UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

DEPARTAMENTO ACADMICO DE QUMICA

CURSO: QUMICA ANALTICA TEORA
TRABAJO ENCARGADO FINAL
TTULO: Aplicaciones de las tcnicas instrumentales de
anlisis qumico en alimentos y medio ambiente

INTEGRANTES:
Del Carpio Uzquisa, Melani
Makka Crdova, Minako
Melgar Saboya, Henry
Prez Gonzales, Francisca
Vinces Vergaray, Suali

FACULTAD: Pesquera
HORARIO DE CLASES: Lunes 9-10am, Viernes 8-10am
PROFESOR(A): Juan Carlos Palma
FECHA DEL INFORME: 9 de diciembre del 2016

LA MOLINA LIMA PER

INDICE
1. Introduccin
2. Revisin de literatura
2.1. Tcnicas espectroscpicas
2.1.1.Espectroscopia de absorcin molecular
2.1.2.Espectroscopia de emisin molecular
2.1.3.Espectroscopia de absorcin atmica
2.1.4.Espectroscopia de emisin atmica
2.2. Tcnicas de separacin
2.2.1.Tcnicas cromatografas
2.2.2.Tcnicas electroforesis
2.2.3.Tcnicas elelctroanaliticas
2.2.4.Potenciometria
2.2.5.Conductimetria
2.2.6.Voltamperometria
2.2.7.Electrogravimetria
3. Tcnicas instrumentales
3.1. Mtodos espectroquimicos
3.1.1.Espectroscopia de absorcin molecular UV-Visible
3.1.2.Espectroscopia de infrarroja
3.1.3.Espectroscopia de absorcin atmica
3.2. Mtodos no espectroquimicos
3.2.1.Determinacin de azucares totales en mozto
3.3. Mtodos instrumentales de separacin
3.3.1.Cromatografa de gases
3.3.2.Cromatografa de papel
3.4. Mtodos electroqumicos
3.4.1.Conductimetria
3.4.2.Potenciometria
4. Tcnicas instrumentales usadas en la tesis
4.1. Deteccin por la luz ultravioleta
4.2. Mtodo de presin y fluorescencia
4.3. Espectroscopia de imagen
4.4. Deteccin electromagntica
4.5. Electrocucin
4.6. Irradiacin
4.7. Western blot
4.8. Inmunohistoquimica
4.9. Electroforesis en gel de poliacrilamida
4.10. Medida instrumental de calor
4.11.Evaluacin por microscopia electrnica de barrido
4.12. Emisin de fluorescencia

5. Bibliografa

1 INTRODUCCION
Las tcnicas instrumentales son de gran importancia debido al establecimiento de
diversos mtodos para determinar la composicin qumica de numerosas muestras de
materia. En un principio la mayor parte de los anlisis se ejecutaban separando los
componentes de inters, denominados analitos, los cuales se encontraban en una
muestra mediante precipitacin, extraccin o destilacin, proporcionando informacin
acerca de la cantidad relativa de uno o ms componentes utilizando la gravimetra y
volumetra.

En la actualidad hay una gran cantidad de instrumentos impresionantes e ingeniosos con

los que se puede obtener informacin cualitativa y cuantitativa acerca de la composicin y
estructura de la materia. El uso de la instrumentacin es una parte fascinante del anlisis
qumico que interacciona con todas las reas de la qumica y con muchos otros campos
de la ciencia pura y aplicada como es la Ingeniera Ambiental. Esta disciplina permite la
toma de decisiones relacionadas con la prevencin, control y remediacin de la
contaminacin, a travs de su diagnstico, anlisis y evaluacin, promoviendo el uso
sostenible del territorio y sus recursos.

La instrumentacin empleada en el control de la contaminacin juega un papel demasiado

importante al determinar las concentraciones de elementos y compuestos. En los ltimos
aos se han producido diversos instrumentos precisos y exactos que han incrementado
considerablemente la capacidad del ingeniero para cuantificar y controlar los materiales
contaminantes, cuya complejidad va en aumento. Los mtodos instrumentales de anlisis
tienen aplicacin en el monitoreo de la calidad del aire, contaminacin del suelo, calidad
del agua superficial y subterrnea, como tambin durante el proceso de tratamiento de
agua residual. La concentracin de metales y aniones en el agua se pueden detectar,
empleando tcnicas UV o de absorcin atmica. Es de suma importancia determinar las
concentraciones de estos componentes para tener un conocimiento de su calidad y
comprobar si es que cumple con los lmites mximos permisibles naciones e
internacionales.

2 REVISION LITERARIA
Dentro del campo de la analtica ambiental, hay tres tipos de tcnicas instrumentales muy
utilizadas:

- Las tcnicas ESPECTROSCPICAS.

- Las tcnicas SEPARATIVAS.
- Las tcnicas ELECTROQUMICAS.

2.1. Tcnicas ESPECTROSCPICAS

Estn basadas en las interacciones que se producen entre la materia y la radiacin

electromagntica. Tales interacciones pueden implicar intercambios de energa, como la
absorcin o la emisin de radiacin. A partir del estudio de esa absorcin o de esa
emisin se puede determinar la presencia y la cantidad de un analito en la muestra. Las
radiaciones electromagnticas ms utilizadas con fines analticos son la radiacin visible
(intervalo de longitudes de onda entre los 400 y los 750 nm), la radiacin ultravioleta (UV)
(intervalo de longitudes de onda entre los 400 y los 200 nm), y la radiacin infrarroja (IR)
(intervalo de longitudes de onda entre los 750 y los 50 m).

Todos los tomos o molculas poseen un nmero discreto de niveles de energa. En

general, a temperatura ambiente, la mayora de las especies qumicas se encuentran en
un nivel energtico basal o fundamental. Cuando una onda electromagntica alcanza a un
tomo o a una molcula, si su energa coincide exactamente con la necesaria para pasar
a un nivel energtico superior, la radiacin es absorbida y la especie qumica pasa a un
estado excitado. La excitacin apenas dura unos nanosegundos, al cabo de los cuales la
molcula se relaja devolviendo la energa absorbida. Estas transiciones a estados
excitados pueden ser de dos clases:

- Electrnicas, cuando se promueve el paso de electrones a orbitales de mayor energa.

