UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA

DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
IZTACALA
CARRERA MDICO CIRUJANO
M. Enfermedades infecciosas,
microbiologa y
parasitologa mdicas

Prcti
ca I
Cultivo, aislamiento e identificacin
bacteriana
Objetivos

Que el estudiante conozca y realice dos de las diversas tcnicas de siembra de cultivos de
bacterias en medios slidos.
El alumno efectuar el aislamiento de cultivos bacterianos primarios en medios slidos.
Conocer, seleccionar y realizar de manera adecuada la toma de muestra biolgica para
cultivos bacterianos primarios.
Se realizar la tincin ms utilizada para la diferenciacin de bacterias (tincin de Gram)
Los alumnos podrn observar el grupo al cual pertenecen (Gram positivas o Gram
negativas) las bacterias aisladas en el cultivo primario. As mismo el estudiante distinguir
y describir las diferentes morfologas bacterianas que presentan los cultivos bacterianos
primarios con la ayuda del microscopio.
Los alumnos investigarn la composicin del medio de cultivo bacteriano primario utilizado
en la prctica.
Se mencionar de manera general la utilidad que tienen los medios de cultivo y la
aplicacin de usar medios diferenciales y selectivos en lugar de un medio de cultivo
general.

Introduccin:

Louis Pasteur desech la hiptesis de la generacin espontnea. Pero fue Gustav Henle (1809-
1885) quien seal por primera vez las pautas para considerar que un germen (microorganismo)
era la causa de una enfermedad determinada. [1]. Los perfeccionamientos tcnicos introducidos
por Robert Koch (1843-1910) y sus colaboradores, tales como los medios de cultivos slidos, le
permitieron emitir a Koch en 1882 sus famosos postulados, que son los siguientes:
1.El microorganismo debe estar presente, en abundancia, en los tejidos, sangre o excretas
del animal que sufre la enfermedad.
2. Debe ser aislado y estudiado en cultivo puro.
3. Debe ser capaz de reproducir la misma enfermedad cuando es inoculado a animales sanos.
4. Debe ser encontrado, tambin en abundancia, en los animales as inoculados
experimentalmente (6).
Las bacterias, hongos y protozoos se miden en micrmetros (m), por lo que resulta necesario
utilizar el microscopio ptico para poder observarlos. Estos microorganismos pueden ser
clasificados basados en estructuras celulares como morfologa, patrones de tincin. Generalmente
poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano con estructuras que las hacen diferentes.
Muchas bacterias disponen de flagelos, pilis o fimbrias, cpsulas, otras presentan o no movilidad.
La observacin de las estructuras de los microorganismos se facilita utilizando muestras teidas,
para ello se tien con colorantes que son compuestos qumicos para aumentar el contraste (4).
Fundamento:
El sistema respiratorio se divide en vas altas o superiores, que comprenden las reas anteriores a
la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, odo externo y medio, y los
senos paransales, y vas bajas o inferiores que incluyen todas las estructuras posteriores a la
laringe. El tracto respiratorio habitual (la faringe) est formado por distintos microorganismos
entre los que destacan los siguientes grupos y especies: Streptococcus, Staphylococcus,
Micrococcus, Neisserias, Moraxella catarrhalis, Corynebacterium, Haemophilus spp,
Porphyromonas spp, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, etc.
Sin embargo, cuando encontramos una patologa en la faringe, el agente etiolgico ms
frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero tambin, otros microorganismos
patgenos que podemos hallar son: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemoltico, etc
(5).

Frotis bacteriano.
Las tinciones aumentan artificialmente el contraste entre las clulas bacterianas y el medio
circundante. Se requiere que la muestra de estudio se someta al proceso de fijacin para ser
observada, ya sea en un frotis o en extensin sobre portaobjetos, lo que asegura una adecuada
separacin en las clulas y permite se distribuya de forma homognea y posteriormente se realiza
la tincin siguiendo los procedimientos adecuados (7).

