METODE ANALIZIRANJA VITAMINA

Zahtjevi vezani uz uzorak:

Plazma ili serum uzeti natate
Antikoagulant izbora je litijum heparin za odreivanje
vitamina, kao to su: tiamin, riboflavin, retinol, tokoferoli &
holekalciferol

EDTA se moe koristiti za odreivanje vitamina kao: B6 i

folna kiselina
Metode i njihov odabir

Odabir metode ovisi o tome koji e vitamin biti

analiziran. Neki od vitamina, kao to su A, K ili
B12 pokazuju specifinosti, to dozvoljava
koritenje specifinih methoda na nain koji ima
uticaja na cijenu kotanja izvoenja metode.
 Neke od metoda omoguuju direktno
mjerenje koncentracije vitamina. Ove su metode
preporuene za koritenje pri mjerenju
koncentracije vitamina interesantnih u klinikoj
praksi. Meutim, one su skupe, pa ih svaki od
laboratorija ne moe provoditi.
Ove metode ukljuuju:
HPLC (referentna metoda)
Imunoeseji (ELISA, RIA, FIA)
Kolorimetrijski i spektrofotometrijski eseji
Fluorometrijski i hemiluminescencijski eseji
Amperometrijski eseji
 S obzirom da vitamini funkcioniraju kao ko-
faktori i supstrati u mnogim reakcijama u tijelu, u
pojedinim se metodama koriste ova svojstva, te se
vitaminima indirektno mjeri koncentracija
mjerenjem aktivnosti enzima koji su pod njihovim
uticajem. Ove metode su jeftinije, a mogu biti
semi-kvantitativne ili kvalitativne.
 Neke od ovih metoda koje se danas koriste,
koriste se iskljuivo u istraivake svrhe, a one
ukljuuju:
test nakupljanja metabolita
esej aktivacije enzima eritrocita
test fragilnosti eritrocita
protrombinsko vrijeme
mikrobioloke metode
bioeseji (in-vivo & in-vitro)
 High Performance Liquid Chromatography
(HPLC). Ovo je referentna metoda analiziranja bilo
kojeg tipa vitamina. Takoer se koristi za
odreivanje izoformi vitamina
 PREDNOSTI NEDOSTACI
Zahtjeva prethodno tretiranje uzorka kao to su
Direktna
ekstrakcije i filtracija

Kvantitativna Zahtjeva paljiv odabir mobilne faze

Precizna i tana Mora se provesti optimiziranje metode

Osjetljiva i Zahtjeva pristustvo standarda, kalibratora i HPLC
specifina reagenasa

Automatizirana Skupa za nabavku, a visoki trokovi odravanja

Imunoeseji

Postoji nekoliko vrsta imunoeseja:

- Enzyme Linked Immuno- Sorbant Assay (ELISA) koji
koriste antitijela vezana za enzime.
- Radio-imunoeseji koriste radioaktivne izotope (problem
odlaganja radioaktivnog otpada)
- Fluorescirajui imunoeseji koriste antitijela oznaena
fluoroforom, ali imaju niu osjetljivost u poreenju sa
prethodna dva tipa testova.
 Vitamin B12 i vitamin D mogu biti analizirani
pomou imunoeseja. Ovi eseji mogu ovisiti o
dostupnosti monoklonalnih antitijela pomou kojih se
odreuje specifinost i osjetljivost.
Ako se odreivanja vre u malom broju uzoraka,
imunoeseji se smatraju skupim, ali se cijena moe
smanjiti ako se prikupi dovoljan broj uzoraka i
analizira istovremeno na plati od 96 mjesta za
analiziranje. Imuneseji su drugi po redu metod po
pouzdanosti u odreivanju koncentracije vitamina,
nakon mjerenja pomou HPLC metoda.
Kolorimetrijske i spektrofotometrijske metode

