapidez es indispensable,
especialmente en pases en vas de desarrollo que enfrentan problemticas mltiples
de salud pblica (Ecuador) (Manock et al, 2009).

En pases de Suramrica los trabajos publicados sobre C burnetti se han

basado en mtodos serolgicos, Brasil (Gonalves de la Costa et al, 2005),
Venezuela (Orpeza et al, 2010), Per (Blair, 2004) y Colombia (Parra y Mattar,
2006), de este modo no se siguen las recomendaciones de la OIE, donde deben
existir una combinacin de mtodos moleculares y serolgicos. Niemczuk et al.,
2013) a traves de la comparacin de cinco mtodos diagnsticos demostr que la
qPCR permite establecer concentraciones de ADN del microorganismo y de este
modo establecer que concentracin del microorganismo es diseminada, permitiendo
la evaluacin de animales de forma individual, limitante que posee los ensayos
serolgicos. Los autores afirman que le diagnstico de coxielosis debe ser realizado
entre mtodos serolgicos y moleculares.

Recientemente, se inform de mtodos basados en ADN para C. burnetii.

Tipeado por Secuencia Multilocus (MLST). Basado en variaciones de la secuencia
de ADN de 10 regiones intergnicas cortas y puede ser realizado en aislado cepas de
C. burnetii o directamente en el ADN extrado de muestras clnicas. Otro mtodo
molecular, es Analisis Multiple de Loci VNTR (MLVA) se basa en la variacin de
nmero de repeticiones en tndem repetido elementos de ADN en mltiples loci en
el genoma de C. burnetii y podra ser ms discriminatoria que MLST. El MLVA
puede ser tambin realizado en cepas de C. burnetii o directamente en el ADN
extrado de muestras clnicas. Un total de 17 diferentes marcadores de minisatlite y
de repeticin de microsatlites se han descrito. Estos mtodos a pesar de ser
altamente especficos y sensibles poseen limitantes, personal entrenado, equipos y
reactivos de alto costo (Roest et al., 2011).
 La PCR ha demostrado ser la herramienta altamente fiable para el
diagnstico de abortos infecciosos EFSA, (2010). A partir de muestras de fetos
abortados, placenta y descargas vaginales poco despus del parto o aborto (OIE,
2015). La PCR dirige una o ms secuencias especficas del genoma, para la
identificacin, una de las secuencias utilizadas para su deteccin son secuencias de
plsmido (QpH1 o QPRS), o genes cromosmicos, como el isocitrato
deshidrogenasa (ICD), la codificacin de la protena de la membrana externa com1
gen, el gen de la superxido dismutasa (SOD), o el gen de transposasa en el
elemento de insercin IS1111. Este ltimo es de utilidad preferente para los ensayos
de PCR debido a su presencia en mltiples copias dentro del genoma (National
Institute for Public Health and the Environment [RIVM] 2011; OIE, 2015) Monteiro
de Mello et al., 2014 Brasil, Astobiza et al., 2012 Espaa, Contreras et al., 2014
Colombia, Mohammad et al., 2015 Iran, han detectado C, burnetti a travs de PCR
basados en la regin repetitiva del transposon. Demostrando una alta sensibilidad y
una mayor especificidad en relacin a otras secuencias del genoma.

En Venezuela no existe un mtodo molecular estandarizado para el diagnstico de

C. burnetti, segn los boletines epidemiolgicos zoosanitarios de los aos 2012
2015 emitidos por el ministerio del Poder Popular Para la Agricultura y Tierras en
conjunto con el Instituto Nacional de Salud Agrcola Integral (INSAI), No se han
producidos brotes de coxielosis en el pais. Oropeza et al., 2010 en tres rebaos de
cabras del estado Lara demostraron una elevada seropositividad de anticuerpos
contra C. burnetti, determinando 60,63% de prevalencia. Los autores asociaron la
alta tasa de abortos a estos resultados, pero debido a que la muestra no fue
representativa para toda el rea de produccin caprina la investigacin no representa
una seroprevalencia.
Esta investigacion refleja la circulacin de C. burnetti en rebaos de cabras,
generando un foco de infeccin para rumiantes salvajes y domsticos de zonas
adyacentes, y generando prdidas econmicas representativas en la produccin
caprina del estado y pas, donde la poblacin venezolana posee entre su dieta el
consumo de productos agrcolas. Segn el Instituto de Estadisticas, para el primer
semestre del ao 2014 la adquisicin de carne, leche y queso blanco de los hogares
venezolanos fue de 84.81%, 22.12% y 90.78% respectivamente, de este modo se
genera una alerta epidemiolgica donde el hombre se encuentra expuesto a la
infeccin por C burnetti como consecuencia del consumo de productos agrcolas
esto puede desencadernar una serie de patologas como endocarditis, neumonas y
en algunos casos la muerte.

