LABORATORIO: 39 RECONOCIMIENTO DE LOS ELEMENTOS DEL EMBRION DE POLLO Y SU EMPLEO EN VIROLOGIA. ~~ El embrién de pollo es uno de los medios de cultivo mas favorables para el aislamiento de algunos virus. Los huevos embrionados pueden ser inoculados por varias vias y su cleccién depende del virus que se quiera estudiar. Comunmente se emplean embriones, por las siguientes razo- nes: a Estn relativamente exentos de infecciones y conta- minaciones, 1b. Son sensibles a la infeccién por muchos agentes vira- les. ¢. No forman anticuerpos contra la virus inyectados. d. Son baratos, se adquieren con facitidad y son de ta: mafio adecuado, Algunas de las condiciones que influyen sobre el crecimien- to de los virus en los embriones son: a Lavia de inoculacion b. La dilucién y la cantidad del indculo, c. La edad del embrién, d, La temperatura y ef tiempo de incubacién tras la ino- culacién. En la prictica se utilizan para: a Preparar vacuna’ (¢j.) lebre arnarilla, influenza), Las vacunas:se logran después de atenuar é virus, esto se consigue haciendo pases seriados. Para el aidlatniénto. dé los virus con fines de diagndsti- co. (ej. viruela herpes, influenza). Por: E, Ramirez (1) Para hacer ensayos de nuevos agentes antivirales. ALGUNAS NOCIONES SOBRE EMBRIOLOGIA AVIAR, Para utilizar con éxito el cultivo de los embriones de pollo, se requiere reconocer el desarrollo y la fisiolo- gia de los inismos. Bl embrién eifipieza a desarrollarse bajo la forma de una membrana de-oélulas que recu- bre el polo superior dela yema, “Durante los tres rimetos dias su apreciacion es dificil, pero a los cua- tro 0 cinco dias de incubacion, se ‘puede observar fécilmente en ovoscopio. (ver fig. 2). Se reconoce que el embrién esté vivo, porque @ la transluminacién se ven como una telarana, las venitas que forman la membrana corioalantoidea y ademés se observa que se desplaza un punto negro. intermitentemente (e! ojo). Al morir ct embriém, los vasos se desintegran y este ‘yace fijo al polo. superior del huove. A partir del noveno dia, puede observarse a veces movimicntos de deglucidn. Después del undécimo dia el embridn aumenta de tamafo ripidamente y empie- an a aparecer las plumas. A medida que aumenta de tamaiio, disminuye el volumen de los liquidos ex- traembrionatios. Durante la incubacién hay una cons- tante pérdida de agua por transpiracidn a través de ta céscara, por esta raz6n la incubadora se debe consor- var con cierto grado de humedad, También hay que tener en cuenta, de voltear los hue- Yos mas © menos cada doce horas, ya que ef embrién. durante las dos primeras semanas carece de miisculos para cambiar de posicion por si mismo. Para nacer tarde mas o menos 21 dias. Para hacer la inoculacin en el saco de la yema (vite- Jo) son mas adecuados los embriones de siete dias de (1) Profesora, Departamento de Biologia, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia, Actualidades Biotogicas Vol.S,No.6incuban los huevos por espacio de 72 horas y a una temperatura de 35C, una vez que los virus prenden en la membrana se pueden manifestar asi: E] virus de la Viruela provoca lesiones pequeitas, re- dondeadas, casi siempre en forma de rosario (fig. 3). EL virus de la Vacuna, provoca lesiones grandes apla- nadas con halo hemorragico y necrotico (Fig. 3). BI virus del Herpes, prosenta lesiones pequetias, ovala- — se “das (como una perla). ete pasteur o gotero a eotete Pps pasteur oe . La inoculacign en la cavidad amnitica, se utiliza principaliments para’el aislamiento del virus de Ia