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Tcnicas de separacin
Roy Sherwood
Por qu separar?
La mayor parte de los anlisis que se realizan en labora-
torios clnicos implican la deteccin y cuantificacin de
los compuestos individuales en fluidos corporales, por lo
comn en sangre u orina. Para este propsito, se utilizan
mtodos qumicos o inmunolgicos especficos en el com-
puesto de inters. Si bien tales ensayos explican la mayor
parte de los anlisis en el laboratorio clnico, a veces una
familia de compuestos muy relacionados requiere una me-
dicin. Aunque ensayos especficos podran desarrollarse
para cada compuesto del grupo familiar, este acercamiento
no es con frecuencia econmico o en la prctica es menos
viable que usar una tcnica que pueda separar y cuantificar
todos los compuestos de manera simultnea. Una variedad
amplia de tcnicas de separacin se utiliza en los laborato-
rios clnicos, pero casi siempre se basa en el principio de
la separacin cromatogrfica o electrofortica. La croma-
tografa en todas sus variantes, por ejemplo, de capa fina
(TLC), de alto rendimiento (HPLC) o la gaseosa (GC),
puede utilizarse para separar muchos tipos diferentes de
compuestos desde molculas pequeas, como aminocidos
y frmacos hasta protenas como la hemoglobina gluco-
silada. La electroforesis, por otra parte, se emplea para la
separacin de protenas, casi cualquier protena (p. ej., pro-
tenas sricas), o para identificar variantes de una en parti-
cular (p. ej., variantes heredadas de hemoglobina).
Cromatografa
La cromatografa cumpli 100 aos en 2003. M.S. Tswett
de la Universidad de Varsovia describi primero el uso de la
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
2005 John Wiley & Sons, Ltd.
adsorcin para separar los pigmentos de una hoja de planta
en marzo de 1903. El principio de los diferentes tipos de
cromatografa es la interaccin de las molculas de inters
entre una fase mvil (lquida o gaseosa) y una estacionaria
(slida). Esas molculas que interactan con la fase esta-
cionaria se mueven ms lento a travs de una placa, o de
una columna, que las que no interactan y, por consiguien-
te, se produce una separacin de molculas desde el inte-
rior de una mezcla. El control de estas interacciones, y por
tanto de la separacin, se alcanza explotando las diferen-
cias sutiles de ciertas propiedades fsicas de las diferentes
molculas en las muestras, por ejemplo, su solubilidad en
agua o en solventes orgnicos, la carga neta y el tamao. El
cuadro 44-1 detalla las propiedades moleculares que rigen
la separacin en las diversas formas cromatogrficas.
Cromatografa de capa fina (TLC)
Principios
La TLC reemplaz a la cromatografa de papel en la dca-
da de 1960 y en la actualidad se le est sustituyendo en una
gran parte por la HPLC. En la TLC la fase estacionaria (por
lo comn almina, gel de slice o celulosa) se fija sobre una
placa de cristal, plstico o metal. Una mezcla solvente (fase
mvil) aplicada a un extremo de la placa viaja a lo largo de
ella por atraccin capilar y produce la separacin cromato-
grfica de los solutos en una muestra aplicada a la placa. A
menos que sean fluorescentes, la mayor parte de los com-
puestos requieren la derivacin (modificacin qumica)
para que puedan ser visualizados; esto se logra rociando
con, o sumergiendo la placa en, reactivos cromognicos.
430 CAP. 44 TCNICAS DE SEPARACIN
Cuadro 44-1 Propiedades moleculares que gobiernan
la separacin dentro de las varias formas cromatogrficas
Propiedad Tipo de cromatografa
Propiedades de adsorcin TLC, HPLC
Particin GC, HPLC
Interacciones antgeno- Afinidad
anticuerpo o enzima-sustrato
Tamao y forma molecular Filtracin en gel
Carga inica Intercambio inico
La informacin cualitativa puede obtenerse observando
simplemente la placa y la identificacin de las manchas
individuales con mediciones del factor de retencin (Rf,
distancia recorrida por la muestra dividida por la distancia
total recorrida por el frente del solvente). La mayor resolu-
cin se obtiene corriendo la placa una segunda vez, pero en
la direccin del solvente a 90 de aquella primera corrida
(TLC bidimensional [TLC 2-D]). La desventaja de la TLC
2-D es que slo una muestra se aplica a cada placa. La
cuantificacin requiere el uso de un densitmetro que pue-
da examinar la placa, o la elucin de la mancha a partir de
la fase estacionaria seguida por una medicin colorimtri-
ca. La TLC 2-D experimenta, sin embargo, un interesante
resurgimiento por los progresos en el campo de los prote-
micos. Despus de la TLC 2-D, el patrn de las manchas
correspondientes a las protenas individuales se compara
entre los individuos con una enfermedad particular y con
los controles, y las manchas que difieran en intensidad en-
tre los grupos son eluidas de la placa para identificar la
protena especfica implicada.
