Está en la página 1de 187

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

FACULTAD DE QUMICA Y FARMACIA

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS


FRACCIONES OBTENIDAS DE LA CROMATOGRAFA DE COLUMNA
(n-HEXANO:ACETATO DE ETILO 70%, ACETATO DE ETILO PURO Y
METANOL PURO) PROCEDENTES DEL EXTRACTO DICLOROMETNICO
DE LA GOMA-RESINA DE Eucalyptus citriodora (EUCALIPTO)

TRABAJO DE GRADUACIN PRESENTADO POR:


IMELDA MARISOL GUZMN DAZ
JOAQUIN ANTONIO HENRQUEZ ARDN

PARA OPTAR AL GRADO DE


LICENCIATURA EN QUIMICA Y FARMACIA

JUNIO 2007
SAN SALVADOR, EL SALVADOR, CENTRO AMERICA.
UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

Rectora

Dra. Maria Isabel Rodrguez

Secretaria General

Licda. Alicia Margarita Rivas de Recinos

FACULTAD DE QUMICA Y FARMACIA

Decano

Lic. Salvador Castillo Arvalo

Secretaria

MSc. Miriam del Carmen Ramos de Aguilar


COMIT DE TRABAJOS DE GRADUACIN

Coordinadora General

Licda. Maria Concepcin Odette Rauda Acevedo

Asesora de rea de Anlisis de Alimentos: Microbiolgico

MSc. Mara Evelyn Snchez de Ramos

Asesora de rea de Microbiologa:

MSc. Coralia de los ngeles Gonzlez de Daz

Docentes Directores

Ing. Sergio Armando Maravilla Miranda

Dr. Marvin J. Nez Rivas

Licda. Mercedes Tatiana Quinteros Prez


AGRADECIMIENTOS

De forma especial a nuestros docentes directores: Dr. Marvin J. Nez Rivas,

Licda. Mercedes Tatiana Quinteros Prez e Ing. Sergio Armando Maravilla

Miranda, por la oportunidad y confianza que depositaron en nosotros para

realizar este trabajo de investigacin; gracias por su orientacin y paciencia en

los momentos difciles. Que la vida generadora de xitos os premie.

A la planta docente de la Facultad de Qumica y Farmacia por su

responsabilidad y compromiso al compartir sus conocimientos, sabiendo

orientar de la mejor forma las habilidades de los estudiantes formando ntegros

profesionales en Qumica y Farmacia.

Al Lic. Ral, Lic. Amy y Sr. Juan Jos, por sus valiosos consejos y colaboracin

en el desarrollo de nuestro trabajo experimental desarrollado en CENSALUD.

Al comit de graduacin: Licda. Maria Concepcin Odette, MSc. Evelyn

Snchez de Ramos y MSc. Coralia Gonzlez de Daz por su colaboracin a lo

largo de este trabajo de investigacin.

Y a todas las personas que directa o indirectamente influyeron en nuestra

formacin tica y profesional, les estamos agradecidos eternamente.

Imelda y Joaqun
DEDICATORIA

A Dios todo poderoso y a la Virgen Santsima por iluminarme y guiarme por el

buen camino y permitirme culminar esta etapa tan importante de mi vida.

A mi madre, querida, Leticia Daz por su amor incondicional, su apoyo, por ser

mi ejemplo a seguir, y mi nimo para superarme en la vida.

A mi abuelo Mariano Daz (Q.D.E.P) que desde el cielo me gua y me cuida.

A mis hermanos Karen y Steven por estar siempre a mi lado cuando los

necesito.

Al Lic. Francisco Contreras y Licda. Ada Marcela Campos por creer en m, por

su apoyo y nimo para la realizacin de esta tesis.

Al Lic. Carlos Felipe lvarez por darme nimos para continuar.

A mis amigos y compaeros (Elbita, Katy, Rocio, Lidizse, Benito, Vernica,

Marcela, Osito, etc.) por brindarme su amistad, confianza, apoyo y compartir

juntos a lo largo de esta carrera.

A mi compaero Joaqun Henrquez, por darme un voto de confianza, por su

amistad y su apoyo para la realizacin de nuestro trabajo de graduacin.

IMELDA MARISOL GUZMN DAZ


DEDICATORIA

A la vida, la naturaleza del ser, que reanima nuestras conciencias llevndolas a

un desarrollo constante.

A mi familia por su sacrificio y apoyo a lo largo de estos aos.

A mi madre Maria Angelina Ardn por su voluntad y su incansable amar y

esperar.

A mis amigos, compaeros y conocidos que aun sin recordar sus nombres,

estn presentes en las cosas que digo, pienso y escribo; por su apoyo, su

solvencia moral al decir las cosas, gracias por siempre.

A mi compaera Imelda Guzmn por su confianza, su amistad y sobre todo su

capacidad y profesionalismo al realizar este trabajo.

JOAQUIN ANTONIO HENRQUEZ ARDN


NDICE

Resumen

Pgina

CAPTULO I

1.0 Introduccin xxii

CAPTULO II

2.0 Objetivos 25

CAPTULO III

3.0 Marco Terico 28

3.1 Generalidades del Eucalipto 28

3.2 Generalidades sobre metabolitos secundarios

que presentan actividad antimicrobiana. 39

3.2.1 Terpenos 39

3.2.2 Antransidos 43

3.2.3 Flavonides 44

3.2.4 Compuestos fenlicos 46

3.3 Exudados de las plantas 49

3.4 Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear (RMN-1H) 51

3.5 Generalidades sobre cromatografa 56

3.5.1 Cromatografa en columna 58

3.6 Fraccionamiento bioguiado 63

3.7 Generalidades de las cepas sometidas a bioensayo 65


3.7.1 Staphylococcus aureus 65

3.7.2 Streptococcus pneumoniae 66

3.7.3 Pseudomona aeruginosa 67

3.8 Mtodo de difusin 70

CAPTULO IV

4.0 Diseo Metodolgico 73

4.1 Tipo de estudio 73

4.2 Investigacin bibliogrfica 73

4.3 Metodologa de campo 74

4.4 Metodologa de laboratorio 74

4.4.1 Caracterizacin organolptica 74

4.4.2 Parte fitoqumica 75

4.4.2.1 Obtencin del extracto etanlico 75

4.4.2.2 Obtencin del extracto diclorometnico 75

4.4.2.3 Cromatografa de columna 75

4.4.3 Ensayo Microbiolgico 79

4.4.3.1 Pruebas de identificacin microbiolgicas 79

4.4.3.2 Determinacin de la actividad antimicrobiana 81

CAPTULO V

5.0 Resultados y discusin de resultados 85

CAPTULO VI

6.0 Conclusiones 129


CAPTULO VII

7.0 Recomendaciones 133

Bibliografa

Glosario

Anexos
INDICE DE CUADROS

CUADRO Pginas

1. Metabolitos secundarios aislados del

Eucalyptus citriodora. 34

2. Metabolitos secundarios aislados de las hojas

de Eucalyptus citriodora. 35

3. Continuacin de metabolitos secundarios aislados de las hojas

Eucalyptus citriodora. 36

4. Metabolitos secundarios aislados de la corteza de

Eucalyptus citriodora. 37-38

5. Desplazamientos qumicos tpicos en RMN-1H 54

6. Desplazamientos qumicos aproximados de varios tipos

de protones de flavonoides. 55

7. Seales caractersticas de RMN-1H de algunos compuestos

presentes en las plantas. 55

8. Caractersticas macroscpicas. 80

9. Pruebas de identificacin microbiolgica. 80

10. Parmetros de referencia de los halos de inhibicin. 83

11. Caractersticas organolpticas del extracto diclorometnico

de la goma-resina del Eucalyptus citriodora. 85

12. Datos de RMN-1H de la fraccin n-hexano: acetato de etilo 70%

(CD3COCD3, 300MHz). 95
13. Datos del espectro de RMN-1H de la fraccin acetato de etilo puro

(CD3COD3, 300MHz). 101

14. Datos del espectro de RMN-1H de la fraccin metanol puro

(MOD3, 300MHz). 106

15. Resultados de las pruebas de identificacin del

Staphylococcus aureus. 106

16. Morfologa microscpica y macroscpica de la

Pseudomona aeruginosa. 110

17. Pruebas de identificacin y diferenciacin de

Pseudomona aeruginosa. 110

18. Pruebas de identificacin del Streptococcus pneumoniae. 114

19. Resultados de la evaluacin microbiolgica de las fracciones

en estudio por el mtodo de Kirby Bauer Modificado, para

Staphylococcus aureus. 116

20. Resultados de la evaluacin microbiolgica de las fracciones

en estudio por el mtodo de Kirby Bauer Modificado, para

Pseudomona aeruginosa. 120

21. Resultados de la evaluacin microbiolgica de las fracciones

en estudio por el mtodo de Kirby Bauer Modificado, para

Streptococcus pneumoniae. 124


INDICE DE ANEXOS

ANEXO

1 Eucalyptus citriodora (Eucalipto)

2 Fotografas de aparato soxhlet y rota evaporador

3 Metodologa general de trabajo

4 Fraccionamiento bioguiado

5 Preparacin de las diluciones de las fracciones en estudio

6 Pruebas microscpicas (Coloracin al Gram)

7 Caractersticas microscpicas

8 Cromatografa de columna flash

9 Pruebas de identificacin y diferenciacin para Staphylococcus aureus

10 Pruebas bioqumicas

11 Pruebas de identificacin y diferenciacin para Streptococcus

pneumoniae

12 Preparacin del estndar Mc Farland

13 Mtodo de Kirby Bauer Modificado

14 Resultados del mtodo Kirby Bauer Modificado en Staphylococcus

aureus

15 Resultados del mtodo Kirby Bauer Modificado en Pseudomona

aeruginosa
16 Resultados del mtodo Kirby Bauer Modificado en Streptococcus

pneumoniae

17 Preparacin de medios de cultivo

18 Materiales, equipos, reactivos y solventes


INDICE DE FIGURAS

FIGURA

1. rbol de Eucalyptus citriodora

2. Estructura del Isopreno

3. 1,8 cineol

4. santonina

5. cido abitico

6. Lupeol

7. Emodina

8. Rutina

9. cido cafico

10. cido glico

11. Recoleccin de goma-resina de Eucalyptus citriodora

12. Empacado de la columna de cromatografa.

13. Preparacin de la cabeza de la columna

14. Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%

(CD3COCD3, 300 MHz)

15. Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%

(CD3COCD3, 300 MHz)

16. Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%

(CD3COCD3, 300 MHz)


17. Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%

(CD3COCD3, 300 MHz)

18. Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%

(CD3COCD3, 300 MHz)

19. Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%

(CD3COCD3, 300 MHz)

20. Espectro de RMN-1H de la fraccin AcOEt puro (CD3COCD3, 300 MHz)

21. Espectro de RMN-1H de la fraccin AcOEt puro (CD3COCD3, 300 MHz)

22. Espectro de RMN-1H de la fraccin AcOEt puro (CD3COCD3, 300 MHz)

23. Espectro de RMN-1H de la fraccin MeOH puro (MOD3, 300 MHz)

24. Espectro de RMN-1H de la fraccin MeOH puro (MOD3, 300 MHz)

25. Espectro de RMN-1H de la fraccin MeOH puro (MOD3, 300 MHz)

26. Staphylococcus aureus, en tincin al Gram

27. Staphylococcus aureus en agar Chapman

28. Staphylococcus aureus en agar Baird Parker

29. Prueba de catalasa

30. Prueba de coagulasa

31. Pseudomona aeruginosa en tincin al Gram

32. Pseudomona aeruginosa en agar Cetrimide

33. Prueba positiva de movilidad

34. Prueba negativa de rojo de metilo

35. Prueba positiva de citrato


36. Prueba negativa de indol

37. Prueba negativa de Voges Proskauer

38. Prueba de TSI

39. Prueba positiva de oxidasa

40. Streptococcus pneumoniae en tincin al Gram

41. Streptococcus pneumoniae en agar sangre

42. Prueba positiva de discos de Optoquina

43. Comparacin del efecto inhibitorio de las diluciones 0.5%, 1.05%, 2.1% y

3.0% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo

puro (AcOEt) y metanol puro (MeOH) del extracto diclorometnico de la

goma-resina de Eucalyptus citriodora (Eucalipto) en Staphylococcus

aureus.

44. Comparacin del efecto inhibitorio de las diluciones 0.25%, 0.5%, 0.75%

y 1.05% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo

puro (AcOEt) y metanol puro (MeOH) del extracto diclorometnico de la

goma-resina de Eucalyptus citriodora (Eucalipto) en Pseudomona

aeruginosa.

45. Comparacin del efecto inhibitorio de las diluciones 0.5%, 0.75%, 1.5% y

3.0% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo

puro (AcOEt) y metanol puro (MeOH) del extracto diclorometnico de la

goma-resina de Eucalyptus citriodora (Eucalipto) en Streptococcus

pneumoniae.
ABREVIATURA Y SIMBOLOGIA UTILIZADA

AcOEt: Acetato de etilo

ATCC: American Type Culture Collection

BaCl2: Cloruro de bario

BHI: Brain Heart Infusin Agar

C: Carbono

cm: Centmetros

CDCl3: Cloroformo deuterado

CD3COCD3: Acetona deuterada

CHCl3: Cloroformo

CO2: Dixido de Carbono

d: Doblete

HDO: Agua deuterada

H2SO4: cido Sulfrico

H2O: Agua

H2O2: Peroxido de Hidrogeno

MeOH: Metanol

mg: Miligramo

mm: Milmetros

MO: Microorganismo

MOD3: Metanol deuterado


msnm: Metros sobre el nivel del mar

ppm: Partes por milln

RMN-1H: Resonancia Magntica Nuclear de protn

TMS: Tetrametilsilano

TSA: Tryptone Soya Agar

UES: Universidad de El Salvador

UNSA: Universidad Nueva San Salvador


RESUMEN

La presente investigacin tiene como finalidad determinar la actividad

antimicrobiana de las fracciones obtenidas de la cromatografa de columna del

extracto diclorometnico de la goma-resina del Eucalyptus citriodora contra

las cepas Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa y

Streptococcus pneumoniae, empleando el mtodo Kirby Bauer Modificado.

La goma resina se recolect en la poca seca sometindose a extraccin en

Soxhlet con Etanol 95, luego realizando una particin lquido-lquido

H2O/CH2Cl2 y seguidamente llevando a cabo una cromatografa de columna a

media presin, con el extracto diclorometnico, obteniendo las fracciones n-

hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo puro y metanol puro; las cuales se

analizaron por medio de RMN-1H, con el fin de determinar los metabolitos

secundarios presentes. Finalmente se comprob la actividad antimicrobiana a

travez del mtodo Kirby Bauer Modificado, que consiste en colocar cilindros de

acero inoxidable que contienen la sustancia a investigar, sobre un medio

solidificado (Agar Muller Hinton) cuya superficie debe encontrarse inoculada por

el microorganismo de prueba; de manera que si es susceptible se forma un halo

alrededor de el cilindro.

La fraccin que present mayor actividad microbiolgica fue n-hexano:acetato

de etilo 70%, cuya actividad se debe a la presencia de sustancias como

flavonoides y cidos fenlicos comprobando as, que la fraccin antes

mencionada posee actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus y

Pseudomona aeruginosa.
I. INTRODUCCIN
xxii

1.0 INTRODUCCIN

En los ltimos aos, el descubrimiento de nuevos agentes antibacterianos ha

sido producto de numerosas investigaciones y, aunque muchos de estos

agentes pueden sintetizarse por diferentes mtodos qumicos, constantemente

se estn buscando nuevas sustancias inhibitorias de origen natural,

principalmente vegetal. (34)

En El Salvador hay una gran variedad de especies vegetales y de ellas se

pueden obtener diferentes extractos que pueden constituirse en un

farmacgeno (que genera un frmaco) e identificar estructuras qumicas que

pueden tener aplicaciones como agentes para curar diversas enfermedades, la

importancia de esta investigacin radica en justificar la utilizacin de preparados

vegetales y contribuir a la investigacin de la flora medicinal en el pas. (34)

Una de las especies vegetales que mayor beneficio ha aportado al rea de la

salud, es el Eucalipto (Eucalyptus citriodora), el cual exuda una goma-resina

del tronco la cual ha sido poco estudiada. Dicha resina contiene varios

metabolitos secundarios que presentan actividad antibacteriana. (18)

En este trabajo, se partir de de la goma-resina del Eucalyptus citriodora, del

cual se obtendr un extracto diclorometnico que se someter a una


xxiii

cromatografa de columna obtenindose, as las fracciones n-hexano:acetato de

etilo 70%, acetato de etilo puro y metanol puro, las cuales se analizarn por

espectroscopa de RMN-1H para determinar sus posibles metabolitos

secundarios y luego se investigar si poseen propiedades antibacterianas, y

para ello se realizar una evaluacin microbiolgica por medio del mtodo de

Kirby Bauer Modificado, con las bacterias; Staphylococcus aureus,

Pseudomona aeruginosa y Streptococcus pneumoniae, las cuales son

microorganismos patgenos que pueden causar enfermedades como por

ejemplo, neumona, meningitis, infecciones menores hasta potencialmente

mortales, epidemias de influenza, bronquitis, etc.

Con esta investigacin se espera determinar si las fracciones de la

cromatografa de columna antes mencionadas de la goma-resina de

Eucalyptus citriodora presentan actividad antibacteriana en contra de

Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa y Streptococcus

pneumoniae, convirtindose as en una alternativa teraputica para el

tratamiento de infecciones causadas por estos microorganismos.


II. OBJETIVOS
2.0 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar la actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas de la

cromatografa de columna, (n-hexano:acetato de etilo 70%; acetato de

etilo puro y metanol puro), procedentes del extracto diclorometnico de la

goma-resina de Eucalyptus citriodora (Eucalipto).

