PROTOCOLO DE MUESTREO, ANLISIS Y

EVALUACIN DEL FITOPLANCTON EN MASAS

DE AGUA DE TRANSICIN Y COSTERAS

Noviembre de 2014
Agencia Vasca del Agua / Uraren Euskal Agentzia

Cdigo: TW_CW_FITOPLANCTON_URA_V_1.0
1 OBJETO
La Agencia Vasca del Agua mediante este documento pretende establecer protocolos que
permitan la evaluacin estandarizada del fitoplancton en masas de agua de transicin y costeras
en la Comunidad Autnoma del Pas Vasco.
Las comunidades de fitoplancton (algas unicelulares o microalgas) responden de manera rpida
a los cambios ambientales, especialmente al aporte de nutrientes y a la disponibilidad de luz.
Por lo tanto, el seguimiento de su abundancia, composicin de especies y biomasa puede
utilizarse en muchos casos para caracterizar el medio ambiente y la magnitud de los impactos
sufridos debido a la contaminacin por nutrientes. Los nutrientes en concentracin y proporcin
adecuada son esenciales para las comunidades de fitoplancton, que forman la base de las redes
trficas en los ecosistemas pelgicos. Sin embargo, un aporte excesivo (especialmente de
compuestos de nitrgeno y/o fsforo) puede causar un crecimiento acelerado de algas y
especies vegetales superiores que resulte perjudicial, tanto para el funcionamiento del
ecosistema como para los usos del agua. Este proceso se conoce como eutrofizacin.
Los vertidos de aguas residuales urbanas son una de las fuentes ms importantes de
contaminacin por nutrientes en Europa. Los aportes difusos, por ejemplo, de la atmsfera y de
las actividades agrcolas, tambin son importantes en algunas zonas costeras.
Uno de los primeros sntomas de la eutrofizacin es el incremento de la biomasa y/o abundancia
celular del fitoplancton. En este sentido, la clorofila se considera una variable de gran utilidad
como aproximacin a la biomasa fitoplanctnica y como indicador de la respuesta del
fitoplancton al enriquecimiento en nitrgeno y fsforo del medio marino. Asimismo, el proceso de
eutrofizacin puede alterar la composicin de las comunidades fitoplanctnicas (por ejemplo,
favoreciendo a unas especies frente a otras, que pueden ser txicas o no consumibles por
niveles trficos superiores).
En el mbito de aplicacin de la Directiva Marco del Agua 2000/60/CE del Parlamento Europeo,
y del Consejo de 23 de octubre de 2000 por la que se establece un marco comunitario de
actuacin en el mbito de la poltica de aguas, en adelante DMA, el indicador biolgico
fitoplancton es utilizado para la clasificacin del estado ecolgico de las masas de agua de
transicin y costeras.
La DMA en el epgrafe 1.3.6 de su anexo V indica que los mtodos empleados para controlar los
parmetros de cada tipo sern conformes a determinadas normas internacionales que enumera
o a cualesquiera otras normas nacionales o internacionales que garanticen el suministro de
informacin de calidad y comparabilidad cientfica equivalentes.
El objetivo de este documento es, en primer lugar, establecer un protocolo de muestreo,
identificacin y anlisis para el fitoplancton en masas de agua de transicin y costeras, que
garantice el cumplimiento de los requisitos mencionados anteriormente.
En segundo lugar, en este documento se establece un sistema de evaluacin de
estado/potencial ecolgico basado en la comunidad de fitoplancton en masas de agua de
transicin y costeras acorde con las definiciones normativas del anexo V de la DMA, que incluye
la determinacin de condiciones de referencia y valores umbrales como herramienta para
determinar el grado de cumplimiento de objetivos ambientales de forma coherente con lo
requerido por la DMA.

Protocolo de muestreo, anlisis y evaluacin de fitoplancton en masas de agua de transicin y costeras

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2 ALCANCE
Este documento tiene como objeto establecer un procedimiento para la toma de muestras y la
estima en laboratorio de las variables fitoplanctnicas en las masas de agua de transicin y
costeras, siendo asimismo aplicable para la obtencin de datos necesarios para la clasificacin
del estado ecolgico o del potencial ecolgico de esta categora de masas de agua.
En este protocolo la toma de muestras est orientada a la obtencin de datos de concentracin
de clorofila-a (como aproximacin a la biomasa), as como de composicin taxonmica y
abundancia celular de fitoplancton, que es el elemento utilizado en la clasificacin del
estado/potencial ecolgico.
Con la informacin recopilada mediante esta instruccin, se obtienen datos vlidos para el
clculo de los ndices establecidos para el elemento de calidad fitoplancton en aguas de
transicin y costeras en el Real Decreto 400/2013, de 7 de junio, por el que se aprueba el Plan
Hidrolgico de la Demarcacin Hidrogrfica del Cantbrico Oriental.

