Espectrofotometra

Objetivos:

4. Conocer las partes y funcionamiento del Espectrofotmetro.

5. Calibracin del Espectrofotmetro. Determinacin del espectro de absorcin y
determinacin de la concentracin de una muestra problema.

Teora:

La mayora de los mtodos para el anlisis de los componentes de la sangre, orina y otros
lquidos biolgicos se basan en la produccin de una solucin (coloreada o no) y la comparacin
de la luz que transmite (o absorbe) la solucin problema con la que transmite una solucin de
concentracin conocida.

Los mtodos son simples, rpidos y sensibles; y hacen posible la estimacin de pequeas
cantidades de sustancias muy difciles de medir por otros mtodos. Los espectrofotmetros son
instrumentos para medir la luz que llega a una fotocelda, por medio de un potencimetro al que
se adapta una escala convencional graduada en unidades que permiten hacer el clculo de la
concentracin del material emisor, absorbente, dispersor, o transformador de longitud de onda
(fluorescencia) de la luz.

Se tiene as los fotmetros de flama, que miden la luz emitida por un elemento
incandescente y que es proporcional a su concentracin si se ajustan las condiciones del
experimento. Los fotocolormetros y espectrofotmetros que miden la absorcin de luz de
longitudes de onda especficas de materiales como soluciones, cristales, etc. no slo en el rango
visible del espectro electromagntico, sino extensivo al ultravioleta y al infrarrojo. La medicin
de la luz dispersa por material suspendido en un lquido se conoce con el nombre de nefelometra
o turbidimetra. Los fluorocromos son sustancias que emiten luz cuando son excitadas por
radiaciones de longitud de onda ms corta que la luz emitida; la fluorometra mide la luz emitida
por los fluorocromos colocando la fotocelda sensible en ngulo recto con la luz excitadora que
llega a la solucin problema.

Los fotmetros y espectrofotmetros constan en esencia de las siguientes partes:

a Una fuente luminosa que es variable segn la zona del espectro que desee utilizarse: lmpara
de hidrgeno, de mercurio, de tungsteno, de halgeno, etc.
b Un dispositivo colimador para alinear los rayos luminosos que se emiten en todas las
direcciones a partir del material incandescente y que puede ser un espejo curvo, una lente o
ambos y formar un haz de rayos paralelos.
c Un selector de longitud de onda, para eliminar del haz de luz de la fuente, las radiaciones de
longitudes de onda que no van a utilizarse y obtener luz "monocromtica" y que puede ser un
filtro, o un prisma, o retcula de difraccin para descomponer la luz en su espectro y por
medio de una hendidura mvil dejar pasar slo la que interesa para el experimento.
d Una "cubeta" que es un recipiente que absorbe una cantidad de luz conocida y constante, en
la cual se coloca la solucin problema o el "blanco" de reactivos. Las cubetas pueden ser
tubos de ensayo seleccionados por su calibre igual, y que al ponerse en el aparato dan lecturas
iguales, que se ajusta a "cero".
e Una fotocelda que transforma (efecto fotoelctrico) la energa luminosa que excita su
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 superficie en energa elctrica.
f Un potencimetro para medir la corriente generada en la fotocelda con escala graduada en
unidades de lectura convenientes, sea, densidad ptica (D.O.) Absorbancia, Transmitancia
(T). La aguja indicadora se mueve en todos los casos por la corriente elctrica y slo vara la
escala que "traduce" la corriente en un dato manejable para el anlisis fotomtrico.

Las unidades en que se expresa la absorcin de luz son:

Transmitancia (T) = I x 100 escala aritmtica de 0 a 100

Io
Absorbancia (A) = - log T escala logartmica de 0 a 2
Densidad ptica (D.O)

Material y Reactivos

1. Tubos de prueba y gradillas 2. Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml.

3. Espectrofotmetro 4. Agua destilada.
5. Solucin de anaranjado de metilo 0,8 mg % (w/v en agua)

Procedimiento:
Disponga de una serie de tubos y montar el siguiente set de trabajo:

Reactivos 1 2 3 4 5 6
Sol. de Anaranjado de metilo (ml) 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00
Agua destilada (ml) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

1. Mezclar por inversin

2. Recibir del instructor una o dos soluciones problemas.
3. Tomar el tubo denominado como blanco y calibrar el equipo a 100 % de T y a 0 (cero) de
A. Luego tomar uno de los tubos y realizar el espectro de absorcin, el cual consiste en
realizar lecturas a diferente longitud de onda, hasta determinar cual es la longitud de onda
en la cual hay mayor Absorbancia. Graficar en papel milimetrado.
4. Para leer el set de tubos de trabajo, utilizar la longitud de onda en la cual se obtuvo mayor
Absorbancia.
5. Hacer la grfica de Absorbancia vs. Concentracin y de Transmitancia vs.
Concentracin. Calcular la concentracin de las soluciones problemas.

Cuestionario:

1.En qu consiste la Ley de Lambert-Beer?

2. Qu es el coeficiente de extincin molar?

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