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CULTIVO MIXTO BACTERIANO EN LA DEGRADACIN DE

HIDROCARBUROS DEL AGUA CONTAMINADA DE UNA PLANTA DE


TRATAMIENTO.ESTUDIO DE FACTIBILIDAD Y ESTUDIO DE
TRATABILIDAD

1. DESCRIPCIN DEL REA DE ESTUDIO:

La Planta de Tratamiento de Aguas ubicada en Punta de Palmas, Municipio La


Caada Estado Zulia recibe el agua que ha sido inyectada a los pozos petroleros y
luego es enviada a travs de una lnea de 20 hacia el patio de tanques donde es
almacenada y recibe un pretratamiento qumico antes de ser enviada finalmente a la
planta de tratamiento en la cual es recibida al inicio por un separador API para llevar a
cabo la separacin mecnica del agua, luego de separadas las dos fases, el crudo se
bombea por tubera a PDVSA (recuperacin secundaria de crudo) y el agua restante
se lleva a travs de un sistema de tuberas a la fosa home, en donde se le aplica un
tratamiento qumico con clarificante para lograr crear una emulsin que es bombeada
hacia un sistema de flotacin, donde al inyectarse aire, la emulsin se rompe y las
aspas internas del sistema recogen las partculas flotantes reenviando este crudo
nuevamente y llevando el agua restante a las fosas limpia y semilimpia de la planta, de
all es enviada al sistema de filtracin para despus ser tratada qumicamente con
inhibidores de incrustacin, secustrate de oxgeno y biocida. Finalmente al llegar a la
torre desaereadora donde se libera el oxgeno atrapado por el secuestrante, pasa a las
estaciones de bombeo que envan esta agua tratada por dos tuberas hacia Lagomar
para los pozos de recuperacin secundaria de sta agua. En la Figura 10 se observan
las fases que comprenden la Planta de Tratamiento.

1.2. Caracterizacin de la planta: La caracterizacin de la planta se realiz a travs


de la determinacin de los parmetros microbiolgicos y fsico-qumicos (Tabla 1).
1.3. Aislamiento de cepas bacterianas:

Utilizando el agua tomada de la PTA especficamente de las piscinas o fosas (limpia y


semilimpia) ubicadas antes de los filtros; se adicionaron 10 ml de dicha agua a 90ml
de salina peptona; de all se tom una alcuota con asa de platino y se transfiri a
placas con agar nutritivo. Las placas se incubaron durante 24 a 48 hrs. Despus de
este tiempo, se observaron colonias aisladas y se realizaron transferencias sucesivas
de las mismas hasta que permaneci el fenotipo de las colonias. Estas cepas
bacterianas aisladas fueron refrigeradas a 4 C en tubos de agar nutritivo inclinado.

2.4. Micromorfologa:

de las cepas bacterianas La micromorfologa de cada cepa se determin utilizando la


tincin de GRAM en cultivos de 48 hrs (Kerr, 1981; Madigan et al., 2000).

Tincin de GRAM: es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la


visualizacin de bacterias. Se utiliza para poder referirse a la morfologa celular
bacteriana y para realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana,
considerndose bacteria GRAM positiva a las bacterias que se visualizan de color
violeta y bacteria GRAM negativa a las que se visualizan de color rosa.

Primeramente, se fij un frotis con la ayuda de un asa tomando un poco de muestra,


extendindola sobre una lmina portaobjetos. Luego se agreg una cantidad suficiente
con violeta cristal sobre la muestra, hasta cubrirla por completo por 1 minuto. Se
enjuag la lmina con agua corriente y se aplic mordiente yodo o lugol durante 1
minuto, transcurrido el tiempo se decolor con alcohol-acetona y se enjuag con agua
nuevamente. Luego de secado se aplic safranina y se dej actuar durante 1 minuto.
Por ltimo se enjuag lalmina con agua, hasta que sec de forma natural. De esta
manera, se observaron los frotis bajo el microscopio.

1.5. Macromorfologa de las cepas bacterianas:

La macromorfologa de las colonias se determin con base en la caracterizacin


sugerida por Seeley y Vandemark (1973) y por Kerr (1981), por observacin y
comparacin (Tabla 2).

Tabla 2. Macromorfologa sugerida por Kerr, Seeley y Vandemark


1.6. Pruebas Bioqumicas:

Con frecuencia para identificar una bacteria se requiere conocer ms detalladamente


su actividad bioqumica, ya que otras caractersticas no son suficientes distintivas o
diferenciales. Para esto es necesario cultivar la cepa aislada en medios que contienen
una sustancia nutritiva especfica y despus de la incubacin del cultivo examinar los
cambios qumicos ocurridos. Para este estudio, se aplic una serie de pruebas
bioqumicas, tales como crecimiento en agar triple azcar hierro (TSI), utilizacin del
citrato, utilizacin del triptofano o indol, prueba de la ureasa, prueba del rojo de metilo,
motilidad, glucosa, ornitina, nitrato, manitol, casena, gelatina, prueba de Voges-
Proskauer, y prueba de la catalasa (MacFaddin, 1980; Madigan et al., 2000).

Prueba de la Catalasa: su finalidad es comprobar la presencia de la enzima catalasa.


Se agregaron 5 ml de perxido de hidrgeno al 3% en un tubo de ensayo, se tom una
muestra de la cepa y se introdujo al tubo de ensayo, observndose la reaccin de
sta. La prueba es positiva al observar burbujas de oxgeno.