3 NORMATIVA DE REFERENCIA
Directiva 2000/60/CE del Parlamento Europeo y del Consejo por la que se establece un
marco comunitario de actuacin en el mbito de la poltica de aguas.
Real Decreto Legislativo 1/2001 por el que se aprueba el Texto refundido de la Ley de
Aguas.
Real Decreto 907/2007, de 6 de julio, por el que se aprueba el Reglamento de
Planificacin Hidrolgica.
Orden ARM/2656/2008 por la que se aprueba la Instruccin de Planificacin Hidrolgica.
Real Decreto 400/2013, de 7 de junio, por el que se aprueba el Plan Hidrolgico de la
Demarcacin Hidrogrfica del Cantbrico Oriental.
Directiva 2014/101/UE de la Comisin, de 30 de octubre de 2014, que modifica la
Directiva 2000/60/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, por la que se establece un
marco comunitario de actuacin en el mbito de la poltica de aguas. Diario Oficial de la
Unin Europea, L311: 32-35.
Decisin 2013/480/EU, Decisin de la Comisin de 20 de septiembre de 2013 por la que
se fijan, de conformidad con la Directiva 2000/60/CE del Parlamento Europeo y del
Consejo, los valores de las clasificaciones de los sistemas de seguimiento de los Estados
miembros a raz del ejercicio de intercalibracin, y por la que se deroga la Decisin
2008/915/CE. Diario Oficial de la Unin Europea, L266: 1-47.
EN 15204:2006 Water quality Guidance standard on the enumeration of phytoplankton
using inverted microscopy (Utermhl technique).
EN 15972:2011 Water Quality Guidance on quantitative and qualitative investigations of
marine phytoplankton.
Adems, se debe considerar como material de referencia de este protocolo los siguientes
documentos:

Protocolo de muestreo, anlisis y evaluacin de fitoplancton en masas de agua de transicin y costeras

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 Jeffrey S.W., Humphrey G.F., 1975. New spectrophotometric equations for determining
Chlorophyll a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie
und Physiologie Pflanzen, 167: 191-194.
Lorenzen C.J., Jeffrey S.W., 1980. Determination of chlorophyll in seawater. UNESCO
Technical Papers in Marine Science, 35.
Utermhl H. 1958. Zur vervollkommung der quantitativen Phytoplankton-Methodik.
Mitteilungen der Internationalen Vereinigung fr Theoretsche und Angewandte
Limnologic, 9: 1-38.
Dodge J.D., 1982. Marine Dinoflagellates of the British Isles. Her Majestys Stationery
Office, London. 303 pp.
Tomas C.R. (Ed.) 1993. Marine Phytoplankton. A Guide to Naked Flagellates and
Coccolithophorids. Academic Press, San Diego.
Tomas C.R. (Ed.) 1996. Identifying Marine Diatoms and Dinoflagellates. Academic Press,
San Diego.
Brard-Therriault L., Poulin M., Bose L., 1999. Guide didentification du phytoplankton
marin de lestuaire et du golfe du Saint-Laurent incluant galement certains protozoairs.
Publication spciale canadiense des sciences halieutiques et aquatiques, 128: 387 pp.
Guiry M.D., Guiry G.M., 2008. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National
University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org
Registro Europeo de Especies Marinas (www.marbef.org/data)
Edler L., Elbrchter M., 2010. The Utermhl method for quantitative phytoplankton
analysis. En: B. Karlson, C. Cusack, E. Bresnan (Eds.). Microscopic and molecular
methods for quantitative phytoplankton analysis. IOC Manuals and Guides, 55: 13-22.
Paris, UNESCO.
Revilla M., Briz-Miquel O., Carrillo de Albornoz P., Escalona M., Garca P., Guinda X.,
Prez P., Prez V., Rodrguez N., Serret P., 2008. Description of National Methods: Spain
Member State Report for the Phytoplankton Element: Coastal Waters NEA 1/26 Type.
January 2, 2008. Technical Report. 49 pp.
Revilla M., Franco J., Bald J., Borja ., Laza A., Seoane S., Valencia V., 2009a.
Assessment of the phytoplankton ecological status in the Basque coast (northern Spain)
according to the European Water Framework Directive. Journal of Sea Research, 61: 60
67.
Revilla M., Borja A., Garca P., Guinda X., Juanes J.A., Puente A., Zapico E., 2009b.
Description of National Methods: Spanish Phytoplankton Tool for North East Atlantic
Transitional Waters (NEA TW). Part 1- Cantabrian estuaries (Bay of Biscay). November
23, 2009. Technical Report. 19 pp.
Revilla M., Garmendia M., Franco J., Borja ., 2010. A new method for phytoplankton
quality assessment in the Basque estuaries (northern Spain), within the European Water
Framework Directive. Revista de Investigacin Marina, 17(7): 149-164; http://www.azti.es.
Revilla M., Borja ., Chust G., Fontn A., Franco J., Gonzlez M., Novoa S.,
Sagarminaga Y., Valencia V. 2012. Estudio de la clorofila, elemento clave para la

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 Estrategia Marina Europea y la Directiva Marco del Agua. Informe elaborado por AZTI-
Tecnalia para la Agencia Vasca del Agua. 102 pp.
Revilla M., Borja ., Franco J., Garmendia J.M., Solaun O., Uriarte A., Zorita I. 2014.
Eutrofizacin en el medio marino del Pas Vasco: influencia antrpica e impactos sobre el
fitoplancton. Informe de AZTI-Tecnalia para la Agencia Vasca del Agua.