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

2.2.1. Obtener el extracto etanlico de la goma-resina de Eucalyptus

citriodora.

2.2.2. Realizar la particin lquido-lquido (agua/diclorometano) de la

goma-resina de Eucalyptus citriodora.

2.2.3. Obtener las fracciones, n-hexano: acetato de etilo 70 %; acetato de

etilo puro y metanol puro, a partir de la cromatografa de columna

del extracto diclorometnico.


2.2.4. Realizar un anlisis espectroscpico por medio de Resonancia

Magntica Nuclear de protn (RMN-1H) de las fracciones

obtenidas de la cromatografa de columna.

2.2.5. Comprobar la actividad antibacteriana de las fracciones n-hexano:

acetato de etilo 70%; acetato de etilo puro y metanol puro, por el

mtodo microbiolgico Kirby Bauer Modificado, contra las

bacterias Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa y

Streptococcus pneumoniae.
III. MARCO TERICO
28

3.0 MARCO TERICO

3.1 GENERALIDADES DEL EUCALIPTO

Nombre comn: Eucalipto limn, Eucalipto

aromtico, Gomero de olor a limn.

Nombre cientfico: Eucalyptus citriodora

Familia: Myrtaceae.

Subfamilia: Leptospermoideae.

Figura 1 rbol de Eucalyptus citriodora.

Es una especie de gran adaptabilidad y rpido crecimiento, cuya madera es

pesada y fcil de aserrar, desarrolla fustes rectos, proporciona lea de alto valor

calorfico, tiene gran potencial en el establecimiento y manejo de sistemas

agroforestales.

ORGEN Y DISTRIBUCIN

Los rodales naturales estn restringidos a la costa oriental de Australia, entre

los 7 C y 26 C de latitud sur. Se le ha plantado en frica Central, Amrica del

Sur, especialmente en Brasil, Amrica Central, el Mediterrneo, India y Hawaii.


29

DESCRIPCIN BOTNICA

rbol perennifolio, monoico de gran porte que puede superar los 43 metros de

altura, con la corteza lisa, caediza, blanca o con ligera tonalidad azulada. Hojas

juveniles opuestas, un poco peltadas, pecioladas, de oblongas a oblongo-

lanceoladas, con pilosidad abundante. Hojas adultas alternas, pecioladas,

estrechamente lanceoladas, de 10-16 cm de longitud y 1-2 cm de anchura.

Todas las hojas desprenden un fuerte olor a limn. Inflorescencias terminales

corimbosas formadas por umbelas de 3-5 flores. Pednculos cilndricos.

Oprculo hemisfrico, ligeramente rostrado, ms corto que el tubo del

receptculo. Cpsula urceolada, pedcelada, de 8-10mm de dimetro, con

valvas sin sobresalir. (26)

HBITAT

Prefiere suelos de carcter cido, y exposicin al sol.

SIEMBRA

Siembra directa en otoo o primavera.

REQUERIMIENTOS AMBIENTALES (17)

- Temperatura y elevacin.

En Amrica Central se le ha plantado en sitios de 100 a 1200 msnm; con una

temperatura promedio anual de 20 C a 26 C. En El Salvador se ha plantado

en sitios de 20 a 600 msnm; con temperaturas de 23.9 C a 26.5 C.


30

- Precipitacin.

En la regin Centroamericana se ha plantado en sitios con 850 mm. y 280 mm.

de precipitacin anual con 4 a 8 meses de dficit hdrico.

- Suelos.

La especie crece naturalmente sobre suelos ondulados, pobres, pedregosos,

incluyendo suelos laterticos. No tolera suelos arcillosos, pesados y mal

drenados.

SILVICULTURA (17)

- Regeneracin natural.

No se tiene experiencia con regeneracin natural en Amrica Central.

- Recoleccin de semillas.

La floracin se da de noviembre a diciembre, la recoleccin se puede realizar

en todo el ao. Las semillas no requieren tratamiento pregerminativo, su

viabilidad, de 75%. El momento de cosechar las semillas es cuando cambian de

color verde amarillento a un color negro blanquecino y dentro del fruto aparece

un color caf y 3 divisiones bien definidas. La recoleccin se efecta cortando

las ramas con frutos; el secado se realiza exponiendo la semilla al sol de 3 a 4

das; el purificado se realiza a travs de un tamizado y luego se almacenan en

un cuarto fro a temperaturas de 8 C a 12 C.

- Produccin en vivero.

Requiere de germinadores conteniendo arena desinfectada. Las semillas

germinan de 5 a 12 das. Se trasplanta a la bolsa cuando la planta presenta de


31

2 a 3 hojas. Las plantas alcanzan 40 cm en 16 semanas, no se puede producir

a raz desnuda, ni como seudoestaca para su propagacin.

- Establecimiento de la plantacin.

El establecimiento requiere de una eliminacin de malezas; al igual que

proteger la plantacin del ataque de termitas y zompopos en los primeros aos.

Posee lignotubrculos, mecanismo fisiolgico que le ayuda a la planta a resistir

los incendios.

- Manejo.

La especie presenta un buen desarrollo por debajo de los 800 msnm, con

menos de 1000 mm de precipitacin anual y 8 meses de dficit hdrico, posee

capacidad de rebrote. Su rendimiento es de 15 m3/ha/ao, cosechadas en

rotaciones de rebrote de 8 aos. Tiene un incremento en altura de 3 mts/ao,

durante los primeros aos.

USOS TERAPUTICOS

En general el eucalipto es antisptico y antifngico, tiene accin

antiinflamatoria, antiespasmdica y antidiabtica, se utiliza en los tratamientos

de artritis inflamatoria y reumatoidea. La utilizacin del eucalipto es tambin

recomendado en casos de fiebre, tos, heridas y picaduras de insectos. (18)

En medicina popular se emplean sus hojas como sudorfico, espasmdico,

contra la gripe y los resfriados. En inhalaciones se aprovechan con gran


32

resultado en caso de ronquera, perdida de la voz y en la sinusitis, el aroma de

las hojas y corteza son un repelente de zancudos y mosquitos. (35)

Su aceite esencial es destilado de las hojas y ramas jvenes se utiliza: en

inhalaciones, vaporizaciones, fricciones y masajes. Se ha utilizado adems

como antisptico, balsmico, anticatarral, desodorante, cicatrizante,

antiparasitario, antirreumtico, antifebril y estimulante en especial del sistema

respiratorio. Es fantstico para aliviar congestiones nasales. Es usado

principalmente para infecciones de las vas respiratorias, gripe, sinusitis, cistitis,

llagas, quemaduras y reumatismo. (30)

OTROS USOS

La madera es de color castao-oscuro a castao-griscea, es muy pesada,

dura tenaz y fuerte, es resistente a la pudricin y a las termitas, es una madera

de aserro de buena calidad y se usa en estructuras y armazones, carruajes,

tarimas, carpintera naval, apero de labranza, etc. en la construccin en general,

mangos de herramientas, durmientes de ferrocarril, se tornea fcilmente y

produce postes rectos que pueden impregnarse fcilmente a presin. La lea es

utilizada como combustible, arde en forma constante y se utiliza para la

produccin de carbn industrial y tambin para obtener celulosa y pulpa de

papel. Las hojas en Australia lo utilizan para la extraccin de un aceite esencial

con olor a limn, el cual es rico en citronelal, y muy apreciado en perfumera. (26)

TOXICIDAD

El citronelal encontrado en el Eucalyptus citriodora, se reporta que es

mutagnico. (46)
34

COMPOSICIN QUMICA
CUADRO 1 METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DEL Eucalyptus
citriodora. (31)
PARTE DE LA EXTRACTO TIPO DE COMPUESTO NOMBRE DEL
PLANTA COMPUESTO
1.Acido glico
Derivados del fenol 2.Acido elgico
Tanino 3.Castalagina
4.Quercetina
5.Miricitina
Flavonoides 6.Miricitina-3-O-glucosa
7.Quercetina-3-O-glucosa
8.Myricetina-3-O-ramnosa
Antocianida 9.Cianidina
10.Delphinidina
Antocianidina 11.Citriodorina
12.Eucalyptina
Hojas Etanlico Esterol 13.-Sitosterol
Triterpeno 14.Acido botulnico
15.Acido shikmico
16.Acido glutrico
cidos carboxlicos 17.Acido succnico
18.Acido ctrico
19.Acido mlico
Fenilpropanopolimrico 20.Lignina
Monoterpenos 21.Citral
22.Citronelal
Triterpeno 23.Acido urslico
1.Trans-calamenino
Sesquiterpenlactonas 2.T-murolol
3.-cadinol
4.2-hidroxi--cadinol
5.4-hidroxi-3,5-
Derivados del fenol dimetoxibenzaldehdo
6.Acido 4-hidro-3,5-
dimetoxibenzoco
Acido graso 7.Acido linoleico
Hidrocarburo 8.Escualeno
Terpenoquinona 9.-tocoferol
Corteza Clorofrmico 10.Eritrodiol
Triterpenos 11.Acido morlico
12.Acido botulnico
13.Cicloescualenol
14.Vernolitato de
cicloeucalenol
Esteroles 15.-sitosterol
16.-sitosterilo--O-
glucopiranosido
17.-sitosterona
Lignanos 18.Yamgambina
19.Sesamina
35

CUADRO NO. 2 METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LAS HOJAS DE


Eucalyptus citriodora.

O OH
HO
HO O HO O
O OH OH
HO
HO
O OH
OH OH
HO O OH O
1.cido glico 2.cido elgico 4.Quercetina

OH

HO O
OH

MeO O OH
O OH
5.Miricetina 9.Cianidina

COOH

O
HO
13. -sitosterol 14.cido betulnico

HO
O
HO O O
OH
HO HO OH

15.cido shikimico 16.cido glutrico


36

CUADRO NO. 3 CONTINUACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LAS


HOJAS DE Eucalyptus citriodora.

O OH
O O
HO
HO OH OH
OH HO HO
O
O OH O
O
17.cido succnico 18.cido ctrico 19.cido mlico

21.Citral 22.Citronelal

H
OH

O
H
HO

23.cido urslico
37

CUADRO NO. 4 METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LA CORTEZA DE


Eucalyptus citriodora
H OH
OH H
OH

H H
1.Trans-calameneno 2.T-muurolol 3. - cadinol

OH
H CHO

MeO OMe
H OH
4. 2 -hidroxi - -cadinol 5. 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldehdo

COOH

MeO COOH
OMe
OH

6.Acido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzico 7.Acido linoleico

OH

8.Escualeno 9. -tocoferol

CH2OH

HO

10.Eritrodiol
38

CUADRO NO. 4 CONTINUACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LA


CORTEZA DE Eucalyptus citriodora.

COOH COOH

HO O

11.Acido morlico 12.Acido betulnico

HO

13.Cicloeucalenol

R1: CH3

O
R1O

14.Vernolitato de cicloeucanol Radical del vernolitato de cicloeucanol

HO glucosa-O
15. - sitosterol 16. -sitosterilo- -D-glucopiransido
39

3.2 GENERALIDADES SOBRE METABOLITOS SECUNDARIOS QUE

PRESENTAN ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA.

3.2.1. TERPENOS

Son substancias que tienen un origen biosntetico comn y que siguen la

llamada regla del isopreno, pueden clasificarse como monoterpenos (C10),

sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25), triterpenos (C30), y

tetraterpenos (C40), segn el nmero de unidades de isopreno que lo forman.

Figura 2: Estructura del Isopreno

- MONOTERPENOS

Formados por dos molculas de isopreno; los monoterpenos suelen ser los

componentes de las esencias voltiles de las flores y de los aceites esenciales

de las hierbas y especias, en los que los monoterpenos pueden constituir

incluso el 5% del peso seco de la planta. Los monoterpenos se pueden aislar

tanto por destilacin como por extraccin, y son utilizados para la produccin

industrial de sabores y perfumes.


40

Figura 3: 1,8-cineol
Descongestionante, expectorante.
Eucalyptus globulus (Mirtaceae)

- SESQUITERPENOS

Son estructuras C15 formadas a travs de la condensacin isoprnica. Se

encuentran frecuentemente formando parte de los aceites esenciales pero

tambin hay sesquiterpenos distintos de los que se encuentran en dichos

aceites. Entre ellos destacan las lactosas sesquiterpnicas presentes en el

rnica o los sesquiterpenos que contiene la valeriana.

Figura 4: -santonina
Analgsica.
Chenopodium ambrosioides L.
(Chenopodiaceae)
41

- DITERPENOS

Comprende un grupo de compuestos de 20 tomos de carbono que pueden

presentarse en forma de hidrocarburos, alcoholes, cetonas, lactonas, y cidos

carboxlicos, siendo estos ltimos conocidos desde tiempo atrs como cidos

resnicos obtenidos como componentes de las resinas exudadas obtenidas por

cortes en los troncos de pinos y abetos.

Se subdividen atendiendo al tipo de esqueleto carbonado, entre otros, como

bicclicos, tricclicos, tetracclicos.

Tambin se han clasificado en base a sus propiedades; entre los cidos

resnicos ya nombrados, tenemos los cidos abitico y agtico a los que se le

atribuye funcin protectora a la planta; los diterpenos txicos como las

grayanotoxinas de las hojas de Rhododendron y son las responsables de la

naturaleza venenosa de llas; y las giberelinas, un grupo de hormonas que

estimulan el crecimiento vegetal, de las cuales el mas comn es el cido

giberlico.

Algunos diterpenos muestran actividad antitumoral y citotxica, otros, actividad

irritante, algunas actividades anti-inflamatorias y otros propiedad edulcorante.(25)


42

Figura 5: cido abitico


Expectorante, anticatarral, vermfuga, antiulcerognica.
Pinus silvestris L. (Pinaceae)

- TRITERPENOS

Son compuestos con un esqueleto carbonado basado en seis unidades de

isopreno que derivan biogenticamente del escualeno, hidrocarburo acclico de

30 carbonos. Son de estructura relativamente compleja generalmente

tetracclicos o pentacclicos, y pueden contener grupos hidroxilo, cetona o

aldehdo y cido carboxlico. Muchos se encuentran formando las llamadas

saponinas triterpnicas.

Figura 6: Lupeol
Antiinflamatorio, analgsico y antipirtico.
Aloe vera L. (Liliceas)
43

3.2.2. ANTRANSIDOS

Las quinonas naturales, son un grupo de compuestos cuya coloracin puede

ser desde el amarillo plido hasta casi negro. Se encuentran frecuentemente en

la corteza, en el corazn de la madera o de la raz, y en algunos casos en las

hojas donde su color est enmascarado por otros pigmentos. Se presentan

mayormente al estado libre, pero las hidroxiladas pueden encontrarse

glicosidadas. Para confirmar su presencia puede ser til una reaccin de color

basada en la propiedad rdox de las quinonas.

Para su mayor estudio, las quinonas se subdividen en benzoquinonas,

naftoquinonas, antraquinonas, quinonas isoprenoide. Ellas adems pueden

contener diversos grupos funcionales, anillos de furano o pirano, encontrarse

como dmeros, ser parcialmente reducidas como los antranoles y antronas, etc.

Se asume que la mayora de las antraquinonas han sido elaboradas a travs de

la ruta acetato y en otros casos, han sido formadas de la ruta del cido

shikmico. Incluye O-hetersidos y C-hetersidos (estos ltimos son enlace

carbono-carbono entre el azcar y el aglicn) su accin ms especfica es la de

estimular la musculatura lisa del intestino grueso. La cual llega a ocasionar una

mayor dilucin del contenido intestinal. En conjunto producen un claro efecto

laxante que se manifiesta despus de unas 6 a 7 horas. Las plantas que

contienen antraquinonas se comportan como laxantes o purgantes segn la

dosis. Este tipo de laxantes est contraindicado en caso de embarazo,

menstruacin y hemorroides.(10)
44

Las quinonas han sido conocidas desde pocas antiguas por sus propiedades

tintreas; algunas presentan otras propiedades como la emodina que es

catrtica; shikonina, antimictica; rheina, bajo la forma de diacetato,

antirreumtico; plumbagina, muy activa para la leishmaniasis; lapachol,

citosttica, bacteriosttica, fungisttica, entre otros. (25)

Figura 7: Emodina
Catrtico.
Rheum officinale. (Polygonaceae)

3.2.3. FLAVONOIDES

Los flavonoides son pigmentos vegetales que se encuentran en forma libre y en

forma de glicsidos, poseen esqueleto carbonado C6C3C6 como se

encuentran en las flavononas, aurona, chalcona, flavona, flavanonol,

antocionadina, catequina, isoflavona, antocianidina, etc. Los flavonoides

naturales se encuentran extensamente distribuidos entre las plantas, en sus

flores, frutos y hojas, en su mayora estn en forma de glicsidos, estos ltimos

contribuyen a darle color a las flores, frutos y hojas.

Se conocen diez tipos de flavonoides cada uno de los cuales suelen

encontrarse bajo la forma de glicsidos con una o tres unidades de azcar los
45

cuales se ubican en los carbonos, C3 y/o C7. Los diferentes tipos de flavonoides

se pueden identificar mediante reacciones de coloracin y por sus propiedades

de solubilidad.

Figura 8: Rutina
Antiinflamatorio,
antiespasmdico y contra la fragilidad capilar.
Citrus limon L. (Rutceas)

Provienen de la ruta del acetato y shikimato, el primer flavonoide formado es la

chalcona, a partir del cual se derivan los otros tipos de flavonoides por

modificaciones que ocurren en varias etapas.

Las agliconas son ms comunes en tallo, corteza, races y exudaciones

resinosas de la madera.