Se producen como consecuencia de la absorcin de radiacin visible y UV.

- Vibracionales, asociadas a los modos vibracionales de los enlaces moleculares. Se

producen como consecuencia de la absorcin de la radiacin IR.

Los mtodos analticos basados en la absorcin de radiacin electromagntica permiten

determinar la concentracin del analito gracias a la ley de Lambert-Beer, que relaciona
absorbancia con concentracin a travs de la siguiente ecuacin:

A = .b.C

Donde:

A es la absorbancia de la muestra
es la absortividad especfica de la especie que estamos estudiando. Depende tanto de
la naturaleza qumica de la especie qumica como de las condiciones de medida.
b es el espesor de muestra que es atravesado por la radiacin
C es la concentracin del analito en la muestra

La absorbancia se define como log Io/I, siendo Io la intensidad de la luz incidente e I la

intensidad de la luz emergente. Al cociente I/Io tambin se le conoce como
TRASMITANCIA (T), por lo que la absorbancia tambin puede definirse como:

A= -logT
 Las tcnicas espectroscpicas pueden clasificarse en funcin de su aplicacin a tomos
o a molculas, y en funcin de que lo medido sea la energa absorbida o emitida. De este
modo tendremos:

Ilustracin 1 tcnicas espectroscpicas

A continuacin revisaremos sucintamente cada una de ellas.

2.1.1. Espectroscopia de absorcin MOLECULAR

El instrumento empleado en las tcnicas de espectroscopia de absorcin molecular recibe

el nombre genrico de espectrofotmetro. Los elementos bsicos de un espectrofotmetro
son:

La fuente de radiacin
El monocromador
Las celdas o cubetas
Sistema de medida

Estos elementos sufren variaciones segn el tipo de espectrosocopa de que se trate, si

bien la forma en que se ordenan viene a ser siempre la misma.

La fuente de radiacin es el elemento de la radiacin que interaccionar con la muestra.

Las principales fuentes, segn el tipo de espectroscopia, se muestran en el siguiente
cuadro:

Ilustracin 2 tipo de espectroscopia

 El EMISOR DE INCANDESCENCIA DE NERNST consiste en una varilla de unos
pocos centmetros de largo y 1 mm de dimetro, de xido de zirconio. La varilla se
calienta con una resistencia elctrica adyacente hasta alcanzar lo 1800 K,
temperatura a la que emite radiacin infrarroja. Como a esa temperatura el
material de la varilla se hace conductor, se puede mantener la temperatura
haciendo pasar una corriente elctrica. Debido a que el vidrio y la slice son
materiales opacos al IR, no se pueden emplear en la fabricacin de fuentes para
este tipo de espectroscopia.
Las LMPARAS DE INCADESCENCIA son lmparas dotadas de un filamento de
tungsteno capaz de calentarse hasta 3000 C emitiendo entonces un espectro
continuo entre 320 y 750 nm.
Las LMPARAS DE ARCO estn formadas por una ampolla hermtica rellena de
un gas, generalmente Deuterio, y dotadas de dos electrodos conectados a una
fuente de energa. Cuando se produce una descarga elctrica, se excitan las
molculas del gas, y cuando vuelven a su estado fundamental emiten luz
ultravioleta en un espectro continuo de 190 a 320 nm.

El monocromador es elemento que selecciona una longitud de onda determinada de entre

las muchas que parten de la fuente. Para ello est dotado de una serie de lentes, prismas,
espejos, y rendijas.

Las celdas o cubetas son los dispositivos en los que se coloca la muestra a analizar, y
que sern atravesados por la radiacin, por lo que deben disponerse perpendicularmente
al paso de sta. Segn la clase de radiacin se deben usar cubetas de distinta naturaleza:

Ilustracin 3 segun la radiacion

El sistema de medida es el
encargado de detectar la
radiacin que atraviesa la
muestra y transformarla en
una corriente elctrica que se
mide una vez amplificada
en el circuito electrnico de
lectura. Para tal fin suelen emplearse fototubos, y fotodiodos. Existen dos grandes
categoras de espectrofotmetros:

Espectrofotmetros de haz sencillo

Espectrofotmetros de doble haz.

2.1.2. Espectroscopia de emisin MOLECULAR

Determinadas molculas pueden absorber radiacin electromagntica excitndose, para

luego relajarse emitiendo esa energa en forma de fotones. Este fenmeno tambin se
conoce como FLUORESCENCIA, y la tcnica que permite determinar la presencia de un
analito fluorescente, ESPECTROSOCOPA DE FLUORESCENCIA. Las principales
caractersticas de la espectroscopia de fluorescencia son:

- Una sensibilidad superior a los mtodos de absorcin.

- Un mayor intervalo de respuesta lineal que el de los mtodos de absorcin.
- Una aplicacin restringida a un menor nmero de especies moleculares.
- Un equipamiento ms costoso que el de la espectroscopia de absorcin.

No todas las molculas fluorescen, porque pueden presentar otras vas de relajacin
alternativas, por ejemplo las vibracionales. El que una molcula sea o no capaz de
fluorescer depender en gran medida de su estructura. As, la mayora de los compuestos
con anillos aromticos fluorescen, y dentro de stos lo hacen en mayor cuanta los que
presentan estructuras rgidas.

El equipo de medida de fluorescencia, o fluormetro consta de los siguientes

componentes:

Una fuente de luz,

Un selector de longitud de onda de entrada
Una celda, en la que se coloca la muestra Un selector de longitud de onda de salida
Un detector
Un registrador
Dentro del campo de la qumica ambiental, la principal aplicacin de las tcnicas de
fluorescencia la encontramos en los detectores de equipos de cromatografa lquida de
alta resolucin (HPLC) empleados en la determinacin de Hidrocarburos Policclicos
Aromticos. (GARCA, 2007)

2.1.3. Espectroscopia de absorcin ATMICA

Ilustracin 4 absorcin atmica

Sus principales caractersticas son:

- Se aplica a tomos aislados.

- Slo se puede llevar a cabo dentro de un medio gaseoso.
- Permite la determinacin cuantitativa y cualitativa de 70 elementos qumicos.
- Es un mtodo de determinacin unielemental.
- En general son rpidos, selectivos y sensibles.