4 PROTOCOLO DE MUESTREO
Los muestreos se realizan basndose en protocolos de vigilancia estandarizados (EN
15972:2011 Water Quality. Guidance on quantitative and qualitative investigations of marine
phytoplankton).
4.1 Equipos y conservantes
Todo el material que vaya a estar en contacto con las muestras tiene que estar limpio y seco.
Para ello, los recipientes se aclaran con agua y se secan antes de su almacenamiento para su
uso posterior. El secado debe ser rpido para evitar crecimientos indeseados de fitoplancton en
su interior.
El material necesario para el muestreo es el siguiente:
Embarcacin equipada con gra y cable para CTD (solo para aguas costeras y estuarios
profundos)
CTD (SeaBird-25 similar)
Balde de plstico
Embudo de plstico
Garrafas de plstico
Frascos de vidrio (125 mL) con tapn a rosca
Solucin de Lugol cido. Se prepara con antelacin en el laboratorio, para ello se
disuelven en 200 mL de agua destilada: 20 g de yoduro de potasio (KI), 10 g de yodo (I2)
y 20 g de cido actico concentrado. La solucin se conserva en condiciones de
oscuridad y refrigeracin.
Pipetas Pasteur
Neveras porttiles y acumuladores de fro
Lpiz y rotuladores indelebles
Estadillo de campo (ver Anexo I)
GPS
Equipos de proteccin individual (EPI): guantes de seguridad, botas de seguridad, etc.
4.2 Planificacin de la toma de muestras
En cada masa de agua estudiada se incluyen entre 1 y 6 estaciones de muestreo, dependiendo
de su tamao y de las afecciones a que se vea sometida. Las estaciones de muestreo se
localizan en zonas representativas de cada tramo estudiado de las masas de agua.

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En todas las estaciones se debern medir dos atributos de la comunidad fitoplanctnica: por una
parte, la biomasa (como concentracin de clorofila-a), y por otra, la abundancia celular de los
diferentes taxones que componen la comunidad.
En las estaciones costeras se realizan cuatro muestreos al ao (invierno, primavera, verano y
otoo). Con esta estrategia se intenta cubrir un mnimo de la variabilidad anual que presentan de
forma natural las poblaciones fitoplanctnicas en los mares costeros templados y que est
ntimamente ligada a la hidrografa de estos sistemas. De este modo, se pretende obtener
muestras representativas del periodo de mezcla de la columna de agua (invierno), de las pocas
de estratificacin parcial (primavera y otoo) y mxima estratificacin (verano). Generalmente
los muestreos se realizan entre los meses de febrero y noviembre.
En el caso de las estaciones de muestreo localizadas en las masas de agua de transicin, se
distinguen aquellas cuya salinidad (valor de la mediana de la serie histrica) supera 30 psu
(euhalinas), de aquellas que presentan una salinidad inferior (oligo-, meso- o polihalinas). En las
estaciones euhalinas el muestreo se realiza con la misma periodicidad que en las costeras. En el
resto de las estaciones esturicas el muestreo es tambin trimestral para la clorofila, pero para
la abundancia y composicin celular slo se realizan dos campaas al ao (primavera y verano).
Las aguas costeras se muestrean sin tener en cuenta el estado de la marea, ya que su calidad
est muy poco influida por este factor.
Por el contrario, hay que recordar que las aguas de transicin de la CAPV, al tratarse de
estuarios de carcter meso- o macromareal, presentan fuertes variaciones en su composicin
qumica en relacin con los ciclos mareales. Por ello, en las aguas de transicin, para la estima
de la clorofila-a se realizan dos muestreos en el mismo da, uno en pleamar y otro en bajamar.
Esta estrategia garantiza el muestreo en situaciones hidrogrficas netamente diferenciadas,
dndose la mxima influencia marina en el estuario en pleamar, y la mxima influencia fluvial en
bajamar.
Para la abundancia y composicin celular, el muestreo de las aguas de transicin slo se realiza
en pleamar, esto es as con el fin de evitar la recogida de material detrtico que es ms probable
que ocurra en bajamar y que interfiere con el anlisis de esta variable.
4.3 Procedimiento de recogida de muestras
Los puntos de muestreo se posicionan con precisin, a poder ser con un GPS. Se proporcionan
las coordenadas en latitud y longitud, as como la referencia utilizada. Tambin es necesaria la
profundidad. Otros datos complementarios a proporcionar incluyen: tipo de ingenio de muestreo
utilizado, hora, fecha, condiciones meteorolgicas y oceanogrficas (altura de ola, corrientes
fuertes, etc.).
En las masas de aguas costeras y en los estuarios ms profundos (masas de agua de transicin
del Nevin y del Oiartzun) la concentracin de clorofila-a se mide in situ mediante fluorescencia
con CTD (Sea-Bird). El CTD se calibra regularmente con muestras de agua tomadas en esas
mismas masas de agua; las muestras para la calibracin se analizan en el laboratorio mediante
el mtodo espectrofotomtrico que se describe ms adelante en este mismo protocolo.
Se dispone de un manual de instrucciones detallado para el uso del CTD, cuyo esquema se
presenta en la Figura 1.
Por otra parte, en todas las estaciones, costeras y de transicin, se toma una nica muestra de
agua con el fin de determinar posteriormente en el laboratorio la abundancia y composicin del
fitoplancton (muestra cuantitativa). Adems, en los estuarios someros, que es el caso de la

