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Separacin de una mezcla de dos aminocidos por

cromatografa por intercambio inico

1.-NOMBRE DE LA MATERIA:

2.-NOMBRE DE LA PRACTICA:

3.-NOMBRE DEL ALUMNO:

4.-GRUPO: 5.-SECCION:

6.-NOMBRE DEL PROFESOR:

7.-FECHAS DE REALIZACION:

8.-FECHA DE ENTREGA:
9.-SITUACION ESCOLAR:

1.-DATOS EXPERIMENTALES E INFORME:


TABLA 1. Valores de separacin de prolina e histidina
Numero Volumen A a 470 A a 570
de tubo de Antes Despus Antes Despus
elucin( del del del del
mL) tratamie tratamie tratamie tratamie
nto de nto de nto de nto de

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Separacin de una mezcla de dos aminocidos por
cromatografa por intercambio inico

datos datos datos datos


1 3 -0.010 0.048
2 6 -0.022 0.036
3 9 0.005 0.063
4 12 0.003 0.061
5 15 -0.058 0
6 18 0.107 0.165
7 21 0.449 0.507
8 24 0.653 0.711
9 27 0.595 0.653
10 30 0.561 0.616
11 33 0.505 0.563
12 36 0.360 0.418
13 39 0.327 0.385
14 42 0.298 0.356
15 45 0.257 0.315
16 48 0.156 0.214
17 51 0.186 0.244
18 54 0.243 0.301
19 57 0.127 0.185
20 60 0.224 0.282
21 63 0.165 0.223 0.189 0.193
22 66 0.206 0.264 0.187 0.191
23 69 0.185 0.243 0.224 0.228
24 72 0.229 0.287 0.288 0.232
25 75 0.145 0.203 0.217 0.221
26 78 0.195 0.199
27 81 0.228 0.232
28 84 0.221 0.225
29 87 0.167 0.171
30 90 0.140 0.144
31 93 0.064 0.068
32 96 -0.004 0
33 99 0.016 0.02
34 102 0.002 0.006
35 105 0.013 0.017
36 108 ---* ---*

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37 111 0.013 0.017


38 114 0.018 0.022
39 117 0.039 0.043
40 120 0.025 0.029
*Dato perdido debido a la mala colocacin de la canica.

2.-CALCULOS:
Volumen de elucin:

Ajuste matemtico de blanco:

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0.8

0.7

0.6

0.5

Absorbancia 0.4

A 470 nm A 570 nm

0.3

0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120

Volumen de elucion (ML)

3.-GRAFICA:
Figura No. 1 Perfil de elucin de la separacin de
aminocidos

4.-DISCUSION DE RESULTADOS EXPERIMENTALES:


Una vez obtenidas las fracciones en tubos de ensaye, se
realiz una reaccin colorida con ninhidrina para comprobar
si se haba llevado a cabo la separacin de los
aminocidos empleados, el color que se obtiene al reaccionar
la ninhidrina con la prolina resulta de una tonalidad amarilla-
mbar mientras que la reaccin con la histidina da un color
ligeramente violeta, aplicando un mtodo

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espectrofotomtrico esto nos permite realizar un perfil


de elucin midiendo su absorbancia a distintas longitudes
de onda 470 nm para el tono violeta y 570 nm para el
amarillo.
Nuestras primeras fracciones fueron color amarillo-mbar y
las ultimas fueron ligeramente moradas, por esa razn
podemos decir que la prolina eluyo primero que la histidina.
Vindolo desde el punto de vista molecular, nosotros tenemos
un estado estacionario que es un intercambiador catinico el
cual nos dice que tiene una carga negativa, por lo tanto al
agregar nuestra mezcla de aminoacidos, el aminocido que
eluira primero ser el que no tenga afinidad por el estado
estacionario en este caso fue la prolina, esto debido a que a
pH 5.25, que es el pH de la primera fase mvil, tuvimos un
medio lo suficientemente bsico como para pasar el primer
pKa de la prolina que es de 1.99 pero sin llegar al segundo
pKa que es de 10.96,y de esta manera desprotonarlo y
acercarnos a su punto isoelctrico que es de 6.47 y as la
estructura que prevalecer ser la que tenga una carga neta
de 0 y asi la prolina eluyo primero. Por otro lado, la histidina a
pH de 5.25 la estructura que prevalecer ser la que tenga
carga neta de +1 convirtindola en una especie catinica
haciendo que tenga una afinidad mucho mayor a la fase
estacionaria que es un intercambiador catinico y por lo tanto
no eluyo.
En segundo lugar, al cambiar de fase mvil por el regulador
de citratos pH 2.0 lo que hicimos fue acidificar el medio lo cual
estuvo mal porque para tener una estructura de la histidina
que sea una especie anionica y que no tenga afinidad por la
fase estacionaria para que pudiera eluir, debimos de haber
alcalinizado el medio hasta de un pH que sobrepase el pKa2
de la histidina que es de 9.17 y as poder obtener la especie
anionica ya que a ese pH la histidina estar completamente
desprotonada con una carga de -1,dndonos como resultado
que perdiera la afinidad por la fase estacionaria y por ultimo

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eluyendo. Pero no fue asi , lo que hicimos fue reducir an ms


el pH a 2.0 y bsicamente, la especie catinica con carga +1
que tenamos en pH 5.25 se hizo an ms catinica casi
llegando a obtener una carga neta de +2, obteniendo como
resultado una afinidad mayor aun que cuando tenamos un pH
de 5.25 y por lo tanto la histidina prcticamente no eluyo.

ESQUEMA DE LA SEPARACION:

5.-CONCLUSIONES:
Los aminocidos se separaron medianamente, eluyendo en
primer lugar la prolina y en segundo lugar la histidina.

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Un aminocido con pH cercano al punto isoelctrico o con una


carga neta de 0 tendr poca afinidad o afinidad nula a la fase
estacionaria.