Aplicaciones
La TLC se utiliza ahora ms como una tcnica de tamizaje,
ya que es relativamente rpida, econmica y fcil respec-
to a otros mtodos cromatogrficos. Las aplicaciones para
TLC en un laboratorio clnico incluyen ensayos de amino-
cidos, frmacos y carbohidratos.
Aminocidos
Los programas de tamizaje neonatal existen en muchos
pases para la deteccin temprana de nios con fenilceto-
nuria. Aunque los mtodos espectrofotomtricos o HPLC
especficos existen para la fenilalanina, muchos laborato-
rios de tamizaje prefieren utilizar un mtodo TLC 1-D que
separe los aminocidos bsicos, neutros y cidos, debido
a que este mtodo tiene el potencial para la identificacin
de otros desrdenes del aminocido, por ejemplo, tirosi-
nemia, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce,
etc. La confirmacin de la identidad de un aminocido
incrementado anormalmente puede conseguirse por TLC
2-D o HPLC, por ejemplo, el patrn caracterstico de los
aminocidos con cadena ramificada incrementados de for-
ma anormal (leucina, isoleucina y valina) en la enfermedad
de la orina con olor a jarabe de arce. Avances recientes en
la tecnologa relacionados con la cromatografa lquida,
en particular en combinacin con espectrometra de masa
(LC-MS; vase ms adelante), condujeron a una reduccin
en el uso de TLC en los programas de tamizaje neonatal.
Frmacos
El tamizaje de frmacos urinarios es complicado por la di-
versidad de frmacos disponibles para uso recreacional
o tomados de manera deliberada o accidental en sobredo-
sis, incluyendo compuestos bsicos, neutros y cidos. En
el paciente inconsciente o no cooperativo, poca informa-
cin puede estar disponible sobre el consumo de frmacos
especficos. La TLC es con frecuencia la tcnica elegida
para el tamizaje inicial, y sistemas comerciales, por ejem-
plo, Toxilab, estn disponibles. stos tienden a tener pla-
cas separadas y sistemas de solventes para frmacos cidos
y bsicos, incluidos los neutros en cualesquiera de los sis-
temas. La nebulizacin secuencial de diversos reactivos
cromognicos produce colores diferentes que tien a los
diferentes frmacos, permitiendo as una identificacin
ms sencilla. En aos recientes, sin embargo, surge un
movimiento significativo que se dirige a emplear inmu-
noensayos enzimticos en analizadores automticos para
el tamizaje de primera lnea de frmacos adictivos.
Carbohidratos
La TLC es la tcnica elegida para el tamizaje inicial de
muestras de orina o fecales de infantes sintomticos con
desrdenes metablicos de carbohidratos, por ejemplo,
fructosuria, etc. Slo se requieren resultados cualitativos
para esta aplicacin, pero el desarrollo de pruebas para la
funcin y la integridad del tracto gastrointestinal que usan
azcares administrados por va oral crea la necesidad de
una TLC cuantitativa de los azcares. Ocurre, por ejemplo,
cuando se emplea una mezcla de mono y disacridos (xi-
losa, ramnosa, 3-o-metilglucosa y lactulosa), que cruzan la
pared del tracto gastrointestinal va diversos mecanismos,
para evaluar la permeabilidad del intestino por el diagnsti-
co diferencial de la enfermedad del tracto gastrointestinal.
La reduccin de la superficie intestinal disponible para la
absorcin (p. ej., enfermedad celiaca) conduce a una re-
duccin progresiva en la absorcin intestinal de monosac-
 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
ridos, mientras el dao a la integridad de la pared intestinal
(p. ej., enfermedad de Crohn) se perfila como un aumento
en la absorcin de disacridos.
Cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC)
Principios
La HPLC es la forma ms comn de cromatografa que se
emplea en el laboratorio clnico. Un mejor funcionamiento
se logra al contener la fase slida en columnas estrechas
(de 150 3 5 mm) y bombeando la fase mvil a travs de la
columna bajo presin (de 1.5 a 2.0 3 presin atmosfrica).