Prueba de Motilidad: permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la


reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina. Se inocularon las cepas en el
medio de cultivo y se incubaron por 24 horas a 37 C. Prueba TSI (Triple Sugar Iron
Triple Azcar Hierro): es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la
capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un
nico medio. Se inocularon los tubos de TSI y se incubaron a 35 C durante 24 hrs.
Posteriormente se midi el pH de los cultivos. A estos resultados se les agreg la
produccin de gas. Indol: esta prueba est basada en la formacin de un complejo rojo
cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo.. El
medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano. Se inocularon el caldo triptfano
con las cepas y se incubaron a 35C durante 18 a 24 horas. Finalizado el perodo, se
aadieron 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de
un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de
aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. Prueba del Rojo
de Metilo: es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que
se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido
mixta. Se inocul el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas de
las cepas y se incubaron a 35 C durante 48 hrs. Finalizado el tiempo de incubacin se
agregaron unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se
desarrolla de un color rojo estable. Prueba de Vogues Proskauer: en sta se determina
la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo y se
revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. Se inocul el caldo
RM/VP con un cultivo puro de las cepas y se incubaron a 35 C durante 24 horas.
Luego de finalizado el tiempo de incubacin se transfiri 1 ml del caldo RM/VP de cada
cepa a un tubo limpio respectivamente y se agregaron 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2
ml de KOH al 40%. Se agit cada tubo y se dej reposar durante 10 a 15 minutos. El
desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo,
producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP positiva.

Prueba de la Ureasa: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea


formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Se cultiv la cepa
en agar urea de Christensen para ser degradada por aquellos microorganismos
capaces de

producir la enzima ureasa. Esta degradacin produjo amonaco que hizo variar el color
del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa.
Prueba de la Ornitina: La descarboxilacin de aminocidos es llevada a cabo por
descarboxilasas y se forman aminas y CO2. El caldo descarboxilasa de Moeller es el
medio base ms comnmente usado para la determinacin de las descarboxilasas en
enterobacterias .Para esta prueba se inocul un cultivo puro de 24 horas en un tubo de
ensayo con base de Moeller con el aminocido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo
de la base (control sin aminocido) y se incub a 35 C durante 18 a 24 horas. Prueba
de Manitol: se aplica para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el
manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de
fenol que cambiar a color amarillo, y se pueden realizar cultivando el microorganismo
en un nico medio, el Manitol Movilidad, que se prepar en tubos con agar recto y se
sembr en picadura, incubndose a 37 C durante 24 horas. Prueba de nitrato: en sta
se determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Se
incorpor en el medio manitol movilidad, 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la
presencia de nitritos despus de su incubacin se aadieron los reactivos A y B de
Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Prueba de Casena: la leche
descremada constituye un buen medio de cultivo para muchas bacterias, sin otra
modificacin que aadir un indicador: prpura de bromocresol o tornasol. Los cambios
bioqumicos que puede sufrir son: a) Desarrollo de reaccin alcalina con precipitacin
de casena, como un verdadero requesn, eventualmente con reduccin del indicador
b) Formacin de cido y precipitacin de la casena, generalmente con reduccin del
indicador. Prueba de gelatina: Se usa para valorar la licuefaccin o licuacin de la
gelatina por accin de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas
Enterobacterias. La reaccin positiva hace que el medio permanezca lquido despus
de la incubacin an despus de dejarse en refrigeracin durante media hora. La
reaccin negativa permite nuevamente la solidificacin.

Luego de realizar las pruebas bioqumicas se llevo a cabo una prueba para
reagruparlas. Esta prueba consisti en sembrar con asa de platino en placas con 97%
Medio Mnimo Mineral, 2% Agar agar y 1% gasoil durante 24 hrs, cada una de las
cepas. Transcurrido el tiempo, se seleccionaron aquellas cepas que presentaron
mayor crecimiento, las cuales fueron empleadas para realizar el estudio de factibilidad.

1.7. Estudio de Factibilidad:

Esta fase tuvo como objetivo principal, evaluar la capacidad biodegradadora de las
cepas bacterianas mediante un ensayo de factibilidad, donde se utiliz medio mnimo
mineral y gasoil como nica fuente de carbono. El medio mnimo mineral propuesto
por Jobson, tiene como funcin suplir los requerimientos nutricionales de los
microorganismos inoculados excepto la fuente de carbono, la cual fue suministrada por
el gasoil, de tal manera que la capacidad de las cepas en degradar el hidrocarburo, fue
evaluada midiendo la cantidad de hidrocarburos presentes. Para realizar el estudio de
factibilidad las cepas bacterianas aisladas y activadas se transfirieron a un medio de
cultivo fresco. Los cultivos se amplificaron por transferencia a volmenes mayores.
Cada cepa bacteriana se inocul en un matraz de 250ml, con 97% de Medio Mnimo
Mineral compuesto por 1 g/l de NH4Cl, 2 g/l de KNO3, 0,0005 g/l de CaCl2.6H2O, 2 g/l
de Na2SO4, 1 g/l de MgSO4, K2HPO4 (0,5), FeSO4.7H2O (0,001) propuesto por
Jobson (1975), 2% v/v de gasoil y 1% v/v del inculo bacteriano (Figura 6) con su
respectivo testigo no inoculado.

Los matraces se colocaron en una incubadora New Brunswick, modelo 625, a 37 C y


a 120rpm por 5 semanas (ver figura 11); en este perodo, se realizaron,
semanalmente, los anlisis microbiolgicos y fisicoqumicos determinando los
hetertrofos mesfilos mediante la tcnica de placa vertida, la cantidad de
hidrocarburos totales presentes (HCT) por el mtodo 5520-F, nitrgeno y fsforo
(APHA, 2005), temperatura, pH y conductividad elctrica. Estos parmetros
permitieron la seleccin de las cepas ms eficientes en la degradacin de
hidrocarburos del gasoil, y se tomaron porciones equivalentes de cada cepa
bacteriana seleccionada para la integracin del cultivo mixto.

