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PRCTICA N 1: OBSERVACIONES MICROSCPICAS, MORFOLOGA

MICROBIANA. EXAMEN EN FRESCO Y COLORACIONES SIMPLES.

IVN SABOGAL TORI

OBJETIVO

El alumno de Medicina conocer la utilidad de un examen en fresco y de las coloraciones


simples.

INTRODUCCIN
El examen en fresco, es uno de los exmenes ms simples para observar cualquier
microorganismo, especialmente si tiene movimiento y el tipo de movimiento.
Las coloraciones simples se utilizan para visualizar la morfologa y utilizan slo un
colorante. Ej. Azul de Metileno, Azul de Lactofenol y tinta china (da una coloracin
negativa; el microrganismo no se colorea).
Uno de los aspectos ms notables de los microorganismos es su tamao pequeo. En
bacterias las medidas se calculan en unidades de micrmetros (1um=0,001mm, hay
1000 micrmetros en un milmetro). La obervacin de la bacteria puede darse en uno
o varios planos, pudiendo evidenciarse formas esfricas (cocos); stos a su vez pueden
disponerse en cadenas (estreptococos), en cadenas y de pares (diplococos); o en
racimos (estafilococos). Tambin se observan de forma alargada (bacilos), pudiendo
ser alargadas y espiraladas (espiroquetas).
Estas caractersticas morfolgicas proporcionan la base principal para su
sistematizacin morfolgica.
En cuanto a los hongos pueden presentar la forma redondeada como las levaduras o la
forma filamentosa como los mohos.

Los virus en cambio, nunca se pueden observar al microscopio compuesto, slo se


visualizan a travs del microscopio electrnico por su tamao menor de 300nm
(1nm=0,000001mm).

MATERIALES

- Tubo con mezcla bacteriana en medio lquido


- Lminas coloreadas con Azul de Lactofenol de un hongo filamentoso.
- Lminas montadas con tinta china (coloracin negativa). Sirve para discriminar detalles
estructurales de algunos microorganismos como las levaduras.
- Lminas portaobjetos.
- Laminillas cubreobjetos.
- Colorante Azul de Metileno.
- Asa en anillo.
- Aceite de cedro o de inmersin.

PROCEDIMIENTOS

A. OBSERVACIN EN FRESCO

- Tomar una asada de la mezcla bacteriana.


- Cubrir con una laminilla y observar al microscopio con lente de menor y mayor aumento.
- Observar la morfologa y movilidad de los grmenes

B. COLORACIN SIMPLE: AZUL DE METILENO

- Preparar un frotis a partir del tubo con mezcla bacteriana.


- Fijar al calor.
- Cubrir el material con unas gotas de Azul de metileno y dejar actuar el colorante durante
3 a 5 minutos.
- Lavar con agua, secar la lmina al calor suavemente.
- Observar al microscopio con objetivos de inmersin agregando una gota de aceite de
cedro.
- Anotar en el protocolo.

C. COLORACIN SIMPLE: AZUL DE LACTOFENOL:

- Se realiza un cultivo del hongo filamentoso en una gota de medio de cultivo, en una
lmina.
- Cuando hay crecimiento se coloca una gota del colorante sobreel crecimiento.
- Se cubre con laminilla y se sella con blsamo de Canada
- En la prctica se observar con lente de menor y mayor aumento, lminas ya listas.
- Anotar en el protocolo.

D. PREPARACIN CON TINTA CHINA

- Se colocar sobre una lmina portaobjetos una gota de tinta china.


- Se tomar una asada del cultivo a estudiar (Cryptococcus) y se le mezcla en la gota del
colorante.
- Se cubre con laminilla.
- En la prctica se observa con lente de menor y mayor aumento, laminas ya preparadas.
- Anotar en el protocolo.
RESULTADOS
Anote y esquematice sus observaciones

ESQUEMA DE LA OBSERVACIN
LMINAS DESCRIPCIN MORFOLGICA
MICROSCPICA

Examen en Fresco

Coloracin con Azul de


Metileno

Coloracin con Azul de


Lactofenol

Preparacin con Tinta


China

CUESTIONARIO

1. Qu permite observar una coloracin simple de un microorganismo al microscopio?


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Qu se observa en el microscopio al examen en fresco?
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BIBLIOGRAFA

1. Guia de Prcticas de Microbiologia Mdica 2005. Departamento de Microbiologa Mdica


UNMSM.
PRCTICA N 2: COLORACIN DE GRAM-KOPELOV Y COLORACIN DE
ZIEHL-NEELSEN
IVN SABOGAL TORI

OBJETIVO

Los alumnos deben:

- Realizarar la Coloracin Gram y reconocer microrganismos Cocos Gram Positivos, Cocos


Gram Negativos, Bacilos Gram Positivos y Bacilos Gram Negativos.
- Realizar la coloracin Ziehl-Neelsen y reconocer los microorganismos Bacilos cido-Alcohol
Resistentes.