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mayora de las masas de agua de transicin de la CAPV, se toma otra muestra de agua para la
estima posterior de la concentracin de clorofila-a en el laboratorio.
Se utiliza una profundidad de muestreo de entre 0 y 1 m, con objeto de que las muestras sean
representativas de las aguas de superficie.
VERIFICACIN DEL ESTADO DE LA
MEMORIA Y LAS BATERIAS DEL CTD
(LABORATORIO/ BARCO
OCEANOGRAFICO)

VERIFICACIN DE LA
CORRECTA COLOCACIN DE
TUBOS Y PROTECTORES.

ACTIVACIN, revisin del

mosquetn de cierre.

ACONDICIONAMIENTO EN
SUPERFICIE 2 .5 MINUTOS.

INMERSIN HASTA LA PROFUNDIDAD

DESEADA A VELOCIDAD DE 40m/mn.

IZADO DEL COLOCACIN DE VOLCADO DE DATOS LISTADOS DATOS

APARATO, PROTECTORES (LABORATORIO BARCO EN ASCII
DESACTIVACIN OCEANOGRAFICO)

REPRESENTACIN
MANTENIMIENTO - CALIBRACIN DE DATOS (Excel,
(LABORATORIO) Grapher, Surfer)

Figura 1. Esquema del procedimiento de actuacin con el CTD.

4.4 Conservacin, etiquetado y transporte de las muestras

Las muestras de agua destinadas a la determinacin de la clorofila-a se mantienen en garrafas
de plstico a temperatura ambiente hasta su procesado en el laboratorio. En el transporte de las
muestras se toman las medidas necesarias para evitar que queden expuestas a altas
temperaturas y/o a la luz directa.
Las muestras de agua destinadas a la determinacin de la abundancia y composicin
taxonmica se depositan en frascos de vidrio. El frasco no se rellena totalmente, ya que es
necesario cierto espacio para facilitar el proceso de mezclado antes de la toma de una
submuestra para su anlisis. Siguiendo la norma EN 15972:2011 se procede a:
Fijado en el campo: a cada muestra de agua de 125 mL se le aaden con una pipeta
Pasteur 0,5 mL de una solucin de Lugol cido (vase Apartado 4.1. Equipos y
conservantes).

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 Transporte de las muestras: en condiciones de oscuridad y temperatura inferior a 20C,
protegidas del hielo. Para ello se utilizan neveras porttiles (con acumuladores de fro,
cuando el muestreo coincide con das muy clidos).
Almacenamiento en condiciones de oscuridad y refrigeracin. Para ello, las muestras
fijadas se guardan en cmaras frigorficas (4C). El tiempo transcurrido entre la recogida
de la muestra y su anlisis deber ser siempre inferior a 12 meses.
Todos los recipientes utilizados para la muestra son identificados con una etiqueta adhesiva en
la que aparecen los siguientes datos:
Cdigo de la estacin de muestreo
Fecha
Variable objeto de muestreo
Agente de conservacin utilizado
4.5 Ficha de campo
Los datos referentes a la toma de muestras se anotan en una ficha de campo (Anexo I) en la
que se recogen los siguientes aspectos:
Identificacin y localizacin de la estacin
Coordenadas de la estacin
Profundidad de la estacin
Fecha y hora de la toma de la muestra
Equipo utilizado para el muestreo
Condiciones meteorolgicas y de oleaje
Personas presentes en el muestreo
Otras circunstancias que puedan facilitar la interpretacin de resultados: riadas,
presencia de detritos, irisaciones, etc.