Los disolventes empleados en la extraccin de estos compuestos son desde

muy polares como el agua, etanol, para glicosidos o agliconas muy hidroxilados,

hasta menos polares como el ter y cloroformo para flavonas altamente

metoxiladas. (11)
46

Algunos pigmentos flavnicos desprovistos de toxicidad para el hombre, tienen

propiedades diurticas, antiespasmdicas, antihemorrgicas, hemostticas,

antiarrtmicas, cardacas, antiinflamatorias, antirradicales libres,

antihepatotxicas y antiinfecciosas; adems son ampliamente usadas en

problemas circulatorios ya que disminuyen la fragilidad capilar, se usan como

edulcorantes y hepatoprotectores. (10)

3.2.4. COMPUESTOS FENLICOS

Los compuestos fenlicos se refieren a un grupo de sustancias que poseen en

comn un anillo aromtico con uno o ms sustituyentes hidroxilados, y que

ocurren frecuentemente como glicsidos, combinados con unidades de

azcares. Son relativamente polares que tienden a ser solubles en agua;

pueden ser detectados por el intenso color verde, prpura, azul o negro, que

producen cuando se les agrega una solucin acuosa o alcohlica al 1% de

cloruro frrico.(25) Entre los compuestos fenlicos podemos encontrar los

siguientes:

- CIDOS CINMICOS

Los cidos cinmicos son obtenidos por reacciones de hidroxilacin y de

metilacin, que sigue la secuencia de los patrones de la substitucin, tpicos de

los metabolitos de la va del shikimato, es decir un patrn orto de la

hidroxilacin. Algunos de los cidos cinmicos naturales ms comunes son los


47

cidos 4-coumrico, cafico, ferlico, y sinpico. stos se pueden encontrar en

plantas en forma libre y en una gama de formas esterificadas.

Figura 9: cido cafico


Antifngico y colagogo.
Cynara scolymus L. (Asteraceae)

- CIDOS BENZOICOS

Los cidos benzicos derivados de C6-C3, componen algunos de los cidos

hidroxibenzicos simples (compuestos C6-C1) por ejemplo el cido 4-

hidroxibenzico y el cido glico que se pueden formar directamente de

intermediarios en la va del shikimato, ejemplo, el cido 3-dihidroshikmico o el

cido chorsmico, aunque existen rutas alternativas en qu derivados cidos

cinmicos (compuestos C6-C3) se rompen en el enlace doble y pierden dos

carbonos de la cadena lateral. As, el cido 4-coumrico puede actuar como

precursor del cido 4-hidroxibenzico, y el cido ferlico puede dar el cido

vanillico (cido 4-hidroxi-3-metoxibenzico).

Algunos de estos compuestos poseen actividad antibacterial, bacteriosttica y

bactericida frente a Estafilococos, Estreptococos, Salmonella, Bacilo


48

subtillis, Proteus bulgaris, posiblemente por accin de cidos fenlicos y

cidos ferlicos. Otros como el cido cafico y los cumaratos de bencilo poseen

propiedades antifngicas. (30)

Figura 10: cido glico


Antibronqutico, astringente.
Hamamelis virginiana L. (Hamamelidceas)
49

3.3 EXUDADOS DE LAS PLANTAS

Los exudados de las plantas han sido utilizados a lo largo de la historia, por

numerosas culturas ya sea para propsitos religiosos, para impartir lustre al

papel y textiles, como adicin en materiales de construccin, como pegamentos

dentales, como lubricantes en instrumentos quirrgicos, como estabilizador del

vino, o simplemente como objetos de la belleza en joyera.

Estos exudados incluyen: resinas, gomas, goma resinas y ltex; los cuales

definimos a continuacin:

Resinas: son insolubles en agua, estn constituidas por grandes cantidades de

terpenos, o sustancias extrables con solventes apolares.

Gomas: son mezclas solubles en agua o dispersables en agua de polisacridos

de alto peso molecular.

Goma-resinas: Poseen tanto carbohidratos como terpenos o sustancias que

son extrables en fase acuosa y fase orgnica respectivamente.

Ltex: Diminutas gotas blanquecinas o fluidos lechosos de compuestos

orgnicos suspendidos o dispersos en medios acuosos, formados por

poliisoprenos.

Estos son producidos por clulas de la superficie de la planta como resultado de

un dao o lesin, estos exudados se limitan a los compuestos orgnicos que no

requieren la extraccin qumica, es decir estos materiales se pueden escoger o

raspar de la superficie de plantas, pueden tener apariencia fsica y propiedades

similares, pero diferente estructura molecular.


50

Las plantas vasculares son las productoras dominantes de exudados, las

familias de las gimnospermas tienen a los productores ms grandes de resinas

como las Cupresceas y Pinceas; entre las angiospermas ms comunes que

exudan tenemos: Anacardiceas, Burcerceas, Dipterocarpceas, Euforbiceas

y Fabceas/Leguminosas.

Las gimnospermas generan resinas, las angiospermas pueden generan

resinas, gomas o ltex. Las gomas son producidas principalmente por las

Fabceas/Leguminosas y Esterculiceas; los ltex son producidos por las

Apocinceas, Asclepidiceas, Euforbiceas y Sapotceas.

Las resinas son producidas por el epitelio derivativo de clulas adyacentes a las

clulas parenquimatosas. Estas resinas estn contenidas en canales alargados

(Gimnospermas) o al interior de glbulos en las Angiospermas; las gomas son

producidas por clulas parenquimatosas derivadas del cambium y los ltex son

producidos por clulas conocidas como laticferos de varios tejidos de la planta

tal como el parnquima y el floema secundario.(48)


51

3.4 ESPECTROSCOPA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR


(RMN-1H)

El mtodo se basa en la absorcin de energa por cambio del espin nuclear de

tomos sometidos a un campo magntico externo. El anlisis en RMN ofrece

evidencias bastante explcitas sobre las caractersticas de los ncleos que

conforman una dada molcula, y los ms frecuentemente analizados son: 1H,


13 15 19 31
C, N, F, P, etc, siendo los dos primeros utilizados en anlisis de rutina.

Los desplazamientos qumicos de las seales de RMN de 1H (020 ppm) y de


13
C (0200 ppm) dan informacin acerca de la naturaleza de hidrgenos

(alifticos, aromticos, olefnicos, geminales y heterotomos, etc.) y de

carbonos (en dobles enlaces, aromticos, carbonilicos, oxigenados, etc.)(28)

Para identificar los valores de desplazamiento qumico, se toma la seal

producida por el tetrametilsilano (TMS) ya que debido a la gran proteccin

electrnica experimentada por sus protones es necesario excitarlos a campos

mucho ms altos que la mayora de los protones de los compuestos orgnicos.

Los valores de desplazamiento qumico se expresan en partes por milln (ppm).

Con independencia de los efectos producidos por el medio, el desplazamiento

qumico de un protn se encuentra determinado por tres factores:

a) Distribucin de la densidad electrnica

b) Efecto de la anisotropa

c) Efectos estricos
52

ACOPLAMIENTO H,H

El acoplamiento magntico de dos ncleos en una molcula se realiza por lo

general a travs de los enlaces que los unen, sin embargo se conocen tambin

acoplamientos escalares a travs del espacio; estos se manifiestan cuando,

debido a la compresin estrica, dos ncleos se encuentran tan prximos que

se produce una interaccin directa de orbitales.

Una medida cuantitativa del acoplamiento la suministra la constante de

acoplamiento J la cual mide la distancia entre los diferentes protones. Entre los

acoplamientos ms importantes tenemos:

a) acoplamiento geminal J 2

b) acoplamiento vecinal J 3

c) acoplamiento a larga distancia J 4 o J 5

PREPARACIN DE MUESTRAS Y REGISTRO DE ESPECTROS (19)

Los espectros de resonancia magntica nuclear con finalidad analtica se

registran habitualmente en disolucin, para ello se prepara una solucin

concentrada pero no viscosa en un disolvente aprtico el ms frecuente es

CDCl3 , adems se pueden adquirir una serie de disolventes deuterados.


53

Los disolventes polares presentan con frecuencia un pequeo contenido de

agua cuya presencia se detecta a travs de la seal del H2O o bien HDO.

Como sustancia de referencia para el establecimiento del punto cero u origen

de la escala se utiliza el tetrametilsilano (TMS), que esta contenido bien en la

propia disolucin (referencia interna) o bien se aporta al tubo de resonancia en

capilar colocado en el tubo (referencia externa). La utilizacin del TMS es

innecesaria cuando por ejemplo se puede tomar directamente la seal residual

del CHCl3 en el CDCl3 como punto de referencia.

El registro del espectro se lleva a cabo habitualmente a temperatura ambiente,

se utilizan espectrmetros de resonancia con frecuencia de trabajo de 250, 270,

300, 400, 500, 600 e incluso 750 MHz. Para el registro de espectros en RMN1H

se conocen dos tcnicas: la tcnica CW (onda continua) y tcnica de pulsos

con transformada de fourier (Espectroscopia RMN-PFT)

Tcnica CW las diferentes seales de resonancia se van obteniendo una tras

otra al ir variando continuamente v (frecuencia) o B (campo magntico).

La espectroscopia RMN-PFT se emplea para muestras diluidas, con ella se

puede obtener espectros de RMN H-1 con 1mg o aun menos de muestra.
54

Cuadro No. 5 Desplazamientos qumicos tpicos en RMN-1H. (21)

TIPO DE PROTN DESPLAZAMIENTO QUMICO (ppm)

Alquilo 1, RCH3 0.8-1.0

Alquilo 2, RCH2R 1.2-1.4

Alquilo 3, R3CH 1.4-1.7

Arlico, R2C=C-CH3 1.6-1.9


I
R
Benclico, ArCH3 2.2-2.5

Cloruro de alquilo, RCH2Cl 3.6-3.8

Bromuro de alquilo, RCH2Br 3.4-3.6

Yoduro de alquilo, RCH2I 3.1-3.3

ter, ROCH2R 3.3-3.9

Alcohol, HOCH2R 3.3-4.0

Cetona, RCCH3 2.1-2.6



O
Aldehdo, RCH 9.5-9.6

O
Vinlico, R2C=CH2 4.6-5.0

Aromtico, ArH 6.0-9.5

Acetilnico, RCCH 2.5-3.1

Hidroxilo alcohlico, ROH 0.5-6.0a

Carboxlico, RCOH 10-13a



O
Fenlico, ArOH 4.5-7.7a

Amino, R-NH2 1.0-5.0a


a
Los desplazamientos qumicos de estos grupos varan en los distintos

disolventes y con la temperatura y concentracin.


55

Cuadro No. 6 Desplazamientos qumicos aproximados de varios tipos de


protones de flavonoides. (27)

Desplazamiento, ppm Tipo de Protn


ca. 1,0 C-CH3 de ramnosa (doblete ancho)
Metilos de substituyentes prenilos (-CH2-
ca. 1,7 CH=C(CH3)2)
(los otros protones a 3,5 y5,2 ppm)
ca.2,0 Acetato (-OCOCH3) y aromtico =C-CH3
2,0-3,0 H-3 de flavonas ) mltiplete, 2 protones)
3,7-4,1 Grupo metoxilo (OCH3)
3,5-4,0 C-H de muchos azcares
H-1 de azucares ( tambin H-2
4,2-6,0 dihidroflavonoles a 5,0 ppm y
H-2 de flavanonas a 5,0-5,5 ppm)
6,0 Grupo metilendioxi, O-CH2-O (singulete)
6,0-8,0 Protones de anillo A y B
7,5-8,0 H-2 de isoflavonas (singulete)
9,5-12,5 OH (en derivados no sigilados)

Cuadro No. 7 Seales caractersticas de RMN-1H de algunos compuestos


presentes en las plantas. (11,27)

COMPUESTO SEAL
Diterpenos Protones metilnicos y metnicos entre 0,5 y 1,9 ppm; H geminal al grupo OH
=3,2-4,5 ppm; H vinilicos =6,0-6,8 ppm; protones aldehdicos =9,1 ppm;
protones a grupo carbonilo =2,1 ppm; H geminal a grupo OR =4,4 ppm;
protones metnicos =1,5-2,0 ppm.
Regin de 3,00-1,00 ppm, protones metlicos entre 1,20 y 0,70 ppm.
Singuletes a 0,73 y 1,20 ppm para protones metilicos en C-18 y C-19 y
dobletes a 0.89 y 0.87 ppm para los C-21 y C-26 en los triterpenos los grupos
Triterpenos y CH3 en C-4 originan singuletes entre 0.8 y 0.9 ppm. Los protones vinlicos
Esteroides producen seales a 5,20-5,50 ppm.
Protn del sistema quinonico (~6,5-7,0 ppm), Quinonas parcialmente
sustituidas, los protones del sistema insaturado dan seales a 6,40 y 6,50 y
Antransidos se acoplan (J= 1,6-3,0) con los protones inmediatos de un grupo alquilo
unidos al carbn contiguo (protones allicos). Los protones de metilo unidos
al sistema carbonilo insaturado dan seales a 2,0-2,10, si aparecen como
dobletes es que hay protn allico ya citado, los protones enlicos (HO-C=C)
dan seales a 7,0-7,10.
Las naftoquinonas pueden exhibir seales en la regin aromtica. Las
antraquinonas y fenantraquinonas solo pueden mostrar seales de protones
aromticos y de sus sustituyentes.
cidos Protones aromticos =6,5-7,7 ppm; protones vinlicos =6,4-7,9 ppm, con
cinmicos J3 (cis) =11 Hz y J3 (trans) =14 Hz; protones aldehdicos =9,1 ppm;
protones hidroxilos =5,9 ppm
56

3.5 GENERALIDADES SOBRE CROMATOGRAFIA. (27)

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los componentes

de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos:

a) Retencin: Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una

fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un

soporte slido.

b) Desplazamiento: Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por

una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas.

La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaria y la fase mvil

atraviesa el sistema desplazando los componentes de la mezcla a distinta

velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con

ambas fases. La repeticin sucesiva de las operaciones elementales de

deteccin y desplazamiento a lo largo del sistema cromatogrfico da lugar a la

separacin de la mezcla original.

El fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo largo de la

fase estacionaria, impulsados por la mvil, recibe el nombre de elucin. La

cromatografa puede emplearse para conocer el nmero de componentes de

una mezcla y su identificacin, por comparacin con patrones (cromatografa

analtica). Tambin se aplica a la separacin de mezclas de compuestos, tanto

a pequea como a gran escala, y como mtodo de purificacin (cromatografa

preparativa).
57

Tipos de Cromatografa:

Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria (slida o lquida) y de la

fase mvil (lquida o gaseosa), se pueden distinguir distintos tipos de

cromatografa:

- Cromatografa slido-lquido: la fase estacionaria es un slido y la mvil un

lquido.

- Cromatografa lquido-lquido: la fase estacionaria es un lquido anclado a

un soporte slido y la fase mvil es un lquido.

- Cromatografa lquido-gas: la fase estacionaria es un lquido no voltil

impregnado con un slido y la fase mvil es un gas.

- Cromatografa slido-gas: la fase estacionaria es un slido y la mvil un

gas.

Por otra parte, en funcin al tipo de interaccin que se establezca entre los

componentes de la mezcla y las fases mvil y estacionaria, se puede hablar de:

- Cromatografa de absorcin: la fase estacionaria es un slido polar capaz

de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo

polar.

- Cromatografa de particin: la separacin se basa en diferencias de

solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y

mvil, que son ambas lquidas. Si la fase estacionaria es menos polar que la

fase mvil, se denomina cromatografa en fase inversa.


58

- Cromatografa de intercambio inico: la fase estacionaria es un slido que

lleva anclado grupos funcionales fijos ionizables, cuya carga esta

contrabalanceada por iones que se pueden intercambiar por aquellos

presentes en la fase mvil.

En funcin del tipo de soporte empleado para la fase estacionaria, se puede

establecer otra clasificacin:

- Cromatografa en columna: el adsorbente se deposita en el interior de una

columna de vidrio.

- Cromatografa en capa fina: una capa de adsorbente de espesor uniforme

se deposita sobre una capa de vidrio, aluminio o plstico.

3.5.1. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA.

Es el mtodo ms general para la separacin y purificacin de compuestos

orgnicos, slidos o lquidos, a escala preparativa.

La fase estacionaria (adsorbente) se deposita en el interior de una columna de

vidrio que termina en un estrechamiento con una llave, y se impregna con una

fase mvil (eluyente). La mezcla a separar se deposita sobre la parte superior

de la fase estacionaria, y la fase mvil atraviesa el sistema. Los compuestos

eluidos, disueltos en la fase mvil, van saliendo de la columna y se recogen en

fracciones. Los menos polares, que son los que se retienen poco en el
59

adsorbente, son los primeros en salir. Los polares quedan ms retenidos y para

su elucin generalmente es necesario incrementar la polaridad del disolvente.

El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna recibe el nombre de

tiempo de retencin. Es caracterstico para cada compuesto en unas

condiciones cromatogrficas determinadas (adsorbente, disolvente, dimetro de

la columna, presin, etc.).

El adsorbente mas utilizado para cromatografa en columna, es la gel de slice.

La elucin de la cromatografa puede realizarse por gravedad o a media presin

(flash chromatography). En este ltimo caso se conecta la cabeza de la

columna a un compresor de media presin o a una lnea de aire comprimido.

El tamao de partcula del gel de slice para cromatografa a media presin es

ms pequeo que el que se utiliza para cromatografa por gravedad. Si en

gravedad se empleara gel de slice de tamao de partcula ms pequeo, la

elucin no se producira ya que se impedira el flujo del disolvente. Sin

embargo, si se aplica presin, se fuerza al disolvente a eluir.(27)

Procedimiento Experimental

Procedimiento experimental para llevar a cabo una cromatografa en columna,

por gravedad.

