Laboratorio N7

Actividad enzimtica de la enzima catalasa

1. Objetivo
Estudiar el rol de la enzima catalasa en la descomposicin del perxido de
hidrogeno en agua y oxigeno
2. Fundamento terico
Enzima
Los enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres
vivos. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin
consumirse en una reaccin, aumentan notablemente su velocidad. No
hacen factibles las reacciones imposibles, sino que slamente aceleran las
que espontneamente podran producirse. Ello hace posible que en
condiciones fisiolgicas tengan lugar reacciones que sin catalizador
requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH.

Enzima catalasa
La industria alimentaria evita la oxidacin de los alimentos mediante
diferentes tcnicas, como el envasado al vaco, y tambin utilizando
antioxidantes. Hay antioxidantes naturales, presentes en el organismo, o
sintticos. Los antioxidantes en alimentos se definen como preservantes
que retardan el deterioro, rancidez o decoloracin debida a la oxidacin.
Despus de que el antioxidante se une al agente oxidante, ste no est libre
para reaccionar con algunos compuestos de los alimentos y por lo tanto no
puede causar su oxidacin. Los antioxidantes pueden ser enzimas que
aumentan la velocidad de ruptura de los agentes oxidantes (radicales
libres). Entre ellas se encuentran las enzimas superxido disputas, glutatin
peroxidasa y la catalasa. La catalasa se obtiene fundamentalmente a partir
de microorganismos y su funcin es convertir el agua oxigenada (H2O2) en
agua (H20) y oxgeno (O2):
2 H2O2 2 H2O + O2
El uso de esta enzima permite alargar la vida til de zumos de ctricos,
cerveza y vino ya que, al degradar el agua oxigenada (un agente oxidante)
en sustancias no reactivas (agua y oxgeno) se inhiben las reacciones
oxidativas sin problemas secundarios.
Factores que afectan la actividad enzimtica
Efecto del pH
Las enzimas actan dentro de lmites estrechos de pH (pH ptimo de la
reaccin). Por ejemplo, la pepsina (enzima estomacal) tiene un pH ptimo
de 2, al graficar su actividad enzimtica para valores crecientes de pH,
comenzando desde la zona cida, se obtiene una curva en forma de
campana. El mximo de la curva corresponde al pH ptimo en el cual la
enzima tiene su mxima actividad. En medios muy cidos o muy alcalinos,
la enzima se desnaturaliza y se inactiva. Otras enzimas en cambio tienen
una actividad ptima a pH alcalino como la tripsina (enzima intestinal)
Temperatura
La velocidad de las reacciones enzimticas aumenta, por lo general, con la
temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. La
velocidad por lo general se duplica por cada 10C de aumento trmico. La
actividad enzimtica mxima se alcanza a una temperatura ptima, luego la
actividad decrece y finalmente cesa por completo a causa de la
desnaturalizacin progresiva de la enzima por accin de la temperatura.
A bajas temperaturas, las reacciones disminuyen mucho o se detienen
porque decrece la cintica molecular, pero la accin cataltica reaparece
cuando la temperatura se eleva a valores normales para la enzima. No
olvidar que una enzima humana tpica posee su ptimo a 37 C, en cambio
otros organismos como, por ejemplo, las bacterias termfilas resistentes a
altas temperaturas tienen su ptimo de actividad cercano a los 80 C
Concentracin de sustrato
Principalmente, la velocidad de la reaccin o catlisis vara de acuerdo a la
concentracin del sustrato.
Al aumentar la concentracin de sustrato, la actividad enzimtica aumenta,
hasta alcanzar la velocidad mxima, punto donde la enzima se satura,
debido a que las enzimas tienen todos sus sitios activos ocupados

3. Materiales, Reactivos y equipos

Materiales
24 tubos de ensayo
2 gradillas de madera
1 cuchillo de cocina
6 vasos de pp de 250 ml
3 pizetas
3 morteros con pilon
6 pipetas graduadas de 5 ml
1 vaso de pp de vidrio de 1000ml
Papel pH
1 manguera para lavado de gases
1 probeta de 100 ml