Hemijska reakcija izmeu hromogena i

vitamina dovodi do promjene boje. Razvijanje boje
pokazuje prisustvo vitamin - kvalitativna analiza.
Koristi se spektrofotometar da bi se izmjerio
intenzitet boje, pri emu je intenzitet boje
proporcionalan koncentraciji vitamina. Uglavnom
se koristi za odreivanje koncentracije vitamina C
(askorbinske kiseline).
 PREDNOSTI NEDOSTACI
Direktni kvantitati-
Niska osjetljivost i specifinost obzirom da
vni esej
nekoliko drugih metoda moe interferirati
Zahtjeva malu
sa hromogenom ili enzimom koji se koristi
koliinu uzorka
Ne moe se koristiti kada su u pitanju svi
Automatizirana
vitamini
Brza za izvoenje
Moe se primijeniti
Trebaju se koristiti odgovarajui kalibratori
na pojedinanom
i kontrole
ili nekoliko uzoraka
istovremeno
Fluorometrijski & hemiluminescencijski eseji

Pojedini vitamini imaju mogunost

fluorescencije kada reagiraju sa fluoroforom. Nivo
fluorescencije je direktno proporcionalan
koncentraciji vitamina.
 U hemiluminescencijskim esejima, koristi se
luminol za reakciju sa vitaminom koji je predmet
istraivanja. Mjeavina se injicira pod
kontroliranim uvjetima kroz kapilaru gdje se
odvija kinetika reakcija i mjeri koncentracija.
Prednosti i nedostaci su slini kao i kod
fotometrijskih i spektrofotometrijskih metoda.
Amperometrijski eseji

Pojedini vitamini mogu podlijegati elektro-

hemjskoj oksidaciji. Ove reakcije na elektrodi
uzrokuju promjene u elektrinom potencijalu koji
je direktno proporcionalan koncentraciji vitamina
u uzorku. Glavni nedostaci ove metode je
nedostatak specifinosti pa se rijetko koriste,
ponekad paralelno sa metodom HPLC radi
potvrde odreenih rezultata.
Indirektne metode odreivanja vitamina

Test nakupljanja metabolita

Ovi eseji bili su izuzetno popularni u

prolosti. Indirektni su eseji kojima se odreuje
aktivnost vitamina kao kofaktora za odreene
metabolite.
- Ispitaniku se oralno daju velike, mjerljive doze odreenog
metabolita u ijoj pretvorbi uestvuje vitamin koji se
ispituje
- Uzima se krv ili urin ~ 6 sati nakon uzimanja metabolita
-Isti se metabolit mjeri u uzorku, s tim da:
Poveanje koncentracije metabolita iznad normalnih
koncentracija pokazuje nedostatak vitamina
Znaajno smanjenje koncentracije metabolita ukazuje na
normalnu aktivnost vitamina

Npr. triptofan se daje pri isptivanju B6, a histidin pri

ispitivanju koncentracije folata
 PREDNOSTI NEDOSTACI
-Indirektne
Jeftina metoda -Nisu pouzdane in vivo zbog
interferencije drugih faktora
-Ne mogu se primijeniti za
Minimalni neeljeni efekti sve vitamine
-Invazivne metode
Test aktivacije enzima eritrocita

-Priprema se hemolizat pune krvi ili eritrocita

-Mjeri se aktivnost enzima koji je pod direktnim
uticajem vitamina koji je predmet ispitivanja. Ova
aktivnost enzima naziva se KOEFICIJENT
AKTIVNOST (AC).
- Dodaje se odgovarajua koliina vitamina koji je
predmet istraivanja, te se ponovno mjeri
enzimska aktivnost i uporeuje sa onom prije
dodavanja enzima
-Poveanje AC ukazuje na deficit vitamina.
-Aktivnost transketolaza mjeri se za procjenu
koncentracije tiamina, aktivnost glutation
reduktaze mjeri se za procjenu statusa
riboflavina, dok se aktivnost aspartat
transaminaze (AST) mjeri za analiziranje vitamina
B6
Test fragilnosti eritrocita

Koristi se specifino za procjenu koncentracije

vitamina E. Ovaj vitamin odgovoran je za
stabilnost membrane eritrocita.

-Uzorak ispitanika podijeli se u dva alikvota.