- Preparacin de la columna por gravedad:

a) Elegir una columna del dimetro adecuado a la muestra que se pretende

separar (cantidad de muestra).


60

b) Sujetar la columna a un soporte utilizando dos pinzas: una deber sujetar

la columna cerca de la llave y otra en la parte de arriba, fuera de la zona

en que la columna este rellena. De este modo, si la columna se rompiera

accidentalmente en la zona del contacto con las pinzas, seria ms fcil la

recuperacin de su contenido.

c) Si la columna no lleva una placa porosa en su parte inferior para impedir el

paso del adsorbente, colocar en el estrechamiento una pequea cantidad

de lana de vidrio. La cantidad de lana de vidrio debe ser la mnima posible

para retener la fase estacionaria sin dificultar el paso del disolvente.

d) Preparacin de la columna: Un procedimiento consiste en llenar la

columna de disolvente y aadir despus el adsorbente dejando que este

se deposite por gravedad, al mismo tiempo que se golpea suavemente la

columna con la mano. Una vez que el absorbente empieza a depositarse

en el fondo, se abre la llave para que salga el disolvente. Otro mtodo

implica la preparacin de una suspensin con el adsorbente y el

disolvente. Se aade un poco de disolvente a la columna y se vierte la

suspensin en el interior de esta. La columna se golpea ligeramente con la

mano para compactar el adsorbente sin formacin de burbujas, a la vez

que se abre la llave para permitir la salida del disolvente. En ambos casos,

despus de compactar se aaden 1-2 cm de lana de vidrio para proteger el

frente del adsorbente.


61

En la cromatografa de columna por gravedad, la superficie superior del

adsorbente (frente) y la franja de lana de vidrio deben quedar completamente

horizontales. Una vez que el adsorbente se ha compactado, el disolvente

debe quedar a la altura del nivel de la lana de vidrio. El adsorbente no debe

secarse nunca, ya que dara lugar a la aparicin de grietas y burbujas de aire.

- Sembrado de la mezcla a separar:

a) Disolver la mezcla a separar (slida o lquida) en la mnima cantidad del

mismo disolvente en el que se va empezar la elucin o en uno de

polaridad menor. Si la muestra resultara insoluble en dichas condiciones,

el sembrado se realiza adsorbiendo la muestra en el adsorbente (silica gel)

antes de introducirlo en la columna. Para ello, se disuelve la muestra en un

disolvente ms polar y se aade una cantidad de adsorbente proporcional

a la cantidad de muestra. El disolvente de la mezcla se elimina con

cuidado en el rota evaporador, ya que al contener un slido, las

posibilidades de proyeccin de la mezcla al tubo de rota evaporador son

grandes. Una vez que el disolvente se a eliminado, tiene que obtenerse

una mezcla homognea, pulverulenta y exenta de disolvente, que se

incorpora a la columna utilizando un embudo de slidos (preparacin de la

cabeza).

b) Depositar con una pipeta la disolucin sobre la lana de vidrio. Si esta

operacin se realiza con una pipeta Pasteur, mas corta, la disolucin debe
62

dejarse resbalar por las paredes de la columna. En ambos casos, se debe

conseguir una franja horizontal uniforme.

c) Abrir la llave para que la disolucin quede inmersa en la lana de vidrio.

d) Cerrar la llave y aadir con pipeta una pequea cantidad de disolvente

para lavar el recipiente en el que se encontraba la disolucin y la pared

interior de la columna. Si es necesario repetir esta operacin un par de

veces. La adicin debe realizarse con cuidado para no modificar el frente

horizontal.

e) Abrir la llave para introducir en la lana de vidrio el producto recogido hasta

que el disolvente quede al nivel de la lana de vidrio.

- Elucin de Fracciones:

a) Aadir el disolvente con cuidado por la pared de la columna, para no

modificar la horizontalidad del frente hasta llenarla.

b) Los componentes de la mezcla a separar deben fluirse manteniendo un

flujo continuo de disolvente.

c) El volumen inicial de disolvente que se recoge, que corresponde al

volumen muerto de la columna, no contendr ningn producto y puede

despreciarse. Despus se utilizan erlenmeyers, tubos de ensayo, viales o

balones para recoger fracciones en pequeos volmenes.

d) El adsorbente nunca debe secarse.

e) Los componentes de la mezcla elyen en orden de polaridad creciente.


63

3.6 FRACCIONAMIENTO BIO-GUIADO

Es una tcnica cuyo objetivo es ser gua para el descubrimiento de nuevos

frmacos a partir de fuentes naturales. Los extractos son preparados a partir de

varios organismos (especies vegetales, organismos marinos, etc.). Estos

extractos son probados frente a diferentes actividades biolgicas

(antimicrobiana, citotxica, inhibidora de enzimas, etc.). El prximo paso es el

aislamiento de los compuestos responsables de la actividad descubierta. Este

proceso es impedido por la falta de conocimientos de las propiedades qumicas

de los compuestos. El proceso de aislamiento debe por tanto ser monitoreado

por pruebas de todas las fracciones aisladas para la determinacin de la

actividad. Solo las fracciones que den un resultado positivo en la prueba

estarn sujetas a ms pasos de separacin y eventualmente la actividad pura

de los compuestos ser obtenida. Este proceso es llamado

FRACCIONAMIENTO BIO-GUIADO. Como se tiene un gran nmero de

fracciones para ser probadas, el mtodo de prueba usado debe ser fcil de

llevar a cabo y la cantidad de sustancia requerida para la prueba debe ser

pequea.

Cuando se comienza un fraccionamiento bio-guiado a partir de un extracto, no

se conoce ninguna de las propiedades qumicas de el o los compuestos

causantes del efecto farmacolgico demostrado en el sistema de prueba usado.


64

Es por tanto importante obtener alguna informacin preliminar acerca de la

polaridad, carga, peso molecular y estabilidad de los compuestos activos a fin

de disear un proceso de aislamiento adecuado. Los mtodos descritos

tambin pueden ser usados para adquirir los conocimientos deseados probando

todas las fracciones obtenidas por actividad en el sistema de prueba

farmacolgico escogido. (41)


65

3.7 GENERALIDADES DE LAS CEPAS SOMETIDAS A BIOENSAYO

3.7.1. Staphylococcus aureus

Morfologa y fisiologa. Clulas esfricas de 1m de dimetro, aparecen como

masas de clulas arracimadas, aunque se encuentran como clulas aisladas,

en parejas y ttradas, los estafilococos jvenes son gram positivos, sin embargo

al envejecer, muchas clulas se vuelven gram negativas, son no mviles, no

forman esporas. Los estafilococos crecen bajo condiciones aerbicas o

microaerfilas y con mayor rapidez a 37 C, pero su pigmentaciones apreciable

a temperaturas entre 20-25 C. Las colonias en medios slidos son redondas,

lisas, elevadas y resplandecientes. La pigmentacin de las colonias en agar

Chapman va desde el amarillo al amarillo dorado intenso. Cuando se cultivan

en agar sangre la mayora de las colonias de Staphylococcus aureus,

aparecen redondas con una zona de -hemlisis. (15)

Son microorganismos relativamente resistentes a la desecacin, a ciertos

desinfectantes, al calor y al cloruro de sodio 9%. Son sensibles a las actividades

bacteriostticas del trifenilmetano y otros colorantes, adems a los antibiticos.

Los estafilococos producen catalasa, lo que los distingue de los estreptococos.

Tienen la particularidad de fermentar con lentitud muchos carbohidratos y

producen cido lctico pero no gas y su actividad proteoltica varia de una cepa

a otra. (37)

El Staphylococcus aureus es la nica especie que tiene la capacidad y poder

enzimtico de coagular el plasma oxalatado, en presencia de un factor


66

contenido en muchos sueros; esto se asocia con la formacin de la toxina

hemoltica que tiene alto grado de virulencia, se encuentra como

microorganismo de vida libre en el ambiente y vas respiratorias. En los

hospitales las zonas de mayor riesgo de infecciones estafilococcicas graves son

las salas de cuna de recin nacidos, unidad de cuidados intensivos, salas de

operaciones y las salas de quimioterapia del cncer. (15)

Los estafilococos producen enzimas como: catalasa, coagulasa, hemolisinas,

toxinas como: leucocidinas, exfoliativa, la del sndrome del choque txico y

enterotoxinas (de la A a la F) producidas por casi el 50% de las cepas de

Staphylococcus aureus, responsables del envenenamiento con alimentos.

Los estafilococos son patgenos oportunistas, habitualmente las infecciones

producidas por estafilococos son cutneas. El prototipo de infeccin

estafilocccica es el furnculo o cualquier absceso localizado. Entre las

enfermedades ms comunes producidas por Staphylococcus aureus son:

Neumona estafilocccica, sndrome de la piel escaldada, sndrome de shock

toxico y otras enfermedades respiratorias. (12)

3.7.2. Streptococcus pneumoniae

Morfologa y fisiologa: son diplococos tpicos gram positivos, lanceolados o se

presentan en cadena de tres o mas clulas individuales, esfricas, de 0.5 a 1.0

m de dimetro. (23)
67

La hemlisis en agar sangre es de importancia considerable en la subdivisin

del gnero de estreptococos. Los estreptococos que producen estreptolisina o

o s (toxinas) producen una gran zona de hemlisis completa de clulas

sanguneas rojas por lo que se conocen como estreptococos -hemolticos; por

otra parte los estreptococos que no producen hemlisis, originan una zona

verde caf alrededor de sus colonias, la cual se debe no a hemlisis verdadera

sino a decoloracin y prdida de potasio de las clulas rojas; estos pertenecen

a los estreptococos -hemolticos. (3) El Streptococcus pneumoniae forma una

pequea colonia redonda, traslcida, mucoide, al principio en forma de domo y

despus desarrollan una placa central con un reborde elevado; son hemolticos

sobre agar sangre y su crecimiento aumenta con 5 a 10% de CO2.(23)

Muchos estreptococos son miembros de la flora normal del cuerpo humano.

Solo producen enfermedad cuando se establecen en regiones del cuerpo donde

no se encuentra normalmente; por ejemplo los neumococos son habitantes

normales de las vas respiratorias superiores del humano y pueden causar

neumona, sinusitis, otitis, bronquitis, bacteriemia, meningitis y otros procesos

infecciosos. Los alcohlicos y las personas mayores con enfermedad debilitante

son especialmente susceptibles. Sin embargo la sensibilidad de los

neumococos a los derivados de la penicilina hace posible una rpida curacin

para la mayora de los casos de infecciones neumoccicas. (23)


68

3.7.3. Pseudomona aeruginosa

Morfologa y fisiologa. Las clulas de Pseudomona aeruginosa varan

considerablemente de tamao y proporciones, pero generalmente aparecen

como bastoncitos delgados, pequeos, de 1.5 a 3 m de largo y 0.5 m de

ancho frecuentemente unidos a pares y en cadena corta. Son flagelos polares

nicos por que la bacteria tiene movimientos muy activos, no forma cpsulas ni

esporas. Las esporas son grandes y diseminadas, de bordes irregulares y

consistencia grasosa.

Pseudomona aeruginosa se desarrolla fcilmente en todos los medios de

cultivo ordinarios, mas rpidamente a temperatura de 30 a 37 C, requiere

condiciones aerobias.

Su capacidad fermentativa es limitada; produce cido a partir de glucosa, pero

no ataca otros carbohidratos. En leche tornasolada produce reaccin alcalina;

forma un coagulo blando, seguido de peptonizacin rpida y reduccin del

indicador.

Una de las caractersticas mas especiales de Pseudomona aeruginosa es la

produccin de pigmento soluble, verde azulado que no tie las colonias u otras

masas en desarrollo, sino que se difunde en el medio. Algunas cepas tienen

actividad hemoltica. Entre los pigmentos producidos por Pseudomona

aeruginosa estn la piocianina, una sustancia azulosa soluble en agua y en


69

cloroformo, que posee cierta actividad antimicrobiana, y la fluorescena una

sustancia verdosa, fluorescente, hidrosoluble, insoluble en cloroformo.

En el ser humano la bacteria se encuentra implicada en una amplia variedad de

afecciones supurativas y de otra naturaleza. Se encuentra en cultivo puro de

abscesos de diferentes partes del cuerpo, especialmente el odo medio.

Tambin ocurre en caso de endocarditis, neumona y meningitis, aun que raros,

y en los cuales la Pseudomona aeruginosa parece ser el nico

microorganismo casual.

Pueden producirse infecciones despus de ciruga y tiene importancia especial

en infeccin de quemaduras, donde tales infecciones son la causa mas

frecuente de muerte. Las infecciones por Pseudomona son difciles de tratar,

por la resistencia de los microorganismos a los antibiticos. (15)


70

3.8 MTODO DE DIFUSIN EN PLACA

Probablemente la tcnica de ensayo ms ampliamente utilizada, aunque no

necesariamente la mejor, es el mtodo de difusin en agar, tambin conocido

como mtodo de Kirby-Bauer, aqu se usan discos de papel filtro en envase

poroso, que contiene cantidades medidas del frmaco, no as en el mtodo de

Kirby-Bauer Modificado donde se da la utilizacin de cilindros de acero

inoxidable sin fondo donde es colocada la solucin de prueba; luego se coloca

ya sea el disco o el cilindro sobre un medio slido sembrado con abundantes

microorganismos de prueba. Despus de incubacin, el dimetro de la zona

clara de inhibicin que rodea el frmaco depositado se toma como medida de

la potencia inhibidora del frmaco contra el microorganismo en particular de

prueba.

Este mtodo esta sujeto a la influencia de muchos factores fsicos y qumicos

adems de la simple interaccin entre el frmaco y el microorganismo (por

ejemplo, la naturaleza del medio y la del frmaco). No obstante, la

estandarizacin de las condiciones permite efectuar una prueba cuantitativa de

la potencia del frmaco o de la susceptibilidad del microorganismo.

El empleo de un solo disco para cada antibitico y la estandarizacin cuidadosa

de las condiciones de la prueba permiten conocer la susceptibilidad o la

resistencia de un microorganismo al comparar la magnitud de la zona de

inhibicin contra un estndar del mismo frmaco (mtodo de Kirby-Bauer).


71

La inhibicin alrededor de un disco que contiene una cierta cantidad de

antimicrobiano no implica la susceptibilidad a esa misma concentracin del

frmaco por mililitro de medio, sangre u orina.

La prueba en disco mide la capacidad del frmaco para inhibir el crecimiento de

la bacteria. Los resultados se correlacionan de manera razonablemente bien

con la respuesta teraputica en aquellos procesos patolgicos donde las

defensas del cuerpo pueden con frecuencia, eliminar microorganismos

infecciosos. (22)
IV. DISEO METODOLGICO
73

4.0 DISEO METODOLGICO

4.1 Tipo de estudio

La presente investigacin es un tipo de estudio retrospectivo, prospectivo y

experimental, debido a que se basa en estudios realizados anteriormente y a la

vez propone una nueva alternativa mediante datos obtenidos

experimentalmente, adems es hipottico-deductivo ya que a partir de la

informacin retomada de las referencias bibliogrficas, permite formular la

siguiente hiptesis: Las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de

etilo puro y metanol puro del extracto diclorometnico de la goma resina de

Eucalyptus citriodora posee actividad antimicrobiana contra Staphylococcus

aureus, Pseudomona aeruginosa y Streptococcus pneumoniae.

La investigacin se dividi en tres etapas:

Investigacin Bibliogrfica

Metodologa de Campo

Metodologa de laboratorio

4.2 Investigacin Bibliogrfica:

Consultas de libros, trabajos de graduacin, manuales, etc. en la

biblioteca de la Facultad de Qumica y Farmacia, Universidad de El

Salvador (UES) y Universidad Nueva San Salvador (UNSA).

Revistas cientficas

Scifinder scholar (base de datos mundial)


74

4.3 Metodologa de Campo

La recoleccin de la goma-resina del rbol de Eucalyptus citriodora se realiz

en el Campus Universitario, en la zona del parqueo de la Facultad de Qumica y

Farmacia y la Facultad de Ciencias Agronmicas durante la poca seca. La

muestra se recolect en frascos de vidrio color mbar con tapadera de metal y

se almacen en un lugar fresco y seco, (fig. 11).

Figura . 11 Recoleccin de goma-resina de Eucalyptus citriodora.

4.4 Metodologa de laboratorio

4.4.1 CARACTERIZACIN ORGANOLPTICA

Se determinaron las caractersticas organolpticas de la goma-resina: color,

olor, sabor y consistencia.


75

4.4.2 PARTE FITOQUMICA

4.4.2.1Obtencin del extracto etanlico de la goma-resina del Eucalyptus

citriodora.

La muestra de la goma-resina seca o cristalizada se pulveriz en un mortero,

luego se pesaron 2000g. de la muestra, y se realiz la extraccin con etanol al

95% en un Soxhlet ( anexo 2). Se concentr el extracto etanlico por medio

del rota evaporador (anexo 2).

4.4.2.2 Obtencin del extracto diclorometnico.

A partir del extracto etanlico, se realiz posteriormente la particin lquido-

lquido agua/diclorometano, obteniendo as el extracto diclorometnico.

4.4.2.3 Cromatografa de columna

Procedimiento

Se utiliz una columna cromatogrfica de vidrio de un dimetro adecuado a la

cantidad de muestra, si la columna no lleva una placa porosa en su parte

inferior para impedir el paso del adsorbente, se debe colocar en el

estrechamiento una pequea cantidad de lana de vidrio. La cantidad de lana

de vidrio debe ser la mnima posible para retener la fase estacionaria sin

dificultar el paso del disolvente.