Los componentes de un equipo de absorcin atmica son:

El nebulizador.
El atomizador.
La fuente de radiacin.
El monocromador.
El detector.

El nebulizador es un dispositivo que convierte la muestra lquida en un aerosol que pasa

luego al atomizador. Los dos principales tipos de nebulizadores son los nebulizadores
neumticos y los nebulizadores ultrasnicos.
El atomizador es el componente encargado de vaporizar la muestra nebulizada.
Bsicamente se emplean dos tipos: los atomizadores de llama, y los atomizadores
electrotrmicos.

El atomizador de llama consiste en un quemador alimentado por una mezcla de

combustible y oxidante, capaz de alcanzar temperaturas de entre 1700 y 3100 C.

Ilustracin 5

La fuente de radiacin proporciona la radiacin que atraviesa la muestra atomizada. Se

suelen empelar dos tipos de fuentes: las lmparas de ctodo hueco, y las lmparas de
descarga sin electrodo.

El monocromador consiste en un dispositivo que selecciona la longitud de onda del

elemento que queremos determinar.

El detector es el dispositivo que recoge la radiacin seleccionada por el monocromador y

la compara con la enviada por la fuente, permitiendo la deteccin y cuantificacin del
elemento analizado. (GARCA, 2007)

2.1.4. Espectroscopia de emisin ATMICA.

Las principales caractersticas de esta tcnica son:

- Est basada en que cada elemento presente en una muestra va a emitir, una vez
excitado, radiacin a una longitud de onda especfica.

- El atomizador sustituye a la fuente de radiacin.

- Se trata de una tcnica multielemental, es decir, puede analizar simultneamente

muchos elementos.

- Puede presentar problemas de interferencia espectral: existen elementos que emiten a

longitudes de onda muy prximas (por ejemplo, el Calcio a 423 nm y el Cromo a 425 nm).

- Resulta ms rpida y menos costosa que la espectroscopia de absorcin atmica.

- Su sensibilidad y selectividad se pueden ver enormemente mejoradas si se acopla a un
espectrmetro de masas.

El componente ms relevante de un equipo de emisin atmica es el atomizador. Como

dispositivos de atomizacin pueden utilizarse una llama, un arco elctrico, o ms
habitualmente, un plasma de induccin.

Un plasma es un gas ionizado. Cuando se induce en un flujo de un gas, generalmente

argn, recibe el nombre de induced coupled plasma o ICP. Las antorchas de ICP
consisten en tubos de cuarzo por los que circula una corriente de argn. El gas se ioniza
por efecto de una corriente elctrica, y los iones generados son obligados a circular por un
espacio anular cerrado dentro de un campo magntico de radiofrecuencia. La resistencia
a su circulacin provoca un calentamiento del gas que da lugar a una nueva ionizacin,
pasando as a estado de plasma, alcanzndose temperaturas de hasta K. La muestra es
introducida dentro del plasma por una corriente de argn, producindose en su seno la
atomizacin y consecuente excitacin. (GARCA, 2007)

2.2. Tcnicas de SEPARACIN

2.2.1. Tcnicas CROMATOGRFICAS

Se trata de un conjunto de tcnicas que permiten la separacin de los componentes

presentes en una mezcla en base a su diferente movilidad en un medio poroso cuando
son arrastrados por un fluido. El medio poroso recibe el nombre de fase estacionara, y el
fluido (gas o lquido) el de fase mvil. En lneas generales, en todo sistema cromatogrfico
se distinguen los siguientes componentes:

- La fase estacionaria; se trata del material inmvil sobre el que se produce la separacin
de los analitos.

- El soporte, que es el material sobre el que descansa la fase estacionaria.

- La fase mvil, que es el fluido que arrastra a la muestra a travs de la fase estacionaria.

- Detector, aparato que registra una propiedad fsico-qumica del analito que va saliendo
(eluyendo) de la fase estacionaria.

- Cromatograma, representacin de una propiedad fsico-qumica del eluido en funcin del

tiempo o del volumen de elusin.

Las caractersticas de cada uno de estos componentes varan segn el tipo de tcnica.
Existe un gran nmero de tcnicas cromatogrficas, de entre ellas las ms utilizadas en
qumica del medio ambiente son:

Cromatografa inica.
 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).

Cromatografa de gases (GC).

2.2.2. Tcnica ELECTROFORESIS

La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud depende del
pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven
sometidas a un campo elctrico.

Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas en

disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica
fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede realizar con fines preparativos.

Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una velocidad
constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con la
resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesta por el medio en el que se
desplaza.

Fuerza del campo elctrico = Fuerza de friccin

qEqE == fvfv
qq = carga (C) ff = coeficiente de friccin (CVs / m2 = kg/s)
EE = intensidad del campo (V/m = N/C) vv = velocidad de la molcula (m/s)

El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de

cada molcula, siendo stas esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las
molculas grandes y de forma irregular poseen un mayor coeficiente de friccin que las
pequeas y compactas.

La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica,

vE==qf=ZefvE==qf=Zef

(ZZ = nmero entero; ee = carga del electrn)

En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada

molcula definir su separacin en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van
separando progresivamente unas de otras. (Sanchez, 2014)

Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por iones, que son
atrados y as recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de stos
en el campo. Todo ello hace que el tratamiento terico cuantitativo de la electroforesis sea
muy difcil y que esta tcnica resulte poco til para obtener informacin precisa sobre la
estructura de las molculas. Sin embargo, es enormemente til como tcnica analtica y
preparativa.

Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

1. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la

disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o frontera
con el disolvente.

2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran
a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que da soporte a ste. En
este caso no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de la tcnica es
separar los componentes de la muestra.
 3. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso (para ms informacin, vanse las pp.250-2
de Freifelder, 1999).

2.2.3. Tcnicas ELECTROANALTICAS

Estn basadas en la interaccin entre un campo el ectromagntico y la disolucin del

analto que se quiere determinar. Como seal analtica pueden utilizar la conductividad de
la disolucin, la diferencia de potencial entre dos puntos de la misma y la corriente o carga
que circula en ella.

Los procesos electroqumicos en que se basna tienen lugar en las llamadas celdas
electroqumicos.