5 PROTOCOLO DE ANLISIS
En las muestras recogidas segn el Apartado 4 de este documento se llevan a cabo los
procedimientos de ensayo necesarios para: (1) la determinacin de la concentracin de clorofila-
a, como aproximacin a la biomasa fitoplanctnica, y (2) la identificacin taxonmica y el
recuento de la abundancia celular del fitoplancton.
5.1 Equipos y conservantes
Para la determinacin de clorofila-a:
Sistema de filtracin equipado con un kitasatos de 2 L de capacidad, un embudo y un
portafiltros de 47 mm.
Filtros Whatman GF/C 47mm
Pinzas de punta plana para manipular filtros

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 Bomba de vaco
Acetona al 90%
Dispensador automtico o pipeta para volmenes de acetona de 10 mL
Probetas de plstico de 1 L y 500 mL
Estadillo
Tubos de ensayo de vidrio, opacos, con tapn a rosca hermtico
Centrfuga
Espectrofotmetro UV/VIS Shimadzu
Cubetas de cuarzo de 1 cm de camino ptico: una, para la medida de la absorbancia del
extracto y otra, para la del blanco
Manual de instrucciones (UV-2401 PC, Shimadzu)
Para el anlisis de la composicin taxonmica y abundancia celular:
Placas de sedimentacin Hydrobios
Columnas de sedimentacin de 100, 50 y 10 mL
Bases y cubres especficos para el montaje
Equipamiento de microscopa ptica invertida (Nikon, con contraste de fase)
Ficha de identificacin de laboratorio que permita como producto final establecer un
listado taxonmico con los taxones presentes en la muestra y sus abundancias.
Guas de identificacin especializadas (se indican varios ejemplos en la documentacin
de referencia incluida en el Apartado 3 de este protocolo: Dodge 1982; Tomas 1993;
1996; Brard-Therriault et al. 1999).
5.2 Procesamiento de las muestras para clorofila-a
Para la determinacin de la concentracin de clorofila-a en laboratorio se aplica el mtodo
tricromtico de Jeffrey y Humphrey (1975), que es el mtodo espectrofotomtrico recomendado
por SCOR-UNESCO (Lorenzen y Jeffrey, 1980).
El procesamiento de las muestras implica los pasos que se detallan a continuacin.
Filtracin de agua de mar
Se prepara una torre de filtracin (Kitasatos, embudo y portafiltros) donde se coloca un
filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/C) de 47mm de dimetro. La torre de filtracin se
conecta a una bomba de vaco con el fin de que el agua de mar depositada en el embudo
atraviese el filtro y pase al Kitasatos.
Se toman submuestras de agua de volumen conocido con una probeta, procurando que
sean homogneas, esto es, evitando que quede material sedimentado en el fondo de la
garrafa. Para ello, previamente hay que aplicar un movimiento suave a la garrafa.
Se filtra agua de mar hasta que el filtro presente color, evitando una presin excesiva o
un tiempo de filtracin muy largo. El volumen filtrado vara segn la cantidad de material

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 en suspensin que presente el medio. Normalmente es suficiente con 2 litros para las
aguas costeras y 1 litro, o bastante menos, para las de transicin.
El volumen total de agua que ha pasado por el filtro se apunta en un estadillo.
Extraccin de pigmentos
El filtro se recoge con una pinza y se deposita en un tubo de ensayo opaco, al cual se
aaden inmediatamente 10 mL de acetona al 90%. El tubo se cierra hermticamente.
La muestra se mantiene en refrigeracin y oscuridad entre 24 y 48 horas.
En caso de no realizar la extraccin de los pigmentos de forma inmediata al filtrado de la
muestra, es necesario conservar los filtros envueltos en papel aluminio a temperatura de
- 20 C, o en nitrgeno lquido.
Lectura de la absorbancia del extracto
Tras 24-48 h de extraccin en fro, los tubos se dejan a temperatura ambiente unos 30
minutos.
Se agitan las muestras con la mano o con un agitatubos para obtener una muestra
homognea.
Para clarificar el extracto, se centrifugan los tubos durante 15 minutos a 4000 rpm.
Se mide la absorbancia del extracto a las siguientes longitudes de onda: 664, 647 y 630
nm. Para ello, se deposita una cantidad del sobrenadante en una cubeta de cuarzo que
se lee en un espectrofotmetro UV/VIS. Es importante que las muestras que se vayan a
leer estn a temperatura ambiente para que la cubeta no se empae y se obtengan
resultados errneos. Debe evitarse en todos los pasos que reciban luz intensa. Para el
manejo del espectrofotmetro se sigue el manual de instruccin tcnica del mismo.
Las cubetas de lectura se limpian despus de cada sesin de medida con agua del grifo,
pasndolas finalmente con agua Milli-Q y dejndolas secar al aire. Es conveniente cada
cierto tiempo hacer una limpieza de las cubetas con cido ntrico diluido al 10%,
aclarando despus con abundante agua del grifo y finalmente con agua Milli-Q.
5.3 Identificacin y recuento de los taxones
La identificacin y el recuento del fitoplancton se realizan mediante el mtodo de Utermhl
(Utermhl, 1958), siguiendo las recomendaciones que figuran en las normas EN 15204:2006 y
EN 15972:2011 para las tcnicas de anlisis cuantitativo.
Este mtodo implica la utilizacin de cmaras de sedimentacin donde se introduce una alcuota
de agua y, por gravedad al cabo de un tiempo determinado, las clulas de fitoplancton quedan
depositadas en la placa del fondo de manera aleatoria. El anlisis cuantitativo de la muestra que
queda recogida en la base de la cmara se realiza mediante microscopio invertido (Edler y
Elbrchter, 2010).
Se procura identificar a nivel de gnero o especie. Cuando ello no es posible, se clasifica en
grandes grupos (diatomeas, dinoflagelados, ciliados, clorofitas, haptofitas, criptofitas,
euglenofitas, pequeas formas flageladas, pequeas formas cocoides, etc.) o en niveles
jerrquicos inferiores (orden o familia). Para comprobar los nombres cientficos actualmente
aceptados y evitar la utilizacin de sinnimos se consulta el Registro Europeo de Especies
Marinas (www.marbef.org/data) y el de AlgaeBase (www.algaebase.org).