Aunque los mecanismos de intercambio inico o de exclu-
sin por tamao de separacin se utilizan de cuando en
cuando en la HPLC, la mayor parte de los mtodos se basa
en la adsorcin de las molculas en la fase slida. En la
HPLC, en fase normal, los grupos de enlace hidrfilos sobre
la superficie de un material de embalaje de silicona atraen
molculas hidroflicas pero no hidrofbicas, lo contrario es
verdad para HPLC en fase inversa. As, en la HPLC en fase
normal una fase mvil de polaridad incrementada remueve
con ms eficacia molculas polares de la fase slida, mien-
tras en la HPLC en fase inversa las fases mviles (orgni-
cas) remueven ms rpido molculas no polares de la fase
slida. La HPLC en fase inversa, por tanto, favorece la se-
paracin de las molculas neutras, que predominan en los
fluidos biolgicos.
Equipo para HPLC
Los componentes de un sistema de HPLC comprenden una
bomba o bombas, sistema de introduccin de la muestra (in-
yector de jeringuilla o automuestrador), columna, detector y
un sistema de recoleccin de datos (registrador de grficas
o computadora). Para la mayor parte de las aplicaciones,
una sola fase lquida puede utilizarse todo el tiempo a una
tasa de flujo constante (1 a 2 ml/min), es decir una elucin
isocrtica. Sin embargo, en algunas aplicaciones complejas
donde compuestos que se separan son similares en estruc-
tura, es necesario variar la composicin de la fase lquida
durante el anlisis, es decir, la elucin por gradiente. Un
ejemplo donde ocurre sta es en la separacin de aminoci-
dos en sangre u orina.
La seleccin del mtodo de deteccin para HPLC es
dependiente del tipo de analito con deteccin ultravioleta
(UV), fluorescente y electroqumica (EC), la que se utiliza
de rutina. La deteccin UV predomina en la HPLC en fase
inversa pero es raro que se emplee en mtodos de fase nor-
mal, ya que la concentracin alta del solvente orgnico en
431
la fase mvil produce una absorcin de fondo grande entre
190 y 230 nm. La deteccin fluorescente tiene sensibilidad
alta, pero requiere compuestos que tengan fluorescencia
natural o que qumicamente se modifiquen para inducir
fluorescencia. La deteccin electroqumica se basa en la
oxidacin de los compuestos en un electrodo de carbn o
metlico; puede ofrecer sensibilidad y especificidad exce-
lentes para compuestos particulares.
La espectrometra de masa (MS) se utiliza como un
modo de deteccin en combinacin con la cromatografa
gaseosa desde hace muchos aos. Los grandes volmenes
de lquido fluyendo a travs de un sistema de cromatografa
lquida (LC) tpico con una velocidad de flujo de 1 ml/min
evitaron la combinacin de LC y de MS al inicio. La in-
troduccin de LC microporo (dimetro interno < 1) y los
avances en la produccin de los aerosoles lquidos muy fi-
nos (electronebulizacin) han impulsado para que LC-MS
se torne una tcnica viable. La LC-MS o MS en tndem
(MS-MS) es probable que sean las tcnicas de separacin
que crecen ms rpido en el laboratorio clnico.
Preparacin de la muestra para muestras biolgicas
Una complicacin que surge en el anlisis de las muestras
biolgicas usando la HPLC se debe al alto contenido proteico
en muchos fluidos corporales (cerca de 70 g/L en plasma y
suero); que puede producir interferencia de fondo y condu-
cir a la obstruccin de la columna, as que alguna forma de
preparacin de la muestra se requiere, por lo regular, antes
del anlisis. La forma exacta de preparacin de la muestra
vara con el uso especfico, pero por lo comn, se realiza la
desproteinizacin o la extraccin del compuesto de inters,
o ambas. Las extracciones lquido-lquido y en fase sli-
da se utilizan para los mtodos de HPLC que involucran
muestras sanguneas. Cuando se utiliza orina, la interferen-
cia en los mtodos de deteccin UV o fluorescentes suele
ocurrir si pigmentos coloreados o fluorescentes estn pre-
sentes, y alguna forma de extraccin es a menudo necesaria,
ya sea lquido-lquido o en fase slida.