Estos dispositivos estn formados por:

Una cuba electroltica, formada de material inerte y que va a contener la disolucin objeto
de anlisis.
Dos o tres conductores elctricos, los electrodos.
Un circuito externo responsable de generar el campo elctrico entre los electrodos
Las tcnicas electroanalticas pueden clasificarse en dos grupos:
* Tcnicas interfaciales, basadas en los fenmenos que ocurren en las interfases
electrodo disolucin.
Las ms habituales en el campo medioambiental son las potenciometras.
* Tcnicas no interfaciales, basadas en fenmenos que ocurren en el seno de la
disolucin. La ms habitual en el estudio de muestras ambientales es la
conductimetra(GARCA, 2007)

2.2.4. Potenciometria

Los mtodos potenciomtricos estn basados en la medida de la diferencia de potencial

entre dos electrodos introducidos en una solucin. Los electrodos y la solucin
constituyen lo que se conoce con el nombre de celda electroqumica. El potencial entre
ambos electrodos es normalmente medido con la ayuda de un equipo conocido como
potencimetro. Uno de los electrodos involucrado en el proceso se denomina indicador, el
cual tiene una respuesta respecto de una especie particular presente en el seno de la
solucin y cuya actividad se mide durante el experimento y el otro recibe el nombre de
referencia, cuya caracterstica ms importante es que el potencial de semicelda de este
electrodo permanece siempre constante.

2.2.5. Conductimetria
La determinacin conductimtrica es una tcnica ampliamente difundida para las
determinaciones de control de calidad. Estas determinaciones sencillas, econmicas y
tienen una serie de aplicaciones. En primer lugar est el control de la calidad del agua, ya
sea potable o de uso industrial, seguido por la determinacin de la conductividad de las
soluciones en aplicaciones industriales tales como en las electrlisis; ya que el consumo
de energa elctrica durante la electrlisis depende en gran medida de ella. Asimismo, las
determinaciones conductimtricas se usan ampliamente en los laboratorios de anlisis;
por ejemplo, para determinar el contenido de salino de soluciones durante la evaporacin
de agua en calderas, la determinacin de las solubilidades de electrlitos y sus
concentraciones, y las constantes de los cidos y bases. Algunas determinaciones son del
tipo indirecto, tales como la determinacin de CO 2 en agua expuesta a atmsferas
cargadas del gas y la determinacin de SO 2 atmosfrico absorbido en soluciones de
perxido de hidrgeno. (Pardo, 2016)

2.2.6 Voltamperometria

La voltamperometra es un mtodo mediante el cual se puede obtener informacin sobre

un determinado analito, midiendo las intensidades de corriente generadas en funcin de la
diferencia de potencial aplicado, en ciertas condiciones, que favorecen la polarizacin en
el electrodo de trabajo. Muchas veces, los electrodos utilizados en voltamperometra son
microelectrodos, de modo de aumentar la polarizacin gracias a su pequea superficie.

2.2.7 Electrogravimetra

En la electrogravimetria se produce electrolticamente el deposito de un metal o un

compuesto y a continuacin este se pesa. La electrolisis tiene dos aspectos: el aspecto
reversible e irreversible. Para comprender la electrolisis es preciso considerar primero las
clulas voltaicas reversibles, pero luego hay que dar un paso mas y estudiar los factores
que determinan la velocidad del proceso que tiene lugar el electrodo. (Walton)

3 TCNICAS INSTRUMENTALES
3.1. MTODOS ESPECTROQUMICOS
3.1.1. Espectroscopia de absorcin molecular UV-Visible
 La espectroscopa UV-visible puede utilizarse para determinar muchas
caractersticas fsico-qumicas de los compuestos y, por tanto, puede proporcionar
informacin como la identidad.
A continuacin se presentan un ejemplo.
Temperatura de fusin de las protenas y los cidos nucleicos
Los espectros de absorbancia de las protenas resultan principalmente de
la presencia de los aminocidos aromticos triptfano, tirosina y
fenilalanina. Una protena a temperatura ambiente tiene una estructura o
conformacin terciaria especfica que crea un entorno electrnico
determinado para los aminocidos aromticos. Si se calienta la protena, a
una cierta temperatura, se desdobla o funde y pierde su estructura. En este
proceso, el entorno electrnico de los aminocidos aromticos cambia, lo
que resulta en cambios o variaciones espectrales. Puede utilizarse anlisis
multicomponente para determinar la cantidad de cada aminocido
aromtico que est presente en una protena intacta.
El cido desoxirribonuclico (DNA) en su estado nativo, consta de dos
cadenas de molculas de desoxirribosa enlazadas helicoidalmente. Las
cadenas estn unidas por enlaces de hidrgeno entre las bases purina y
pirimidina (la adenina se une a la timina (A-T) y la guanina a la citosina (G-
C)). Estas bases son las principales responsables de la 15 Principios y
aplicaciones de espectroscopa UV-visible absorbancia UV del DNA, con un
mximo a 260 nm
Como en un sistema multicomponente, la absorcin observada de una
molcula de DNA debe ser igual a la suma de las absorbancias
individuales: Sin embargo, la absorbancia observada es siempre
significativamente menor que la esperada debido a que el enlace de
hidrgeno entre las bases cambia su entorno electrnico. Cuando se
calienta una molcula, el enlace de hidrgeno se rompe, la doble hlice se
desenrosca y la absorbancia aumenta, de manera que se acerca a la
esperada de la suma de todas las bases. Este proceso de
desnaturalizacin tambin se conoce como fusin.
En un experimento de fusin de DNA, se aumenta paso a paso la
temperatura de una disolucin de DNA y se mide la absorbancia a 260 nm
a cada temperatura, representndose como una curva de fusin. El punto
medio del rango de temperatura sobre el que ocurre la fusin, es el valor
Tm. El Tm de una muestra particular de DNA depende principalmente del
porcentaje de parejas G-C de la muestra, cada una de las cuales contiene
tres enlaces de hidrgeno (en contraste, cada pareja A-T contiene dos
enlaces de hidrgeno). Cuanto mayor es el porcentaje de parejas G-C en la
muestra, mayor es el Tm observado.