IN- . FLUENZA Y PAPERAS. Los embriones deben ser de Fig 1. Alpines implementos necesrios para la inocuacién de los 8-10 dias de incubados, se incuban 4 350C y se cose. embriones de potto, chan a las 72 horas, Lastrado-con arena Fig, 2, Mirando el huevo a trasluz con al ovoscopio. (se puede hacer con una caja de carton grueso). incubacién. Esta inoculacién se utiliza prineipatmente para el aislamiento de RICKETTSIAS, los embriones se deben cosechar a los 5 dias después de inoculados y la temperaturaa la Cual se deben colocar es de 350C. Se deben revisar al segundo dia para gescartar los em- briones muertos (se consideran inespecificas las muer- tes en estt lapso de tiempo). Para hacer las inoculaciones en las membranas co- rioalantoidea, se utilizan embriones de 9-12 dias éstos son titiles para el aislamiento de ios virus vesiculare Fig. 3. Lesiones en membrana corioalantoidea provocadas por el VIRUELA, VACUNA, ademis HERPES VIRUS, Se virus de la vinsela y vaccinia, respectivamente, Abril/Junio 1976B_TECNICAS DE INOCULACION Materiales: Ovoscopio Huevos embrionados de 7-10 dias. Taladro eléctrico o en su defecto una aguja de disec- cién o una aguja de inyectar estéril No. 18. Lépiz marcador. Azul de metileno al 0.5/0. Jeringas tipo tuberculina de 1 ral, Peras de caucho. ‘Agujas de inyectar No, 21 0 22 de modia y de una y media pulgedas. Cinta pegante transparente Bandejas plisticas Tijeras Métodos: Cada alumno recibird 3 embriones de 7 y 10 dias respectiva- mente: En el primero practicaré la inoculaci6n en el saco de la yema, en el segundo, la inoculacién en la membrana co- rioalantoidea y en el tercero, la inoculacién en Ja cavidad amniética. ‘A cada embrién se le delimitara con lépiz ta camara de aire y él sitio correspondiente a la proyeccion del embrién, esto Cavidad Amnistica (Cavidad Alantoidea al se verifica mediante transluminacién. Antes de inocularlos se deben colocar fos embriones con el polo mayor hacia arriba (donde esta la cémara de aire). Para evitar que se rueden se sugiere hacer circulos con plastilina y colocarlos dentro de ellas. INOCULACION EN EL SACO DE LA YEMA (Fig. No. 4) a). Rerfore la edscara en el centro del polo mayor del huevo con taladro © con la aguja No. 18 estéril. (ehorificio debe ser pequefio). b) Selena una jeringa tipo tuberculina con 0.2 ml de azul de metileno y se le coloca una aguja No. 21 de 1/2 pulgada. ©) Por el orificie que abrimos se introduce total- mente 1a aguja y se depositan los 0.2 ml. La aguja se debe inclinar un poco por fuera de la vertical con el fin de esquivar el embrién. 2. INOCULACION EN LA MEMBRANA CORIOALAN- TOIDEA (Fig.5) a) Se matca un sitio no vascularizado en Ja céscara cercano al limite de la cdmara de aire. b) Se hace una pequefia perforacién en el sitio marcado y otra més, en el centro del polo ma- yor dela chmara de aire. ©) Coloque en ef orificio de la cémara de aire, la pera de caucho y succione suavemente dos o tres veces, con el fin de que parte del aire pase al sitio donde vamos a hacer la inoculacién. Inoculacién en la Membrana Corioalantoidea Inoculacién en el saco Vitetino Inoculacién alantoidea Membrana Corioalantoides. Fig. 4. Partes del embrién de pollo y las diferentes vias de inoculacién, Actualidades Biologicas Vol.5, No. 16vascular cereano a la cimara de aire, ») Semarea un sitioay ©) Se hace una pequefia perforacién con una aguja No. 18 ertéril cen los sitios soil lox sitios sealados. Fig. 5. Inoculacion en la Membrana Corioalanitoidea. 