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Se contabilizan las clulas de cada taxn, incluso en el caso de que sean organismos coloniales
(p. e., cadenas de diatomeas).
La mayora de los organismos se cuentan a 400 aumentos, recorriendo al menos 2 cm de la
placa (80 campos de visin). Este esfuerzo normalmente implica la obtencin de un nmero de
entre 50 y 100 clulas de los taxones ms comunes.
Los especmenes de tamao grande (>30 m, aproximadamente) o los que son muy poco
abundantes se cuentan a 100 200 aumentos, recorriendo toda la placa o, al menos, 40
campos.
5.4 Procesamiento de los datos
Para obtener la concentracin de la clorofila-a se aplica la frmula de Jeffrey y Humphrey
(1975):
Chl-a = ((11.85*E664)-(1.54*E647)-(0.08*E630))*v*V-1
Donde E664 es la absorbancia medida a una longitud de onda de 664 nm
E647 es la absorbancia medida a una longitud de onda de 647 nm
E630 es la absorbancia medida a una longitud de onda de 630 nm
v es el volumen (mL) de acetona en el tubo
V es el volumen (L) de agua de mar filtrada
En cuanto a la abundancia y composicin del fitoplancton para obtener los datos de
densidad (nmero de clulas por litro) de cada taxn individual se aplica una frmula que incluye
como constante el rea de la placa de sedimentacin y como variables el volumen sedimentado,
el nmero de clulas contadas y la superficie observada:
Clulas L-1= V*N*5,31*S-1
Donde V es un factor dependiente del volumen sedimentado (Tabla 1)
N es el nmero de clulas contadas
5,31 es una constante que corresponde al rea de la superficie de la placa
S es la superficie observada, que depende del transecto y los aumentos (Tabla 2)

Vol. Sedimentado (mL) V

3 333,3
5 200
10 100
50 20
100 10
Tabla 1 Valor del factor V en funcin del volumen de muestra sedimentado.
Superficie observada (S)
Aumentos 1 cm 2 cm 4 cm 6 cm
x100 0,1 0,2 0,4 0,6
x200 0,05 0,1 0,2 0,3
X400 0,025 0,05 0,1 0,15
Tabla 2 Valor de S (superficie observada) en funcin de la longitud del transecto realizado y los aumentos
empleados.

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Finalmente, la informacin se almacena en archivos informticos (hojas Excel) y se introduce en
la base de dato SIAE.