Insumos

500 gr de hgado de vaca

Media bolsa de hielo
1 botella de agua oxigenada al 3%(Aprox.250 ml)
Cronometro
1 botella de plstico de 330 ml
1 jeringa de 5 ml
3 pares de guantes de goma
 Reactivos
Solucin de HCl 2M
Solucin de NaOH 2M
Equipos
Balanza analtica
Bao mara
4. Procedimiento
Obtencin de la enzima catalasa
Para obtener la enzima catalasa primero se obtuvo un homogenado
del hgado cortando en pedazos la totalidad de la muestra de hgado
en trozos medianos de aproximadamente 2 cmx2cm, luego se
colocaron los trozos de hgado en el vaso de pp de plstico de 250 ml
hasta llenar la mitad del vaso y se llen con agua destilada hasta el
tope del vaso, se dej macerar la mezcla durante 20 minutos
aproximadamente moliendo levemente con ayuda de un mortero sin
triturar el hgado para evitar trozos muy pequeos en el material de
homogenado y por ltimo se verifico que el homogenado final tuviera
una coloracin naranja intensa.
Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de la
enzima
Al comienzo de la prctica se program un bao mara a 37C y otro a
80C.
Se rotularon cinco tubos de ensayo y se aadieron 5 ml de hgado
homogenado a cada tubo y se mantuvo los tubos a las siguientes
temperaturas:

Nro de tubo Tratamiento Tiempo

1 En bao mara a 80C 15 minutos
2 En bao maria a 37C 15 minutos
3 A temperatura Indistinto
ambiente
4 En bao de hielo 30 minutos
5 En congelador a 4C 30 minutos

Luego se aadieron 2 ml de agua oxigenada asegurndose que

existan al menos 5 minutos de diferencia entre la aadidura de
reactivo a cada tubo y se midi el tiempo transcurrido desde que se
aadi el perxido hasta que se comienzan a producir burbujas con la
ayuda de un cronometro y se anotaron los resultados en la Tabla 1.
Este procedimiento se repiti 3 veces.
Efecto del pH sobre el funcionamiento de la enzima
Se rotularon 3 tubos de ensayo con las letras A,B,C y se aadieron 3
ml de hgado homogenado a cada tubo. Se mantuvo los tubos en las
siguientes condiciones de pH agitando suavemente hasta mezclar.

Tubo Tratamiento
A Se aadieron 3 ml de HCl 2M y se
midio el pH
B Se aadieron 3 ml de NaOh y se
midio el Ph
C Muestra control se midio el pH
 Luego se aadieron 3ml de agua oxigenada y se midio el tiempo
transcurrido desde que se aadi el perxido hasta que se comiencen
a producir burbujas, estos resultados se anotaron en la Tabla 2.Este
procedimiento se repiti 3 veces
Determinacin de la velocidad de reaccin enzimtica
La reaccin de la catalasa con agua oxigenada es de tipo exotrmica.
Para poder medir esta reaccin qumica en trminos de velocidad, se
mide la generacin de oxigeno a travs del tiempo, el cual se
desprende en forma de gas.
Para esto se arm un sistema con una probeta llena de agua y esta la
llenamos hasta el tope y la cerramos con papel film para luego
voltearla 180 grados dentro del vaso de pp con agua y con cuidado
insertamos la manguera de gases que estaba conectada al tubo de
reaccin que conctenla 200 ml de homogenado de hgado tapado
con un corcho el cual estaba conectado con la manguera con mucho
cuidado de no crear burbujas en la superficie superior de la probeta,
una vez armado este sistema por el otro orificio del corcho se
insertaron 5 ml de agua oxigenada con la ayuda de una jeringa
asegurndose que esta este bien encajada y se mantuvo girando el
tubo de ensayo durante la reaccin.En ese instante se realizaron
mediciones cada 10 segundos de los ml de agua desplazados por la
transferencia de oxigeno hasta que ya no haya generacin de
oxigeno, estos datos se colocaron en la Tabla 3.
5. Datos
Tabla N1.Resultados del efecto de la temperatura

Tubo Temperatura Tiempo que Observaciones

tardo en
comenzar la
reaccin
(segundos)
1 80C 2 - 21 El color cambio a
1 - 17 uno marrn claro
1.5 - 19 saturado y hubo
poco burbujeo.
2 37C 1 25 Se formaron
2 14 espumas y al
1 - 13 final un
precipitado
3 Ambiente 1 22 Se forma un
1 23 precipitado y se
1 - 15 forman dos fases
de color naranja
saturado.
4 Hielo 1C 1 18 Se forman
1 22 burbujas y la
2 24 reaccin es ms
larga
5 Congelado 4C 2 - 16 Se forman
2 - 26 burbujas y la
2 - 24 reaccin es ms
 larga