3.1.2. Espectroscopia infrarroja.

Medida del grado de insaturacin de aceites y grasas comestibles por
espectroscopia infrarroja
Se han elegido muestras de aceites y grasas comestibles frecuentemente
utilizadas, de forma que cubran un rango amplio de valores de insaturacin o
ndice de yodo. Se analizan muestras comerciales de aceites de oliva, almendra,
 maz, soja, girasol y pepita de uva, asi como manteca de cacao y de cerdo. Estas
dos ltimas se emplean desecadas a 40 C.
Se describe un mtodo de espectroscopia IR para determinar de forma rpida el
grado de insaturacin de grasas y aceites comestibles, basado en la medida de la
banda correspondiente al enlace olefnico a 3007 cm. Por medio del programa de
anlisis cuantitativo SNGLE se calcula la absorbancia neta, el rea, la primera
derivada y la segunda derivada de la banda a 3007 cm-^ y se estudia la relacin
de estos parmetros con el ndice de yodo. La mejor correlacin y el menor ndice
de error se obtiene con las medidas de la absorbancia neta (r=0,9992; ind.
error=1,75%) y el rea (r=0,9992: ind. error=1,77%) de dicha banda.
3.1.3. Espectroscopia de absorcin atmica.
Cuantificacin de los metales pesados
Los laboratorios de anlisis pertenecientes al SINA (Sistema Nacional Ambiental)
deben estar normalizados, intercalibrados y acreditados para lo cual deben contar
con un sistema de gestin de calidad, que validar su metodologa y confiabilidad
mediante sistemas de referencia establecidos por el instituto de Hidrologa,
Meteorologa y Estudios Ambientales (IDEAM).
Por tal razn realizaron un informe copleto que tiene el fin de presentar los datos
de la validacin del mtodo de llama por la tcnica de E.A.A. para la cuantificacin
de los metales pesados Hierro (Fe), Manganeso (Mn), Sodio (Na), Potasio (K),
Calcio (Ca) y Magnesio (Mg), que se realizan en el L.A.A. de la CARDER, para la
matriz agua.

Para la determinacin de hierro por el mtodo de llama por absorcin atmica se

adoptaron parmetros instrumentales, los cuales ayudan a eliminar posibles
interferencias para una normal medicin del analito de inters.
Longitud de Onda (): 248.3 nm.
Ancho de Banda: 0.2 nm.
Corriente de lmpara (CH): 75% uso norm
Correccin de Fondo: Lmpara de deuterio (D2)
Tipo de llama: Aire/Acetileno.
Intervalo flujo de combustible: 0.8 a 1.0 L/min. 6.6.3.
Para la Validacin de Potasio (K).
Longitud de Onda (): 766.5 nm.
Ancho de Banda: 0.5 nm.
Corriente de lmpara (CH): 100% uso normal.
Correccin de Fondo: Ninguno.
Tipo de llama: Aire/Acetileno.
Intervalo flujo de combustible: 1.1 a 1.3 L/min.

Validacin de Manganeso (Mn).
Longitud de Onda (): 279.5 nm.
Ancho de Banda: 0.2 nm.
Corriente de lmpara (CH): 75% uso normal.
Correccin de Fondo: Lmpara de Deuterio (D2).
Tipo de llama: Aire/Acetileno.
 Intervalo flujo de combustible: 0.9 a 1.2 L/min.

Para la Validacin de Magnesio (Mg).

Longitud de Onda (): 285.2 nm.
Ancho de Banda: 0.5 nm.
Corriente de lmpara (CH): 75% uso normal.
Correccin de Fondo: Lmpara de Deuterio (D2).
Tipo de llama: Aire/Acetileno.
Intervalo flujo de combustible: 0.9 a 1.2 L/min.

Para la Validacin de Calcio (Ca).

Longitud de Onda (): 422.7 nm.
Ancho de Banda: 0.5 nm.
Corriente de lmpara (CH): 100% uso normal.
Correccin de Fondo: Ninguno
Tipo de llama recomendada: xido Nitroso/Acetileno*.
Intervalo flujo de combustible: 4.0 a 4.4 L/min.

3.1.5. Espectrometra de masas (MS)

Espectrometra de masas como una tcnica de eleccin para la determinacin de

protenas que pueden utilizarse como biomarcadores
El descubrimiento, validacin y
determinacin de
biomarcadores constituye un
objetivo de gran proyeccin
debido al potencial que estn
demostrando para el
diagnstico, confirmacin y
prevencin de numerosas
patologas, pero es necesario
disponer de
tcnicas analticas que tengan
(Laura Patricia Olgun Prez,
2004): Gomez, Espectrometra
de masas y anlisis de biomarcadores.
las prestaciones adecuadas para obtener la informacin necesaria. En este
sentido, la espectrometra de masas se revela como una de las ms tiles. Los
parmetros obtenidos con la espectrometra de masas permiten correlacionarlos
con aspectos biolgicos relacionados con ciertas enfermedades, patologas
metablicas o con la identificacin y estructura de protenas y pptidos.

3.2. MTODOS NO ESPECTROQUMICOS

3.2.1. Refractometra

DETERMINACIN DE AZUCARES TOTALES EN MOSTO

 La refractometra es un mtodo indirecto que determina la concentracin de azcar de
un mosto mediante la medida del ndice de refraccin (n).

La refraccin se basa en la modificacin de la trayectoria de un rayo luminoso al

atravesar una superficie que limita dos medios diferentes. Se puede demostrar que el
rayo de luz incidente AO, la normal a la superficie y el rayo de luz refractado OB estn
en el mismo plano y que la relacin entre el seno del ngulo de incidencia i1 y el del
ngulo de refraccin i2 siguen la ley de SNELLIUS. El conocimiento de los azucares
totales de un mosto nos permite evaluar el grado alcohlico probable del mismo (1%
vol = 17,5 gr/l azucares).

Figura 2. Esquema del refractmetro de ABB

Figura3. Campo de visin del ocular de un refractmetro con escalas en Brix.

