PRCTICA 11

Liliana S. Ramrez ; Roberto C. V. Bocanegra

Hidrlisis de una Protena y ensayos para

protenas y aminocidos

RESUMEN:
Se realiz la hidrlisis de una protena as como su identificacin por medio de distintas pruebas y reacciones, preparando cuatro distintas soluciones
con distintas protenas, la primera solucin fue etiquetada como solucin A y fue grenetina con cido clorhdrico concentrado agua destilada a reflujo, la
segunda solucin etiquetada como solucin B que fue la grenetina hidrolizada neutralizada con hidrxido de sodio al 10%, la tercera solucin
etiquetada como solucin C fue la grenetina sin hidrolizar utilizando agua destilada, la cuarta solucin etiquetada como solucin D, fue la solucin de
albmina preparada con clara de huevo, posteriormente se realizaron pruebas de identificacin de aminocidos en las protenas dichas pruebas
fueron: Reaccin Xantoproteca, reaccin de precipitacin, reaccin de biuret, reaccin con ninhidrina, reaccin con cido nitroso, la accin reguladora
de aminocidos y una cromatografa en placa fina para identificacin de componentes de una protena.

INTRODUCCIN:
Las protenas son biopolmeros de los -aminocido, llamados as debido
a que el grupo amino esta enlazado al tomo de carbono adyacente al
grupo carbonilo. Las propiedades fsicas y qumicas de una protena
estn determinadas por los aminocidos que la constituyen. Las
subunidades individuales de los aminocidos se unen por medio de
Esquema 1. Hidrlisis de una protena
enlaces de amida llamados enlaces peptdicos.

Los aminocidos son compuestos orgnicos que contienen las funciones

cido carboxlico y amino. Dos aminocidos se pueden unir en
condiciones adecuadas, a travs de un enlace amida, formando un
dipptido. El dipptido puede incorporar un tercer aminocido, formando
un tripptido. Cadenas con ms de 50 aminocidos se denominan
protenas.
DISCUSIN DE RESULTADOS:
II.Solucin Neutralizada de hidrolizado de Grenetina (Solucin B):
Para la neutralizacin de la protena, tomamos 5mL de la grenetina que
hidrolizamos en el paso anterior y con hidrxido de sodio al 10%, hasta
un pH de 7, con ayuda de papel pH determinamos el punto hasta que se
neutraliz la grenetina, obteniendo nuestro compuesto llamado zwitterin
que es un aminocido estabilizado por una carga positiva y una negativa
(Ver esquema 2).

En el desarrollo de la prctica llevamos a cabo distintos procesos, en los

cuales pudimos identificar uno por uno los distintos aminocidos que
conforman a las protenas, dichos procesos e identificaciones se
mencionan a continuacin:

I.Hidrolisis de una protena (Solucin A):

En un matraz baln de fondo plano colocamos 200mL, 1g de grenetina y

10mL de cido clorhdrico concentrado, y 10mL de agua destilada, a
dicho matraz baln le adaptamos un refrigerante en posicin de reflujo y
calentamos suavemente por 35 minutos, obtuvimos una mezcla con
contaminantes de color y olor, y lo quitamos aadiendo un poco de
carbn activado, calentando a ebullicin por 2 minutos y con ayuda de
papel filtro, filtramos dicha solucin, obteniendo la solucin A, que fue la
grenetina hidrolizada, la protena que en este caso fue la grenetina se
separ en sus aminocidos diferentes, que los conforman, con eso
pudimos posteriormente realizar las pruebas de identificacin de los
aminocidos que conforman la grenetina, en general la reaccin de
hidrolisis es la que se muestra a continuacin (Ver esquema 1).
Esquema 2. Grenetina hidrolizada neutra
III.Solucin de Grenetina sin Hidrolizar (Solucin C): En un vaso de
precipitados de 100mL colocamos 0.5g de grenetina y agregamos 20mL
de agua destilada y agitamos vigorosamente, hasta disolucin total.
IV.Solucin de Albmina (Solucin D): Preparamos la solucin e
albmina (clara de huevo), agitando la clara por 10 segundos, agregamos
100mL de agua, agitamos y filtramos la solucin con un pedazo de manta
de cielo.
Dichas soluciones realizadas en el laboratorio, fueron utilizadas para
realizar distinta pruebas de identificacin de aminocidos contenidos en
la protena de grenetina y en la albmina, a continuacin se menciona
cada una de ellas, as como los resultados obtenidos.

