Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Qumica y Biologa

Bioqumica

Cuantificacin espectrofotomtrica de
aminocidos y protenas.

Felipe Anabaln
Natalia Corrales
Autores:
Siomara Flores
Carlos Riveros
Profesor: Alex Elas
Ayudante: Nelson Garrido
Seccion: L1
Fecha de entrega: 24 de mayo de 2016

1. INTRODUCCIN
La determinacin de concentracin de protenas en solucione tienen gran importancia para
la estudios biolgicos. Los mtodos ms conocidos son el mtodo BCA, Ensayo de Lowry,
absorcin UV, fluerescamina, entre otros.
Dado para los mtodos espectrofotomtricos, se rigen bajo la Ley de Lambert-Beer:
DO= 0 C I (1.1)

Dnde:
DO Densidad ptica o absorbancia de la sustancia
0 Coeficiente de extincin molar

C Concentracin
I Espesor de la celda utilizada para la medicin

Algunos aminocidos tienen la capacidad de absorber los rayos UV debido a los electrones
desapareados que poseen, como es el caso de la tirosina, que posee electrones en su anillo
aromtico.

Figura 1.1 Estructura de la tirosina

Mientras que para los mtodos colormetro, como el de Biuret, se basan en una reaccin
qumica, donde se forma el complejo Cu +2 en un medio alcalino con los grupos -CONH
mediantes enlaces coordinados entre el metal y los pares de electrones libres del oxgeno y
nitrgeno del enlace peptdico. Dando como resultado una solucin violeta.
Es un mtodo econmico, rpido y especficos para protenas solubles.

Figura 1.2 Complejo de Cu+2 , mtodo Biuret

 2. OBJETIVOS

Objetivo General:
Identificar diferentes mtodos de para conocer la concentracin de protenas y aminocidos
en soluciones.

Objetivo Especfico:
Conocer el funcionamiento y usos de la espectrometra
Determinar la concentracin de protenas y aminocidos en la soluciones problemas.
 3. METODOLOGA

3.1 Para comenzar con la primera actividad, se marcaron cuatro tubos de ensayos con
masking tape y plumn. A los tubos se le agregaron diferentes soluciones con la ayuda de
una micropipeta p1000, con sus puntas. Las preparaciones anteriores, se trasvasijaron en
cubetas de cuarzo con el fin de leer la absorbancia a 280nm, en un espectrofotmetro UV-
Visible. La cantidad de solucin agregada a cada tubo de ensayo, se especifica en la
siguiente tabla:
Reactivo/Tubo 1 2 3 4
NaCl 0,9% p/v 1,5 - - -
Glicina - 1,5 - -
Tirosina - - 1,5 -
SAB - - - 1,5

3.2 Para la segunda actividad, se marcaron 8 tubos con masking tape y plumn. A los tubos
se le agregaron diferentes soluciones con la ayuda de una micropipeta p1000 y una de
p100, con sus respectivas puntas. Luego, a las preparaciones anteriores, se les agreg
reactivo de Biuret, por lo cual, se agit suavemente la mezcla. Se incubaron las muestras a
bao mara a 50C por 5 minutos, y despus se trasvasij en cubetas de plsticos con el fin
de leer la absorbancia a 540nm, en un espectrofotmetro UV- Visible. . La cantidad de
solucin agregada a cada tubo de ensayo, se especifica en la siguiente tabla:
Reactivo/Tubo 1 2 3 4 5 6 MP1 MP2
NaCl 0,9% p/v 1,0 0,9 0,75 0,5 0,25 - - -
SAB 5mg/mL - 0,1 0,25 0,5 0,75 1,0 - -
Muestra - - - - - - 1,0 1,0
Problema

Dnde:
MP1: Clara de huevo.
MP2: Orina diluida 1:10 v/v con NaCl 0,9% p/v.

4. RESULTADOS
Tabla 4.1: Masa molecular, coeficiente de extincin molar, absorbancia y concentracin de
los reactivos utilizados.