Figura 7. Incubadora con Unidades Experimentales

Hetertrofos Mesfilos: Los hetertrofos mesfilos se realizaron a travs de la tcnica


de contaje de placa vertida segn la metodologa establecida en APHA, 2000 mtodo
9215-C. Para stos se tomaron 10 ml del agua tomada de la PTA y se transfirieron a
botellas de dilucin con 90 ml de solucin salina peptonada (SSP) previamente
esterilizada. Cada botella o tubo se agit cuidadosamente y se tom 1 ml de esta
solucin y se agreg a un tubo de ensayo que contena 9 ml de SSP, luego se agit y
sucesivamente se hicieron diluciones seriadas hasta 10-8. Se tom una alcuota de
cada dilucin y se agreg a una

placa petri de vidrio previamente esterilizada. Seguidamente se verti


aproximadamente 15 ml de agar de contaje fundido (previamente enfriado a 45 C en
bao de Mara) fundidos en un tubo de ensayo sobre cada placa con alcuota,
haciendo movimientos en forma de 8 para distribuir la mezcla uniformemente hasta
alcanzar la gelificacin. Las placas se colocaron en incubacin durante 48 hrs a 37 C.
Las clulas visibles fueron registradas como unidades formadoras de colonias.
Determinacin de Nitrgeno Total de Kjeldahl. Nitrgeno Total (Mtodo 4500-NH2-B.
APHA, 2005): Se tomaron 50 ml de muestra y se agregaron en un recipiente de vidrio
lavado con agua destilada. Posteriormente, se tomaron 3 tubos digestores: Uno para
el patrn, otro para el blanco, y el ltimo para la muestra. Al tubo del patrn se le
agregaron 50 ml de patrn de nitrgeno con una concentracin de 10 ppm;
paralelamente se agregaron 50 ml de agua destilada al tubo del blanco; y 50 ml de
muestra al ltimo tubo. Seguidamente, se agregaron a los 3 tubos, 6 ml de solucin de
digestin (H2SO4+H2O2). Luego, se coloc cada tubo en el equipo digestor
(previamente encendido), hasta que el volumen disminuya a 10 ml (40 min a 234o C).
Finalizada la digestin, se procedi a la destilacin del blanco, la muestra y por ltimo
el patrn: inicialmente, se agregaron 25 ml de una solucin indicadora mixta con cido
brico en fiolas de 125 ml (se prepar una para cada tubo); en el extremo derecho del
destilador, se ubicaron las fiolas con 25 ml de solucin mixta, y en el extremo izquierdo
el tubo con la muestra (a la muestra se le agregaron previamente 13 ml de Hidrxido
de Sodio Tosulfato de Sodio) y de inmediato se conect al destilador para evitar
prdidas de nitrgeno; la destilacin finaliz cuando la solucin indicadora cambi de
color prpura a color verde. Cuando el destilado estuvo entre 75 ml y 100 ml se retir.
Culminada la destilacin se tom la solucin color verdosa y se procedi a titularla con
cido Sulfrico (H2SO4) 0,02 N, hasta que dicha solucin cambi a color prpura, en
este punto se tom el volumen consumido en la titulacin. Para calcular la cantidad de
nitrgeno total se aplic la siguiente frmula:

Determinacin de Fosforo Total. Fsforo Total (Mtodo 4500-P-C: cido


Vanadomolibdofosfrico) (APHA, 2005): Se tomaron 50 ml de muestra y se agregaron
en un

tubo digestor (paralelamente se tomaron 50 ml de agua destilada para el blanco y 50


ml del patrn de fsforo. Se agregaron 2 ml de H2SO4 al 30% y 0,5 gr de persulfato a
la muestra, patrn y al blanco, bajo la campana de extraccin. Se procedi a la
digestin de la muestra, patrn y blanco a 234o C durante 40 min aproximadamente o
hasta que su volumen estuviera alrededor de 10 ml. Despus de la digestin se dej
enfriar y se lavaron las paredes del tubo con agua destilada, luego se agregaron de 2
a 3 gotas de fenolftalena en cada tubo. Se neutraliz con NaOH 6N hasta que la
solucin se torn color fucsia. Posteriormente se agreg gota a gota H2SO4 al 30%
v/v hasta desaparecer el color fucsia. Se filtr por gravedad, y se recogi el filtrado en
balones aforados de 50 ml (llevando a volumen con agua destilada, agitando
vigorosamente). Se tomaron 25 ml de la muestra, patrn y blanco (muestras filtradas);
para luego adicionar 1 ml de reactivo Vanadato- Molibdato; se esperaron 15 min para
permitir el desarrollo de color y finalmente se ley en el Hach DR2800 a 430 nm,
obtenindose los resultados en mg/l mediante una curva de calibracin interna del
equipo. Conductividad Elctrica: La conductividad elctrica se determin utilizando el
mtodo electromtrico, segn la metodologa establecida por APHA, 2005, bajo el
cdigo 2510-B. Los valores fueron reportados en S/cm tomndolos directamente de
las muestras sumergiendo el electrodo del conductmetro y reportando la lectura al
estabilizarse el equipo. Determinacin de pH: La determinacin del pH se realiz
siguiendo la metodologa establecida por APHA 2005, bajo el cdigo 4500. Se
introdujo el electrodo de un pH-meter y se espero que la lectura se estabilizara
procediendo a la lectura y anotacin de los resultados. Determinacin de
Hidrocarburos Totales del Petrleo (Mtodo 5520-F: Gravimtrico) (APHA, 2005): Se
tomaron las muestras en frascos de vidrios de capacidad 500 ml y luego fueron
marcados a nivel del menisco del lquido, para determinar posteriormente el volumen
de muestra empleado.

Se agreg todo el contenido del frasco de vidrio en un embudo de separacin y luego


se acidific la muestra agregando 1 ml de cido Clorhdrico (HCl) al 37% de pureza.
Se lavaron las paredes del frasco de vidrio donde se hallaba contenida la muestra,
agregando 15 ml del solvente Tetracloruro de Carbono (CCl4). Se transfiri el
contenido del frasco de vidrio al embudo de separacin y se agito vigorosamente por
espacio de 2 minutos, al cabo de este tiempo se dejo reposar para permitir la
separacin de las fases acuosa y orgnica respectivamente. Se filtr por gravedad la
capa del solvente en un vaso precipitado de 150 ml (previamente pesado) haciendo
pasar el lquido a travs de un embudo de filtracin con

papel de filtro Whatman conteniendo 10 g de Sulfato de Sodio Na2SO4, con la


finalidad de absorber el agua y dejando pasar nicamente el solvente hacia el vaso
precipitado. Una vez finalizado el proceso, el vaso precipitado con la muestra filtrada
en ausencia de agua y turbidez (en caso contrario debe repetirse la filtracin) se
coloc dentro de la estufa a 35 C con el fin de evaporar el solvente por completo.
Finalmente se determin la cantidad de hidrocarburos por diferencia de peso,
empleando la siguiente ecuacin (APHA, 2005):

1.8. Ensayo de Tratabilidad;

El estudio de tratabilidad se hizo aplicando ocho tratamientos diferentes en unidades


experimentales a las cuales se aplic el cultivo mixto integrado por las cepas
bacterianas aisladas y seleccionadas previamente.

