IV.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Enzim amilase merupakan enzim yang mampu bertindak sebagai katalis dalam reaksi
hidrolisis pati oleh air membentuk gula. Gula merupakan produk konstituen utama dalam
industri makanan dan minuman (Widiasa dan Wenten, 2007). Kemampuan enzim dalam
memproduksi gula dipengaruhi terutama oleh kemampuan enzim sebagai katalis proses
produksi, yang dapat dikuantifikasi melalui pengujian aktivtas enzim. Terdapat banyak faktor
yang mempengaruhi aktivitas enzim. Oleh sebab itu, pengujian aktivitas enzim sebaiknya
dilakukan pada kondisi optimum sehingga hasil kuantifikasi yang didapatkan lebih akurat.
Proses pengolahan pati dengan enzim disebut dengan likuifikasi. Enzim yang
digunakan adalah enzim -amilase. Enzim -amilase membantu proses hidrolisis pati
(polisakarida) menjadi oligosakarida, berupa limit dekstrin dan senyawa oligosakarida
lainnya
Praktikum kali ini menguji aktivitas enzim -amilase dengan 3 tahapan yang
dilakukan yaitu pembuatan pereaksi DNS, pembuatan kurva standar, dan uji aktivitas enzim
amilase.

Pembuatan Pereaksi DNS

DNS adalah asam dinitro salisilat. DNS umum digunakan sebagai pereaksi pada
reaksi untuk menghasilkan gula pereduksi, contohnya glukosa dan fruktosa. Fungsi
penambahan DNS adalah untuk memberikan reaksi kompleks yang membantu dalam
pengukuran absorbansi larutan pada spektrofotometer dan berfungsi menghentikan kerja
enzim, sehingga enzim tidak memecah pati. (Sastroharmidjojo, 2005)
Sebelum memulai uji aktivitas enzim amilase, dibuat pereaksi DNS terlebih dahulu.
DNS merupakan senyawa aromatik yang akan bereaksi dengan gula pereduksi maupun
komponen pereduksi lainnya untuk membentuk 3-amino-5-nitrolicylic acid, suatu senyawa
yang mampu menyerap dengan kuat radiasi gelombang elektromagnetik pada 540nm.
Semakin banyak komponen pereduksi yang terdapat dalam sampel, maka akan semakin
banyak pula molekul 3-amino-5-nitrolicylic acid yang terbentuk dan mengakibatkan serapan
tinggi. (Sastroharmidjojo, 2005)
Langkah yang dilakukan yaitu pertama disiapkan 0,7486 gram asam 3,5
dinitrosalisilat. Selanjutnya, ditambahkan 1,3983 gram NaOH . Penambahan NaOH ini
bertujuan untuk menciptakan suasana basa. Karena nantinya reaksi dari reagen DNS ini
bekerja pada suasansa basa. Lalu dilarutkan dengan aquades. Selanjutnya ditambahkan
21,609 gram Na-K. Penambahan tersebut bertujuan untuk menstabilkan warna yang terbentuk
saat reaksi terjadi yaitu merah bata/kecoklatan. Selanjutnya ditambahkan 0,5ml phenol yang
dicairkan pada suhu 500C. Terakhir, larutan tersebut ditambahkan aquades sebanyak 100 ml
sehingga terbentuklah pereaksi DNS.