6 SISTEMA DE EVALUACIN
El Real Decreto 400/2013 establece que para la evaluacin del elemento fitoplancton, tanto en
aguas costeras (Anejo 3.6) como de transicin (Anejo 3.5), deben utilizarse dos indicadores de
calidad o mtricas: el percentil 90 de clorofila-a y la frecuencia (%) de floraciones planctnicas.
En el caso de las masas de agua costeras de la CAPV se utiliza un ndice denominado Spanish
Phytoplankton Tool (SPT), que fue elaborado por Revilla et al. (2008, 2009a), modificndose
posteriormente a lo largo del proceso de Intercalibracin europeo. Los lmites entre clases de
estado para la mtrica de clorofila-a se incluyen en el anexo II de la Decisin (2013/480/EU), que
presenta los resultados del ltimo ejercicio de Intercalibracin en los casos en los que ste se
concluy parcialmente. Por lo tanto, estos resultados son provisionales hasta que se complete
dicho proceso, a ms tardar en diciembre de 2016.
Para las aguas de transicin del Pas Vasco se dispone de un ndice denominado Spanish
Phytoplankton Tool for North East Atlantic Transitional Waters, 2 (SPTT-2), que se trata de una
versin actualizada de un ndice que se haba utilizado previamente en estuarios de Asturias,
Cantabria y Pas Vasco (versin inicial en Revilla et al., 2009b; 2010). El ndice previamente
utilizado en el Pas Vasco no pudo intercalibrarse con xito y por tanto, no se encuentra incluido
en la ltima Decisin (2013/480/EU).
Ambos ndices responden a las definiciones normativas de clasificacin del estado indicadas en
el anexo V de la DMA, es decir, tienen en cuenta la biomasa, la composicin y abundancia, y la
frecuencia e intensidad de las floraciones fitoplanctnicas.
Tanto el ndice para aguas costeras (SPT), como el nuevo ndice para aguas de transicin del
Pas Vasco (SPTT-2) se incluyen en el presente tercer ejercicio de Intercalibracin, que
concluir en 2016.
6.1 Mtricas asociadas al ndice
Los ndices empleados para la evaluacin del fitoplancton requieren del clculo de dos mtricas.
Por una parte, se evala un indicador de biomasa, mediante el clculo del Percentil 90 de la
concentracin de clorofila-a presente en el agua. Por otra, se evala un indicador de blooms
(floraciones fitoplanctnicas), mediante el clculo de la frecuencia con la cual un taxn individual
cualquiera supera cierto umbral de abundancia celular en el agua.
Ambos indicadores se evalan en cada una de las estaciones de muestreo, utilizando
nicamente datos de aguas de superficie (0-1 m). Los datos abarcan periodos de seis aos que
comprenden el ao al cual corresponde la evaluacin y los cinco aos previos.
El percentil 90 de la clorofila se calcula con los datos de las cuatro pocas del ao (invierno,
primavera, verano y otoo). Por lo tanto, se emplean 24 datos en las estaciones de aguas
costeras y 48 datos en las de aguas de transicin (en aguas de transicin se toman dos datos de
clorofila por da de muestreo, uno en pleamar y otro en bajamar).
La frecuencia de floraciones (blooms) se calcula con los datos de composicin taxonmica y
abundancia celular. El umbral a partir del cual se considera que existe una floracin es 400.000
clulasL-1 en aguas costeras y 750.000 clulasL-1 en aguas de transicin. Estos umbrales se
aplican a la abundancia de cada uno de los taxones identificados en una muestra. Si un taxn
cualquiera excede el umbral de densidad celular se contabiliza dicha muestra como un caso de

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bloom. El porcentaje de blooms se calcula sobre el nmero total de muestras analizadas. En las
estaciones de aguas costeras se emplean los datos adquiridos trimestralmente (24 datos). Sin
embargo, en aguas de transicin se utilizan nicamente los datos de primavera y verano
recogidos en pleamar (12 datos), ya que no se dispone de datos de invierno y otoo en todas las
estaciones de muestreo.
6.2 Clculo del ndice. Condiciones de referencia y lmites de cambio de clase
Ambos ndices, el de aguas costeras (SPT) y el de aguas de transicin (SPTT-2) se basan en el
promediado de los valores de EQR (Ecological Quality Ratio) que derivan de las dos mtricas
descritas anteriormente (clorofila y blooms).
En cada una de las estaciones de muestreo se realiza una media aritmtica con los valores de
EQR resultantes de cada mtrica. Es posible que en algn caso la medida de una mtrica en
una estacin de muestreo indique una calidad superior a la de la condicin de referencia.
Cuando esto ocurre, el EQR resultante de dicha mtrica se asume que es igual al valor mximo
posible (1), antes de proceder al promediado que dar lugar al valor final del ndice.
Para la evaluacin del estado del fitoplancton en la masa de agua se realiza una ponderacin
con los valores finales de EQR obtenidos en las estaciones de muestreo, teniendo en cuenta el
porcentaje de la superficie de la masa de agua representada por cada estacin.
Las condiciones de referencia de las dos mtricas empleadas para la evaluacin del elemento
fitoplancton deben definirse para cada tipo de masa de agua (Tabla 3). Adems, en el caso de la
mtrica basada en la clorofila-a, las condiciones de referencia en la CAPV guardan relacin con
la salinidad (Tabla 4).
Las condiciones de referencia se determinaron mediante juicio de experto y anlisis de datos de
masas de agua sometidas a distinto grado de presin recogidos por la Red de seguimiento del
estado de las aguas de transicin y costeras en la CAPV.
El estudio donde se justifica la condicin de referencia de la mtrica de la clorofila en aguas
costeras (Revilla et al., 2012) viene citado en el Apartado 3 de este protocolo.
En aguas de transicin (estuarios), la salinidad determina las condiciones de referencia de la
clorofila (Tabla 4). A medida que aumenta la influencia fluvial los lmites establecidos para la
mtrica de la clorofila son menos exigentes. De esta forma, se tienen en cuenta los aportes
naturales de nutrientes, que se diluyen a lo largo del estuario debido a la mezcla progresiva de
las aguas continentales con las aguas costeras. La clorofila, al ser una aproximacin a la
biomasa fitoplanctnica, est condicionada en gran medida por la cantidad de nutrientes que
reciba el sistema. Por ello, las condiciones de referencia de la clorofila en las aguas de transicin
del Pas Vasco presentan un gradiente de aumento entre la zona euhalina (tramo que guarda
mucha similitud con las aguas costeras adyacentes) y la zona oligohalina (tramo donde el aporte
de nutrientes de origen natural es ms importante). Para ms detalles sobre el mtodo de
clasificacin del fitoplancton en aguas de transicin vase Revilla et al. (2014).
Cdigo
Categora Tipologa
tipologa
8 Estuario atlntico intermareal con dominancia del ro sobre el estuario
Aguas de transicin 9 Estuario atlntico intermareal con dominancia marina
10 Estuario atlntico submareal
Aguas costeras 12 Aguas costeras atlnticas del cantbrico oriental expuestas sin afloramiento
Tabla 3 Tipos de masas de agua superficial de la categora aguas costeras y de transicin descritas en la
CAPV.