1.8.1. Preparacin del cultivo mixto:

Una vez escogidas las cepas ms eficientes en degradar hidrocarburos segn el


ensayo de factibilidad se prepar el cultivo mixto de la siguiente manera: cada cepa
fue activada en tubos de ensayo con infusin cerebro corazn (ICC) y transferidas a
fiolas de 250 ml para luego ser amplificadas en fiolas de 2 L con ICC y se incubaron a
37 C a 120 rpm por 24 hrs. La infusin cerebro corazn es un medio lquido adecuado
para el enriquecimiento de bacterias aerobias y anaerobias aparte de ser muy rico en
nutrientes y proporcionar un adecuado desarrollo microbiano. El cultivo mixto se
integr mezclando fracciones equivalentes de las cepas bacterianas seleccionadas,
hasta alcanzar un volumen de 2 L para cada tratamiento.
1.8.2. Preparacin de Unidades Experimentales:

Se prepararon 8 unidades experimentales con su respectivo duplicado en tanques


plsticos de 25 L. Todas las unidades contenan agua contaminada con hidrocarburo
proveniente de la planta de tratamiento, y cada tratamiento contena uno o varios de
los siguientes componentes (Figura 8).

A cuatro de estas unidades y a sus duplicados se les adicion el cultivo mixto,


combinando algunas con fosfato de amonio como nutriente (F) y aireacin (O), para un
volumen total de 20 L (Tabla 3).

En cuatro de los tratamientos, se aplic aireacin, sta fue inducida por medio de
bombas a las cuales se les coloc una manguera fina que llegaba hasta el fondo del
tanque con la finalidad de asegurar que la aireacin ocurriera de manera homognea,
a travs de todo el volumen, durante todo el tiempo estipulado para el ensayo. Cada
quince das, se registr hetertrofos mesfilos mediante la tcnica de placa vertida, la
cantidad de hidrocarburos totales presentes (HCT) por el mtodo 5520-F, nitrgeno y
fsforo (APHA, 2005), temperatura, pH y conductividad elctrica segn la metodologa
establecida en APHA 2005 y descrita anteriormente en este captulo.

1.9. Validacin Estadstica El diseo estadstico empleado:

diseo estadstico empleado, fue totalmente al azar, no hubo restricciones de la


aleatorizacin al asignar los tratamientos a las unidades experimentales, las lecturas
de las variables fueron tomadas en intervalos de 15 das, en cada tratamiento, antes,
durante y al finalizar la investigacin. Se determin que todas las medidas estn
correlacionadas; en consecuencia, estos valores tendieron a ser parecidos dentro
cada ensayo. Este tipo de situaciones se puede analizar, con procedimientos
univariados y diseos clsicos, mediante el anlisis multivariado o modelos mixtos. El
medio evaluado fue el agua, mientras que los niveles evaluados fueron: Tratamientos
sin la adicin de cultivos bacterianos o control Tratamientos con la adicin de cultivos
bacterianos Tratamientos con la adicin de nutrientes Tratamientos con la adicin de
aireacin

Para determinar el mtodo a aplicar se verific la esfericidad de la matriz varianza


covarianza; esto significa que los datos repetidos son independientes. Para saberlo, se
utiliz primeramente el Test de Esfericidad de Mauchly (Montzomery, 1991). En el
anlisis de datos provenientes del diseo de medidas repetidas, generalmente se
utiliza el anlisis

de varianza ANOVA mixto univariado, sin embargo su adecuacin est en funcin de


la satisfaccin de los supuestos asociados al anlisis, en especial del supuesto de
esfericidad (Blanca, 2004). En esta investigacin, todas las matrices fueron no
esfricas, es decir, los resultados de las variables evaluadas en el tiempo, son
dependiente; razn por la cual se considero aplicar el anlisis multivariado MANOVA,
que es simplemente un ANOVA con variables dependientes (Aaron y col., 2006). El
anlisis de ANOVA univariado es el ms usado en el anlisis de los diseos de
medidas repetidas, asumiendo que el factor intrasujeto es fijo y los sujetos aleatorios.
ste requiere satisfacer los supuestos de normalidad, independencia y esfericidad
(Blanca, 2004). El anlisis multivariado es el conjunto de mtodos estadsticos cuya
finalidad es analizar simultneamente un conjunto de datos multivariantes en el
sentido de que hay varias variables para cada objeto estudiado. Su razn radica en un
mejor entendimiento del fenmeno objeto de estudio obtenindose la informacin que
los mtodos estadsticos individuales univariantes y bivariantes son incapaces de
conseguir (Cheng A, 2006). Se realiz la prueba de comparacin mltiple de Duncan,
el cual ordena las medias de grupo de menor a mayor, y utiliza la distancia entre dos
medias, que es el nmero de elementos que hay entre ambas en la ordenacin, para
calcular el valor del rango de cada comparacin. sta prueba se basa en el supuesto
de que, cuanto mayor sea el nmero de medias comparadas, ms probable ser que
se den comparaciones significativamente diferentes. En Duncan, la probabilidad de
encontrar una diferencia significativa cuando los dos grupos son iguales, es menor que
el nivel de significacin especificado.

2. DISCUSIN DE RESULTADOS:

En esta investigacin, se estudiaron 4 aspectos importantes: la caracterizacin de las


propiedades fsico qumicas y microbiolgicas del agua a tratar; el aislamiento de las
cepas bacterianas contenidas en sta; la determinacin del potencial de los
microorganismos para descomponer los hidrocarburos; la comparacin entre los
diferentes tratamientos aplicados para comprobar su eficiencia en la degradacin de
hidrocarburos. En este captulo se muestran los resultados experimentales y el anlisis
del estudio en 5 fases: caracterizacin de la planta, aislamiento de cepas bacterianas,
estudio de factibilidad, estudio de tratabilidad y el anlisis estadstico para la validacin
de los resultados. Los anlisis se llevaron a cabo satisfactoriamente y los resultados
obtenidos permitieron inferir importante conclusiones con respecto a los anlisis
realizados y tcnicas aplicadas.