11 de aire unia pera de caucho @ —Coloque en el otificio de tac. y seccione suavemente. alcohol yodado, los sitios clegi- rculacion dos para hacer ia inox 4), Desinfecte con a) Demarque con un lapiz la Cimara de Aire. Abril/Junio 197643 cuando se esti trabajando con muestras que se presu- men tienen virus. 4, PROCEDIMIENTO PARA ABRIR LOS EMBRIO- NES a) Una vez hechas las inoculaciones, tome los em- briones y marquelos respectivamente: I amnié- tica, I. corioalantoidea, I, saco de la yema, b) Con unas tijeras estériles corte la céscara al rededor de la cdmara de aire de Jos huevos mar- cados: =yema y i-amniética, Luego con cui- ©) Con una jeringa tipo tuberculina inyecte 0.2 mi. en el sitio dado quite la membrana que se encuentra inme- avascular seated. diatamente después. e) Lien una jeringa tipo tubercufina con 0.2 ml. ©) En la inoculacién en el saco de ta yema, se ob- de azul de metileno e inyéctela en el sitio vascu- servari inmediatamente que ésta se tine de azul. lar sefialado con anterioridad, para esta inocula- cién tenga cuidado de introducir solamente el 4) En le inoculacién amnidtica, se torman una pin- bisel de fa aguja. zas y se presiona hacia un lado, se deja salir el liquido y se saca el embrién suavemente. 3. INOCULACION £N CAVIDAD AMNIOTICA. (ig quedé bien inoculado se verd Ja cavidad amnid- 4) tica tefiida de azul claro. a) En el ovoscopio determine la vitalidad del em- ©) En [a inoculacién corioalantoidea, se procede brién y haga una seffal sobre la céscara en el partiendo con las tijeritas el huevo por fa mitad sitio donde esté situado el ojo, el cual se ve muy y se toma la mitad que tiene el otificio donde bien en forma de un punto negro), hicimos la inoculacién. Si quedé bien hecha la inoculacién, dicho sitio y parte de la membrana b) Desinfecte fa cdmara de aire con alcohol yoda- deben verse teflidas de azul. do y realice en ella una pequefia perforacion con el taladro o con Ia aguja No. 18 estéril (el NOTA: Antes de empezar la prictica de inoculacién, orificio debe quedar perpendicular a ta sefial del al profesor debe tomar un embri6n y emperar a abrit- ojo). lo como demostracion a los alumnos, para que pue- ‘dan observar una por una sus diferentes partes. cc) Usando una jeringa tipo tuberculina de 1 ml. ‘con una aguja No. 21 de 1 1/2 pulgadas, inocule Las bandejas plisticas se utilizan para descartar los Ta cantidad de 0,2 ml. de azul de metileno embriones una ve7-abiertos. cha inoculacién se hace introduciendo Ia aguja por el orificio hecho en Ja cdimara de aire hasta PREGUNTAS: tocar et ojo del embrién, (se hace mirando al ovoscopio el huevo para poder observar cuando 1. Qué grupo de virus erecen principalmente en la mem- se toca el ojo) luego se procede a inocular el brana corioalantaoidea del embrion de poilo? azul de metileno. 2, Como se recogen los virus que han crecido en huevos NOTA: Los sitios perforados se deben tapar con cinta para la preparacién de vacunas? pegante transparente antes de ponerlos en ineubacién, teniendo cnidado de que el orificio de Ia inoculacién ——3.-—-Por qué se deben utilizar embriones vivos para culti- permanerca hacia arriba. Esto se tiene en cuenta var virus? BIBLIOGRAFIA: 1, Cunningham, Ch. 1963.Virologia Practica. Ed. Acribia pgs. 35-50. 2. Jawetz, E, 1973.Manual de Microbiologia Médica. Ed. Manual Moderno, México. pags: 309-311. 3. Rivers T. and Hordfall, F. 1965.Diagndstico y Tratamiento de las Enfermedades por virus y Rickettsias. Ed. Interameri- cana S.A, 3a, Ed. pgs. 163-169, 1965. Actualidades Biologicas Vol.5, No.16