Coeficiente
Masa de extincin Absorbancia[nm Concentraci
Reactivo Molecular molar 280 nm ] n [mg/mL]
[g/mol] 1 1
[M cm ]

Tirosina 181,19 1500 3,27 0,395

Seroalbmin
a de bovino 66463 43824 2,50 3,791
(SAB)

Tabla 4.2: Absorbancia de la Seroalbmina de Bovino (SAB) y la concentracin a la que se

midi
Absorbancia
0,205 0,238 0,439 0,649 0,853
[nm]
Concentraci
n SAB [M] 0,72 1,88
3,76 5,64 7,52
10 5
 0.9

0.8

0.7

0.6

0.5
Absorbancia [nm] 0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0 0 0 0 0 0 0 0

Concentracin SAB [M]

Figura 4.1: Regresin lineal referida a la Tabla 4.2.

Tabla 4.3: Datos de la regresin lineal entre la absorbancia y concentracin de SAB.

Ecuacin A=9965 C

R2 0,9869

Rango [ 0,72 10
5 5
; 7,52 10 ]

Tabla 4.4: Concentracin de muestra problema, referido a la absorbancia indicada.

Absorbancia Muestra Problema I [nm] Concentracin[M]
0,632 6,342 10
5
 5. DISCUSIONES

5.1 En la tabla 4.1 se pueden observar las concentraciones obtenidas, a travs de la

ecuacin de Lambert-Beer, en la cual se comprueba que la concentracin es
directamente proporcional a la absorbancia. Lo que nos permite cuantificar de
buena manera las protenas trabajadas. Las protenas trabajadas fueron
protenas que contienen anillos aromticos, puesto que stos tienen absorbancia
en el espectro de los 280 [nm], debido a la resonancia que sufre el anillo de
benceno.
5.2 En la tabla 4.2 se observan los datos obtenidos de la absorcin de Seroalbmina
de Bovino (SAB) y las distintas concentraciones para cada absorbancia
obtenida, con estos datos se construy la curva de calibracin que est en la

figura 4.1, donde la relacin obtenida fue de A=9965 C , lo que nos indica

nuevamente una relacin de proporcionalidad entre la absorbancia y la

concentracin. La muestra problema utilizada fue clara de huevo, ya que sta
posee distintos aminocidos como lo son alanina, triptfano, glicina, leucina,
tirosina, entre otros. La concentracin de protenas totales obtenida, fue de
5
6,342 10 [ M ] .

5.3 Hubo tambin otra muestra problema durante el desarrollo de la experiencia,

que corresponda a orina, pero no se obtuvo ningn valor de absorbancia para
sta. Esto se pudo deber a que la concentracin de orina fue extremadamente
diluida y eso afectara, ya que la orina de una persona con funcionamiento
normal de rin, tiene una concentracin de protenas muy baja, alrededor de 10
mg/ 100 mL, y por ende, no pudo estar dentro del rango de medicin, para
obtener su valor de absorbancia.
 6. CONCLUSIONES

6.1 Respecto al mtodo de reconocimiento y cuantificacin de aminocidos y

protenas por absorbancia a 280 [nm], se puede concluir que es un mtodo
simple, rpido y requiere de un pequeo volumen de muestra. Sin embargo, la
muestra debe encontrarse pura, ya que al contener impurezas stas podran
afectar los resultados si tienen componentes con el mismo espectro de
absorcin. Es por esto, que el mtodo est propenso a errores.
6.2 Con respecto al mtodo de Biuret, se puede concluir que es de las tcnicas ms simples
y baratas de cuantificacin para protenas solubles y tiene la ventaja de ser bastante
especfico, ya que pocas sustancias no protecas interfieren con la reaccin, por ejemplo
el in amonio. De las desventajas se puede decir que no es muy sensible en
comparacin a otros mtodos de cuantificacin, como por ejemplo, el mtodo de
Lowry.

7. REFERENCIAS

7.1 Medline Plus, examen de orina,

https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003622.htm, Revisado el 23 de mayo de 2017.
7.2 DETERMINACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD
https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf. Revisado el 23 de mayo de 2017.
7.3 Freifelder. D. Tcnicas de bioqumica y biologa molecular, Serie de Biologa
Fundamental, Ed. Revert, S. A. Pg. 431