-Eritrociti jednog alikvota ispiru se 2% H2O2
(toksini slobodni radikal za membrane), dok se u
drugom alikvotu eritrociti ispiru destiliranom H2O.
 Nakon 3 sata inkubacije, mjeri se
koncentracija hemoglobina u oba alikvota.
Ako je hemoliza u prvom alikvotu via za
20% nego u drugom, to ukazuje na deficit vitamina
E
Protrombinsko vrijeme

Ovo je specifian, iako indirektan esej za

procjenu aktivnosti vitamina K.
Obzirom da je vitamin K odgovoran za
aktivaciju faktora koagulacije (II, VII, IX, X, protein
C, S & Z) produeno PT > 2 min ukazuje na deficit
vitamina K. Smatra se testom probiranja
(screening test), pa ipak neophodna je potvrda
analiziranjem pomou HPLC ili
spektrofotometrijski.
Mikrobioloke metode (samo u istraivake svrhe)

Pojedini mikroorganizmi ovise o odreenim

vitaminima koji su neophodni za njihov rast. Ovi
mikroorganizmi rastu na podlogama koje sadre
nepoznate koncentracije vitamina koji su predmet
istraivanja. Takoer se koristi i negativna kontrola koja ne
sadri vitamine. Inkubacija traje nekoliko dana. Gustina
rasta mjeri se turbidimetrijski. Moe se mjeriti i koliina
nastale mlijene kiseline, ija koliina je direktno
proporcionalna koncentraciji vitamina u uzorku.
Bioeseji za vitamine

To su istraivaki alati i rijetko se koriste za

kliniko analiziranje koncentracije vitamina.
Pomou njih se mjeri enzimska aktivnost koja je
pod uticajem vitamina, i fenotipski efekti njihovog
deficita. Postoje dva tipa bioeseja:
In-vivo bioeseji
In-vitro bioeseji
In-vivo bioeseji

Neophodne su ive ivotinje, po mogunosti male

rastom, kao takori ili pilii
Promatraju se fizika svojstva ivotinja, kao to
su teina, ponaanje, frekvenca disanja, puls,
pokreti oiju i udova itd.
Odredi se spektrofotometrijski aktivnost enzima
koji je pod djelovanjem vitamina koji je predmet
istraivanja
ivotinje se tada odreeni period vremena hrane
namirnicama koje ne sadre specifini vitamin
 Nakon to se kod ivotinje pone razvijati
poremeaj povezan sa deficitom specifinog
vitamina, uzima se drugi uzorak krvi i ponovno
mjeri aktivnost enzima. Takoer se mjere i ostali
fiziki simptomi. Potom se ivotinji daju vee doze
vitamina koji se ispituje u toku odreenog
vremena, nakon ega se uoava poboljanje u
aktivnosti enzima, te u fizikim svojstvima
ivotinje.
 To sve omoguuje dobivanje standardne
krivulje aktivnosti enzima. Ista se standardna
kriva moe koristiti za analiziranje istog vitamina
za razliite animalne modele, s obzirom da se
aktivnost enzima moe mjeriti i pomou
standardne krive. Na taj nain se moe dobiti i
procjena neophodnih ili oekivanih koncentracija
vitamina.
 Kod takora koji su hranjeni hranom siromanom
vitaminom D razvie se rahitis. Pogoen je enzim vit-D 25-
hidroksilaza, koji koristi vitamin D kao supstrat. Time se
pokree kaskada dogaaja koji dovode do kotanih
deformacije u ovih takora. Nakon to se takorima daje
hrana obogaena odreenim dozama vitamina D simptomi
se povlae. Mjeri se aktivnost enzima u svakom periodu
doziranja i formira standardna kriva.
PREDNOSTI NEDOSTACI
-Indirektne metode
-Zahtijevaju paljivo praenje
-Nisu pouzdane in vivo zbog interferencije
drugih faktora
Vrlo bliske -Ne mogu se primijeniti za sve vitamine
realnosti -Invazivne metode
- Skupe metode zbog trokova vezanih uz
ivotinje
- Zahtijevaju puno vremena
- Nemaju kliniku upotrebu
In-vitro bioeseji

Ovi eseji ukljuuju kulturu stanica ili tkiva.

Uticaj vitamina prouava se u toku rasta,
razmnoavanja i diferencijacije stanica. Mjeri se
koncentracija i drugih faktora koji stvaraju stanice
koje su izloene djelovanju vitamina. Npr. testovi
kojima se prouavaju antioksidativni efekti
vitamina C i E
 PREDNOSTI NEDOSTACI
-Lake za izvoenje nego in-
vivo
-Indirektne
-Bolje praenje i kontrola
stanja
-Manje potrebnog vremena i
-Ne prikazuju stvarno stanje
jeftinije
-Mogu se koristiti za
-Kultura tkiva i stanica se
analiziranje efekata nekoliko
mogu kontaminirati
vitamina