Aplicaciones
La mayor parte de las aplicaciones de la HPLC en la medi-
cina de laboratorio cae dentro del campo de la bioqumica
clnica, aunque los hematlogos tambin utilizan la tcni-
ca. Los grupos de compuestos que por lo regular se anali-
zan por la HPLC en el laboratorio clnico incluyen aminas
biognicas, aminocidos, porfirinas, frmacos, vitaminas,
hemoglobina y carbohidratos. Se han descrito muchas otras
aplicaciones especficas para propsitos de investigacin,
incluyendo los nuclesidos, productos de degradacin del
432 CAP. 44 TCNICAS DE SEPARACIN

colgeno y esteroides, pero stos no se convierten con fre- redados (porfirias) con deficiencias especficas enzim-
cuencia en parte del repertorio de rutina de las pruebas. ticas que conducen a la acumulacin de precursores. La
presentacin clnica de las porfirias es diversa, desde fo-
tosensibilidad crnica a dolor abdominal agudo, y aunque
Aminas biognicas cierta idea del diagnstico exacto puede conocerse por los
sntomas, la caracterizacin del tipo de porfiria requiere la
Las catecolaminas, adrenalina, noradrenalina y dopamina, identificacin de su patrn en sangre, orina y heces. sta
y sus metabolitos, se miden en muestras plasmticas y uri- es posible lograrla por la extraccin lquido-lquido de las
narias para la deteccin de tumores. Los feocromocitomas porfirinas, seguida por la HPLC en fase inversa con de-
secretan cantidades grandes de adrenalina o noradrenalina, teccin UV o fluorescente, puesto que las porfirinas tienen
o ambas, que se metabolizan con cido 4-hidroxi-3-metil- fluorescencia natural. Un ejemplo de separacin de porfiri-
mandlico (HMMA). El incremento en las concentraciones nas por la HPLC se muestra en la figura 44-1.
de catecolaminas y HMMA puede detectarse en la orina de
pacientes con feocromocitoma empleando la HPLC en fase
inversa con deteccin electroqumica. Esta tcnica se utili- Mezcla estndar de porrianas
HPCL sobre Hipersil SAS con deteccin uorimtricas
za tambin para detectar cantidades anormalmente altas de
dopamina y de su metabolito el cido homovanlico (HVA),
producido por los neuroblastomas en nios.
La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) se sintetiza a
partir del triptfano y se metaboliza a cido actico 5-hi-
droxiindol (5-HIAA) por monoaminooxidasas. Los tumo-
res carcinoides secretan cantidades anormales de 5-HT y
la medicin de las concentraciones de serotonina sangu-
nea/urinaria o de la excrecin urinaria de 5-HIAA es til
en la deteccin de tumores y en la vigilancia de la terapia.
Los mtodos para la determinacin simultnea de HMMA,
HVA y 5-HIAA por la HPLC en fase inversa estn dentro
de los mtodos de rutina en los laboratorios clnicos.

Aminocidos

El uso de la TLC para la identificacin cualitativa de anor-

malidades en el metabolismo de los aminocidos se descri-
bi antes. La cuantificacin de aminocidos especficos es
con frecuencia necesaria, en particular para la vigilancia
teraputica en desrdenes como fenilcetonuria, tirosinemia
o enfermedad de la orina de jarabe de arce. El primer sis-
tema HPLC especializado que se crea es el analizador de
aminocidos, que se fundamenta en la deteccin espectro-
fotomtrica despus de la reaccin poscolumna con ninhi-
drina para producir derivados a color. En la actualidad se
han creado muchos mtodos alternativos de la derivacin
para separar aminocidos por la HPLC en fase inversa con
deteccin UV, fluorescente o electroqumica (vanse Lec-
turas adicionales).
Porfirinas
Los porfirinas son tetrapirroles cclicos que se forman por
oxidacin de los porfiringenos, intermediarios de la va
biosinttica del hem. Existe una clase de desrdenes he-
Figura 44-1 HPLC de una mezcla estndar usada para el an-
lisis de porfirina urinaria. Los picos corresponden a uroporfirina
(8COOH), heptaporfirina (7COOH), hexaporfirina (6COOH),
pentaporfirina (5COOH), coproporfirina (4COOH) y mesopor-
firina (2COOH). Columna, 0.8 3 15 cm Hipersil SAS (5 mm).
Elucin por gradiente y deteccin UV (400 nm).