Pembuatan Kurva Standar Glukosa

Kurva standar merupakan standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai
pedoman ataupun acuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva
standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai
absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Terdapat dua metode untuk
membuat kurva standar yakni dengan metode grafik dan metode least square (Underwood
1990).
Kurva standar yang dibuat dalam praktikum ini adalah kurva standar untuk glukosa.
Maka untuk membuat kurva standar glukosa pertama-tama harus diketahui nilai
absorbansinya. Nilai absorbansi merupakan nilai polarisasi cahaya yang terserap oleh bahan
(komponen kimia) tertentu pada panjang gelombang tertentu sehingga akan memberikan
warna tertentu terhadap bahan. Sinar yang dimaksud yakni bersifat monokromatis dan
mempunyai panjang gelombang tertentu. Beberapa atom hanya dapat menyerap sinar dengan
panjang gelombang sesuai dengan unsur atom tersebut. Sehingga memiliki sifat yang spesifik
bagi suatu unsur atom. Kurva standar menunjukan hubungan antara konsentrasi larutan
(sumbu-x) dengan absorbansi larutan pada sumbu y. Dari kurva standar yang telah
dibuatkan diperoleh suatu persamaan yang diregresilinierkan yaitu persamaan y=mx+c .
Langkah pertama yang dilakukan untuk membuat kurva standard adalah melarutkan
125 mg glukosa ke dalam 25 ml aquades, sehingga terbentuklah glukosa 3000ppm.
Selanjutnya pipet glukosa tersebut sebanyak 0,1-0,7ml untuk selanjutnya ditepatkan dengan
aquades hingga volume 1 ml. Lalu ditambahkan 3 ml pereaksi DNS untuk memberikan reaksi
kompleks yang membantu dalam pengukuran absorbansi larutan pada spektrofotometer. Lalu
didihkan dalam waterbath selama 5 menit untuk mempercepat reaksi antara glukosa dan
DNS. Selanjutnya dinginkan hingga mencapai suhu ruang. Kemudian sampel ditepatkan
dengan aquades hingga volume 25 ml yang berfungsi untuk mengencerkan larutan. Terakhir,
ukur absorbanis dengan panjang gelombang 550nm. Hasil yang diperoleh diplotkan dalam
kurva linear.
Uji Aktivasi Enzim
Proses pengolahan pati menjadi gula sebenarnya dapat dilakukan dengan
menggunakan dua jenis katalis, yaitu katalis asam dan katalis enzim. Pengolahan pati dengan
bantuan katalis enzim terdiri dari dua tahap, yaitu likuifaksi dan sakarifikasi. Pada tahap
likuifaksi, enzim yang digunakan adalah enzim -amilase. Enzim -amilase membantu proses
hidrolisis pati (polisakarida) menjadi oligosakarida, berupa limit dekstrin dan senyawa
oligosakarida lainnya. Kemudian proses pengolahan dilanjutkan dengan penambahan enzim
lainnya selama proses sakarifikasi. Jenis enzim yang ditambahkan selama proses sakarifikasi
spesifik tergantung jenis dan karakteristik produk gula yang ingin dihasilkan. (Lehninger,
1997).
Praktikum kali ini dilakukan pengujian terhadap aktivitas enzim alfa-amilase.
Langkah pertama yang dilakukan adalah menimbang 1 gram soluble starch untuk dilarutkan
ke dalam 100 ml 0,02M buffer fosfat pH 6,9. Apabila tidak ada buffer fosfat, dapat digunakan
aquades sebagai pelarutnya. Perbedaan penggunaan pelarut dapat bergantung pada sampel
yang digunakan. Selain itu, penggunaan buffer bertujuan agar enzim yang di dapat tetap
stabil. Namun, Laloknam et. al (2009) menyebutkan bahwa penggunaan larutan buffer atau
akuades memiliki fungsi yang sama dan keduanya dapat juga dipakai sebagai kontrol negatif
aktivitas enzim amilase.
Langkah selanjutnya yaitu inkubasi. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan
bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu 3 menit dan suhu
optimum 30oC. Selanjutnya reaksi kemudian dihentikan dengan penambahan DNS (3,5
dinitro salicilic acid) sebanyak 2ml. Selain itu reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) akan
bereaksi dengan gula pereduksi hasil hidrolisis dan mengakibatkan terbentuknya warna
tertentu.
Sampel kemudian dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 90-100 0C selama 5
menit. Hal tersebut dilakukan agar reagen DNS dapat bereaksi dengan cepat. Setelah itu
dinginkan dengan air hingga suhu ruang. Tepatkan dengan aquades hingga volume sama
dengan 25 ml untuk pengenceran sampel. Lalu, absorbansi sampel diukur pada panjang
gelombang 550 nm. Metode ini terlebih dahulu membuat kurva standar glukosa antara
konsentrasi glukosa dalam berbagai macam konsentrasi dan absorbansi. Kemudian
konsentrasi sampel yang didapat melalui kurva standar dimasukkan ke dalam rumus untuk
mendapatkan aktivitas enzim amilase. Berikut merupakan tabel hasil pengamatan untuk
pengujian aktivitas enzim enzim -amilase.
Tabel 1. Hasil Pengamatan untuk Pengujian Enzim -amilase.
Kelompo
Sampel Absorbansi [X] (g/ml) Aktivitas enzim (g/ml menit)
k
2 0,208 17,610 0,0196
Dextrozyme
5 0,422 36,549 0,0406
8 1,999 176,106 0,1956
Liquozyme
9 1,999 176,106 0,1956
(Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2016).
Cara perhitungan:
y= 0,0113 x + 0,009
Kel 2B:
y = 0,0113 x + 0,009
0,208 = 0,0113 x + 0,009
x = 17, 610 g/ml
X
x W enzim x fp
Aktivitas enzim =
BM glukosa
=
( 17,610
180 )
x 1 ml x 1
= 0,0196 g/ml
5