En este sentido se hace necesaria la estandarizacin de una tcnica de PCR que

determine la presencia de C burnetti en animales asintomticos y sintomticos a
partir de diversas muestras biolgicas permitiendo establecer una correlacin para el
diagnstico del microorganismo, incrementando el nivel de sensibilidad como lo
aseveran Silke et al, (2006) que el diagnstico molecular es 100 veces ms sensible
que el mtodo serolgico y pueda suministrase el diagnostico directo y oportuno
evitando abortos, cras dbiles y animales portadores que mantengan el ciclo
infeccioso del microorganismo generando el anlisis epidemiolgicos de
poblaciones en riesgo o sospechosas en reas limitadas (despus de brotes recientes
en el hombre o en animales), o con fines comerciales de exportacin.
En Venezuela no existen un mtodo diagnostico de identificacin o referencia.

Explicar las desventajas del mtodo serolgico

Explicar las bondades de la PCR y describir antecedentes que sustenten

Explicar los beneficios del diagnostico oportuno para las cabras, a nivel econmico
Y evitar el riesgo de transmisin a la poblacin en riesgo.
Una vez que entra a la clula, los fagosomas que contienen las bacterias se fusionan
con los lisosomas del hospedero formando una gran vacuola parasitofora.

Prrafo 3 metodos diagnosticos.cuales son antecedentes de estos. Y el beneficio de

un mtodo especifico y sensible.

With the exception of reproductive disease, animals are usually asymptomatic. Goats sometimes
have a poor appetite and are depressed for 1 to 2 days before an abortion. Placental retention for 2
to 5 days and agalactia have also been reported. Clinical signs including fever, anorexia, mild
coughing, rhinitis and increased respiratory rates occur in experimentally infected sheep but have
not been reported in natural infections. Experimentally infected cats develop fever, lethargy and
anorexia that last for several days. Experimentally infected mice may have pneumonia, hepatitis or
splenomegaly, depending on the route of inoculation. OIE

Q fever, an acute or chronic zoonotic illness caused by the bacterium Coxiella

burnetii, has
received international attention in recent years, primarily due to a largescale
outbreak in the
Netherlands from 2007 to 2010 involving more than 4,000 human cases and the
euthanasia of
50,000 goats, one of the primary reservoirs for the bacterium (NASH)

REFERENCIAS
OIE, 2007

NASPHV (National Association of State Public Health Veterinarians, Inc.) & CDC (Centers
for Disease Control and Prevention), (2011). Compendium of measures to prevent
disease associated with animals in public settings, 2011: National Association of
State Public Health Veterinarians, Inc. MMWR Recommendations and reports, Vol.60,
No.RR-4, (May 6), pp. 1-24, ISSN 1545-8601

Berri M, Rousset E, Champion JL, Arricau-Bouvery N, Russo P, Pepin

M, Rodolakis A: Ovine manure used as a garden fertiliser is suspected
to be a contamination source of two human Q fever
cases. Vet record 2003, 153:269-270.

Giorgia Borriello and Giorgio Galiero (2012). Coxiella burnetii, Zoonosis, Dr. Jacob Lorenzo-Morales
(Ed.),
ISBN: 978-953-51-0479-7, InTech, Available from:
http://www.intechopen.com/books/zoonosis/coxiella-burnetii

Titulos:

Diagnstico molecular de Coxiella burnetti en caprinos de la regin central de

Venezuela periodo 2015-2016.

Amplificacion del gen () de Coxiella burnetti en caprinos de la regin central

de Venezuela periodo 2015 2016.

Estandarizacin de reaccin en cadena de la polimerasa modalidad anidada para la

identificacin de Coxiella burnetti en caprinos.

Estandarizacin de PCR modalidad anidada para la identificacin de Coxiella

burnetti en muestras de placenta y orina de caprinos.
Identificacion de Coxiella burnetti a traves de la PCR modalidad anidada en
muestras de placenta y orina de Caprinos.

Objetivos especficos:

Estandarizacin del protocolo de extraccin fenol cloroformo alcohol

isoamilico para muestras de placenta y orina de caprinos.
Amplificacin del gen. De C. burnetti en muestras de placenta y orina de
caprinos.
Determinacin de la sensibilidad y especificidad de la PCR modalidad
anidada.
Validacin del mtodo de PCR modalidad anidada en poblacin de caprinos
de la regin central de Venezuela.

1.1. Objetivos

1.1.1. Objetivo General

 Determinar la prevalencia de infeccin natural por Plasmodium sp. en
Anopheles sp. colectados en el municipio Sifontes, Estado Bolvar durante el
perodo Septiembre 2009-Enero 2012.

1.1.2. Objetivos Especficos

1. Determinar la presencia de ADN de Plasmodium sp. en Anopheles sp.

colectados en el municipio Sifontes, Estado Bolvar durante el perodo
Septiembre 2009-Enero 2012, mediante la PCR.

2. Establecer cuales especies de Anopheles sp. presentan mayor

prevalencia de infeccin a las distintas especies de Plasmodium sp.

3. Establecer la asociacin entre los resultados obtenidos en los

anofelinos analizados con los datos registrados de infeccin malrica
durante ese perodo en la poblacin del Municipio Sifontes, Estado
Bolvar.

EL PROBLEMA