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Determinacin de protenas por el mtodo de kjeldahl

I. Introduccin
Las protenas son un componente abundante en todas las clulas, y casi todas
excepto protenas de almacenamiento son importantes para las funciones biolgicas y la
estructura celular. Las protenas de los alimentos son muy complejas. Muchos han sido
purificados y caracterizados.
Las protenas se pueden clasificar por su composicin, estructura, funcin
biolgica o propiedades de solubilidad.
Por ejemplo, las protenas simples contienen slo aminocidos tras la hidrlisis,
pero las protenas conjugadas tambin contienen componentes no aminocidos.
Las protenas tienen conformaciones nicas que podran ser alteradas por
desnaturalizantes tales como calor, cido, lcali, urea 8M, guanidina-HCl 6M, disolventes
orgnicos y detergentes.
II. Marco terico
El anlisis de las protenas se complica por el hecho de que algunos componentes
de los alimentos poseen propiedades fisicoqumicas similares. El nitrgeno no proteico
podra provenir de aminocidos libres, pequeos pptidos, cidos nucleicos, fosfolpidos,
aminocidos, porfirina y algunas vitaminas, alcaloides, cido rico, urea y iones amonio.
Por lo tanto, el nitrgeno orgnico total en los alimentos representara nitrgeno
principalmente de protenas y en menor medida de todas las sustancias no proteicas
orgnicas que contienen nitrgeno. Dependiendo de la metodologa, otros componentes
importantes de los alimentos, incluidos los lpidos y los hidratos de carbono, pueden
interferir fsicamente con el anlisis de las protenas alimentarias.
Numerosos mtodos se han desarrollado para medir el contenido de protenas. Los
principios bsicos de estos mtodos incluyen las determinaciones de nitrgeno, enlaces
peptdicos, aminocidos aromticos, capacidad de unin al colorante, absorcin de
ultravioleta de protenas y propiedades de dispersin de la luz. Adems de factores como
la sensibilidad, la precisin, la precisin, la velocidad y el costo del anlisis, lo que
realmente se est midiendo debe considerarse en la seleccin de un mtodo apropiado
para una aplicacin particular. (Nielsen, 1998)
Mtodo Kjeldahl :
Fundamento
El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico
concentrado, formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio libera
amonaco, el que se destila recibindolo en:
a) cido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado con
hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o
b) cido brico formndose borato de amonio el que se valora con cido clorhdrico.
(Ruiz , 2011)
III. Objetivo
Determinar el contenido en protenas de diversos alimentos haciendo uso del
mtodo Kjeldahl.
IV. Equipos y materiales
Balanza analtica ( Henkel) cido sulfrico concentrado
Equipo Kjeldahl (KDN) 0.1 N
Alimentos Sulfato de potasio
Bureta (Isolab) Sulfato cprico
Erlenmeyer 150 ml (Isolab) Hidrxido de sodio 30%
Vasos de precipitacin 50 Indicador Tashiro
ml(Isolab) cido brico al 2 %
Indicador fenolftalena
V. Procedimiento
a. Digestin
b. Destilacin:
Se agrega en un vaso 50 ml de cido brico al 2 % y unas gotas de indicador ta-
shiro.
Conectar al equipo de destilacin. Colocar el tubo de digestin con la muestra
digestada mas unos 10 ml de agua destilada y unas gotas de fenolftalena en el equipo de
destilacin.
Adicionar hidrxido de sodio al 30 % , abriendo la llave del embudo que est
conectado al baln ( hasta que aparezca color rosa-fucsia) , luego encender la hornilla
calefactora , observar que el color del lquido destilado cambia ,lavar la alargadera con
agua destilada .Retirar el vaso que contiene el destilado y luego desconectar la hornilla.
c. Titulacin:
Valorar el destilado con una solucin de cido sulfrico o clorhdrico 0.1
N (Estandarizado), hasta cambio de color.
Figura 1 Tubo de digestin con la muestra Figura 2 Adicionar (NaOH)
VI. Resultados y discusiones
6.1 Caihuaco:
%N = V*N*14*100/m*1000
%N = (3.9)*(0.177)*(14)*(100)/1*1000
%N = 0.966
% Protena = %N*F
%Protena= 0.966*6.25
%Protena =6.03
Segn las tablas de composicion de alimentos en 100gr de caihua exite 17,60g de
proteinas, entonces en 1 gramo sera 0.176 , en el experimento se obtuvo 6.03. ( Reyes
Garca, Gmez-Snchez Prieto, Espinoza Barrientos, Bravo Rebatta, & Ganoza Morn,
2009)
Figura 3 Titulacin (3.9 de gasto)

6.2 Caqui:
%N = V*N*14*100/m*1000
%N= (1.2)*(0.177)*(14)*100/(1.05)*(1000)
%N = 0.28
% Protena = %N*F
% Protena = 0.28*6.25
% Protena= 1.77
Segn las tablas de composicion de alimentos en 100gr de caqui exite 0.5 g de
proteinas , en 1.5 gramos sera 0.0075 , el analisis se obtuvo 1.77 . ( Reyes Garca, Gmez-
Snchez Prieto, Espinoza Barrientos, Bravo Rebatta, & Ganoza Morn, 2009)
Figura 4 Titulacin (1.2 gasto)