menit
Kel 5B:
y = 0,0113 x + 0,009
0,422 = 0,0113 x + 0,009
x = 36,549 g/ml
X
x W enzim x fp
Aktivitas enzim =
BM glukosa
=
( 36,549
180 )
x 1 ml x 1
= 0,0406 g/ml
5

menit
Kel 8 dan 9B:
y = 0,0113 x + 0,009
1,999 = 0,0113 x + 0,009
x = 176,106 g/ml
X
x W enzim x fp
Aktivitas enzim =
BM glukosa
=
( 176,106
180 )
x 1 ml x 1
= 0,1956 g/ml
5

menit.
 1.600
1.369
1.400 1.225
f(x) = 0.01x + 0.01 1.103
1.200
R = 1 0.954
1.000
0.811
0.695
AU 0.800
0.600 0.530
0.430
0.400 0.316

0.200 0.128
0.000
0.000
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132
Konst Glukosa (ppm)

Kurva 1. Kurva Standar Glukosa

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa sampel pati aquades yang ditambahkan
dengan dextrozyme menghasilkan nilai yang berbeda. Pada kelompok 2B aktivitas enzim
sebesar 0,0196 g/ml menit sedangkan kelompok 5B aktivitas enzim sebesar 0,0406 g/ml
menit. Sampel kelompok 2B menghasilkan aktivitas enzim yang sangat kecil karena sampel
mengalami pengendapan setelah pemanasan sehingga saat diukur dengan spektrometer nilai
yang dihasilkan kecil karena cairan terlalu bening.
Sampel pati dalam buffer yang ditambahkan dengan liquozyme menghasilkan nilai
aktivitas enzim yang sama yaitu 0,1956 g/ml menit. Nilai absorbansi yang besar yaitu 1,999
menunjukkan bahwa sampel masih terlalu kental dan perlu dilakukan pengenceran.
Aktivitas enzim yang paling besar terdapat pada larutan yang memakai buffer.
Aktivitas enzim memiliki satuan yang berbeda tergantung deskripsi dan metode
pengujiannya. Hal ini menyebabkan besarnya aktivitas enzim hasil percobaan tidak dapat
dibandingkan dengan aktivitas enzim pada literatur.
Pengujian aktivitas enzim -amilase pada dasarnya dapat dilakukan melalui tiga
pengamatan utama, yaitu peningkatan kekuatan reduksi, penurunan intensitas warna biru, dan
perubahan densitas optis. Peningkatan kekuatan reduksi diamati dengan pengukuran produk
berupa gula pereduksi dari substrat pati. Penurunan intensitas warna biru senyawa kompleks
iodin-pati terjadi akibat jumlah substrat yang semakin berkurang akibat kinerja enzim untuk
menghidrolisis pati. Perubahan densitas optis terjadi akibat lepasnya substrat dari gugus
kromogenik menuju pelarut (Yoo, 1987).
 Pengujian aktivitas enzim -amilase biasanya dilakukan pada kondisi optimum
dengan susbtrat berupa pati. Pengujian aktivitas enzim biasanya dinyatakan dalam suatu unit
tertentu yang spesifik terhadap deskripsinya. Satu unit enzim internasional dinyatakan
sebagai jumlah enzim yang mampu berperan sebagai katalis untuk melakukan konversi 1 M
substrat/menit pada kondisi standar. Kondisi standar yang dimaksud meliputi konsentrasi
substrat, pH optimum, tidak adanya inhibitor, dan adanya aktivator (Yoo, 1987).
Aktivitas enzim -amilase dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu
(Wirahadikusumah, 1989):
1. Suhu
Aktivitas enzim semakin meningkat seiring dengan peningkatan suhu sampai titik atau