Preparacin de la columna

Cromatografa a media presin (Cromatografa Flash): consiste en aadir un

poco de n-hexano a la columna y se vierte una suspensin de adsorbente y


76

disolvente en el interior de esta. La columna se golpea ligeramente con la mano

para compactar el adsorbente sin formacin de burbujas, a la vez que se abre la

llave para permitir la salida del disolvente. Despus de compactar se aaden 1-

2 cm de lana de vidrio para proteger el frente del adsorbente. Se conecta la

cabeza de la columna a un compresor de aire, asegurndola con una pinza clip,

y hacer pasar el disolvente a travs de la gel de slice para que se compacte.

La superficie superior del adsorbente (frente) y la franja de lana de vidrio deben

quedar completamente horizontales. Una vez que el adsorbente se ha

compactado, el disolvente debe quedar a la altura del nivel de la lana de vidrio.

El adsorbente no debe secarse nunca, ya que dara lugar a la aparicin de

grietas y burbujas de aire.

Figura 12 Empacado de la columna de cromatografa.


77

- Sembrado de la muestra (extracto diclorometnico) a separar.

El sembrado se realiz adsorbiendo la muestra en el adsorbente (silica gel)

antes de introducirlo en la columna. Para ello, se disolvi la muestra en un

disolvente ms polar (Ej. acetona, diclorometano, etc.), y se aadi una

cantidad de adsorbente proporcional a la cantidad de muestra. El disolvente de

la mezcla se elimina con cuidado en el rota evaporador, ya que al contener un

slido, las posibilidades de proyeccin de la mezcla al tubo de rota evaporador

son grandes. Una vez que el disolvente se ha eliminado, tiene que obtenerse

una mezcla homognea, pulverulenta y exenta de disolvente, que se incorpora

a la columna utilizando un embudo de slidos (preparacin de la cabeza), (fig.

13).

Figura 13 Preparacin de la cabeza de la columna.


78

- Elucin de las fracciones:

Aadir 500 ml de n-hexano con cuidado por la pared de la columna, para no

modificar la horizontalidad del frente hasta llenarla.

El volumen inicial de disolvente que se recoge, que corresponde al volumen

muerto de la columna, no contendr ningn producto y puede despreciarse.

Luego adicionar la mezcla de solventes de la siguiente forma:

1. n-hexano : acetato de etilo 10%

2. n-hexano: acetato de etilo 30%

3. n-hexano:acetato de etilo 50%

4. n-hexano:acetato de etilo 70%

5. Acetato de etilo puro

Adicionar metanol puro para lavar la columna.

Las fracciones que se examinaron por medio de ensayos microbiolgicos

fueron: n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo puro y metanol puro.

- Preparacin de las diluciones de las fracciones n-hexano:acetato de

etilo 70%, acetato de etilo puro y metanol puro de la goma-resina del

Eucalyptus citriodora (Eucalipto).

Se parti de la obtencin de una solucin madre, esta se realiz basndonos en

la tesis de Mndez R. y otros. 2006. Facultad de Qumica y Farmacia,

Universidad de El Salvador.
79

Preparacin de la solucin madre: Se pesaron en una balanza analtica

exactamente 750 mg de cada una de las fracciones y se diluyeron en etanol al

70% hasta llevar a volumen cada una de las fracciones en un baln volumtrico

de 25 mL, luego se homogeniza la solucin y para el resto de las diluciones que

se elaboraron, se realizaron utilizando pipetas volumtricas, tomando una

determinada alcuota y llevando a volumen en balones volumtricos. Luego se

homogeniza la solucin y as sucesivamente para cada una de las diluciones.

(anexo 5)

4.4.3 ENSAYOS MICROBIOLGICOS.

4.4.3.1 Pruebas de identificacin microbiolgica.

A los microorganismos se les realizaron tres clases de pruebas:

Caractersticas Macroscpicas

Caractersticas Microscpicas

Pruebas de Identificacin

Caractersticas macroscpicas.

La identificacin se bas en el crecimiento que tienen los diferentes

microorganismos en medios de cultivos selectivos y diferenciales, para ello se

utilizaron los siguientes medios de cultivo:


80

Cuadro 8 Caractersticas macroscpicas

MICROORGANISMOS MEDIO DE CULTIVO COLONIAS


Colonias de color
Staphylococcus aureus Agar Chapman amarillo dorado.
Colonias de color negro
Agar Baird Parker lustroso, redondas de
borde convexo.
Colonias grandes,
Pseudomona aeruginosa Agar Cetrimide diseminadas con
pigmento verde azulado.
Colonias trasparentes,
Streptococcus pneumoniae Agar Sangre pequeas, redondas,
con el tiempo desarrollan
una depresin central,
una -hemlisis rodea
casi siempre a las
colonias.

Caractersticas Microscpicas. (anexos 6,7)

Se utiliz el mtodo de coloracin de Gram, para observar la morfologa de los

microorganismos a ensayar.

Pruebas de Identificacin. (anexo 9, 10, 11)

Para la identificacin y diferenciacin de las bacterias utilizadas en estudio se

realizaron las siguientes pruebas:

Cuadro 9 Pruebas de Identificacin Microbiolgica.

MICROORGANISMO PRUEBA DE IDENTIFICACIN

Staphylococcus aureus Catalasa, Coagulasa


Pruebas bioqumicas: Agar triple azcar y
Pseudomona aeruginosa hierro (TSI), Citrato, Indol; Rojo de Metilo;
Movilidad; Voges-Proskauer,Oxidasa.

Streptococcus pneumoniae Discos de Optoquin


81

Para conservar las cepas, se hicieron resiembras semanales en placas

conteniendo Tripticasa soya agar (TSA), a excepcin del Streptococcus

pneumoniae, que se resembr en Agar Sangre y se conservo en leche

descremada a -5 C. Y las otras cepas se mantuvieron en refrigeracin a

menos de 30 C, adems de conservarse en caldo BHI.

4.4.3.2 Determinacin de la actividad antimicrobiana

Mtodo Cilindro Placa

(Mtodo de Kirby Bauer Modificado)

El fundamento de este mtodo es la difusin de la sustancia en investigacin,

colocada en un cilindro vertical sobre una capa de agar (Muller-Hinton)

solidificado, que contiene en la superficie el microorganismo de prueba, de tal

manera, que si es susceptible, se forma un halo de inhibicin alrededor del

cilindro. ( 22 )

Preparacin de la suspensin de microorganismos.

Del cultivo de Pseudomona mantenido en la placa de agar TSA: se transfiere

cierto nmero de colonias a un tubo de ensayo utilizando un asa bacteriolgica.

El tubo contiene 10 mL de solucin salina isotnica estril 0.85%. Este

procedimiento se repetir hasta que se obtenga una turbidez equivalente al

estndar Mc Farland de 0.5%, el cual se preparara as 0.05ml de BaCl2 + 9.95

mL de H2SO4. Obtenindose una densidad celular aproximada de 1.5 x108


82

microorganismos/mL (MO/mL). De igual manera se realiz para

Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. (anexo 12)

Inoculacin de las placas

Por el mtodo del extendido, utilizando hisopos estriles impregnados con la

suspensin del microorganismo equivalentes a 1.5x108 MO/mL se inocula

uniformemente la superficie del medio Agar Muller Hinton para Pseudomona

aeruginosa, y Staphylococcus aureus. Para el Streptococcus pneumoniae

el medio Agar Muller Hinton se modifica aadindole 7% de sangre, con la

finalidad de cubrir los requerimientos de dichas bacterias.

El medio se deja secar con la suspensin de microorganismos durante 10

minutos a temperatura ambiente, en condiciones estriles.

Inoculacin con la solucin de prueba.

Se colocan sobre la superficie del medio inoculado cuatro cilindros de acero

inoxidable, a intervalos de 90 entre cada uno; luego se llena con una

micropipeta con la solucin de prueba y se incuba a 37 C por 24 y 48 horas.

Los dimetros de inhibicin: se miden con un pie de rey. Las pruebas se

hicieron por duplicado para cada una de las diluciones de cada fraccin, se

colocaran discos de gentamicina para Pseudomona aeruginosa, de ampicilina,

para Streptococcus pneumoniae y penicilina para Staphylococcus aureus,

los cuales sirven como parmetro de comparacin de la eficacia de cada


83

fraccin. Adems de los parmetros antes mencionados; se llevaron dos placas

como blanco una que contena en los cilindros nicamente etanol y otra con

yodo al 2% en presencia del microorganismo inoculado.

Ver procedimiento y esquema del Mtodo de Kirby Bauer Modificado (anexo

13)

Cuadro 10 Parmetros de referencia de los halos de inhibicin. ( 5 )

MICROORGANISMO ANTIBIOTICO RESISTENTE INTERMEDIO SUSCEPTIBLE

Pseudomona
Gentamicina 12 mm 13-14 mm 15 mm
aeruginosa

Staphylococcus
Penicilina 11 mm 12-13 mm 14 mm
aureus

Streptococcus
Ampicilina 18 mm 19-25 mm 26 mm
pneumoniae
V. RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
85

5.0 RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Caracterizacin organolptica del extracto diclorometnico de la goma-

resina de Eucalyptus citriodora.

Una vez obtenido el extracto diclometnico de la goma-resina por medio de la

particin lquido-lquido agua/diclorometano, se determinaron las caractersticas

organolpticas prcticas como son color olor y consistencia.

Cuadro 11 Caractersticas organolpticas de la goma-resina del

Eucalyptus citriodora.

PARAMETROS CARACTERSTICAS

Color Amarillo

Olor Agradable

Consistencia Slido
86

Determinacin del rendimiento del extracto diclorometnico de la goma-

resina del Eucalyptus citriodora.

Se realizaron cuatro extracciones con etanol al 95% a partir del la goma-resina

del Eucalyptus citriodora.

Cantidad de muestra = 2,102.8 gramos

Cantidad de extracto etanlico obtenido = 2,097.4 gramos

Porcentaje de rendimiento =

2,102.8 g ------------- 2,097.4 g


100 g ------------- x
X = 99.74 %
De igual manera se realizaron cuatro particiones lquido-lquido

agua/diclorometano a partir del extracto etanlico obtenido.

Cantidad de extracto etanlico = 2,097.4 g

Cantidad de extracto diclorometnico obtenido = 158.1 g

Porcentaje de rendimiento =

2,097.4 g --------------- 158.1g


100 g --------------- x
X = 7.53 %

Cantidad de extracto diclorometnico utilizado= 94.6 g

Cantidad obtenida de fraccin al 70 %= 5.91g

Cantidad obtenida de fraccin de acetato de etilo puro= 28.23 g

Cantidad obtenida de fraccin de metanol puro= 2.45 g


87

Resultados del Anlisis Espectroscpico realizado por medio de RMN-1H a

las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo puro y

metanol puro procedentes de la goma-resina del Eucalyptus citriodora

(Eucalipto)

Anlisis y discusin del espectro de RMN-1H de la fraccin n-

hexano:acetato de etilo 70% (CD3COCD3 , 300 MHz ).

Del extracto diclorometnico de la goma-resina, se obtuvieron los siguientes

resultados: seales a H= 12.75, 12.74, 12.67, 12.53, 12.52, 12.51, 12.49,

12.17, 12.14, 12.03, 11.99, 11.84 y 11.67 ppm; todas como singulete ancho

(s.a), que corresponden a protones quelatados, los cuales se producen entre el

OH de la posicin 5 y el grupo carbonilo de la posicin 4 de los flavonoides;(25)

lo que nos indica la posibilidad de al menos 13 diferentes flavonoides.(fig.

15).

Adems se observo en la regin 6.7 a 7.5 ppm, cuatro seales tpicas de un

sistema p-hidroxi, presentes en las estructuras de los flavonoides, se aprecian

tambin en esta zona seales de protones aromticos.

Se observa otra seal a H= 5.1 ppm ( d, J = 11.61 Hz ) que corresponde al

protn benclico de los flavonoides, tambin se aprecia una seal a H= 4.6 ppm

( d, J = 10.90 Hz ) correspondiente a H-3 geminal al OH de los flavononoles;

que es caracterstico en esta zona del espectro de protn. (25) (fig. 16).
88

A H= 7. 86 ppm, aparece un singulete correspondiente a H-2 de isoflavonas,

(25) (fig. 17); una seal a H= 6.1 ppm (d, J = 13.6 Hz) correspondiente al H-

3 vinlico de una chalcona, (25)(fig. 18) .La seal de H-2 se encuentra

solapada entorno a 7.5 ppm.

A H= 6.3 a 6.5 ppm aparecen dos dobletes (J = 15.9 Hz) los cuales indican un

sistema trans de protones vinlicos, las que corresponden al H-8 de dos

posibles cidos fenlicos. Las seales del H-7 se encuentran ocultas en la

regin de los protones aromticos. (19, 25) (fig. 19).

Aparecen seales singuletes entre 3.77 y 3.8 ppm que son caractersticas de

protones de grupos metoxilos los cuales son frecuentes en flavonoides y cidos

fenlicos. (19)

Observamos seales correspondientes a metabolitos secundarios no

caracterizados en la regin de 1 a 2 ppm (d, H = 1.6 ppm, J = 7.2 Hz; t H =1.5

ppm; s a, H = 2.1 ppm y m, H = 1.2 ppm); (fig 19).

Los datos de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70% se resumen

en el cuadro 12.
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

89
Figura 14: Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%
(CD3COCD3, 300 MHz)
OH
B
MeO O MeO O
A C A C
OH
OH O OH O
OH
OH
B
MeO OH
A Ampliacin de la zona de H
quelatados de flavonoides

OH O

12.80 12.60 12.40 12.20 12.00 11.80 11.60 11.40

Figura 15: Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70 % (CD3COCD3, 300 MHz).
En esta ampliacin de espectro apreciamos seales de protones quelatados, que se producen entre
el OH y el grupo carbonilo de los flavonoides (rojo).

90
OH
H2 B
MeO O
A C OH
Sistema H3
p-hidroxi
OH O
Flavononol
H- 3

H- 2

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

Figura 16: Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70 % (CD3COCD3, 300 MHz).
En la regin 6.7 a 7.5 ppm se observan cuatro seales tpicas de un sistema p-hidroxi, presentes
en las estructuras de los flavonoides (azul). El protn benclico (verde) aparece a H= 5.1 ppm
y el H-3 de los flavononoles (rojo) a H= 4.6 ppm.

91
MeO O 2 H
A C
H-2
Sistema B
p-hidroxi OH O
OH
Isoflavona

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

Figura 17: Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70 % (CD3COCD3, 300 MHz).
A H= 7. 86 ppm, aparece un singulete correspondiente a H-2 de isoflavonas (azul).

92
OH
B
MeO OH
2
Sistema
p-hidroxi
A
3

OH O
Chalcona

H- 3

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

Figura 18: Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70 % (CD3COCD3, 300 MHz).
Seal a H= 6.1 ppm (d, J = 13.6 Hz) correspondiente al H-3 vinlico de una chalcona (azul).
La seal de H-2 se encuentra solapada entorno a 7.5 ppm.

93
H O
1 7
HO
8 OH
H
HO
H- 7 H- 8 cido fenlico
H- 8
(Ej. cido cafeico)

7.60 7.40 7.20 7.00 6.80 6.60 6.40 6.20

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

Figura 19: Espectro de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70 % (CD3COCD3, 300 MHz).
A H= 6.3 a 6.5 ppm aparecen dos dobletes (J = 15.9 Hz) los cuales indican un sistema
trans de protones vinlicos, las que corresponden al H-8 de dos posibles cidos
fenlicos. Las seales del H-7 se encuentran ocultas en la regin de los protones aromticos.

94
95

Cuadro 12 Datos de RMN-1H de la fraccin n-hexano:acetato de

etilo 70% (CD3COCD3, 300 MHz ).

Tipo de protn.
H ppm J ( Hz )
Metabolito secundario

12.75, 12.74, 12.67,


12.53, 12.52, 12.51, H quelatados de
_
12.49, 12.17, 12.14, flavonoides
12.03, 11.99, 11.84, 11.67
6.7-7.5 _ H de sistema p-hidroxi
7.86 s _ H-2 de isoflavonoides
H-8 vinlico trans de
6.50 d 15.9
cidos fenolicos
6.30 d 15.9 H-8 de cido fenlico
6.10 d 13.6 H-2 de una chalcona
H-2 protn bencilico de
5.10 d 11.61
flavonoides
H-3 geminal al OH de
4.60 d 10.89
los flavononoles
3.80 s _ H de metoxilos
Seal de sustancia
2.10 sa _
desconocida
Seal de sustancia
1.60 d 7.2
desconocida
Seal de sustancia
1.50 t 7.7
desconocida
Seal de sustancia
1.20 m _
desconocida
96

Anlisis y discusin del espectro de RMN-1H de la fraccin acetato de

etilo puro (CD3COCD3, 300 MHz).

En el espectro de RMN-1H de la fraccin acetato de etilo puro, se observ entre

7.4 a 7.7 ppm un sistema p-hidroxi tpico de los flavonoides (fig. 20),

adems aparecen pequeas seales de protones aromticos.

De acuerdo a las publicaciones consultadas, el o los glicsidos se encuentran

presentes en la posicin 5 de la estructura de los flavonoides, de esta manera

se justifica la no aparicin de seales de protones quelatados en el espectro de

RMN-1H.(7)

Se observ un doblete a H = 6.88 ppm ( J = 8.7 Hz ) perteneciente a un protn

en posicin orto de flavonoides o de cidos fenlicos; otra seal singulete a H=

7.99 ppm, que pertenece a H-2 de la isoflavona, (25) (fig. 20).

La estereoqumica trans de los cidos fenlicos, (19)(fig. 21) se determin

mediante una seal doblete a H = 6.5 ppm ( J = 16.1 Hz) que corresponde al H-

8 ( no se observan seales correspondientes al H-7 debido a que se encuentran

solapados en la regin de 7.4 a 7.9 ppm). Aparece otro sistema trans de los

protones vinlicos a H = 6.3 ppm ( J = 16.4 Hz), que confirma la presencia de

otro cido fenlico que podra estar unido a un glicsido como en el caso del

cido clorognico, debido a la polaridad de la fraccin (7) ( fig. 21).