INTRODUCCIN

La coloracin Gram es necesaria para clasificar microorganismos, especialmente a las bacterias,


en Gram Positivas y Gram Negativas. Los microorganismos Gram Positivos se tien de azul y los
Gram Negativos se tien de color fucsia o rojas.

Las bacterias Gram Positivas retienen Violeta de Genciana, por su pared gruesa rica en
Peptidoglicanos, luego de resistir la decoloracin con solucin alcohol acetona.

Las bacterias Gram Negativas no retienen Violeta de Genciana, por su pared delgada rica en
lipopolisacridos, y por lo tanto se decoloran totalmente con solucin alcohol acetona, para
luego teirse con la fucsina bsica.

La Coloracin Ziehl Neelsen nos permite identificar bacterias cido-Alcohol Resistentes. Esta
coloracin se basa en que la alta cantidad de cidos miclicos, dndole un gran contenido
lipdico, en la pared de algunas bacterias. Los acidos miclicos retienen el colorante Fucsina
fenicada luego de resistir la decoloracin con la solucin de alcohol-cido.

MATERIALES
- Lamina con frotis de mezcla bacteriana.
- Lamina con frotis de esputo.
- Serie de Coloracin Gram Kopelov.
- Serie de Coloracin Ziehl - Neelsen.
- Mechero de Alcohol.
- Lmina con Stafilococcus sp.
- Lmina con Streptococcus sp.
- Lmina con Branhamella catarrahlis.
- Lmina con Bacillus sp.
- Lmina con Escherichia coli.
- Lmina con Bacilos cido-Alcohol Resistentes.
PROCEDIMIENTO

a. Realizar la Coloracin Gram en la lmina con mezcla bacteriana:

- Cubrir el frotis con solucin de Violeta de Genciana, agregar dos gotas de Bicarbonato
de Sodio. Dejar que el colorante acte por dos minutos.
- Lavar la lmina con Lugol de Gram y cubrir la lmina con la misma solucin por dos
minutos.
- Lavar la lmina con agua corriente.
- Agregar solucin decolorante de alcohol - acetona por el borde de la lmina, no
directamente sobre la mezcla de bacterias. Se observa como se desprende la Violeta de
Genciana. Dejar actuar solo por 10 segundos.
- Lavar inmediatamente con agua corriente.
- Cubrir la lamina con solucin de fucsina bsica. Dejar actuar por 30 segundos.
- Dejar secar la lmina parada.

b. Realizar la Coloracin Ziehl Neelsen en la lmina con frotis de esputo:

- Cubrir el frotis con solucin de Fucsina Fenicada. Aplicar el calor de la llama del Mechero
de Alcohol tres veces, observar la formacin de 3 vapores (humitos). Se aplica el calor
de lallama una vez, se observa y se deja actuar por un minuto, y asi los tres humitos.
Evitar que hierva el colorante.
- Lavar la lmina con agua corriente.
- Agregar solucin decolorante de alcohol - cido por el borde de la lmina, no
directamente sobre el frotis. Se observa como se desprende la Fucsina fenicada. Dejar
actuar solo por 2 minutos mximo.
- Lavar inmediatamente con agua corriente.
- Cubrir la lamina con solucin de azul de metileno. Dejar actuar por 60 segundos.
- Dejar secar la lmina parada.

c. Observar las lminas con bacterias de diverso tipo.

d. Enfocar los microscopios con aceite de inmersin.

RESULTADOS
Esquema de
Descripcin
Lamina observacin Comentarios
morfolgica
microscpica

Coloracion Gram

C. Ziehl-Neelsen
CUESTIONARIO

1. Qu importancia tiene la pared bacteriana en la coloracin Gram y la Coloracion Ziehl-


Neelsen?

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Identifica otras formas especiales de bacterias y su forma de agruparse con la coloracin
Gram?

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________
Identifica otros elementos que se observa en la Colracion Ziehl Neelsen?

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BIBLIOGRAFA

1. Manual de Prcticas y Atlas. Asignatura de Microbiologa y Parasitologa. Departamento de


Microbiologia Mdica. EAP Enfermeria. Dra. Hilda Mara Solis Acosta. 2009.

2. Gua de Prcticas. Microbiologa. Mdica. Curso Microbiologa Medica Bsica. Escuela


Acadmico Profesional Medicina Humana. Departamento Academico de Microbiologia
Medica. Dr. Rito Zerpa Larrauri. 1998.

3. Manual de Prcticas Atlas de Microbiologa Mdica a Color. Curso Microbiologa Medica


Bsica. Escuela Acadmico Profesional Medicina Humana. Departamento Academico de
Microbiologia Medica. Dr. Rito Zerpa Larrauri. 2009.

4. Microbiologia e Inmunologia Medicas. Warren Lavinson. Octava Edicion McGraw-Hill -


Interamericana de Espaa SAU. 2004.