2.1. Caracterizacin de la planta:

La caracterizacin de la planta se llev a cabo analizando las muestras de agua de las


etapas de la PTA. Para esta investigacin se tomaron como puntos de muestreo las
fosas limpia y semilimpia de la PTA (Figura 9).

Figura 9. Esquema de las Fosas de Agua de la Planta de Tratamiento


Aunque el efluente a nivel de las piscinas no es descargado al Lago de Maracaibo, en
este punto los parmetros exigidos por la ley deben aproximarse a lo exigido por el
Decreto 883 para la clasificacin y el control de calidad de los cuerpos de agua y
vertidos o efluentes lquidos.
2.2. Aislamiento de cepas bacterianas:

Se realiz el aislamiento de las cepas bacterianas a las cuales se les determin la


morfologa de sus clulas observndolas al microscopio ptico (Figura 10).

Una vez determinada la micromorfologa, las cepas bacterianas se desarrollaron en


placas, para definir la morfologa de las colonias (Figura 11).

La determinacin de la micromorfologa y macromorfologa permitieron agrupar las


cepas aisladas en sesenta y ocho cepas bacterianas. Con el objeto de agruparlas se
realizaron pruebas bioqumicas quedando reducidas a veintisiete cepas bacterianas,
las cuales fueron reagrupadas nuevamente con base en su capacidad para crecer en
presencia de un derivado de hidrocarburo. Como resultado de esta ltima prueba se
pudieron seleccionar

ocho cepas bacterianas para el estudio de factibilidad, las cuales fueron identificadas
como: MI-6, MI-22, MI-39, MI-44, MI-46, MI-55, MI-60 y MI-63. La Tabla 5 muestra la
micromorfologa y macromorfologa de las cepas bacterianas seleccionadas.
En la tabla 5 se puede observar que las cepas seleccionadas son bacilos siendo la
mayora Gram negativo. El 90% de las cepas presentaron opacidad y un borde
lobulado, los colores predominantes fueron amarillo y beige y el 70% mostr una forma
irregular. En la Tabla 6 se observan los resultados de las pruebas bioqumicas de las
cepas seleccionadas.

N: Nombre de Cepa; O: Prueba de Ornitina; C: Prueba del Citrato; M: Prueba del Manitol; G: Prueba de la Glucosa; U:
Prueba de la Urea; V.P.K: Prueba Voges Proskauer; R.M: Prueba de Rojo de Metilo; I: Prueba del Indol; B 45: Prueba
de BHI@ 45; B 65: Prueba de BHI@ 65; MO: Prueba de Motilidad; GE: Prueba de Gelatina; CAT: Prueba de la
Catalasa; CAS: Prueba de la Casena; +/g: positivo con gas

En los resultados de las pruebas bioqumicas se puede apreciar que el 90% de las
cepas son tolerantes a la glucosa y capaces de fermentarla y el 80% de las cepas
utilizan el citrato como fuente de carbono provocando la alcalinizacin del medio. Las
cepas MI 55 y MI 60 en las pruebas de Manitol y Glucosa tuvieron un resultado
positivo con liberacin de gas. Las cepas bacterianas aisladas y seleccionadas MI-6,
MI-22, MI-39, MI-44, MI-46, MI-55, MI-60 y MI-63 fueron utilizadas para realizar el
estudio de factibilidad.

2.3. Estudio de Factibilidad:

Este estudio permiti verificar la capacidad de las cepas bacterianas en degradar


hidrocarburo, adems demostr la versatilidad metablica de las cepas evaluadas en
presencia de hidrocarburo liviano. Ortiz, realiz estudios de factibilidad utilizando como
fuente de carbono el gasoil (Ortiz, 2003). Frankenberger realiz estudio de factibilidad
con microorganismos aislados en sitios del norte de Arizona contaminados con
hidrocarburos, seleccionando microorganismos autctonos en base a su capacidad de
degradacin (Frankenberger, 1998).

3.3.1. Capacidad biodegradadora de las cepas bacterianas:

La capacidad degradadora de las cepas bacterianas fue determinada mediante el


anlisis de los hidrocarburos totales (mg/L) antes, durante y al final del tratamiento; la
densidad poblacional, a travs del contaje de hetertrofos mesfilos (UFC/ml)
realizados semanalmente durante 5 semanas que dur el estudio de factibilidad.
Todas las cepas incrementaron su densidad poblacional alcanzado valores superiores
a los 250 UFC/ml.

Crecimiento Bacteriano:

La Tabla 7 muestra los valores promedios de crecimiento bacteriano obtenidos por las
cepas evaluadas en el estudio de factibilidad. El crecimiento oscil entre 3,5x107
UFC/ml y 8,45x1010 UFC/ml ; las cepas que presentaron el mayor crecimiento fueron
MI-46, MI-55, MI-44 y MI-39, con densidades poblacionales mayores a 3x1010 UFC/ml
en diferentes tiempos; mientras que las cepas MI-6 y MI-22 presentaron un
crecimiento inferior a 5x108 UFC/ml. La cepa MI-39 alcanz valores de 1x1013
UFC/ml a los 21 das del ensayo.
Al transcurrir el tiempo las cepas disminuyeron sus valores de densidad poblacional;
este comportamiento est asociado con la disminucin de nutrientes como nitrgeno y
fsforo, la produccin de sustancias txicas y el agotamiento progresivo de la fuente
de carbono. Las cepas bacterianas presentaron curvas de crecimiento tpicas. La
curva de crecimiento cay en tiempos diferentes para cada cepa, situacin que se
gener debido a las diferencias que tienen los microorganismos en su capacidad de
adaptacin a sustratos carbonados y en la eficiencia para degradar los mismos; Myrvik
y col. explican que a medida que el ambiente se torna ms desfavorable, la velocidad
de multiplicacin disminuye gradualmente hasta llegar a la fase estacionaria durante la
cual el ndice de multiplicacin es igual al de mortalidad y, por ltimo, se llega a la fase
de senectud, durante la cual el ndice de muerte excede el de multiplicacin (Myrvik y
col., 1977). Dentro de los factores que influyen en el crecimiento microbiano y la
biodegradacin del sustrato, se encuentran los factores microbiolgicos propios de los
microorganismos; las rutas metablicas de stos para la degradacin del compuesto
de inters, su aclimatacin al medio y los factores ecolgicos (Eweis, 1999).