suhu optimum. Laju reaksi biokimia meningkat seiring kenaikan suhu. Hal ini karena
panas meningkatkan energi kinetik dari molekul sehingga menyebabkan jumlah tabrakan
diantara molekul-molekul meningkat. Namun, suhu yang ekstrim juga tidak baik untuk
enzim. Di bawah pengaruh suhu yang sangat tinggi, molekul enzim cenderung
terdistorsi, sehingga laju reaksi pun jadi menurun. Enzim yang terdenaturasi gagal
melaksanakan fungsi normalnya. Dalam tubuh manusia, suhu optimum di mana
kebanyakan enzim menjadi sangat aktif berada pada kisaran 35C sampai 40C.
2. pH
Sama dengan pengaruh suhu, aktivitas enzim semakin naik seiring dengan peningkatan
pH sampai titik optimum. Secara umum enzim tetap stabil dan bekerja baik pada kisaran
pH 6 dan 8. Tapi, ada beberapa enzim tertentu yang bekerja dengan baik hanya di
lingkungan asam atau basa. Setelah titik optimum, peningkatan pH akan menurunkan
aktivitas enzim.
3. Konsentrasi substrat
Pada jumlah atau konsentrasi enzim yang konstan, semakin tinggi konsentrasi substrat
samapi titik tertentu, aktivitas enzim semakin tinggi. Setelah titik optimum peningkatan
konsentrasi substrat tidak mempengaruhi aktivitas enzim. Hal ini disebabkan enzim
sudah jenuh dengan substrat.
4. Konsentrasi produk
Semakin banyak produk yang terbentuk, aktivitas enzim semakin turun. Hal ini
disebabkan tidak ada/semakin sedikit substrat yang diubah dan bahkan pada beberapa
enzim, produk itu sendiri menjadi penghambat.
5. Konsentrasi aktivator
Aktivator merupakan molekul yang membantu enzim agar mudah berikatan dengan
substrat. Semakin besar konsentrasi aktivator, apabila disertai penambahan konsentrasi
enzim dan konsentrasi substrat akan meningkatkan aktivitas enzim. Molekul aktivator
dapat menyebabkan sisi aktif enzim semakin sesuai dengan substrat.
6. Konsentrasi inhibitor
Semakin besar konsentrasi inhibitor, maka aktivitas enzim akan semakin turun, karena
molekul inhibitor dapat melekat pada sisi aktif enzim sehingga menghalangi melekatnya
substrat pada enzim tersebut. Sisi aktif enzim konformasinya juga dapat berubah dengan
adanya molekul inhibitor sehingga substrat tidak bisa melekat.
V. KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Widiasa, I.N.; Wenten, I.G., 2007. Combination of reverse osmosis and electrodeionization
for simultaneous sugar recovery and salts removal from sugar wastewater. Reaktor 11, 91- 7.

Yoo, Y.J.; Hong, J.; Hatch, R.T. 1987. Comparison of -amylase Activities from Different
Assay Methods. Biotechnology and Bioengineering XXX. 141-151.

Sastroharmidjojo, Hardjono. 2005. Kimia Organic, Stereokimia, Lemak, dan Protein.

Yogyakarta : Gadjah Mada Universiti Press.

Underwood, A. L. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi ke Enam. Erlangga.Jakarta.

Lehninger, A.L. 1997. Dasar-dasar Biokimia (edisi ke-Jilid 1, diterjemahkan oleh M.

Thenawidjaja). Jakarta : Erlangga.