Tabla N2.Resultados del efecto del pH

Tubo Ph Tiempo Observacion

que tardo es
en
comenzar
la reaccin
(segundos)
A 0 12 Se forma un
0 17 precipitado de
0 24 color blanco
B 13.5 1-30 No hay mucho
13.5 4-1.36(min) burbujeo y la
14 5-51 coloracin es
naranja y rojo
C 6 1 25
6.5 1 17
6 0.5 - 18

Tabla N3. Volumen de oxigeno desprendido en el tiempo

Tiempo (s) Cantidad de O2 desprendido(ml)

0 44
10 46
20 46.5
30 47
40 47
50 48
60 48.5
70 49
80 49.2
90 49.2

6. Clculos y Resultados
La mejor condicin de temperatura es a la temperatura ambiente
como se puede observar en el grfico.

El ph optimo es a 13.5 ya que el ph de 6.2 es el pH de la muestra

control.
 La velocidad instantnea de reaccin es en un tiempo=0 , la cual
seria:
tr(0) = 45.062(ml/s).
La velocidad de reaccin es:
tr(t) = 45.062+0.053*t

7. Conclusiones
De acuerdo a los resultados obtenidos se pudo concluir que la
temperatura ptima para la enzima catalasa es a una temperatura
ambiente, aproximadamente 25C, el Ph optimo es 13.5
perteneciente al tubo B , el cual contena 3ml del homogenado y se
hizo reaccionar con hidrxido de sodio (NaOH) a diferencia del tubo A
que reacciono con el cido clorhdrico (HCl), por lo tanto se puede
concluir que la enzima acta mejor en un pH bsico. Por ltimo se
pudieron calcular las velocidades de reaccin instantnea y de
reaccin satisfactoriamente con un ajuste lineal al igual que para el
clculo de la temperatura y pH optimo.
8. Cuestionario
a) Por qu se forman burbujas al hacer reaccionar la enzima
catalasa con agua oxigenada?
Por qu el hgado, contienen la enzima catalasa la cual es un
poderoso antioxidante, es decir, que impide la oxidacin de las
sustancias qumicas. Si agregamos agua oxigenada o Perxido de
Oxigeno (H2O2) a una de estos crudo, la catalasa separar el
Oxigeno del Perxido de Oxigeno, liberando una gran cantidad de
gas (O2), esto es lo que produce el burbujeo.
b) Por qu se prepar un homogneo y se picaron las
muestras? Por qu no se aadi el perxido directamente a
los tejidos sin macerarlos?
 Porque se obtiene mejor la enzimas si la tomamos directamente
del jugo ya que se encuentra en mayor concentracin que si
tomamos del tejido directamente pues aparte de la enzima
contiene otras protenas que pudieran afectar la enzima
c) Qu les sucede a las enzimas cuando se exponen a
temperaturas extremas (muy fras o muy calientes)Por
qu sucede esta desnaturalizacin de las enzimas?
La actividad enzimtica es ptima en los rangos de temperatura
de 35 a 37C, por arriba de esos valores las Enzimas (Protenas
con funciones metablicas) se Desnaturalizan, es decir, pierden
momentneamente sus funciones metablicas porque su
estructura terciaria se desorganiza. Por debajo de estos valores las
Enzimas son Inhibidas, es decir, se mantienen inactivas de tal
manera que no pueden intervenir en una reaccin enzimtica.
Adems la enzima se desnaturaliza ya que a altas o bajas
temperaturas, sta pierde su estructura terciaria, que es la que en
definitiva le da la funcin a la enzima. Sin su estructura no est
formado el sitio activo, por lo que no tiene actividad alguna.
d) Las enzimas del estmago funcionan ptimamente a un pH
de 2 Cmo se afectara la digestin si el pH aumenta a 4?
El pH de estmago es muy acido entonces si nosotros
aumentamos el pH no se realiza la misma reaccin de digestin
ya que son enzimas las que llevan a cabo la digestin, sin
embargo la enzima catalasa funciona en un pH de entre 3 y 6
entonces si nosotros aumentamos el pH del estmago la enzima
funcionaria correctamente ya que se encuentra en sus rangos de
pH.