Durante el ensayo todas las cepas tuvieron diferentes comportamientos, presentando


variaciones en las fases logartmica y estacionaria, debido a que estas fases
dependen de la capacidad que tienen los microorganismos de procesar el sustrato,
adems las velocidades mximas de multiplicacin de las diferentes bacterias varan
considerablemente (Myrvik y col., 1977). En todos los casos despus de 5 semanas,
los microorganismos continuaban activos con capacidad para consumir el sustrato.

Remocin de Hidrocarburos Totales:

La determinacin de la remocin de hidrocarburos totales permiti establecer la


eficiencia de cada cepa bacteriana en degradar el hidrocarburo, utilizado como nica
fuente de carbono. En la Tabla 8 pueden observarse los valores tomados
semanalmente de hidrocarburos totales promedios para cada cepa bacteriana en el
ensayo de factibilidad.
Los microorganismos emplean el sustrato como nica fuente de carbono para cumplir
con sus actividades catablicas, el cual proporciona los materiales suficientes para la
sntesis del material celular a travs de su degradacin (Ordoez, 1996). Estos
resultados demuestran que las cepas aisladas poseen capacidades enzimticas para
degradar los compuestos orgnicos, caractersticas que las hacen ideales para su
utilizacin en tratamientos de biorremediacin de aguas contaminadas con petrleo;
concordando a su vez con los valores obtenidos en trabajos similares, realizados por
Araujo (2004a), Araujo (2004b) y Araujo 2006 donde se lograron aislar y caracterizar
cepas bacterianas de la ribera del Lago de Maracaibo contaminadas con
hidrocarburos, probando su capacidad para degradarlos, mediante un ensayo de
factibilidad, usando gasoil como nica fuente de carbono. Todas las cepas removieron
hidrocarburos siendo las ms eficientes las cepas MI 22, MI 39, MI 44 y MI 55 con los
porcentajes de remocin ms altos al final del ensayo. En la Tabla 9 se muestran los
porcentajes de remocin de hidrocarburos en el ensayo de factibilidad.
A travs del ensayo de factibilidad se determin que las cepas MI 22, MI 39, MI 44 y
MI

55 fueron las ms eficientes en la degradacin de hidrocarburos con porcentajes


superiores al 70% de remocin. Estas cepas fueron seleccionadas para integrar el
cultivo mixto en el estudio de tratabilidad.

2.4. Estudio de Tratabilidad:

Por medio del estudio de tratabilidad, se simul durante 75 das las condiciones del
agua contaminada con hidrocarburos, empleando tecnologa de biorremediacin
combinando la utilizacin de cultivos mixtos de cepas bacterianas con tcnicas de
fertilizacin (F) en tanques plsticos de 25 L (Figura 20). La adicin de nutrientes en
regmenes costeros estimul eficazmente la biodegradacin microbiana de
hidrocarburos, lo que permite reducir el impacto de la contaminacin petrolfera marina
(Atlas 1996 citado por Atlas y Richard Bartha 2002). Ortiz realiz estudio de
tratabilidad a escala piloto y de campo donde demostr la eficiencia de la
bioestimulacin en la biorremediacin de suelos contaminados con ripios base aceite
(Ortiz 2003). Frankenberger utiliz microorganismos seleccionados previamente para
estudios posteriores de biotratabilidad piloto y su aplicacin en el trabajo de campo
(Frankenberger, 1998). El agua utilizada en el ensayo de tratabilidad, fue tomada de
las salidas de las piscinas denominadas limpia y semilimpia. Durante esta prueba
piloto se evaluaron parmetros microbiolgicos y fisicoqumicos, para determinar la
eficiencia del tratamiento y la correlacin entre los parmetros evaluados en
condiciones similares a las reales.

Hetertrofos Mesfilos:

Los valores promedios de crecimiento alcanzados por los hetertrofos mesfilos


durante los 75 das de duracin del estudio se presentan en la tabla 10. Se puede
observar que al inicio del estudio la cantidad de los microorganismos vari en los
distintos tratamientos en funcin de la composicin de los mismos. En trminos
generales los cultivos mixtos bacterianos tuvieron un mayor crecimiento poblacional
respecto a los tratamientos que no posean cultivo mixto. El crecimiento de la tasa
microbiana y la tasa de transformacin del contaminante o hidrocarburo, estuvo
influenciada por factores fsicos como el pH, la humedad y aireacin. En la Figura 16
se muestran las curvas de crecimiento de hetertrofos mesfilos en los 75 das de
tratamiento.