Frmacos
Las tcnicas de inmunoensayo sustituyen en la actualidad
a la HPLC como mtodo de rutina para muchos de los an-
ticonvulsivos establecidos, por ejemplo, fenitona, feno-
barbital, valproato y carbamazepina. Sin embargo, la ms
nueva generacin de anticonvulsivos, incluyendo lamotri-
gina, vigabatrina, gabapentina, topiramato, leviteracetam
y oxacarbazepina, se mide por la HPLC en fase inversa
con deteccin UV. La vigilancia teraputica del frmaco,
sin embargo, se considera que es menos importante para
 CROMATOGRAFA DE GASES (GC)
muchos de los anticonvulsivos ms nuevos respecto de los
ms antiguos, pues tienen amplias vistas teraputicas (la-
motrigina, topiramato y leviteracetam) o su concentracin
plasmtica se correlaciona de manera escasa con la efica-
cia clnica (gabapentina, vigabatrina). La vigilancia, por lo
tanto, se realiza sobre todo si se sospecha inconformidad
con la terapia.
Otros frmacos
Se han desarrollado ensayos para miles de otros frmacos
en fluidos biolgicos. Los lectores que buscan informa-
cin adicional deben consultar la seccin Lecturas com-
plementarias al final de este captulo. El uso de tcnicas
de separacin, que incluyen la LC, tiene una importancia
particular cuando un frmaco contiene un metabolito ac-
tivo que necesite medirse junto al frmaco de origen, por
ejemplo, amiodarona, dotiepina, etctera.
Vitaminas
Las vitaminas son un grupo diverso de compuestos, pero
casi todas se han medido en sangre u orina por la HPLC
(vanse Lecturas adicionales para consultar detalles).
Hemoglobinas incluyendo la hemoglobina glucosilada
Ms de 400 variantes estructurales de la hemoglobina se
conocen, la mayor parte de las cuales no tiene ninguna
secuela clnica para el individuo. Sin embargo, algunas
variantes se relacionan con patologas, por ejemplo, HbS
(hemoglobina de la enfermedad de la clula falciforme).
Un diagnstico definitivo requiere la identificacin de la
variante presente. Recientemente, la separacin de hemo-
globinas se logr por electroforesis, pero han aparecido
varios sistemas comerciales de HPLC especializados con
base en la cromatografa de intercambio inico. stos tie-
nen una ejecucin ms rpida de la muestra y son tiles en
el tamizaje poblacional para hemoglobinopatas. Las mo-
dificaciones a estos sistemas permiten que se les emplee
para cuantificar la fraccin glucosilada de la hemoglobina,
HbA1c, con un tiempo analtico cclico de 4 a 8 minutos.
Una versin de la HPLC del mtodo cromatogrfico de afi-
nidad al gel boronato, tambin disponible, tiene la venta-
ja de que no lo afecta la presencia de variantes heredadas
de la hemoglobina. Un mtodo de referencia establecido
para la medicin de HbA1c implica la descomposicin de
la hemoglobina en pptidos que realiza la endoproteinasa
Glu-C, seguida por la separacin y cuantificacin de los
hexapptidos por HPLC-ionizacin por electronebuliza-
433
cin y anlisis de espectrometra de masas (ESI-MS) o
electroforesis por HPLC capilar.
Carbohidratos
La tamizacin de desrdenes heredados del metabolismo de
los carbohidratos se realiza por lo general por TLC, como
se describe antes. La cuantificacin de carbohidratos espe-
cficos no es con frecuencia necesaria, pero el desarrollo de
estudios de absorcin/permeabilidad intestinal de azcares
hace necesaria la medicin exacta de azcares especficos
en orina, por ejemplo, lactulosa, ramnosa, xilosa, cuando
se requiere la cuantificacin. La separacin puede alcan-
zarse usando la cromatografa de intercambio inico pero
la deteccin es difcil, pues los carbohidratos no tienen pro-
piedades UV ni fluorescencias utilizables. La aparicin de
la deteccin electroqumica amperimtrica pulsada mejora
mucho la situacin, aunque el progreso es lento.
Cromatografa de gases (GC)
Principios
En la GC, los compuestos de inters se separan por la parti-
cin entre el soluto en una corriente de un gas transportador
inerte (nitrgeno, argn o helio) y un lquido de volatilidad
baja sujeto a un soporte inerte (de ah su nombre anterior,
cromatografa gas-lquido, o GLC). El soporte inerte es,
por lo general, de microperlas de cristal o polmeros halo-
genados sintticos y un polialcohol derivado o silicona. Por
convencin las columnas de GC son de 1 a 3 m de largo con
un dimetro interno de 2 a 6 mm, pero en la mayor parte
de las aplicaciones clnicas se emplean columnas capilares,
que pueden ser de hasta 40 m de longitud con un dimetro
interno de 0.2 a 0.5 mm. Las ventajas de la GC capilar son
por lo general una resolucin mejorada y tiempos de corri-
da ms cortos. Los sistemas de deteccin disponibles para
GC son ionizacin a la flama (FID), captura de electrones
(ECD) y espectrometra de masas (GC-MS). Una compa-
racin de GC normal contra GC capilar y de los detalles de
la forma de accin de los tipos de detectores se presenta la
en revisin de Lewis y Sampson (1994).