97

En la regin de 3.5 a 4.7 ppm, se observan varias seales que corresponden a

protones gemnales a grupos OH de los azcares, adems se aprecia una seal

ancha a 3.0 ppm correspondientes al hidroxilo, (fig. 21).

Aparecen en la regin de 0.7 a 1.3 ppm seales singuletes, correspondiendo a

protones de triterpenos (fig. 22), los cuales podran estar unidos a azcares,

para que sea posible su aparicin en esta fraccin.

Los datos de RMN-1H de la fraccin de acetato de etilo puro se resumen en el

cuadro 13.
MeO O 2 H
A C
5
B
OAz O
OH
Isoflavona
H- 2
Sistema
p-hidroxi

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Figura 20: Espectro de RMN-1H de la fraccin AcOEt puro (CD3COCD3, 300 MHz).
Observamos el sistema p-hidroxi tipico de flavonoides, ademas se observa
una seal singulete H= 7.99 ppm, que pertenece a H-2 de la isoflavona.

98
O HO O CO2H
OH
8 OH
H- 8 cido fenlico
Ej. cido clorognico

OH
OH

6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 6.35 6.30 6.25

H de azucares

O-H

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Figura 21: Espectro de RMN-1H de la fraccin AcOEt puro (CD3COCD3, 300 MHz).
La estereoquimica trans de los cidos fenlicos, se determino mediante
una seal doblete a H = 6.5 ppm que corresponde al H-8 (azul). Aparece otro
sistema trans de los protones vinlicos a H = 6.3 ppm. Las partes

99
marcadas en rojo corresponden a seales de azcares.
AzO Triterpeno

H de azucares

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

100
Figura 22: Espectro de RMN-1H de la fraccin AcOEt puro (CD3COCD3, 300 MHz).
Aparecen en la regin de 0.7 a 1.3 ppm seales singuletes, correspondientes
a protones de triterpenos (azul).
101

Cuadro 13 Datos del espectro de RMN-1H de la fraccin acetato de

etilo puro (CD3COCD3, 300 MHz)

Tipo de protn.
H ( ppm) J (Hz)
Metabolito secundario

7.99 s _ H-2 de isoflavonoides

Sistema p-hidroxi de
7.40-7.70m _
flavonoides

H de flavonoide o cido
6.88 d 8.7
fenlico en posicin orto

H-8 trans de cidos


6.50 d 16.1
fenlicos

H-8 trans de cidos


6.30 d 16.4
fenlicos

H geminal al OH de
3.50-4.70 m _
azcares

3.00 sa _ OH de azcares

0.70-1.30 s _ H de triterpenos
102

Anlisis y discusin del espectro de RMN-1H de la fraccin metanol puro

(MOD3, 300 MHz).

Como en el caso de la fraccin anterior se observa una seal singulete a H=

7.88 ppm del H-2 de los isoflavonoides. (25) (fig. 23).

Presenta seales entre 7.3 a 7.7 ppm pertenecientes a protones aromticos de

cidos fenolicos y de isoflavonoides.

Se observa dos dobletes a H= 6.3 ppm y 7.7 ppm; J = 15.8Hz correspondientes

a los protones del H-8 y H-7 de los cidos fenlicos presentes en la fraccin,

(19) ( fig. 24).

En la regin de 3.4 a 4.0 ppm, se aprecian seales tpicas de protones

geminales a grupos OH de azcares (fig. 14).

Al igual que en el espectro de la fraccin anterior, aparecen seales entre 0.7 y

1.5 ppm que corresponderan a protones de triterpenos que deben estar unidos

a grupos azcares, para que sea posible su presencia en esta fraccin (fig.

25).

Adems se observa una seal singulete a H= 1.9 ppm de metilos sobre dobles

enlaces correspondientes a triterpenos (25)(fig. 25).

Los datos de RMN-1H de esta fraccin se resumen en el cuadro 14.


Isoflavona
H- 2

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

103
Figura 23: Espectro de RMN-1H de la fraccin MeOH puro (MOD3, 300 MHz).
Seal singulete a H= 7.88 ppm del H-2 de los isoflavonoides (Azul).
O HO O CO2H
OH
8 OH
7
cido fenlico
Ej. cido clorognico

OH
OH

H- 8 H de azucares
H- 7

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Figura 24: Espectro de RMN-1H de la fraccin MeOH puro (MOD3, 300 MHz).
Dos dobletes a H= 6.3 ppm y 7.7 ppm; J = 15.8Hz correspondientes

104
a los protones del H-8 y H-7 de los cidos fenlicos. De 3.4 a 4.0 ppm,
se aprecian seales tpicas de protones geminales a grupos OH de azcares.
H2O
CD3OD

H de azucares

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Figura 25: Espectro de RMN-1H de la fraccin MeOH puro (MOD3, 300 MHz).

105
Seales entre 0.7 y 1.5 ppm que corresponderan a protones de triterpenos
que deben estar unidos a grupos azcares(cuadro azul).
106

Cuadro 14 Datos del espectro de RMN-1H de la fraccin metanol puro

(MOD3, 300 MHz)

Tipo de protn.
H (ppm) J (Hz)
Metabolito secundario.

7.88 s _ H-2 de isoflavonoides

H-7 trans de cidos


7.70 d 15.8
cinmicos

H-8 trans de cidos


6.30 d 15.8
cinmicos

H geminal a grupos OH
3.30-3.80 m _
de azcares

H de metilos sobre

1.90 s _ dobles enlaces de

triterpenos

0.70-1.50 s _ H de triterpenos
107

Resultados de la evaluacin microbiolgica.

Pruebas de identificacin de Staphylococcus aureus, Pseudomona

aeruginosa y Streptococcus pneumoniae.

Cuadro 15 Resultados de las pruebas de identificacin del

Staphylococcus aureus.

PRUEBA RESULTADO

Coloracin al Gram: microorganismos Gram positivos. Se


Caractersticas
observan bacterias en forma de cocos, unidos en pares y
microscpicas en racimos, color azul.
Prueba positiva (+)
En medio selectivo agar Chapman se observan colonias
de color amarillo dorado.
Caractersticas
En el medio agar Bair-Parker se observan colonias de
macroscpicas color negro lustroso con halo alrededor, redondas de
borde convexo.
Prueba positiva (+)
Catalasa: al colocar H2O2 se produce una efervescencia

Identificacin y rpida.
Prueba positiva (+).
diferenciacin
Coagulasa: se observa una coagulacin total del plasma.
Prueba positiva (+)

Estas pruebas son caractersticas del Staphylococcus aureus, donde se

confirma que la bacteria analizada se encuentra en ptimas condiciones y sin

contaminacin de otro microorganismo.


108

Figura 26 Staphylococcus aureus, en tincin al Gram.

Microorganismo Gram positivo.

Figura 27 Staphylococcus Figura 28 Staphylococcus

aureus en agar Chapman. aureus en agar

Baird Parker.
109

Figura 29 Prueba de Catalasa


Positivo(+) Burbujeo vigoroso de perxido de hidrogeno.

Figura 30 Prueba de Coagulasa


Positivo(+) Coagulacin parcial del plasma
110

Cuadro 16 Morfologa microscpica y macroscpica de la Pseudomona


aeruginosa.

PRUEBA RESULTADO

Caractersticas Coloracin al Gram: microorganismo Gram negativo, se


observan bacterias en forma de bacilos pequeos, unidos en
microscpicas
pares y cadenas cortas, color rosado.
Prueba positiva (+)
Caractersticas En medio selectivo agar Cetrimide, se observan colonias
grandes, diseminadas con pigmento verde azulado.
macroscpicas
Prueba positiva (+)

Cuadro 17 Pruebas de identificacin y diferenciacin de Pseudomona


aeruginosa.

PRUEBAS BIOQUIMICAS RESULTADO

TSI K/K

Citrato +

Indol -

Rojo de metilo -

Voges Proskauer -

Movilidad +

Oxidasa +

K/K = Pico de flauta alcalina/ Profundidad alcalina

(+) = Positivo (-) = Negativo


111

Estas pruebas son caractersticas de la Pseudomona aeruginosa, donde se

confirma que la bacteria analizada se encuentra en ptimas condiciones y sin

contaminacin de otro microorganismo.

Figura 31 Pseudomona aeruginosa en tincin al Gram.

Microorganismo Gram negativo.

Figura 32 Pseudomona aeruginosa en agar Cetrimide.


112

Figura 33 Prueba (+) de Movilidad, Figura 34 Prueba (-) de Rojo de


crecimiento de la bacteria metilo, no hay apari-
ms all de la lnea de cin de color rojo
incisin. intenso.

Figura 35 Prueba (+) de Citrato, Figura 36 Prueba (-) de Indol,


crecimiento de la no hubo formacin
bacteria en el medio de anillo violceo
y cambio de color en la interfase.
verde-azul.
113

Figura 37 Prueba (-) de Voges Figura 38 Prueba de TSI, no hay


Proskauer no hay fermentacin de
cambio de color. azcares, por lo que el
pico es alcalino y el
fondo es alcalino (K/K).

Figura 39 Prueba positiva de Oxidasa,


viraje de color a prpura-negruzco
intenso presencia de enzimas oxidasas.
114

Cuadro 18 Pruebas de identificacin del Streptococcus pneumoniae.

PRUEBA RESULTADO

Coloracin al Gram: Microorganismo Gram positivo, se

Caractersticas observan bacterias en forma de cocos, unidos en cadenas

microscpicas cortas, color azul.

Prueba positiva (+)

En medio Agar Sangre, se observan colonias trasparentes,

pequeas, redondas, inicialmente convexas y con el tiempo


Caractersticas
desarrollan una depresin central, una -hemlisis rodea
macroscpicas
casi siempre a las colonias.

Prueba positiva (+)

En una placa de Agar Sangre, se coloca un disco de

Identificacin y Optoquin, el cual presenta una zona de inhibicin alrededor

diferenciacin de ste.

Prueba positiva (+)

Estas pruebas son caractersticas de Streptococcus pneumoniae, donde se

confirma que la bacteria analizada se encuentra en ptimas condiciones y sin

contaminacin de otro microorganismo.


115

Figura 40 Streptococcus pneumoniae en tincin al Gram.

Microorganismo Gram positivo.

Figura 41 Streptococcus pneumoniae en agar Sangre.

Figura 42 Prueba positiva de discos de Optoquina,


inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor
del disco de Optoquina.
116

RESULTADOS DE LA DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA.

Cuadro 19 Resultados de la evaluacin microbiolgica de las fracciones en

estudio por el mtodo de Kirby Bauer Modificado, para

Staphylococcus aureus. (anexo 14)

FRACCIN DILUCIONES RESULTADOS LECTURA DE HALOS


Formacin de halos de 18.2 mm de
0.5 % dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 16.6 mm de
1.05 % dimetro aproximadamente
Fraccin n-
MO Susceptible
hexano:acetato de etilo
Formacin de halos de 17.4 mm de
70%,
2.1 % dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 19 mm de
3% dimetro aproximadamente
MO Susceptible.
Formacin de halos de 15.5 mm de
0.5 % dimetro aproximadamente
MO Susceptible.
Formacin de halos de 15.2 mm de
1.05 % dimetro aproximadamente
Fraccin acetato de etilo MO Susceptible.
puro Formacin de halos de 17.5 mm de
2.1 % dimetro aproximadamente
MO Susceptible.
Formacin de halos de 17.5 mm de
3% dimetro aproximadamente
MO Susceptible.
Formacin de halos de 14 mm de
Fraccin metanol puro 0.5 % dimetro aproximadamente
MO Susceptible
117

Formacin de halos de 13 mm de
1.05 % dimetro aproximadamente
MO Intermedio
Formacin de halos de 13.6 mm de
2.1 % dimetro aproximadamente
MO Intermedio
Formacin de halos de 14.6 mm de
3% dimetro aproximadamente
MO Susceptible

RESULTADOS LECTURA DE LAS


PATRONES Y CONTROLES
PLACAS
No hay formacin de halos. Crecimiento en
Blanco: Etanol al 70%
toda la placa MO resistente
Formacin de halos inmedibles. No hay
Patrn: Yodo al 2% crecimiento en toda la placa
MO Susceptible.
Patrn: Disco de Antibitico de Penicilina 10 Formacin de halos de 39 mm de dimetro
Unidades MO Susceptible.
Placa control positivo Crecimiento total en toda la placa.
Placa control negativo No hay crecimiento en la placa.

MO: Microorganismo

La susceptibilidad o resistencia se ha determinado en base al cuadro 3 de

Parmetros de referencia de los halos de inhibicin.

NOTA: Se empleo como disolvente etanol 70% debido a que en ensayos

previos el etanol 96 presento inhibicin sobre la cepa.


118

En el cuadro se considera la bacteria susceptible a las diluciones 0.5%, 1.05%,

2.1%, 3% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo puro

y metanol puro, ya que hay formacin de halos con medidas considerables de

inhibicin, excepto las dilucines del 1.05% y 2.1% de la fraccin metanol puro

considerndose al microorganismo como intermedio. Para confirmar el efecto

antimicrobiano de las fracciones y sus diluciones se determin que este se

debi a la goma-resina y no al alcohol etlico al 70%, ya que se llev un blanco

de este ltimo, presentando crecimiento abundante en toda la placa sin zona de

inhibicin, por lo que el Staphylococcus aureus, es resistente al alcohol etlico.

Como comparacin entre las fracciones de la goma-resina y sustancias de

conocida actividad antimicrobiana, se llevaron como patrones: solucin de yodo

al 2% y un disco de antibitico (penicilina), en cuyas placas hubo formacin de

halos de inhibicin, haciendo notar la actividad antimicrobiana del yodo y de la

penicilina, en comparacin a las diluciones de las fracciones.

Adems se llevaron placas de control de crecimiento positivo y negativo, en la

primera se observ un crecimiento uniforme y abundante en toda la placa y en

el segundo no, lo que indica que no hay contaminacin por parte de bacterias

extraas.
119

Staphylococcus aureus
20

Dimetro de halos de
inhibicin (mm)
15

10
70,00%
AcOEt
5 MeOH

0
0,50% 1,05% 2,10% 3,00%
Diluciones de las fracciones

Figura 43. Comparacin del efecto inhibitorio de las diluciones 0.5%, 1.05%,

2.1% y 3.0% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%,

acetato de etilo puro (AcOEt) y metanol puro (MeOH) del extracto

diclorometnico de la goma resina de Eucalyptus citriodora

(Eucalipto) en Staphylococcus aureus.


120

Cuadro 20 Resultados de la evaluacin microbiolgica de las fracciones en

estudio por el mtodo de Kirby Bauer Modificado, para

Pseudomona aeruginosa. (anexo 15)

RESULTADOS LECTURA DE
FRACCIN DILUCIONES
HALOS
Formacin de halos de 13.4 mm de
0.25% dimetro aproximadamente
MO Intermedio.
Formacin de halos de 21.5 mm de
0.5% dimetro aproximadamente
Fraccin
MO Susceptible.
n-hexano:acetato de
Formacin de halos de 31.6 mm de
etilo 70%,
0.75% dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 24.8 mm de
1.05% dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 19.7 mm de
0.25% dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 22.7 mm de
0.5% dimetro aproximadamente
Fraccin acetato de MO Susceptible
etilo puro Formacin de halos de 31.1mm de
0.75% dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 22.5 mm de
1.05% dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 19 mm de
Fraccin metanol puro 0.25% dimetro aproximadamente
MO Susceptible
121

Formacin de halos de 23.2 mm de


0.5% dimetro aproximadamente
MO Susceptible.
Formacin de halos de 27.4 mm de
0.75% dimetro aproximadamente
MO Susceptible
Formacin de halos de 19 mm de
1.05% dimetro aproximadamente
MO Susceptible

RESULTADOS LECTURA DE LAS


PATRONES Y CONTROLES
PLACAS
No hay formacin de halos. Crecimiento en
Blanco: Etanol al 70%
toda la placa MO Resistente
Formacin de halo entre 25 a27 mm de
Patrn: Yodo al 2%
dimetro MO Susceptible
Patrn: Disco de Antibitico de Gentamicina Formacin de halo entre 19 a 20 mm de
10 Unidades dimetro MO Susceptible
Placa control positivo Crecimiento total en toda la placa
Placa control negativo No hay crecimiento en la placa

MO: Microorganismo

La susceptibilidad o resistencia se ha determinado en base al cuadro 3 de

Parmetros de referencia de los halos de inhibicin.

NOTA: Se empleo como disolvente etanol 70% debido a que en ensayos

previos el etanol 96 presento inhibicin sobre la cepa.


122

En el cuadro se considera la bacteria susceptible a las diluciones 0.25%, 0.5%,

0.75%, 1.05% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo

puro y metanol puro, ya que se observa la formacin de halos definidos con el

tamao requerido para afirmar que la bacteria es sensible a estas

concentraciones excepto la dilucin al 0.25% de la fraccin n-hexano:acetato de

etilo 70% donde por el tamao de los halos es considerado como intermedio .

Para confirmar el efecto antimicrobiano de las fracciones y sus diluciones se

determina que este se debi a la goma-resina y no al alcohol etlico al 70%, ya

que se llevo un blanco de ste ltimo, presentando crecimiento abundante en

toda la placa sin zona de inhibicin, por lo que la Pseudomona aeruginosa,

es resistente al alcohol etlico.