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Categora Tipologa Tramos Chl-a, percentil 90 (g L ) Blooms (%)
Aguas costeras 12 Euhalino mar 1,00 16,7
Euhalino 1,30 16,7
Aguas de Polihalino 2,20 16,7
8, 9, 10
transicin Mesohalino 3,40 16,7
Oligohalino 4,40 16,7
Tabla 4 Condiciones de referencia para la mtrica basada en la clorofila (Chl-a) y en las floraciones de un
taxn individual cualquiera (Blooms), en el Pas Vasco. Tramos en funcin de la salinidad
(percentil 50 de la serie de datos histrica): oligohalino (0-5 UPS), mesohalino (5-18 UPS),
polihalino (18-30 UPS), euhalino (30-34 UPS) y euhalino mar o costa (>34 UPS). Las tipologas
vienen descritas en la Orden ARM/2656/2008 (ver Apartado 3 de este protocolo).
EQR EQR EQR EQR
Categora Tipologa Tramos
MB/B B/Mo Mo/D D/M
Aguas costeras 12 Euhalino mar
Aguas de Oligohalino, mesohalino, polihalino, >0,755 >0,380 >0,230 >0,180
8, 9, 10
transicin euhalino
Tabla 5 Objetivos de calidad (umbral B/Mo) expresados como valores del Ecological Quality Ratio (EQR).
Muy Buen estado ecolgico (MB), Buen estado (B), estado Moderado (Mo), estado deficiente (D)
y estado malo (M). Tramos en funcin de la salinidad (percentil 50 de la serie de datos histrica):
oligohalino (0-5 UPS), mesohalino (5-18 UPS), polihalino (18-30 UPS), euhalino (30-34 UPS) y
euhalino mar o costa (>34 UPS). Las tipologas vienen descritas en la Orden ARM/2656/2008 (ver
Apartado 3 de este protocolo).

Los objetivos de calidad o lmites de clase entre los estados ecolgicos pueden verse en la
Tabla 5. Estos lmites estn actualmente en fase de intercalibracin.
En lo referente a las masas de agua muy modificadas, de acuerdo al Plan Hidrolgico de la
Demarcacin Hidrogrfica del Cantbrico Oriental, se aplica la misma metodologa, pero los
lmites entre clases se modifican de modo que a los lmites entre Potencial Ecolgico Aceptable
y Buen Potencial Ecolgico y entre Buen Potencial Ecolgico y Mximo Potencial Ecolgico les
corresponden valores de EQR de 0,323 y 0,642 (equivalentes al 85% del valor de los lmites
entre los estados ecolgicos Aceptable y Bueno, y Bueno y Muy Bueno), respectivamente.
Esto se considera aplicable para el fitoplancton slo en las masas de agua cuyas modificaciones
puedan haber dado lugar a mayores tiempos de residencia, esto es, las que presentan drsenas
(donde la renovacin del agua es menor que la que cabra esperar en condiciones naturales). En
concreto, se aplicara en las masas de agua de transicin que presentan fuertes
modificaciones hidromorfolgicas por el desarrollo de puertos, como las del Nervin
exterior, Nervin interior y Oiartzun. Sin embargo, no se aplicara esta reduccin de la exigencia
de los umbrales en masas de agua que no tuvieran las citadas modificaciones, como es el caso
de la masa de agua de transicin del Urumea, tambin muy modificada pero fundamentalmente
por obras de canalizacin.

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Anexo I Ficha de campo

Proyecto: Fecha:

Zona de muestreo: Embarcacin:

Personal: Viento:

Ola:

Trabajo realizado:

Datos de muestreo

Estacin Localizacin Lat (N)/Lon (W) Hora Sonda T aire Observaciones

(m) (C)

Notas:

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