3.3. MTODOS INSTRUMENTALES DE SEPARACIN

3.3.1. Cromatografa de gases.
Anlisis de aceites esenciales
La cromatografa de gases es ampliamente utilizada en el anlisis de aceites
esenciales para detectar adicin de compuestos clandestinos como antioxidantes
as como componentes utilizados como diluyentes. Un ejemplo de esto puede ser
el aceite de limn al cual se adulteraba por la adicin de turpentina. De aqu que la
cromatografa de gases es usada no solo para establecer cuales son los
materiales normales que contiene cada muestra, sino tambin aquellos
componentes cuya concentracin aumenta el abuso del aceite (ejemplo: el p-
cymeno). La complejidad el aceite es tan alta que no se podra analizar su
composicin por una simple columna cromatogrfica, por lo que se usan columnas
especializadas de polimetilsiloxano con diferentes fases estacionarias, para
producir una mejor separacin de los compuestos as como un tiempo de vida ms
largo.

Deteccion de contaminantes dentro de la comida empaquetada

Se pueden detectar contaminantes dentro de la comida empaquetada por
cromatografa de gases. Estos contaminantes estn relacionados con trazas de
solventes residuales usados en las pelculas plastificadas del empaquetamiento
(por ejemplo, el 2-etilhexanol). El dibromo de etileno (EDB) ha sido utilizado
ampliamente para inhibir la infestacin de insectos en comida empaquetada, pero
se demostr que este compuesto es carcinognico en altos niveles. Debido a la
gran complejidad de las muestras de comida, la deteccin de estos EDBs puede
ser un problema, por lo que se han optimizado fases estacionarias que permiten
un aumento en la retencin relativa y velocidad parcial de la volatilidad de los
compuestos, dando prioridad a la salida de los contaminantes.

Aplicaciones ambientales
Los anlisis ambientales se enfocan a la deteccin y/o cuantificacin de muchas
substancias diferentes en una diversidad de matrices. Estos anlisis pueden ir
desde qumicos de pesticidas y herbicidas hasta hidrocarburos aromticos
polinucleares (PAHs), compuestos clorados mezclados en el aire, agua y tierra. En
muchos casos el problema inicial es la obtencin y preparacin de la muestra. Las
muestras de agua son muy variables, desde agua potable hasta aguas
industriales. En muchos casos las agencias de regulacin de calidad tienen
procedimientos estndar especficos para el anlisis de materiales dados en una
matriz dada. Con algunas excepciones los mtodos de anlisis oficiales son
menos sensitivos y consumen mayor tiempo que los mtodos que se desarrollaron
en los comienzos de la cromatografa. En Estados Unidos, la agencia de
proteccin ambiental (EPA) especific procedimientos para el monitoreo de
efluentes industriales en 1977. Los mtodos 603 hasta el 613 separan en 13
clases los 113 contaminantes orgnicos que son monitoreados por cromatografa
de gases.

Otras aplicaciones
Tambin se hacen anlisis cromatogrficos para la determinacin de metanos
trihalogenados, los cuales daan la salud por la desinfeccin del agua de piscinas
 con cloro. Se hacen anlisis de componentes de la acrilamida. Se determinan los
residuos de ditiocarbamato en los alimentos dietticos. La determinacin de
aceites minerales en el agua. Anlisis de herbicidas en campos de golf. Para
determinar los grados de alcohol en bebidas como la cerveza. Para la
determinacin de componentes aromticos en alimentos y bebidas.

3.3.2. Cromatografa de papel

Determinacin del acido mlico
Este mtodo consiste en colocar una pequea cantidad de vino en el extremo de
un papel de filtro; ste se introduce en una solucin de desarrollo que consiste en
algn disolvente orgnico saturado con una solucin acuosa. La porcin acuosa
del sistema disolvente forma una fase inmvil a medida que es absorbida por el
papel, la parte orgnica sirve para extraer el cido de la fase acuosa. Para evitar
que los disolventes se evaporen (mal desarrollo del
cromatograma) las tiras de papel deben estar en un recipiente cerrado saturado
con el vapor del disolvente. El tamao y la intensidad de las manchas se utilizan
para la valoracin cuantitativa de los solutos.

Figura 4. Representacin del Cromatograma.

3.4 MTODOS ELCTROQUMICOS
3.4.1.Conductimetra

Las aguas residuales de las industrias de tratamiento de leche presentan las siguientes
caractersticas generales:

-Marcado carcter orgnico (elevada DBO5 y DQO), debido a la presencia de

componentes de la leche, que tiene una DBO5 de 110.000 mg/l y una DQO de 210.000
mg/l.

-Alta biodegradabilidad.

- Presencia de aceites y grasas.

-Altas concentraciones de fsforo y nitratos, principalmente debidos a los productos de

limpieza y desinfeccin.

-Presencia de slidos en suspensin, principalmente en elaboracin de quesos

- Conductividad elevada (especialmente en las empresas productoras de queso debido al

vertido de cloruro sdico procedente del salado del queso)

-Valores puntuales de pH extremos, debidos a las operaciones de limpieza. Uso de cidos

y bases en las limpiezas CIP.

Las aguas residuales generadas en la fabricacin de quesos es posible que contengan

cantidades apreciables de lactosuero, sobre todo salino, lo que, adems de incrementar
notablemente la carga contaminante, supone la prdida de un subproducto de alto valor
econmico. Es recomendable, por tanto, que se evite la incorporacin del lactosuero al
agua residualy que se destine a la obtencin de sustancias aprovechables.

Por otro lado, las aguas residuales generadas en la fabricacin de helados presentan una
baja carga contaminante, aunque la presencia de nitrgeno amoniacal en cantidades
elevadas hace aconsejable su tratamiento biolgico con nitrificacin-desnitrificacin. En la
siguiente tabla, elaborada por la Federacin nacional de industrias lcteas, se resumen
las caractersticas de los vertidos en funcin de su origen.
( Contaminacin de las aguas, 2008)

Figura 5. Cuadro del origen del vertido ( Contaminacin de las aguas, 2008).

Figura 6. Cuadro de parmetros ( Contaminacin de las aguas, 2008).

3.4.2. Potenciometra
La determinacin del pH en el mosto y el vino es una medida complementaria de la acidez
total porque nos permite medir la fuerza de los cidos que contienen. Por definicin el pH
es el logaritmo negativo de la concentracin de iones hidrgeno:

pH = log [H+]

La estabilidad de un vino, la fermentacin malolctica, el sabor cido, el color, el potencial

redox y la relacin de dixido de azufre libre y total estn estrechamente relacionados con
el pH del vino.