Aplicaciones
Los compuestos que pueden separarse por GC deben ser
voltiles o capaces de convertirse a un estado voltil por
derivacin. stos incluyen alcoholes, esteroides, frmacos,
cidos orgnicos y cidos biliares.
434 CAP. 44 TCNICAS DE SEPARACIN
Alcoholes
El etanol y el metanol son compuestos voltiles que se mi-
den muy rpido por GC con FID. Una columna de GC nor-
mal puede utilizarse, pues la resolucin adicional de la GC
capilar es innecesaria. Las mediciones del glicol de etileno
en toxicidad sospechada son tambin factibles.
Esteroides
El perfil esteroideo urinario proporciona informacin sobre
la produccin y metabolismo de esteroides a partir de la
glndula suprarrenal, testculos y ovarios. Es en particular
importante en la evaluacin de nios de gnero incierto o
con desarrollo sexual precoz. Tambin existe considerable
inters en esta medicin para detectar el abuso de esteroi-
des anablicos en los atletas. Usando la GC capilar con
FID despus de la derivacin de los esteroides, hasta 25
esteroides y metabolitos pueden detectarse y cuantificar en
una corrida (fig. 44-2). La disponibilidad y la reduccin
ms amplias, por el costo de instrumentos GC-MS condu-
Figura 44-2 Cromatograma tpico a partir de un anlisis por
GC capilar de derivados del ter metil oxima-trimetilsilil (MO-
TMS) de esteroides en la orina de una mujer adulta normal. Los
picos mximos son como sigue: A, B, C, estndares internos;
1, androsterona; 2, etiocolanolona; 3, dehidroepiandrosterona;
4, 11-oxo-etiocolanolona; 5, 11b-OH androsterona; 6, 11b-OH
etiocolanolona; 7, 16a-OH dehidroepiandrosterona; 8, pregnane-
diol; 9, pregnanetriol; 10, androstenetriol; 11, tetrahidrocortisona;
12, tetrahidro-11-dehidrocorticosterona; 13, allo-tetrahidrocorti-
costerona; 14, tetrahidrocortisol; 15, allo-tetrahidrocortisol; 16,
a-cortolona; 17, b-cortolona; 18,a-cortol.
cen hacia el reemplazo de la GC capilar convencional de
esteroides por GC-MS.
Frmacos
Los frmacos que no se miden fcil por HPLC, por ejem-
plo, valproato, antidepresivos tricclicos, etc., su ensayo
se practica con frecuencia por GC, o para la vigilancia de
frmacos teraputicos o para propsitos toxicolgicos. La
mayor parte de los sistemas utiliza columnas normales de
la GC con FID, pero GC-MS tiene un papel particular en la
confirmacin de exmenes positivos de frmacos adictivos
que se obtienen por TLC, EMIT u otros inmunoensayos.
Los mtodos especficos para varios frmacos se pueden
encontrar en el texto de Ghosh (1992).
cidos orgnicos
Las enfermedades heredadas que producen cambios en la
excrecin cida orgnica incluyen enfermedades especfi-
cas, por ejemplo, acidemia propinica, y a las relacionadas
con anormalidades del ciclo de la urea. Las mediciones de
cido orgnico urinario se realizan por lo comn usando
GC-MS capilar. La ventaja adicional de MS como detector
es la identificacin positiva de cualquier compuesto poco
comn.
Electroforesis
Principios
La separacin electrofortica se basa en la migracin di-
ferenciada de molculas cargadas bajo influencia de un
potencial elctrico aplicado. Las molculas que pueden
separarse por electroforesis deben llevar una carga neta
positiva o negativa en su estado natural, por ejemplo, mu-
chas protenas y aminocidos, o deben aceptar una carga,
por ejemplo, carbohidratos acomplejados con iones borato.