VII. Conclusiones
El mtodo kjeldahl es el mtodo patrn para determinar la protena contenida en
cereales, carnes y otros materiales biolgicos.
El caihuaco tiene ms porcentaje de protena a comparacin con el caqui en
gramos se obtuvo 6.03 y 1.77 respectivamente, comparando con la literatura es mucha
la diferencia.
Los resultados no se asemejan con lo que nos dice la literatura eso se debe talvez
por error durante el proceso de digestin : perdida de nitrgeno durante la digestin ,
digestin incompleta de la muestra porque falta de tiempo o falta de cido sulfrico .
VIII. Cuestionario
8.1 Para que es importante el anlisis de las protenas
El anlisis de protenas es importante para:
Etiquetado nutricional
Precios: El costo de ciertos productos bsicos se basa en el contenido de
protena medida por el contenido de nitrgeno (por ejemplo, granos de cereal,
leche para producir ciertos productos lcteos, por ejemplo, queso).
Investigacin de propiedades funcionales: Las protenas de diversos tipos de
alimentos tienen propiedades funcionales nicas en alimentos: por ejemplo,
gliadina y gluteninas en harina de trigo para panificacin, casena en leche
para coagulacin en productos de queso y albmina de huevo para espumar.
Determinacin de la actividad biolgica: Algunas protenas, incluyendo
enzimas o inhibidores enzimticos, son relevantes para la ciencia alimentaria
y la nutricin: por ejemplo, las enzimas proteolticas en la ablandamiento de
las carnes, las pectinasas en la maduracin de los frutos y los inhibidores de
la tripsina en las semillas de leguminosas son protenas. Para comparar entre
muestras, la actividad de las enzimas a menudo se expresa en trminos de
actividad especfica, lo que significa unidades de actividad enzimtica por mg
de protena. (Nielsen, 1998)
El anlisis de protenas es necesario cuando se quiere saber:
Contenido total de protenas
Contenido de una protena particular en una mezcla
Contenido proteico durante el aislamiento y purificacin de una protena
Nitrgeno no proteico
Composicin de aminocidos.
Valor nutricional de una protena.
8.2 Porque no es igual el factor de conversin de nitrgeno a protena para todos los
alimentos por el mtodo Kjeldahl? Y como se calcula el factor 6.25?
Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N en porcentaje de protena
bruta. La mayora de las protenas contienen 16% de N, por lo que el factor de
conversin es 6,25 (100/16 = 6,25). % N / 0,16 =% de protena .
O% N 6,25 =% de protena
Tabla 1 Nitrogen to Protein Conversion Factors forVarious Foods

8.3 Exprese en ecuaciones lo que sucede en el proceso de anlisis de nitrgeno por el


mtodo Kjeldahl.
Preparacin de la muestra Los alimentos slidos se mueven para pasar una
malla de 20 mallas. Las muestras para el anlisis deben ser homogneas. No se requieren
otros preparados especiales.
Digestin Colocar la muestra (pesada con precisin) en un matraz Kjeldahl.
Aadir cido y catalizador; Digerir hasta obtener una descomposicin completa de toda
la materia orgnica. El sulfato de amonio no voltil se forma a partir de la reaccin de
nitrgeno y cido sulfrico.

Durante la digestin, el nitrgeno proteico se libera para formar iones de amonio;


El cido sulfrico oxida la materia orgnica y se combina con el amonio formado;
Carbono e hidrgeno se convierten en dixido de carbono y agua.
Neutralizacin y destilacin
El producto digestivo se diluye con agua. Se aade alcalino que contiene tiosulfato
sdico para neutralizar el cido sulfrico. El amonaco formado se destila en una solucin
de cido brico que contiene los indicadores azul de metileno y rojo de metilo.

Titulacin Se titula el anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) con


HCl normalizado.

Clculos
Moles de HCl = moles de NH3
= Moles de N en la muestra [5]
Se debe hacer un blanco de reactivo para sustraer el nitrgeno del reactivo del
nitrgeno de la muestra.