DETERMINACIN DE LA ACIDEZ TOTAL EN VINOS

Con el mtodo volumtrico del patrn coloracin consiste que la acidez total es la suma
de todas las acideces valorables, cuando se lleva al vino a pH 7 por adicin de una
solucin alcalina valorada. Se utiliza el azul de bromotimol como indicador para alcanzar
el punto de equilibrio.

En el mtodo potenciomtrico es como en el caso anterior se basa en la valoracin

mediante una solucin alcalina valorada hasta llevar al vino a pH 7. El punto de equilibrio
se regula mediante un electrodo de pH. El cido carbnico y el anhdrido sulfuroso libre y
combinado, no estn comprendidos en la acidez total.

4. TECNICAS INSTRUMENTALES USASDAS EN LA TESIS

Fabiola Otilia Olivares Ponce

Efecto sobre los alrgenos de las larvas L3 de anisakis al aplicar tratamientos

selectivos en pescado parasitado

4.1. Deteccin por luz ultravioleta

Este mtodo es muy similar al anterior, salvo que en lugar de utilizar luz blanca se utiliza
luz ultravioleta a una longitud de onda de 366 nm (Pippy, 1970). El procedimiento consiste
en hacer incidir luz ultravioleta a unos 10 cm sobre la superficie del pescado
examinndolo por ambos lados. Se pueden distinguir larvas de Anisakis y
Pseudoterranova que se muestran de un color fluorescente azulado, y las Contracaecum
que aparecen en amarillo. Generalmente no es un mtodo destructivo, es relativamente
rpido y adecuado para visualizar y extraer nematodos del pescado con carne
pigmentada. Sin embargo, para una mayor eficacia requiere que se congele y descongele
la muestra. Cuando las larvas se someten a un proceso de congelacin, la emisin de
fluorescencia es intensa mientras que en larvas vivas por lo general no hay emisin de
fluorescencia a no ser que hayan sido sometidas a tratamientos posteriores (Tejada et al.,
2006b). La muerte de la larva no coincide en muchos casos con la emisin de
fluorescencia por lo que se considera que es un mtodo inadecuado para discriminar
entre larvas vivas y muertas (Rodrguez-Mahillo et al., 2008;Solas et al., 2008; Vidaek et
al., 2009a; 2009b; 2010).

4.2. Mtodo de presin y fluorescencia

Este mtodo elimina el problema del grosor de las piezas cuando son evaluadas por
emisin de fluorescencia. Los filetes son sometidos a una presin previa con el fin de
conseguir un espesor de 1-2 mm, para lo cual los filetes dorsales y ventrales sin piel se
introducen individualmente en bolsas de plstico transparente, se someten a presin con
prensa hidrulica, se congelan a -18C durante un periodo igual o superior a 12 h y
posteriormente se someten a inspeccin visual bajo una fuente de luz UV a 366 nm (Karl
y Leinemann, 1993).El mtodo adems de permitir la cuantificacin de las larvas, permite
conocer su ubicacin en el filete. Sin embargo, se trata de un mtodo destructivo y al
realizarse en productos congelados no discrimina entre larvas vivas y muertas.

4.3. Espectroscopia de imagen

Se trata de un mtodo de deteccin instrumental no destructivo, basado en el espectro de

imagen del nematodo y la cuantificacin del contraste. El espectro de imagen vara en
funcin de la longitud de onda aplicada y se correlaciona con las propiedades de
absorcin de la larva. Al respecto, se han identificado componentes de la larva que
absorben la luz en la regin de 400 a 600 nm (Stormo et al., 2004).

Se utiliza de preferencia en filetes sin piel y detecta las larvas hasta una profundidadde 8-
9 mm (Heia et al., 2007). La precisin del mtodo depende del nivel de contraste, no
necesita contacto directo con el producto y se puede aplicar para trabajar en lneas de
produccin en tiempo real lo que permite tomar decisiones sobre el procesado posterior
en funcin de la zona infestada.

4.4. Deteccin electromagntica

El mtodo se basa en la diferencia de la conductividad entre el msculo del pescado y las

larvas. Para la deteccin se utiliza un magnetmetro SQUID (Superconducting Quantum
Interference Device magnetometer), que registra de forma automatizada las
perturbaciones en el campo magntico y transfiere una seal que luego es amplificada y
almacenada en formato digital (Choudhury et al., 2002). Con este mtodo se puede
determinar la orientacin y posicin de las larvas o la presencia de espinas. A partir de
este mtodo se pretende construir un sistema comercial automatizado que sustituya la
transiluminacin (Choudhury et al., 2002).

4.5. Electrocucin

Se trata de un mtodo patentado (Bereciartua, 2005) que consiste en someter a los

pescados recin capturados a una corriente elctrica por inmersin en recipientes con una
disolucin de electrolitos donde el nodo y el ctodo proporcionan una intensidad que
puede variar en funcin de tamao y caractersticas del pescado y parsito a eliminar. Se
aplica de forma individualizada en especies de gran tamao o en forma masiva en
especies pequeas. Los autores de la patente consideran que se inactivan las larvas sin
que se produzcan cambios sensoriales en el pescado.

4.6. Irradiacin

De acuerdo a la EFSA (2010) los tratamientos de irradiacin no son considerados como

adecuados debido a que las dosis eficaces para producir la muerte de las larvas
(FAO/IAEA, 1992; Seo et al., 2006) son muy superiores a las recomendadas para aplicar
a pescado y mariscos (3 kGy).

4.7. Western-blot

La inmunodeteccin por Western-blot es una tcnica mediante la cual se separan

protenas por electroforesis en gel de poliacrilamida y despus se transfieren a una
membrana de nitrocelulosa o similar, donde son detectadas con anticuerpos que
reconocen los antgenos que hay en ellas. La inmunodeteccin se puede realizar
mediante IgE, anticuerpos monoclonales o policlonales. La ventaja de los anticuerpos
policlonales es que poseen la capacidad de reconocer varios eptopos, aumentando el
umbral de deteccin (Poms et al., 2004).