1) Reaccin Xantoproteca:
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Esta prueba como sabemos caracteriza a los aminocidos aromticos.
Esta reaccin se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molcula
proteica. Los complejos de la molcula proteica que son de importancia
en esta reaccin son la tirosina y el triptfano. En dos tubos de ensayo
colocamos en el primero 1mL de solucin de grenetina hidrolizada
(Solucin A) y en el otro, 1mL de solucin de albmina (Solucin D), a
cada tubo agregamos 2.5mL de cido ntrico concentrado, calentamos
lentamente en un bao mara, esto para favorecer la formacin del in
nitronio para que se lleve a cabo la reaccin de nitracin, en esta
reaccin de identificacin esto nos sirvi para poder identificar en que
tubo estaban presentes anillos aromticos, dicha reaccin da positiva
mayoritariamente con la tirosina, al reaccionar obtenemos el anillo de
benceno nitrado, obteniendo un precipitado amarillo del nitrocompuesto.
La reaccin slo dio positiva en la albmina, ya que al analizar la tabla 1,
nos damos cuenta que la albmina tiene el aminocido tirosina, y puesto
que esta reaccin reacciona mayoritariamente en este, obtuvimos un
color naranja intenso en este tubo al aadir el hidrxido de sodio,
mientras que en el tubo donde estaba la grenetina, no obtuvimos ninguna
coloracin, al no tener aminocidos con anillos aromticos presentes.
Tabla 1. Aminocidos de la Albmina
La reaccin que sucede con la tirosina de la albmina fue la siguiente
(Esquema 3).
Esquema 3. Reaccin Xantoproteca
2) Reaccin de Precipitacin: El enlace disulfuro es un enlace
covalente que se produce cuando dos grupos sulfhidrlo (SH)
reaccionan para formar un puente disulfuro (SS). Los residuos
de cistena pueden formar puentes disulfuro. Pueden unir 2
cadenas peptdicas o una sola para formar un anillo. Dicha
prueba identifica los enlaces disulfuro de las protenas, n mayor
parte las protenas que contengan un nmero mayor de
puentes disulfuro, en la prueba en un tubo de ensayo
colocamos 2mL de grenetina hidrolizada, en otro 2mL de
albmina y en un tercero 2mL de agua destilada, agregamos
5mL de solucin de hidrxido de sodio al 10% y 1 mL de
acetato de plomo, obtuvimos los siguientes resultados:
Sustrato Observaciones
Solucin A(Grenetina) Negativo (pp. Blanco)
Solucin D (Albmina) Positivo (pp. Caf)
Como podemos darnos cuenta, el plomo reacciona con los puentes
disulfuro (esquema 4), formando un precipitado caf, que dio positiva en
la almina indicndonos la existencia de dichos puentes disulfuro,
reaccionando tanto en la cistena como en la metionina de la albmina
que contienen puentes disulfuro.
Esquema 4. Reaccin de precipitacin
3) Reaccin de Biuret: Es empleado para detectar la
presencia de protenas o polipptidos, ms especficamente,
para identificar enlaces peptdicos, cambiando de una
coloracin azul cielo a una azul rey, indicndonos que la
prueba fue postiva. En seis tubos de ensayo colocamos
distintas soluciones, en las cuales colocamos las soluciones
A, C y D, los resultados fueron los siguientes.
SUSTRATO OBSERVACIONES
Agua Destilada Azul cielo
Solucin A (Grenetina Hidrolizada) Sin color
Solucin C (Grenetina sin hidrolizar Azul rey
Solucin D Azul rey
Como podemos darnos cuenta, en los tubos donde se encontr la
solucin de grenetina sin hidrolizar y en donde estaba la solucin de
albmina, dieron la prueba positiva, esto nos quiere decir que en estos
tubos las soluciones que tenan existencia de enlaces peptdicos, esto es
aminos libres en su estructura, esto se debe a que en esos tubos hubo
una desnaturalizacin de dichas protenas, es decir la estructura terciaria
de las protenas se rompi dejando libres los aminos formando de nuevo
los enlaces peptdicos no se hidrolizaron, por ello haba aminos libres
por tanto enlaces peptdicos. (Ver esquema 5).
Esquema 5. Reaccin de biuret, formacin de complejo de cobre con los aminos
Esquema 7. Reaccin con cido nitroso
libres
4) Reaccin con Ninhidrina: Es una de las reacciones
caractersticas del grupo -amino Por calefaccin de un -
aminocido con dos molculas de ninhidrina da un producto
intensamente coloreado. Aparece un color purpura con todos
los aminocidos y pptidos, esto es con los aminocidos que
tengan aminos libres, dndonos en esta reaccin con hidrxido
de sodio y ninhidrina y al calentar obtenemos una coloracin
purpura, esto quiere decir que las protenas con aminos libres
reaccionaron con la ninhidrina y el hidrxido de sodio, puesto
que en las dems soluciones, no tenan aminos libres primarios
con quien reaccionar, los resultados fueron los siguientes:
SUSTRATO OBSERVACIONES
Agua Destilada Prueba negativa, sin color
Solucin B Prueba positiva, color purpura
Solucin C Prueba negativa, sin color
Solucin D Prueba negativa, sin color
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Aminocido patrn Prueba positiva, color purpura que viraron con fenolftalena a color rojo, los resultados fueron los
Como podemos darnos cuenta, la prueba dio positiva en el tubo con la siguientes (Ver esquema 8)
grenetina neutralizada B, puesto que la ninhidrina reacciona con
aminocidos con un pH de entre 4 a 8, y la solucin la tenamos en un pH
neutro, por ello dio positiva y en el aminocido patrn, al tener aminos Cromatografa en capa fina.
Muestras Distancia Frente del Rf
libres primarios pudo reaccionar, esto es un aminocido libre y puede
reaccionar libremente. (Esquema 6). recorrida solvente
SOLUCION 2 4 0.5
B
Fenilalanina 2.9 4 0.725
Glicina 2 4 0.5