Como comparacin entre las fracciones de la goma-resina y sustancias de

conocida actividad antimicrobiana, se llevaron como patrones: solucin de yodo

al 2% y un disco de antibitico (gentamicina), en cuyas placas hubo formacin

de halos de inhibicin, haciendo notar la actividad antimicrobiana del yodo y de

la gentamicina, en comparacin con las diluciones de las fracciones.

Tambin se llevaron placas de control de crecimiento positivo y negativo. En el

control positivo crece por completo la bacteria por toda la placa, no as en el

control negativo este sirve para asegurar que no exista ningn tipo de

contaminacin por parte de otra bacteria.


123

Pseudomona aeruginosa
35
Dimetro de halos de inhibicin 30
25
20
(mm)

15 70%
AcOEt
10
MeOH
5
0
0,25% 0,50% 0,75% 1,05%
Diluciones de las fracciones

Figura 44. Comparacin del efecto inhibitorio de las diluciones 0.25%, 0.5%,

0.75% y 1.05% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%,

acetato de etilo puro (AcOEt) y metanol puro (MeOH) del extracto

diclorometnico de la goma resina de Eucalyptus citriodora

(Eucalipto) en Pseudomona aeruginosa.


124

Cuadro 21 Resultados de la evaluacin microbiolgica de las fracciones en

estudio por el mtodo de Kirby Bauer Modificado para el

Streptococcus pneumoniae. (anexo 16)

RESULTADOS LECTURA DE
FRACCIN DILUCIONES
HALOS
Formacin de halos de 12 mm de
0.5% dimetro aproximadamente
MO Resistente
Formacin de halos de 16.25 mm de
0.75% dimetro aproximadamente
Fraccin
MO Resistente
n-hexano:acetato de
Formacin de halos de 18 mm de
etilo 70%,
1.5% dimetro aproximadamente
MO Resistente
Formacin de halos de 15.5 mm de
3% dimetro aproximadamente
MO Resistente
Formacin de halos de 13 mm de
0.5% dimetro aproximadamente
MO Resistente.
Formacin de halos de 16 mm de
0.75% dimetro aproximadamente
Fraccin acetato de MO Resistente
etilo puro Formacin de halos de 22.5 mm de
1.5% dimetro aproximadamente
MO Intermedio
Formacin de halos de 20.5 mm de
3% dimetro aproximadamente
MO Intermedio
Formacin de halos de 12.5 mm de
Fraccin metanol puro 0.5% dimetro aproximadamente
MO Resistente.
125

Formacin de halos de 15.2 mm de


0.75% dimetro aproximadamente
MO Resistente
Formacin de halos de 16 mm de
1.5% dimetro aproximadamente
MO Resistente
Formacin de halos de 15.4 mm de
3% dimetro aproximadamente
MO Resistente

RESULTADOS LECTURA DE LAS


PATRONES Y CONTROLES
PLACAS
No hay formacin de halos. Crecimiento en
Blanco: Etanol al 70%
toda la placa MO Resistente
Formacin de halos de 40 mm de dimetro
Patrn: Yodo al 2%
MO Susceptible.
Patrn: Disco de Antibitico de Ampicilina Formacin de halos entre 35 a 38 mm de
10 Unidades dimetro MO Susceptible.
Placa control positivo Crecimiento total en toda la placa
Placa control negativo No hay crecimiento en la placa
MO: Microorganismo

La susceptibilidad o resistencia se ha determinado en base al cuadro 3 de

Parmetros de referencia de los halos de inhibicin.

NOTA: Se empleo como disolvente etanol 70% debido a que en ensayos

previos el etanol 96 presento inhibicin sobre la cepa.


126

En el cuadro se considera la bacteria resistente a las diluciones 0.5%, 0.75%,

1.5% y 3.0% de la fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%; y resistente a las

diluciones 0.5% y 0.75% de la fraccin acetato de etilo puro, exceptuando la

dilucin al 1.5% y 3.0% que se considero como intermedio; en cuanto a las

diluciones de 0.5%, 0.75%, 1.5% y 3% de la fraccin de metanol puro se

considera la bacteria como resistente, ya que hay formacin de halos con

medidas no considerables de inhibicin, las cuales se encuentran dentro de los

parmetros establecidos.

Se lleva al mismo tiempo un blanco con alcohol etlico al 70%, presentando

crecimiento abundante en toda la placa sin zona de inhibicin, por lo que el

Streptococcus pneumoniae, es resistente al alcohol etlico.

Como comparacin entre las fracciones de la goma-resina y sustancias de

conocida actividad antimicrobiana, se llevaron como patrones: solucin de yodo

al 2% y un disco de antibitico (ampicilina), en cuyas placas hubo formacin de

halos de inhibicin, haciendo notar la actividad antimicrobiana del yodo y de la

ampicilina, en comparacin con las diluciones de las fracciones.

Se llevaron placas de control de crecimiento positivo y negativo, en la primera

se observ un crecimiento uniforme y abundante en toda la placa y en el

segundo no, lo que nos indica que no hay ningn tipo de contaminacin por

parte de otras bacterias.


127

Streptococcus pneumoniae

25
Dimetro de halos de
inhibicin (mm)
20

15
70%
10 AcOEt
MeOH
5

0
0,50% 0,75% 1,50% 3%
Diluciones de las fracciones

Figura 45. Comparacin del efecto inhibitorio de las diluciones 0.5%, 0.75%,

1.5% y 3% de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%,

acetato de etilo puro (AcOEt) y metanol puro (MeOH) del extracto

diclorometnico de la goma resina de Eucalyptus citriodora

(Eucalipto) en Streptococcus pneumoniae.


VI. CONCLUSIONES
129

6.0 CONCLUSIONES

1. De acuerdo con los resultados obtenidos del espectro de RMN-1H de la

fraccin n-hexano:acetato de etilo 70%, en esta ltima se encuentran

presentes al menos 15 metabolitos secundarios, entre los cuales es

posible la presencia de chalconas, isoflavonoides, flavononoles y cidos

fenlicos (Ej. cido sinpico, cido ferlico, cido cumrico, cido

cafico, cido clorognico, entre otros ).

2. De acuerdo a los datos espectroscpicos obtenidos de la fraccin

acetato de etilo puro, en esta fraccin se encuentran isoflavonoides, que

aparentemente presentan azcares en la posicin 5 de su estructura;

esto explica la no aparicin de protones quelatados en la regin de 11-12

ppm.

3. En la fraccin acetato de etilo puro se observan al menos 4 cidos

cinmicos diferentes, los cuales no poseen grupos metoxilos por lo que

tendramos cidos como el cafico, cinmico y cumrico; y que adems

por encontrarse en esta fraccin podran estar unidos a azcares como

en el caso del acido clorognico.


130

4. Debido a la aparicin de seales de protn en la regin de 0.7-1.3 ppm

en la fraccin acetato de etilo puro, tambin se encuentran presentes

sustancias triterpnicas las cuales deben estar glicosadas, para que sea

posible su presencia en esta fraccin.

5. En relacin con las seales que aparecen en el espectro de RMN-1H de

la fraccin metanol puro, en esta se encuentran presentes isoflavonoides

unidos a azucares, 3 posibles cidos fenlicos tambin glicosados,

adems de triterpenos glicosados.

6. En la valoracin microbiolgica de las diluciones de las fracciones n-

hexano:acetato de etilo 70%, acetato de etilo puro y metanol puro del

extracto diclorometnico de la goma resina de Eucalyptus citriodora

(Eucalipto), los microorganismos Staphylococcus aureus y

Pseudomona aeruginosa resultaron susceptibles, debido a que los

halos de inhibicin presentados se encuentran dentro del rango de

susceptibilidad; no as para Streptococcus pneumoniae que resulto

resistente ya que sus halos de inhibicin se encuentran dentro del rango

de resistencia.
131

7. Se llev un blanco de etanol al 70 %, en el que se obtuvo un crecimiento

abundante y no hubo formacin de halos, lo que demostr que el efecto

antimicrobiano se debe a las sustancias extradas y no al etanol al 70%.

8. Las diluciones de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%, acetato

de etilo puro y metanol puro del extracto diclorometnico de la goma

resina de Eucalyptus citriodora (Eucalipto), poseen actividad

antimicrobiana contra Staphylococcus aureus y Pseudomona

aeruginosa.

9. La fraccin n-hexano:acetato de etilo 70% presento mayor efecto

inhibitorio contra el Staphylococcus aureus, esto se debe a que en

dicha fraccin se encuentran metabolitos secundarios tales como

flavonoides y cidos fenlicos, los cuales presentan actividad

antimicrobiana comprobada.

10. La dilucin del 0.75 % de las fracciones n-hexano:acetato de etilo 70%,

acetato de etilo puro y metanol puro para la cepa Pseudomona

aeruginosa, present mayor actividad antimicrobiana a causa de

encontrarse sustancias como flavonoides, cidos fenlicos y triterpenos

glicosados de conocida actividad antimicrobiana. (25, 17)


VII. RECOMENDACIONES
133

7.0 RECOMENDACIONES

1. Continuar con el fraccionamiento bioguiado de la gomaresina de

Eucalyptus citriodora, a travs de la realizacin de sucesivas

cromatografas de columna, en las fracciones obtenidas, con el objetivo

de aislar los metabolitos secundarios responsables de la actividad

antimicrobiana.

2. Investigar la actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas por

cromatografa de columna, contra diferentes cepas de inters clnico,

comprobando as su amplio espectro y poder utilizarlo en un mayor

nmero de afecciones.

3. Realizar un ensayo con los disolventes a utilizar, previo a la evaluacin

de susceptibilidad, para verificar que estos no afecten ni inhiban la cepa

y evitar la obtencin de un resultado falso positivo, as tambin durante

la evaluacin de susceptibilidad se debe llevar un blanco corroborando

as que los resultados se deban a la sustancia en estudio y no al

disolvente.

4. Para una mejor conservacin de los microorganismos utilizados se

recomienda mantenerlos en caldos nutritivos ya sea BHI para


134

Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa y leche

descremada para Streptococcus pneumoniae, conservndolos en

congelacin a -5C.

5. Preparar las diluciones de la muestra utilizando etanol al 70 % para

Pseudomona aeruginosa y Streptococcus pneumoniae, ya que a

96 presenta un efecto inhibitorio sobre estas cepas.

6. Extraer en soxhlet por cinco das continuos sin cambiar la muestra;

para obtener el mayor rendimiento posible de la goma-resina.

7. Recolectar la goma-resina preferiblemente en poca seca, ya que en

estas condiciones se facilita su recoleccin y conservacin.

8. Conservar adecuadamente durante el proceso de secado cada una de

las fracciones obtenidas de la cromatografa de columna, ya que

pueden ser afectadas por el calor y humedad.

9. Para muestras de origen vegetal, es preferible emplear la cromatografa

flash (cromatografa a media presin) ya que permite obtener un

fraccionamiento en menor tiempo.


BIBLIOGRAFA

1. Acortes J. 2003. Prcticas de Laboratorio de Microbiologa. Espaa.


Consultado 3 de Agosto 2006. Disponible en:
www.upm.edu/biology/cursos/micro/pruebas

2. Beatty, W.K. 1993 Diccionario de ciencias mdicas 25aed. Buenos


Aires,Editorial Mdica Panamericana. Pg. 37, 69, 163, 165 y 438.

3. Brock, T. D y otros. 1987. Microbiologa. 4a ed. Mxico. Prentice-Hall.


Pg.906

4. Cucufate Rivas,C.M. y otros. 2001. Formulacin y elaboracin de una


tintura con accin antisptica cicatrizante a base del extracto del tallo del
apio (Apium graveolens). Trabajo de graduacin. Licenciatura en
Qumica y Farmacia. Facultad de Ciencias Puras y Aplicadas.
Universidad Nueva San Salvador. San Salvador, El Salvador, C.A.

5. Ministerio de Salud. Curso Latinoamericano de Actualizacin en


Antimicrobianos. 2000. Perfomance Standards for Antimicrobial Disk
Susceptibility Test Approved Standard. Sptima Edicin.

6. Dayal, R. y otros. 1980. Chemical components of Eucalyptus citriodora


leaves. Forest Res Lab., Bangalore, India. Current Science, 49(3), 116.

7. Dewick, P. 2002.Medicinal Natural Products. Editorial John Wiley.


Toronto, Canad. Pgs. 219,220 y 221.
8. Domnguez, A. 1973. Mtodos de Investigacin Fitoqumica. 9aed.
Mxico. Editorial Limusa. Pgs.84, 153.

9. Duke J. 1983. Eucalyptus citriodora Hook. Myrtaceae-Lemonscented


gum. Francia, Purdue University. Consultado 22 de Agosto de 2006.
Disponible en:
http://www.nortpurdue.edu/newcrop/duke-
energy/Eucalyptuscitriodora.html

10. Evans, W.C. y otros. 1991, Farmacognosia, 13aed.Editorial


Interamericana McGraw-Hill. Mxico. Pgs.519.

11. Facultad de Qumica y Farmacia. Manual de Laboratorio de


Farmacognosia. 2004. Universidad de El Salvador. San Salvador, El
Salvador, C.A.

12. Facultad de Qumica y Farmacia. Manual de Laboratorio de Microbiologa


Aplicada III.2001. Universidad de El Salvador. San Salvador, El Salvador,
C.A.

13. Facultad de Qumica y Farmacia. Manual de Microbiologa y


Parasitologa. 1994. Universidad de El Salvador. San Salvador, El
Salvador, C.A.

14. Font Quer, P. 1993. Diccionario Botnico. 9a. Reimpresin. Barcelona.


Editorial Labor S.A. Tomo 1.Pgs.326, 365,941.
15. Freman, B. A. 1984. Tratado de Microbiologa de Burrows.21a. Ed.
Mxico, D.F. Nueva Editorial Interamericana, S.A. de C.V. Pgs.
446,447.

16. Gilg, E. 1926. Farmacognosia. Traducido de la 3a. Ed. Alemania. Editorial


Labor S.A. Barcelona, Espaa. Pgs. 240-241.

17. Grieve M. 1998. Eucalipto. Estados Unidos. Missouri Botanical.


Consultado 22 de Julio de 2006. Disponible en:
www.Botanical.com/botanical/mgmh/eucaly14html

18. Guzmn, D.J.1975. Especies tiles de la Flora Salvadorea Medico


Industrial. Ministerio de Educacin, San Salvador, El Salvador. Impreso
en los talleres de la Direccin de Publicaciones. Pg.361.

19. Herrera F., A. y otros. 1995. Mtodos Espectroscpicos en Qumica


Orgnica. 2a edicin. Madrid, Espaa. Editorial Sintesis. Pgs. 100-142.

20. Shen, Z y otros. 1987. Isolation and Identification of Citriodorin. Chinese


Acad, Foresty, Nanjing, Peop, Rep, China, Linchan Huaxue Yu Gongye;
7(2), 35-43.

21. Shen, Z y otros. 1987. Isolation and Identification of Flavonoid


Compounds. Chinese Acad. Foresty, Nanjing, Peop, Rep. China. Linchan
Huaxue Yu Gongye, 7(2) 28-34.

22. Jawets, E, y Otros. 1992. Microbiologa Mdica. 14aed. Mxico, D.F.


Editorial Manual Moderno. Pgs. 217, 218, 237,238 y 239.
23. Koneman, E.W. y otros. 1992. Diagnostico Microbiologco. 3aed. Buenos
Aires, Argentina. Editorial Mdica Panamericana S.A. Pg.415-604.

24. Kuklinski, C. 1983. Farmacognosia. Ediciones Omega. Pgs. 167,168 y


169.

25. Lock de Ugaz, O. 1994. Investigacin Fitoqumica. 2a edicin. Per.


Fondo Editorial. Pontificia Universidad Catlica del Per. Pgs. 64, 66,
72, 73, 111,112, 114, 183,184, 185,186.

26. Lpez L. y otros. 2004. rboles en Espaa, Manual de identificacin.


Ediciones mundi-Prensa. 2a.Edicin. Pgs.654.

27. Martnez G., y otros. 2001. Tcnicas Experimentales en Sntesis


Orgnica. 1a Reimpresin. Espaa. Editorial Sntesis S.A.Pgs.168-187.

28. Marcano, D. y otros. 1991. Fitoqumica Orgnica. 1aed. Caracas,

Venezuela. Editorial Talleres de Litopar. Pgs. 125-131.

29. Martnez R., y otros. 2003. Comprobacin de la actividad antimictica in-


vitro de la tintura elaborada con oleorresina de Eucalipto (Eucalyptus
citriodora). Trabajo de Graduacin. Facultad de Qumica y Farmacia.
Universidad de El Salvador. San Salvador, El Salvador, C.A.

30. Martnez R, M. 2006. Los beneficios del Eucalipto. Consultado el 12 de


jul. de 2006. Disponible en:
http://www.infarmate.org/pdfs/mayo_junio06/eucalipto.pdf
31. Mndez R., y otros. 2006. Determinacin de la actividad antibacteriana
del extracto diclorometnico de la goma-resina de Eucalyptus citriodora
(Eucalipto). Trabajo de Graduacin. Facultad de Qumica y Farmacia.
Universidad de El Salvador. San Salvador, El Salvador, C.A.

32. Merck. 1994. Manual de Medios de Cultivo. Darmstadt. Alemania. Pgs.


74, 127, 144,807.

33. Ministerio de Agricultura y Ganadera (MAG). Direccin General de


Ordenamiento forestal cuencas y riesgos. rea Forestal Eucalyptus
citriodora. Consultado 9 jul. 2006. Disponible en:
http://www.mag.gob.sv/admin/publicaciones/upload-file/1121114265-
82.pdf

34. Najarro M.,y otros. 2005. Determinacin de la actividad antibacteriana del


extracto etanlico de la oleorresina del Eucalyptus citriodora (Eucalipto).
Trabajo de Graduacin. Facultad de Qumica y Farmacia. Universidad de
El Salvador. San Salvador, El Salvador, C.A.