El ambiente qumico alrededor de la molcula, la solucin
electroltica, debe ser capaz de conducir una corriente elc-
trica, pero tambin tiene un papel crtico en la determina-
cin del estado de ionizacin y, por tanto, en la carga de
cualquier molcula en contacto con l. La opcin del elec-
trlito y de su pH es crtica para alcanzar movilidad y se-
paracin ptimas. El movimiento de la partcula cargada es
causado por la accin de la fuerza elctrica. La velocidad
de la migracin depende de la relacin entre el potencial
aplicado y la distancia entre los electrodos, la migracin
ms grande puede obtenerse al aumentar el voltaje aplica-
do o al disminuir la distancia entre los electrodos. El paso
 ELECTROFORESIS
de una corriente elctrica genera calor, y las condiciones
ptimas tienen que equilibrarse con la maximizacin de la
separacin. Una fuerza que retarda, la cual est en funcin
del tamao molecular y de la viscosidad de la solucin,
neutraliza la migracin hacia adelante inducida por el cam-
po elctrico. La velocidad de la migracin es, por tanto, di-
rectamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga
neta de la molcula e inversamente proporcional al tamao
de la partcula y a la viscosidad de la solucin.
La separacin electrofortica se puede llevar a cabo en
solucin libre pero por lo general se utiliza alguna forma
de medio de soporte slido, por ejemplo papel, acetato de
celulosa, gel de agar o gel de poliacrilamida. En los ltimos
10 aos, el inters se ha centrado en realizar la electrofo-
resis en tubos capilares estrechos a voltaje alto, es decir,
electroforesis capilar.
Aplicaciones
La electroforesis se emple por primera vez en el laborato-
rio clnico en la dcada de 1950 para la separacin de pro-
tenas sricas. Desde entonces, se desarrollan aplicaciones
para separar protenas del suero, isoenzimas (p. ej., creatina
cinasa, fosfatasa alcalina, etc.), variantes de la hemoglobina
y fragmentos de DNA resultado de la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR). En cuanto a la cromatografa, exis-
ten muchas otras aplicaciones, por ejemplo la separacin de
Albmina
Figura 44-3 Electroforesis de protenas sricas en gel de agar: a) patrn normal; b) aumento monoclonal en g-globulinas debido a cir-
rosis heptica; c) gammapatas monoclonales (IgG) con paresia inmunitaria.
435
lipoprotenas, pero stas permanecen en el dominio de la
investigacin y no se emplean como pruebas de rutina.
Electroforesis de protenas sricas
El uso principal de la separacin electrofortica de las pro-
tenas sricas es para la identificacin de gammopatas mo-
noclonales, aunque se contina utilizando para demostrar
los cambios relacionados (no especficos) con una variedad
de condiciones, por ejemplo, el sndrome nefrtico. Los
mtodos iniciales para la electroforesis de protenas sricas
utilizaron acetato de celulosa como medio de soporte, pero
ste produjo resolucin limitada de las protenas sricas y se
han reemplazado en gran parte por la electroforesis en gel
de agarosa. Las protenas sricas se separan en las bandas
principales correspondientes a la albmina, a1-globulinas,
a2-globulinas, b-globulinas (b1 y b2) y g-globulinas. Si se
utiliza plasma en lugar de suero, una banda adicional de fi-
bringeno est presente, por lo comn entre las regiones b-
y g-globulina (fig. 44-3). La visualizacin despus de teir
con rojo de Ponceau o azul brillante de Coomassie es por lo
general adecuada para detectar alteraciones a grosso modo,
pero la exploracin densitomtrica puede emplearse si se
requieren datos cuantitativos sobre las fracciones indivi-
duales, es decir, si una paraprotena est presente. Incluso la
mayor resolucin se puede obtener usando los geles de po-
liacrilamida, pero este valor es raro en el uso clnico de ru-
436 CAP. 44 TCNICAS DE SEPARACIN
tina. Los sistemas automatizados para la electroforesis de
protenas sricas estn disponibles en la actualidad.
Isoenzimas
Muchas de las enzimas que se miden de rutina en suero
existen como mezclas de isoenzimas, cada una de las cuales
puede producirse por un sistema orgnico diferente en el
cuerpo, por ejemplo, la creatina cinasa (CK) srica es una
mezcla de CK-MM (del msculo esqueltico), de CK-MB
(predominante del corazn) y de CK-BB (del cerebro). Con
la electroforesis puede distinguirse si la causa de una CK
total elevada es un dao del msculo cardiaco o el esquel-
tico. La separacin se consigue usando geles de agar recu-
biertos con un sustrato sinttico para la enzima que produce
un compuesto fluorescente visible bajo luz UV cuando es
activado por la CK. Aunque la medicin de las troponinas
especficas del corazn ha sustituido en gran parte las me-
diciones CK-MB en muchos laboratorios, la electroforesis
sigue como el nico mtodo capaz de detectar la presencia
de los complejos macro-CK. La electroforesis tambin se
utiliza para separar la fosfatasa alcalina en formas heptica,
sea, placentaria e intestinal, y para determinar el patrn de
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa.