Esquema 6. Reaccin con Ninhidrina

5) Reaccin con cido nitroso Esta prueba nos permite
determinar la cantidad de hidrogeno liberado de una amina en
protenas, con la reaccin de cido nitroso, identificando los
grupos aminos libres de los pptidos y las protenas midiendo
la cantidad de nitrgeno liberado en la reaccin, las pruebas
donde haya un burbujeo continuo, indica la existencia de
dichos aminos libres, en la prueba de laboratorio obtuvimos los
siguientes resultados.

Sustrato Observaciones
Agua Destilada Negativo, no hubo burbujeo
Solucin A Positivo, mucho burbujeo
Solucin C Negativo, no hubo burbujeo
Solucin D Negativo, no hubo burbujeo
Como podemos darnos cuenta, la nica prueba donde dio positivo fue en
la solucin A, de grenetina hidrolizada, esto quiere decir que la hidrolisis
fue parcial en nuestra solucin, ya que quedaron aminos libres con los Esquema 8. Accin reguladora de aminocidos
cuales pudo reaccionar el cido nitroso y liberar ese nitrgeno gas (Ver 7) Cromatografa en placa fina: En una cromatoplaca
esquema 7). colocamos tres puntos, el primero la solucin de grenetina, en
el siguiente colocamos muestra de fenilalanina y al final glicina,
corrimos la cromatografa en una solucin de isopropanol-agua
(7:3) con 2 gotas de hidrxido de amonio para que no se
corriera toda la placa en un solo rayo, al ser muy polar el
isopropanol con los aminocidos muy polares, la cromatoplaca
se corri muy lento, secamos la cromatoplaca y le aplicamos
solucin de ninhidrina para revelar la placa, obteniendo
Esquema 7. Reaccin con cido Nitroso distintas machas cuyo resultado se muestra a continuacin.
6) Accin Reguladora de Aminocidos

En esta reaccin se pone en manifiesto como un aminocido acta como

un cido o una base, ya que los aminocidos son anfteros, utilizamos
hidrxido de sodio y cido clorhdrico para las diferentes reacciones.
Agregamos a dos tubos de ensayo, en el primero colocamos 2mL de
sol.B y en otro 2mL de agua destilada, 6 gotas de rojo congo, primero
observamos que ambos mostraron un color rojo intenso, esto quiere decir
que nuestras soluciones estaban bsicas, puesto que rojo congo al
contacto si sigue rojo significa que nuestras soluciones estn en un pH Con estos resultados nos dimos cuenta que la grenetina por prueba de
bsico, al agregarle cido clorhdrico, el tubo 1 y tubo 2 cambiaron la cromatografa, est compuesta en su mayor parte por glicina y no por
coloracin a morado en diferentes velocidades, el tubo que contena fenilalanina.
agua cambio rpido al agregar una gota, el cambio fue en cuestin de
segundos, mientras que en el tubo que contena la solucin B cambio CONCLUSIN:
lento, se le tuvieron que agregar 8 gotas para ello, la diferencia entre las
velocidades del cambio de cloracin se debe a que los aminocidos
Se llev a cabo la hidrolisis de una protena
presentes en la solucin B producen un efecto bfer que de alguna
manera amortigua o dicho en otras palabras hace que la reaccin se
lleve a cabo de manera lenta, con hidrxido de sodio fue lo mismo solo BIBLIOGRFIA:
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1. Wade, Leroy. Qumica Orgnica, Volumen 2. Sptima. Mxico: 2. Voet, voet, Bioqumica 3 edicin, Mxico, editorial
PEARSON EDUCACION, 2011.pp: 1153-1161 panamericana, 2006, pp:71-100