4.8. Inmunohistoqumica

Se trata de un procedimiento que se encuentra dentro del grupo de tcnicas de

inmunodeteccin, que por medio de una reaccin antgeno-anticuerpo puede ser
visualizada mediante microscopia ptica o electrnica. Esta reaccin, que permite la
identificacin de un constituyente del tejido in situ, es visible slo si el anticuerpo est
marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o un coloide de un metal pesado,
como por ejemplo el oro (Hodges et al., 1984; Duerr, 2006). A nivel de microscopia
electrnica, el oro coloidal debido a su alta densidad, es el marcador que consigue una
mejor resolucin para la localizacin de los antgenos y es prcticamente imposible
confundirlo con cualquier estructura biolgica (Roth, 1983; Rojas et al., 1994; Oliver,
2010). La inmunohistoqumica con marcaje de oro coloidal se realiza en secciones ultra
finas de tejido fijado y montadas en rejillas de oro o nquel para su observacin por
microscopia electrnica. Las partculas de oro pueden ser conjugadas con anticuerpos
primarios para la identificacin de un slo paso de antgenos (marcaje directo) pero
generalmente se utilizan mtodos de deteccin indirectos, donde adems del anticuerpo
primario se incluyen otros anticuerpos (anticuerpos secundarios) o ligandos (protena A),
siendo stos los portadores de la partcula de oro coloidal (Molday y Maher 1980). Los
conjugados del anticuerpo son absorbidos en gammaglobulinas, de determinadas
especies animales, mezclada con un dializado de etilenglicol (Duerr, 2006).

4.9. Electroforesis en gel de poliacrilamida

Para el estudio electrofortico (SDS-PAGE) se sigui la tcnica de Hames (1985). Para

poder comparar las bandas obtenidas, en todas las muestras se ajust laconcentracin de
protena a 5 mg mL-1, con excepcin de los sobrenadantes obtenidosen la extraccin de
actomiosina. La electroforesis se llev a cabo empleando un equipo PhastSystem
horizontal (Pharmacia Biotecnology AB, Uppsala, Suecia) usando geles de poliacrilamida
de 12.5%. Las muestras tratadas con SDS (25 g L-1 SDS y 0,02 g L-1 de azul
debromofenol) o SDS + -mercaptoetanol (-ME, 50 mL L-1) fueron calentadas durante 5
minutos en un bao de agua a 100C. Las condiciones de electroforesis fueron de 4 mA
por gel, 250 V y 3 W. Las bandas de protenas se tieron con azul brillante de Coomassie
(Pharmacia LKB Biotecnology AB). Las masas moleculares de las protenas en las
muestras se calcularon mediante la comparacin de su movilidad con la de un estndar
comercial (Full Range Rainbow Recombinant Protein Molecular Weigth Marker, Amersham
GE Heatlhcare UK Limited, Reino Unido) compuesto por miosina (220 kDa), fosforilasa b
(97 kDa), seroalbmina bovina (66 kDa),ovoalbmina (45 kDa), anhidrasa carbnica (30
kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y lisozima (14,3 kDa).

5.10. Medida instrumental de color

La determinacin instrumental de color se determin usando una escala CIELab (Young

and Whitte, 1985; Park, 1995) con un colormetro (Chroma Meter, MINOLTA). Se
determinaron la luminosidad (L*), valores de a*: la tendencia al rojo(+a*) o verde (-a*) y
valores de b*: la tendencia a amarillo (+b*) o azul (-b*). Todas las determinaciones se
llevaron al menos por triplicado.

4.11. Evaluacin por microscopa electrnica de barrido

Para microscopa electrnica de barrido (Scanning Electron Microscopy: SEM), se
cortaron pequeos bloques de tejido (1,5-2,0 mm de lado) de todas las muestras
infestadas y de las muestras sometidas a los distintos tratamientos (msculo,surimi o
geles). Las muestras fueron fijadas inmediatamente con una mezcla (1:1, v:v) de
paraformaldehdo (40 g L1) y glutaraldehdo (2 mL L1) en tampnfosfato 0,1 M (pH 7,2)
y se almacenaron en refrigeracin (51C) hasta su envo( 2 das) al ICTS Centro
Nacional de Microscopa Electrnica (CNME), UniversidadComplutense de Madrid (UCM).
El estudio se realiz por los integrantes del Subproyecto1 a partir de muestras preparadas
en nuestro Departamento (ICTAN)siguiendo el protocolo descrito.Para su observacin por
SEM, las muestras fueron fijadas con OsO4, lavadas,deshidratadas en concentraciones
crecientes de acetona, secadas mediante puntocrtico, recubiertas por pulverizacin
catdica con oro-paladio en una metalizadora (SCD 040, OC Oerlikon Balzers Ltd.,
Principality Liechtenstein) y analizadas porSEM (Jeol JSM 6400, Akishima, Tokio, Japn) a
20 kV. Se tomaron un gran nmerode micrografas con el fin de seleccionar las ms
representativas.

4.12. Emisin de fluorescencia

Para contabilizar las larvas enteras muertas de ambos lotes (lotes 1 y 2), las muestras se
colocaron en cmara oscura, se observaron con luz ultravioleta (366 nm) y se tomaron
fotografas con una cmara digital (Coolpix 5000, Nikon, Tokyo, Japn) con luz visible y
luz ultravioleta (366 nm). La fluorescencia emitida por las larvas con luz ultravioleta
permiti verificar su presencia, integridad y cuantificacin. En todas las muestras (Tnx,
Rnx) se contabilizaron las larvas enteras y por diferencia se obtuvo la cantidad de larvas
rotas. Se calcul el porcentaje de retencin de larvas en cada tipo de tamizado
Figura 7.Esquema de la extraccin de protena para inmunodeteccin a partir de msculo
de merluza con infestacin artificial (50 larvas/100 g msculo) y sometidos a tratamientos
de digestin y digestin ms calentamiento.
Figura 8. Esquema del estudio de la separacin mecnica de msculo de merluza con

infestacin natural y artificial.

Figura 9. Imgenes de los anlisis en las muestras de trabajo: Msculo tamizado (Tnx) y
Residuo (Rnx). Las flechas sealan ejemplos de larvas encontradas.
Figura 10. Esquema general de elaboracin de surimi a partir de msculo de merluza

infestado artificialmente (50 larvas/100 g msculo) lavado con diferentes soluciones y

obtenido en la etapa anterior.

5. BIBLIOGRAFIA
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