Tabla 10. Valores promedios de hetertrofos mesfilos`


En el tiempo cero, la densidad poblacional de los hetertrofos mesfilos, en el

tratamiento OCM, fue de 200x108 UFC/ml; y por encima de 1,9x1010 UFC/ml en los
tratamientos FCM y OCM. Todos los tratamientos presentaron un mayor crecimiento
que el control, esto era de esperarse ya que el control no se inocul con cultivo mixto;
sin embargo el control tuvo un crecimiento de 9,96x1010 UFC/ml a los 15 das y
7,72x1011 UFC/ml a los 45 das, esto se debe a que el agua tratada es un medio rico
en microorganismos. La tasa de biodegradacin del petrleo en entornos marinos
costeros (medio acuoso) est gravemente limitada por las concentraciones disponibles
de nitrgeno y fsforo. En estos casos aadir nutrientes sirve para estimular la
actividad biodegradadora de las poblaciones microbianas autctonas (Atlas 1996,
Prince 1993, citado por Atlas y Bartha 2002). A los 75 das, en todos los tratamientos,
se report la presencia de microorganismos, debido a que el sustrato no se agot en
su totalidad. Cuando las concentraciones del contaminante bajan, provocan
reducciones en la poblacin microbiana, mientras que cuando los contaminantes son
degradados por cometabolismo, la eliminacin temprana de los cosustratos, necesaria
para la degradacin de los contaminantes, pueden detener los procesos de
biorremediacin (Hamme y col., 2003). Araujo y col, utilizaron bacterias endgenas en
la biorremediacin de agua contaminada con aceite lubricante. Los cultivos que
presentaron valores ms altos de crecimiento durante el estudio, fueron aquellos a los
cuales se les aplic tcnicas de fertilizacin y aireacin, estimulando su crecimiento
logrndose ttulos bacterianos de 109 UFC/ml a los 30 das de tratamiento (Araujo y
col., 2004a).

Hidrocarburos Totales:

El porcentaje de remocin de hidrocarburos fue diferente para cada tratamiento, esto


era de esperarse ya que las interacciones de los microorganismos con el crudo
dependieron de las especies de microorganismos presentes y de la composicin
qumica del hidrocarburo contenido en el agua. La degradacin de los sustratos
hidrocarbonados por comunidades microbianas depende de la comunidad y de su
respuesta adaptativa a la presencia de hidrocarburos. Las comunidades que han sido
expuestas inicialmente a los hidrocarburos, tienen una tasa de degradacin ms alta
que aquellas que proceden de ambientes no contaminados (Leahy y Colwell 1990).
Diferentes interacciones podran influir en la eficiencia de los procesos en los cuales la
mezcla de especies microbiolgicas es utilizada para el tratamiento del crudo, que
podran sugerir incluso la combinacin de tcnicas qumicas y biolgicas (Hao, R y col
2004). En la figura 17 se muestran las curvas de comportamiento de

HDT en los 75 das de tratamiento. En la Tabla 11 se observan los valores de


hidrocarburos totales a lo largo del ensayo de tratabilidad.
Los tratamientos FCM, CM, OCM y OFCM presentaron porcentajes de remocin de
hidrocarburos sobre el 90%, esto demuestra que aquellos tratamientos con cultivo
mixto son ms eficientes en la degradacin de hidrocarburos que el control y el resto
de los tratamientos. En la tabla 12 se muestran los porcentajes de remocin de
hidrocarburos en el estudio de tratabilidad.

Tabla 12. Porcentajes de Remocin de Hidrocarburos en estudio de tratabilidad.

En la Figura 18 se observan detalladamente los porcentajes de remocin de


hidrocarburos en este estudio de tratabilidad
Nitrgeno Total Kjeldahl:

El nitrgeno proporciona el elemento necesario para la produccin de aminocidos y


enzimas. Wren, Lyle y colaboradores demostraron que la biorremediacin de aceite
puede ser fuertemente afectada por la fuente de nitrgeno en forma de amonaco y
nitrato, descubriendo que el proceso de biodegradacin se acelera cuando el nitrgeno
era suprimido en forma de amonaco (Wrenn, B. y col, 1993). En la tabla 13 se
muestra las concentraciones de nitrgeno durante los 75 das de tratamiento. Todos
los tratamientos presentaron mayor consumo de nitrgeno que el control, excepto el
tratamiento O que slo posee aireacin.
Al comparar el comportamiento del nitrgeno con el crecimiento bacteriano, se puede
observar que las cepas bacterianas alcanzaron su mximo crecimiento en los
tratamientos donde el suplemento de nitrgeno fue menor, es de considerar que parte
del nitrgeno presente estaba disponible en forma de fosfato diamnico, el cual es de
ms fcil utilizacin para los microorganismos (Wrenn y col., 1994). Al comparar el
comportamiento del nitrgeno con los hidrocarburos totales se observ que a mayor
consumo de nitrgeno mayor fue la cantidad de hidrocarburos degradados. El
metabolismo microbiano est orientado la reproduccin de los organismos y stos
requieren que los constituyentes qumicos se encuentren disponibles para su
asimilacin o sntesis (Vargas y col, 2004). Segn Araujo, es posible establecer una
relacin entre la adicin de fertilizante y oxgeno al medio y la remocin de
hidrocarburos. La remocin del contaminante fue mayor en los tratamientos con
fertilizante y aireacin que en los tratamientos sin ellos; de la misma manera, el
crecimiento bacteriano fue incrementado con la aplicacin de ese tratamiento (Araujo y
col, 2004a). Los tratamientos OF, O y OFCM, presentaron los mayores porcentajes de
remocin de nitrgeno por encima del 80% (Tabla 14) . En la Figura 20 se observan
los porcentajes de remocin de este nutriente.

Tabla 14. Porcentaje de Remocin de Nitrgeno en Estudio de Tratabilidad

Fsforo Total:

El fsforo es un nutriente importante para el crecimiento de los microorganismos al


proporcionar el elemento necesario para la produccin de aminocidos y enzimas; de
esta forma interviene en la formacin de compuestos energticos dentro de la clula
que se utilizan en los procesos de reproduccin y sntesis (Ercoly y col., 2001). En
todos los tratamientos hubo una disminucin de la concentracin de fsforo, siendo el
tratamiento FCM el que present mayor remocin de fsforo con un porcentaje de
remocin de 63,17 % (Tabla 16). Al comparar la utilizacin del fsforo con el
crecimiento bacteriano y degradacin de hidrocarburo se observ un comportamiento
bastante similar para algunos tratamientos (OCM y FCM), es decir, donde hubo mayor
crecimiento bacteriano es donde se observ la mayor degradacin de hidrocarburos y
la mayor utilizacin de fsforo. En los tratamientos OCM y FCM donde la poblacin
microbiana es mayor se utiliz mayor cantidad de este nutriente. Los resultados
obtenidos concuerdan con lo reportado por Venosa y col quienes reportaron que la
mayor parte de la remocin de fsforo en forma de fosfatos procedentes de
fertilizantes en granos disueltos en medios acuticos contaminados con hidrocarburos
tena lugar en las primeras semanas del estudio y disminuan de manera secuencial en
menor grado hasta el final del estudio (Venosa y col, 1990). Margesin, 1997, demostr
que la fertilizacin en una relacin C:N:P 100:10:1 increment significativamente la
degradacin del aceite diesel por parte de los microorganismos autctonos del medio
contaminado y esta actividad fue mayor que cuando se utiliz la inoculacin de los
microorganismos. En la tabla 15 se observan los valores de fsforo total a lo largo del
estudio de tratabilidad.