Fijacin con calor:

Se toma una pequea porcin de muestra del medio de cultivo sin desgarrar el medio con una asa
bacteriolgica esterilizada en la flama y enfriar en un extremo del cultivo sin daar las colonias,
utiliza un portaobjeto, coloca una gota de solucin salina o agua destilada y realiza una extensin,
se deja secar al aire; inmediato se pasa la preparacin sobre la llama de un mechero sin quemar la
muestra, quedando de esta forma fijada la muestra (7).

Colorantes:
Son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares.
Algunos colorantes utilizados son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los cidos nuclicos y
polisacridos. Colorantes catinicos son el azul de metileno, cristal violeta y la safranina (7).

Tincin de Gram:
La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la
naturaleza y caractersticas de la pared celular bacteriana (3).

Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener
al complejo colorante-mordente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloracin con alcohol acetona
se provoca una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces
al complejo en el interior de la clula. Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de
peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante-mordente (cristal violeta-yodo) y
es fcilmente teida por el colorante secundario o de contraste.
Los dos grupos bacterianos a los que nos referimos tendrn diferente color, con el que finalmente
se tien las bacterias. Gram positivas se observarn de color violeta o morado por el cristal violeta
y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern
la coloracin inicial con los siguientes pasos y se teirn de roja o rosa debido a la safranina (2).
Mordentes:
Los mordentes intensifican la tincin porque aumentan la afinidad de la clula con el colorante,
esta sustancia puede ser el Lugol (solucin de yoduro de potasio)
Precauciones
Realizar la toma de muestras y manipular los cultivos con el cuidado pertinente, utilizar guantes y
cubrebocas durante las actividades, realizar el desecho de muestras biolgicas de manera
adecuada en las bolsas o contenedores rojos para desecho de residuos peligrosos biolgicamente
infecciosos (RPBI).

La toma de muestra, las resiembras, incubaciones tincin y lecturas se podrn efectuar fuera de
las sesiones formales, ya que se trata de actividades muy sencillas que slo requieren de 10 a 15
minutos por sesin extraclase, y su oportuna realizacin optimizar el tiempo global de la
asignatura.

Cada estudiante podr utilizar hasta: Para tincin de Gram

2 cajas petri con agar nutritivo (carne de res) por equipo Caja para tincin (Jugo de 1L ), palitos de
madera
Hisopos estriles Piseta con agua destilada
Encendedor Frascos goteros para tincin de Gram.
Lpiz Colorante de cristal violeta
Cajas petri con agar nutritivo Lugol (solucin de yoduro de potasio)
Solucin salina isotnica Decolorante alcohol-acetona (1:1)
Colorante de safranina
Mechero de Bunsen. Aceite de inmersin
Asa bacteriolgica y micolgica. Toallas de papel
Portaobjetos y cubreobjetos. Papel filtro
Piseta con solucin salina Microscopio.

Actividad I (aislamiento):

Tcnica y procedimiento

Por equipos de 5 integrantes, obtener una muestra biolgica proveniente de un alumno

participante. Se podr realizar la toma de las diferentes zonas de microbiotas humanas: por
exudado farngeo, exudado nasal, exudado tico y microbiota de la piel.

Para la toma de muestra de exudado farngeo, deber encontrarse el alumno con las
siguientes caractersticas: 4 horas de ayuno, sin beber agua y sin haber realizado en ese
lapso de tiempo su higiene bucal.
Con el hisopo estril se realizar raspado enrgico de la regin farngea del participante,
evitando contaminar la muestra con la saliva propia de la persona.
Posteriormente realizar la siembra por estra simple o estra cruzada en el medio de agar
nutritivo (cultivo bacteriano primario) para su crecimiento.
Los medios de cultivo se incubarn a 35+ 2C durante 24 y 72 horas.
Se realizara un frotis y posteriormente se teir con la tcnica de Gram y se observar al
microscopio para identificar las caractersticas morfolgicas y observar el grupo al cual
pertenecen los gneros bacterianos aislados (Gram positivas o Gram negativos).
Pasos de un frotis.

1. Colocar una pequea gota de agua o solucin salina en el centro de un portaobjetos limpio,
marcar con lpiz graso en un extremo las inciales del microorganismo.