Dnde:
NHCl = normalidad de HCl, en mol / 1000 ml

Vol. cido corregido. = (Ml de cido estril para la muestra) - (ml de cido estndar
para blanco)
14 = peso atmico del nitrgeno
Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N en porcentaje de protena bruta.
La mayora de las protenas contienen 16% de N, por lo que el factor de conversin
es 6,25 (100/16 = 6,25). (Nielsen, 1998)
8.4 Describa el fundamento, ventajas y desventajas de otros dos mtodos de anlisis
de protenas.
A. Mtodo Biuret
Principio
Se produce un color violceo violceo cuando los iones cpricos se complejan con
enlaces peptdicos (sustancias que contienen al menos dos enlaces peptdicos, es decir,
biuret, pptidos grandes y todas las protenas) en condiciones alcalinas.
La absorbancia del color producido se lee a 540 nm. La intensidad del color (absorbancia)
es proporcional al contenido proteico de la muestra.
Aplicaciones
El mtodo biuret se ha utilizado para determinar protenas en cereales, carnes,
protenas de soja y como prueba cualitativa para alimentacin animal. El mtodo de
biuret tambin se puede usar para medir el contenido de protenas de protenas aisladas.
Ventajas:
Menos costoso que el mtodo Kjeldahl; Rpido (se puede completar en menos de
30 min); Mtodo ms sencillo para el anlisis de protenas.
Las desviaciones de color se encuentran con menos frecuencia que con Lowry,
absorcin ultravioleta (UV) o mtodos turbidimtricos (descritos ms adelante).
Muy pocas sustancias distintas de las protenas de los alimentos interfieren con la
reaccin del biuret.
No detecta nitrgeno de fuentes no pptido o no protenicas.
Desventajas:
No es muy sensible en comparacin con el mtodo de Lowry; Requiere al
menos 2-4 mg de protena para el ensayo.
La absorbancia podra ser aportada de los pigmentos biliares si est presente.
La alta concentracin de sales de amonio interfiere con la reaccin.
El color vara con diferentes protenas; La gelatina da un color rosado-prpura.
Opalescencia podra ocurrir en la solucin final si hay altos niveles de lpidos
o carbohidratos.
No es un mtodo absoluto: el color debe estandarizarse contra protenas
conocidas (por ejemplo, BSA) o contra el mtodo de nitrgeno de Kjeldahl.
B. Mtodo de Lowry
Principio
El mtodo de Lowry combina la reaccin de biuret con la reduccin del reactivo
de fenol de Folin-Ciocalteau (cido fosfomolbdico-fosfotngstico) por los residuos de
tirosina y triptfano en las protenas (Figura 9-3). El color azulado desarrollado se lee a
750nm (alta sensibilidad para baja concentracin de protena) o 500nm (baja sensibilidad
para la alta concentracin de protenas). El procedimiento original ha sido modificado por
Miller y Hartree para mejorar la linealidad de la respuesta de color a la concentracin de
protenas.
Aplicaciones
Debido a su sencillez y sensibilidad, el mtodo de Lowry ha sido ampliamente
utilizado en la bioqumica de protenas.
Sin embargo, no se ha utilizado ampliamente para determinar protenas en sistemas
alimentarios sin extraer primero las protenas de la mezcla de alimentos.
Ventajas:
Muy sensible
(A) 50-100 veces ms sensible que el mtodo biuret
(B) 10-20 veces ms sensible que el mtodo de absorcin de UV de 280 nm (descrito ms
adelante)
(C) Sensibilidad similar a la Nesslerizacin; Sin embargo, ms conveniente que
Nesslerization
Menos afectado por la turbidez de la muestra.
Ms especfico que la mayora de los otros mtodos.
Relativamente simple; Se puede hacer en 1-1.5 h.
Desventajas:
Por las siguientes razones, el procedimiento de Lowry requiere una estandarizacin
cuidadosa para aplicaciones particulares:
El color vara con diferentes protenas en mayor medida que el mtodo biuret.
El color no es estrictamente proporcional a la concentracin de protenas.
La reaccin es interferida en grados variables por sacarosa, lpidos, tampones de
fosfato, monosacridos y hexoaminas.
Las altas concentraciones de azcares reductores, sulfato de amonio y compuestos
sulfhidrilos interfieren con la reaccin. (Nielsen, 1998)
8.5 Cul es el efecto de los indicadores fenolftalena y del tashiro , porque?
La adicin de fenolftalena en el proceso de digestin es para neutralizar el cido
sulfrico.
Mediante esta operacin el nitrgeno que est en forma de sulfato de amonio, se
ataca con un lcali fuerte Hidrxido de sodio para liberar el amonio y despus de la
condensacin lograda con la parte refrigerante, el hidrato de amonio se recibe en un vaso
precipitado.

El vaso precipitado contiene cido brico. Con el siguiente indicador tashiro (rojo metilo
y verde de bromo crisol), formndose ion borato de amonio en el vaso. (Chiroque Garcia
, 2012)
Bibliografa
Reyes Garca, M., Gmez-Snchez Prieto, I., Espinoza Barrientos, C., Bravo Rebatta, F., &
Ganoza Morn, L. (2009). TABLAS PERUANAS DE COMPOSICIN DE ALIMENTOS. Lima.

Chiroque Garcia . (2012). VOLUMETRA DE NEUTRALIZACIN. Anlisis Qumico Un Enfoque


Ambiental, 130. Obtenido de
http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Finales_Inve
stigacion/Julio_2011/IF_BARRETO_PIO_FIARN/CAP.VII.PDF

Nielsen, S. (1998). Food Analysis. London: Springer. doi:10.1007/978-1-4419-1478-1

Ruiz . (2011). DETERMINACIN DE PROTEINAS Mtodo Kjeldahl. Santiago. Obtenido de


http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/doc/ambiente%20pdf/Proteina.pdf

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