Hemoglobina
Hasta la reciente introduccin de los mtodos de HPLC
para la identificacin de las variantes de la hemoglobina,
los mtodos electroforticos se emplearon con mucha fre-
cuencia, fundamentados sobre la carga global diferente
en la molcula de la hemoglobina causada por las susti-
tuciones del aminocido. El acetato de celulosa se man-
tuvo como el medio de soporte normal para los mtodos
de tamizaje, con la electroforesis del gel de agar citrato
usada para la identificacin positiva de cualquier variante
anormal vista en el tamizaje. La separacin de las varian-
tes de la hemoglobina por electroforesis con gel de citrato
confa en las interacciones de los aminocidos sustituidos
con agaropectina. Las hemoglobinas variables con sustitu-
ciones cerca de la superficie, por ejemplo, HbS y HbC, se
retienen, mientras que en las sustituciones ms profundas
no ocurre, como HbD y HbG. Combinaciones comple-
jas de electroforesis o el enfoque isoelctrico se requieren
para identificar hemoglobinopatas raras.
Fragmentos de DNA obtenidos por PCR
Aunque fuera del alcance de esta seccin, merece la pena
recordar que muchas de las tcnicas moleculares actuales
introducidas en el laboratorio clnico incluyen la separa-
cin electrofortica de fragmentos de la restriccin del
DNA, despus de amplificacin por PCR. El gel de agar es
el medio usado en la mayor parte de las aplicaciones en la
biologa molecular, con la visualizacin por radiomarcaje o
por tincin con bromuro de etidio. Un ejemplo del empleo
de tales tcnicas es la deteccin de las dos mutaciones en
el gen HFE relacionado con hemocromatosis gentica: los
cambios aminoacdicos C282Y y H63D.
Electroforesis capilar (EC)
Aunque la electroforesis en un capilar estrecho se describi
primero en 1937, es desde 1985 que la tcnica se emplea
de manera independiente. Se utilizan capilares de 25 a 100
m de dimetro y de 25 a 100 cm de longitud; sus extre-
mos se colocan en viales con amortiguador, que tambin
contienen los electrodos. Voltajes muy altos (10 a 30 kV)
se aplican para producir el flujo electroendosmtico dentro
del capilar. El tipo pH y la fuerza inica del amortiguador
que llena el tubo capilar son crticos para lograr la separa-
cin deseada.
Existen cuatro formas importantes de separacin por
electroforesis capilar: electroforesis capilar de zona (CZE)
o separacin en solucin libre; cromatografa capilar elec-
trocintica micelar (MECC); enfoque isoelctrico capilar
(CIEF) e isotacoforesis capilar.
Los principios de estas formas diferentes de separacin
y los usos potenciales en la medicina de laboratorio fueron
revisados hace poco. Se ha desarrollado un instrumento
comercial que usa CE para la electroforesis de protenas
sricas (Beckman Instruments). ste utiliza varios tubos
capilares en paralelo para alcanzar un alto rendimiento e
incluye la identificacin de paraprotenas usando la tcnica
de inmunosustraccin. La CE se convirti en la metodolo-
ga dominante en el Proyecto del Genoma Humano, y es
la base para la generacin actual de los secuenciadores de
DNA del banco principal.
Lecturas adicionales
Chace DH. Mass spectrometry in the clinical laboratory, Chem
Rev 2001; 101: 445-477.
Ghosh MK. HPLC Methods in Drug Analysis. 1992: Springer
Verlag, Berlin.
Lehmann R, Voelter W, Liebich HM, Capillary electrophoresis in
clinical chemistry, J. Chromatogr B1997; 697: 3-35.
Lewis J, Sampson D. Chromatography for the clinical bioche-
mist. Clin Biochem Rev 1994; 15: 56-63.
Sherwood RA. Liquid chromatography: applications in clinical
analysis. In Encyclopaedia of Analytical Science, 2nd edn.
2004: pp. 267-76 Academic Press, London.