Tabla 15. Valores de Fsforo Total en Estudio de Tratabilidad (mg/l)


Figura 21. Curvas de Fsforo Total en Estudio de Tratabilidad
Conductividad Elctrica:

En los tratamientos de biorremediacin la conductividad elctrica es una medida de


lacondicin electroltica de los metales y los elementos inorgnicos en el medio
analizado. Loselementos en forma electroltica pueden atravesar la membrana de la
clula afectando sucrecimiento, si se encuentran en grandes cantidades. La
conductividad es un indicativo de lasalinidad del medio. La conductividad fue medida
en todos los tratamientos. La Figura 23 muestra las curvas de conductividad elctrica a
lo largo del ensayo de tratabilidad

Figura 23. Curvas de Conductividad elctrica en Tratabilidad


pH:

El pH es importante para el desarrollo de los microorganismos siendo los adecuados


los comprendidos entre seis y ocho (Ercoli y col, 2001). Condiciones altamente cidas
o alcalinas, generalmente inhiben la actividad microbiolgica (Eweis y col., 1999).
Durante el ensayo el mximo valor registrado fue 9,4 al final del mismo, manteniendo
las condiciones para el mantenimiento de la viabilidad de los cultivos. Inicialmente
tienen un valor cercano a siete; sin embargo se observ un incremento entre 8,3 y 9
como resultado del fertilizante agregado.

Los niveles de pH neutros y ligeramente alcalinos favorecen el crecimiento biolgico.


Wrenn y col realizaron estudios para establecer el efecto de las fuentes de nitrgeno
sobre cambios de pH en la biodegradacin de hidrocarburos y encontraron que los pH
finales de los cultivos estudiados que contenan amonio fueron sustancialmente ms
bajos que los fertilizados con otra fuente de nitrgeno (Wrenn y col, 1994).

De acuerdo a lo antes enunciado se puede afirmar que el incremento se debi a la


adicin de fertilizante como fuente de nitrgeno en forma de amonio. Las variaciones
de pH fueron bastante similares en todos los recipientes, ya que algunas bacterias son
productoras de cido, como parte de su proceso metablico. Cuando el pH es muy alto
puede inhibirse el crecimiento de los microorganismos y por ende la velocidad de
biodegradacin de los hidrocarburos; sin embargo en este estudio el crecimiento de
los microorganismos y la degradacin de hidrocarburo se mantuvieron durante el
ensayo. En la figura 24 se observan las curvas de comportamiento del pH a travs del
ensayo.
3. ANALISIS Y DISCUSIONES DEL PROCESO DE BIORREMEDIACION DE
AGUA CONTAMINADA CON DERRAME DE PETROLEO

Tipo de sistema: es un sistema abierto porque hay interaccin e


intercambio continuo de materia y energa. En presencia de organismos
vivos.
Flujo de procesos:

Ventajas:
El anlisis de resultados mostr que todas las cepas
bacterianas fueron capaces de degradar el hidrocarburo
liviano. Las cepas bacterianas MI-46, MI-55, MI-44 y MI-
39, lograron la mayor remocin de hidrocarburos as como
tambin las mayores tasas de crecimiento bacteriano.
En los ensayos realizados el control present la menor
remocin de hidrocarburos, lo que indica que la adicin del
cultivo mixto, fertilizante y aireacin determinaron la
remocin de hidrocarburos.
La eficiencia en la remocin de hidrocarburos utilizando la
tcnica de biorremediacin fue posible a los 75 das de
tratamiento lo que permite inferir que la biorremediacin es
una alternativa de eleccin para el saneamiento de aguas
contaminadas con hidrocarburos. La aplicacin del anlisis
estadstico de comparacin de medias es el ms indicado
para comprobar si existe o no una gran diferencia entre los
resultados de diversos tratamientos aplicados.
Las cepas bacterianas autctonas de la planta de
tratamiento de Punta de Palma degradaron eficientemente
los hidrocarburos del efluente de las piscinas combinando
un consorcio bacteriano con fertilizantes y aireacin. Las
caractersticas fisicoqumicas y microbiolgicas del
efluente de las piscinas de la PTAPP facilitaron el
desarrollo de las comunidades bacterianas. El efluente de
la PTAPP posee una densidad microbiana de 3x109 que
facilito el aislamiento de veintisiete cepas bacterianas. El
estudio de factibilidad es importante ya que permite
seleccionar el consorcio bacteriano ms eficiente para
degradar hidrocarburos en aguas contaminadas.
El estudio de tratabilidad permiti demostrar que la
utilizacin de cepas bacterianas estimuladas con aireacin
y nutrientes son muy eficientes para la degradacin de
hidrocarburos logrando una remocin del 90%.
Desventajas:

Adems de lo contajes bacterianos y determinacin de


hidrocarburo, otra forma para confirmar la accin del proceso
biodegradativo es la determinacin de la produccin de CO2
(respirometra) que evidencian la mineralizacin del sustrato
como el anlisis de los metabolitos secundarios
correspondientes, los cuales acumulan en el medio acuoso
que por este mtodo no se pudo determinar.

Realizar estudios a escala piloto en campo que permitan


obtener resultados ms cercanos a los que pudieran
encontrarse al momento de aplicar esta tecnologa
directamente en sitios impactados con hidrocarburos
(biorremediacin en situaciones diferentes ) controlando as
todos los factores que intervienen en el proceso.

Solo es aplicable a algunos tipos de aguas