2.Encender el mechero y utilizar la flama azul, flamear el asa de siembra, tomar y acercar a la
flama el medio de cultivo de donde se tomar una pequea cantidad del cultivo bacteriano en
medio slido con el asa bacteriolgica, enfrindola en una esquina del medio sin daar el cultivo y
transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una
suspensin homognea que quede extendida no aglomerada para facilitar su secado.

4. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el portaobjeto a la

llama del mechero. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias se continua con el
proceso de tincin.

Tincin de Gram:

1. Primer colorante. Un colorante bsico (+) catin

que en contacto con las clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El
ms utilizado es el cristal violeta.

2. Solucin mordente. Fija las tinciones y aumenta la

afinidad entre el colorante y las clulas, solucin de
yoduro de potasio.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico;
alcohol acetona (1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de
distinto color que el primer colorante, como la
safranina.

Cuestionario:
1. Cul es la morfologa de los microorganismos observadas al microscopio?+

2. A qu gneros podran corresponder cada una? +

3. Cules tipos de tincin existen? Cul fue el tipo de tincin que se utiliz en la prctica y
por qu?+
4. Dibuje las formas y agrupaciones de las bacterias que se pueden observar al microscopio
ptico. +
5. Determine cul(es) microorganismo(s) patgeno(s) de vas respiratorias altas se
encuentra(n) presente(s) en la faringe o amgdalas de su compaero. +
6. Determine cul(es) microorganismo(s) se encuentra(n) presente(s) en el exudado nasal,
tico o drmico segn haya sido su caso.
Se hizo una muestra drmica pero no se encontraron bacterias.
7. Qu es un medio de cultivo?
Son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas
ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.
8. Cmo se clasifican los medios de cultivo?+
9. Qu es un medio de cultivo enriquecido? Mencione 2 ejemplos.
 Estn compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al cual se le puede
agregar un gran exceso de nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre,
suero, lquido asctico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias
nutricionales.
10. Qu es un medio de cultivo selectivo diferencial? Mencione 2 ejemplos.
Son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios gneros y especies de
microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha aadido un carbohidrato y un indicador y
la bacteria que se cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una
acidificacin del medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de
pH. El citrato de Simmons es un medio cuya nica fuente de carbono es el citrato sdico,
entonces en l solo crecern las bacterias capaces de desarrollarse utilizando como nica
fuente de carbono ese componente. A menudo la separacin se basa en la diferencia de
color de las colonias aisladas, como en el agar con azul de metileno - eosina que permite
diferenciar E. coli (colonias oscuras y de brillo metlico) de Enterobacter aerogenes
(colonias rosadas de centro azul sin brillo). Estos dos microorganismos en agar nutritivo
producen colonias de color gris blancuzco.
11. Cul fue el tipo de medio que se utiliz en la prctica

Agar EMB y sangre.

12. Dibuje la tcnica de estra simple.

13. Cul es el objetivo de utilizar la tcnica de estra simple?

14. Dibuje la tcnica de estra cruzada.

15. Cul es el objetivo de utilizar la tcnica de estra cruzada?
Diluir la densidad celular de la muestra para poder aislar al microorganismo de inters y
observar las caractersticas de la morfologa colonial.
Referencias

(1) Hernndez Alina Llop. 2001. Microbiologa y parasitologa mdicas. Editorial

Ciencias Mdicas Ciudad de La Habana.
(2) http://depa.fquim.unam.mx/bacteriologia/curri.htm
(3) http://www.libros.unam.mx/manual-de-bacteriologia-experimental-depto-de-
biologia-9786070235948-libro.html
(4) http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/pdf/Bacteriologia_2016.pdf
(5) http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/
(6) Madigan M. T, Martinko J. M., Dunlap P.V and Clark D.P., Brock Biologa de los
microorganismos, 12 edicin, UK, Pearson Education, 2009.
(7) Broocks G. F., Butel J. S and Morse S. A., Microbiologa mdica de Jawets, Melnick y
adelberg, 19 edicin, Mxico, Editorial El Manual Moderno, 2008.