35. Naturamedic. 2002. El Eucalipto. Argentina. Consultado 5 de Junio de


2006. Disponible en:
www.naturamedic.com/eucalipto.htm

36. Organizacin de los Estados Americanos (OEA), Universidad de El


Salvador (UES), Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social
(MSPAS). Planter.1994. Obtencin y Aprovechamiento de Extractos
Vegetales de la Flora Salvadorea. 2aed. San Salvador. Editorial
Universitaria. Pg. 354-355.
37. Pelczar, M.J. y otros, 1992. Microbiologa. 4aed. Mxico, D.F. Editorial
McGraw-Hill. Pgs. 206-271.

38. Real Academia Espaola. 1970. Diccionario de la Lengua Espaola.


19aed. Madrid. Editorial Espasa-Calpe, S.A. Pg.940

39. Reina, M. 2003. Cromatografa (en lnea). Consultado 10 jul. 2006.


Disponible en: http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimia-
53/cromatografia4.jpg.

40. Senz P., R. 1999. Revista de Ciencias Forestales-Quebracho 7.


Facultad de Agroindustria. Universidad Nacional del Nordeste. Argentina.
Consultado 10 jul. 2006. Disponible en:
http://fcf.unse.edu.ar/pdf/quebracho/q7-11.pdf.

41. Samuelsson, G. 1992. Drugs of Natural Origin a Textbook of


Pharmacognosy. 4aed. Pgs 57, 58 y 59.

42. Skoog, D.A. y otros. 2001. Qumica Analtica. 7aed. Mxico D.F. Editorial
McGraw-Hill. Pgs.203, 204.

43. Tcnicas Experimentales en Sntesis Orgnicas. M, Angeles Matnez


Grau, Editorial Sntesis, 2001. Pgs. 171-176.

44. The Isolation of Shikimic Acid from Eucalyptus citriodora. Anet, E. F.L.J.
Birch, A.J. Massy-Westropp, R.A. Univ. Sydney, Australian Journal of
Chemistry (1957), 1093-4.
45. Tortora, G. y otros. 1993. Introduccin a la Microbiologa. Editorial
Acribia, S.A. Pg.494.

46. University Purdue. Department of Horticultura and Landscape

Architecture. Consultado: 10 de mayo 2006. Disponible en:

http://www.hort.purdue.edu/newcrop/dukeenergy/eucalyptuscitriodora.ht

ml

47. United Status Pharmacopeial convention USP 25. NF 20. 2002. The
Official Compendia of Standars 25 Revision (USP) y 20 ed. (NF), Inc.
Canada. Pgs. 883, 2221 y 2234.

48. Wu, Y.; y otros. (2005). Taxonomic And Chemical Relationships


Revealed By Nuclear Magnetic Resonance Spectra Of Plant Exudates..
Journal of Natural Products. Volume 68, Number 5. 1(14): 635-648.
GLOSARIO (2, 36, 14)

Absceso: Cavidad que contiene pus y esta rodeada de tejido inflamado


formado como consecuencia de la supuracin de una infeccin localizada.

Aerobio: Microorganismo que vive y crece en presencia de oxigeno.

Anaerobio: Microorganismo que crece mejor o exclusivamente en ausencia


de oxigeno.

Antiespasmdico: Agente que cura o alivia los espasmos.

Antisptico: Sustancia que sirve para lograr la desinfeccin.

Asepsia: Una condicin libre de microorganismos patgenos viables.

Astringente: Sustancia que provoca una contraccin fibrilar de los tejidos


orgnicos o que produce contraccin y sequedad de los tejidos cuando se
aplica localmente.

Corimbo: Inflorescencia racimosa; los pendnculos arrancan a distintas


alturas del eje de la inflorescencia y las flores quedan ms o menos al
mismo nivel.

Dermatitis: Diversas afecciones de la piel.

Edema: Acumulacin de cantidades excesivas de liquido acuoso en clulas,


tejidos o cavidades serosas.

Endocarditis: Inflamacin aguda o crnica del endocardio, se manifiesta


generalmente en el curso del reumatismo articular agudo y en otras
enfermedades febriles agudas.

Eritema: Enrojecimiento o inflamacin de la piel o membranas mucosas


como resultado de la dilatacin y congestin de los capilares superficiales.

Espasmo: Contraccin involuntaria persistente de un msculo o grupo


muscular.

Exudados vegetales: Estos son producidos por clulas de la superficie de


la planta como resultado de un dao o lesin, estos exudados se limitan a
los compuestos orgnicos que no requieren la extraccin qumica.

Febrfugo: Agente que tiende a reducir la fiebre.


Furnculo: Infeccin cutnea estafilocccica de carcter localizado y
supurativo, que se origina en una glndula o folculo piloso y se caracteriza
por dolor, enrojecimiento e hinchazn.

Kino: El nombre kino se ha aplicado a numerosos jugos desecados, ricos en


flavotaninos y empleados antiguamente por sus propiedades astringentes.

Necrosis: Muerte de una porcin de tejido a consecuencia de una


enfermedad o lesin.

Neumona estafilocccica: Inflamacin del tejido pulmonar causada por los


estafilococcos.

Oleorresina: Jugo lquido, o casi lquido, procedente de varias plantas,


formado por resina disuelta en aceite voltil.

Patogenicidad: Capacidad de un microorganismo de infectar (invadir y


multiplicarse, en un ser vivo), produciendo unos sntomas (enfermedad).

Patgeno: Productor o causante de enfermedad.

Septicemia: Infeccin sistmica caracterizada por la aparicin de patgenos


en la sangre circulante, procedentes de una infeccin localizada en cualquier
parte del organismo.

Silvicultura: Comprende todas las operaciones necesarias para regenerar,


explotar y proteger los bosques, as como para recolectar sus productos.

Urceolado (a): Se aplica a la corola o a la flor cuya corola tiene forma de


olla.
ANEXOS
ANEXO 1

Eucalyptus citriodora (Eucalipto)

Figura 46 rboles de Eucalyptus citriodora (Eucalipto)

Figura 47 rboles de Eucalyptus citriodora exudando goma-resina.


ANEXO 2

FOTOGRAFAS DE APARATO SOXHLET Y ROTA EVAPORADOR.

Figura 48 Extraccin continua con Soxhlet

Figura 49 Rota Evaporador.


ANEXO 3

METODOLOGA GENERAL DE TRABAJO


Recoleccin de la goma-resina del
Eucalyptus citriodora

Caractersticas
organolpticas
Extraccin Soxhlet
EtOH 95%

Extracto etanlico

Particin liquido-liquido
H2O/CH2Cl2

Extracto
Extracto acuoso diclorometnico

Obtencin de las fracciones, n-hexano:


acetato de etilo70%; acetato de etilo puro y
metanol puro a partir de cromatografa de
columna flash

Continuacin

Figura 50 Diagrama de la metodologa general de trabajo.


Continuacin

Obtencin las fracciones, n-hexano:


acetato de etilo70%; acetato de etilo
puro y metanol puro a partir de
cromatografa de columna flash.

Anlisis espectroscpico por


medio de RMN-1H de las Ensayo
fracciones problemas. microbiolgico

Pruebas de Identificacin Determinacin de la actividad


Microbiolgica a las cepas a antimicrobiana por el mtodo de
ensayar (Staphylococcus Kirby Bauer Modificado
aureus, Pseudomona
aeruginosa, Streptococcus
pneumoniae).

Tabulacin y anlisis de
resultados.

Caractersticas Pruebas de Caractersticas


microscpicas identificacin y macroscpicas
diferenciacin

Medios de cultivos
Mtodo de coloracin selectivos y
al Gram diferenciales

Figura 51 Diagrama de la Metodologa General de Trabajo.


ANEXO 4

Extraccin
Extracto

(Soxhlet)
Etanlico

Actividad
Biolgica

Particin
H2O/CH2Cl2

Actividad
Biolgica
Extracto CH2Cl2

Actividad
Biolgica
Cromatografa de
Fracciones Columna

Figura 52 Esquema del Fraccionamiento bioguiado.


ANEXO 5

PREPARACIN DE LAS DILUCIONES DE LAS FRACCIONES EN ESTUDIO.


Para Streptococcus pneumoniae se realizaron las diluciones de 0.5%,

0.75%,1.5% y 3%.

750 mg 25 mL (30 mg/mL) 3 %

5 mL 10 mL (15 mg/mL) 1.5%

5 mL 10 mL (7.5 mg/mL) 0.75 %

50 mg 10 mL (5.0 mg/mL) 0.5 %

Nota: De cada una de las fracciones se peso inicialmente 750 mg para preparar

la solucin madre.

Figura 53 Diluciones de las fracciones para Streptococcus pneumoniae.


Para Staphylococcus aureus se realizaron las diluciones de 0.5 %, 1.05 %,

2.1 % y 3 %.

750 mg 25 mL (30mg/mL) 3%

5 mL 10 mL (15mg/mL) 1.5 %

7 mL 10mL (10.5mg/mL) 1.05 %

7 mL 10 mL (21mg/mL) 2.1%

50 mg 10mL (5.0mg/mL) 0.5 %

Figura 54 Diluciones de las fracciones para Staphylococcus aureus.


Para Pseudomona aeruginosa se realizaron las diluciones 0.25 %, 0.5 %, 0.75

% y 1.05 %.

750mg 25mL (30mg/mL) 3 %

5 mL 10ml (15mg/mL) 1.5%

5mL 10mL (7.5mg/mL) 0.75%

750mg 25mL (30mg/mL) 3 %

5 mL 10mL (15mg/mL) 1.5%

7mL 10mL (10.5mg/mL) 1.05%

50mg 10mL (5.0mg/mL) 0.5%

5mL 10mL (2.5mg/mL) 0.25%

Figura 55 Diluciones de las fracciones para Pseudomona aeruginosa.


ANEXO 6

PRUEBAS MICROSCPICAS (COLORACIN AL GRAM)


PRUEBAS MICROSCPICAS (COLORACIN AL GRAM) (1)

Este mtodo hace uso de colorantes orgnicos catinicos como cristal violeta

safranina con fuerte afinidad por materiales celulares con carga negativa como

los cidos nuclicos y polisacridos cidos.

METODO:

1. Extensin: Se limpia con etanol 93% un portaobjeto, en este se coloca una

gota de solucin salina a la que con el asa de siembra, previamente esterilizada

a la llama; se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o, en su

caso, de una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el

portaobjetos y se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la

llama del mechero hasta que se seque.

Figura 56 MTODO DE EXTENSIN


2. Coloracin: Se llevan a cabo los siguientes pasos:

a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial),

b) Se lava con agua destilada,

c) 1 minuto en lugol (mordiente),

d) Se decolora con alcohol de 95 (decolorante),

e) Se lava con agua destilada,

f) 1 minuto en safranina (colorante de contraste),

g) Se lava con agua corriente y

h) Se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro.

Cuando la preparacin esta totalmente seca, poner una gota muy pequea

de aceite de cedro de inmersin y observar al microcopio con el objetivo de

inmersin.
ANEXO 7

CARACTERSTICAS MICROSCPICAS.

Cuadro 22 Resultados de Tincin al Gram.

MICROORGANISMO INTERPRETACIN COLORACIN

Staphylococcus aureus
Gram positivo Azul
ATCC 25923

Pseudomona aeruginosa
Gram negativo Rosado
ATCC 27853

Streptococcus pneumoniae
Gram positivo Azul
ATCC 49619
ANEXO 8
CROMATOGRAFIA DE COLUMNA FLASH
Figura 57 Cromatografa de columna flash.
Figura 58 Elucin de fraccin Figura 59 Elucin de fraccin
n-hexano:acetato de acetato de etilo
etilo 70%. puro.

Figura 60 Elucin de fraccin Figura 61 Fracciones obtenidas


metanol puro
CUADRO No. 23 PRUEBAS DE IDENTIFICACIN Y DIFERENCIACIN (34)

MICROORGANISMO PRUEBA PRINCIPIO PROCEDIMIENTO INTERPRETACION

Identifica la enzima Colocar una gota de Se produce un burbujeo


Catalasa Catalasa que H2O2 al 30% sobre una vigoroso del perxido que
descompone el H2O2, lamina portaobjetos y indica la presencia de
caracterstica que colocar una porcin de Staphylococcus.

ANEXO 9
permite diferenciar colonia del
los Staphylococcus microorganismo.
Staphylococcus de los
aureus Streptococcus

Evidencia de Colocar 0.5 ml de La observacin de


Coagulasa reaccin de plasma citratado. coagulacin total o parcial
coagulacin del Inocular una colonia de del plasma, indica prueba
plasma sanguneo microorganismo e positiva, y se interpreta
que produce la incubar a 37C por 24 como presencia de
enzima coagulasa. horas coagulasa, enzima
caractersticamente
producida por
Staphylococcus aureus
ANEXO 10
PRUEBAS BIOQUMICAS
CUADRO No. 24 PRUEBAS BIOQUMICAS (13)

MICROORGANISMO PRUEBA PRINCIPIO PROCEDIMIENTO INTERPRETACION


Mide la Inocular el medio con cultivo Los organismos capaces de
fermentacin de puro, tanto en la superficie fermentar solamente la glucosa
azucares a travs inclinada como en el fondo causan la formacin del acido
de la incorporacin del agar. Se incuban de 24 a dentro del agar, los que
Agar triple de pH que cambia 48 horas a 37C fermentan la sacarosa y la
azcar y de color (amarillo) lactosa causan la formacin de
hierro al acidificarse el acido en la parte alta del medio.
(TSI) medio. Determina La fractura indica la formacin
la produccin de de gas, el medio ennegrecido
H2CO2 y H2S. indica la formacin de H2S. La
prueba para Pseudomona
debe indicar que no hay
Pseudomona fermentacin de azcares, por
aeruginosa lo que el pico es alcalino y el
fondo es alcalino (cambiando
de color el medio a rojo) con
produccin de gas.
Identifica la Inocular, la superficie del Prueba positiva permite el
utilizacin del medio e incubar 24 horas a crecimiento en el medio y el
Citrato Citrato como nica 37C cambio de color es de verde a
fuente de carbono azul. En el resultado para
que se visualiza Pseudomona debe
por la elevacin del observarse crecimiento y
pH en el colorante cambio de color en el medio
utilizado como
indicador.
Caldo de peptona Inocular el caldo con el Prueba positiva da la formacin
con alto contenido microorganismo e incubar de de anillo violceo en la
Indol de triptfano el cual 24 a 48 horas a 37C. Aadir interfase que identifica la
es convertido en reactivo de Erlich (P-dimetil presencia del Indol. Para
Indol. Amino Benzaldehdo) por las Pseudomona no debe darse
paredes del tubo y ver la la formacin de anillo violceo.
formacin de anillo.
MICROORGANISMO PRUEBA PRINCIPIO PROCEDIMIENTO INTERPRETACION
Indica fermentadores Inocular el caldo con el La aparicin de un rojo
Rojo de acido-mixto que producen microorganismo en estudio intenso que se mantiene es
Metilo suficiente acido para con un asa en punta e indicio de la cada de pH.
disminuir el pH por incubar a 37C de 24 a 48 En Pseudomona no se da
debajo de 4.3 horas. Aadir gotas de la aparicin de un color rojo
indicador rojo de metilo. intenso.
Determina la capacidad Inocular el medio hasta el Si las bacterias no son
Movilidad de las bacterias de fondo con el microorganismo mviles, el crecimiento no
desplazarse en medios con una asa en punta e se difunde ms all de la
slidos por medio de incubar durante 24 a 48 lnea de puntura. Pero si es
flagelos pertricos horas a 37C mvil el crecimiento se
Pseudomona caractersticos de las difunde visualmente
aeruginosa Enterobacterias. formando turbidez. Para
Pseudomona el
crecimiento debe difundirse
formando turbidez por lo
que es mvil.
Determina la presencia Inocular el caldo con el El desarrollo de una
Voges- de acetil Carbinol que es cultivo del microorganismo e coloracin roja que perdura
Proskauer una acetona producida incubar de 24 a 48 horas a de 15 a 30 minutos, indica
por la fermentacin de la 37C. Aadir gotas de - la presencia de acetil
dextrosa. naftol, alcohol absoluto y carbinol. Para
KOH 40% Pseudomona no debe
haber cambio de color.
MICROORGANISMO PRUEBA PRINCIPIO PROCEDIMIENTO INTERPRETACION
Determina la presencia de Se toma una colonia
enzimas oxidasas. La proveniente de una placa El desarrollo de una
reaccin de la oxidasa se de agar sangre de carnero coloracin azul oscuro
de 15 a 24 horas de indica la presencia de
debe a la presencia de un incubacin. Se frota sobre enzimas oxidasas, si la
sistema citocromooxidasa un pedazo de papel filtro zona de frotacin
Pseudomona que activa la oxidacin del impregnado con una gota permanece incolora indica
Oxidasa
aeruginosa citocromo que es reducido del reactivo de oxidasa una prueba negativa.
por el oxgeno molecular modificado (6% Pseudomona aeruginosa
hidrocloruro de da prueba positiva de
que produce agua o tetrametilfenildiamina oxidasa por lo que se da el
perxido de hidrgeno dimetil sulfxido). Se viraje de color a azul
segn la especie observa la reaccin en el oscuro.
bacteriana. trmino de dos minutos.
CUADRO No. 25 PRUEBA DE IDENTIFICACIN Y DIFERENCIACIN (15)

MICROORGANISMO PRUEBA PRINCIPIO PROCEDIMIENTO INTERPRETACION


Inocular por

ANEXO 11
diseminacin la
Inhibe selectivamente el
superficie de Agar
crecimiento de
sangre con el
S. pneumoniae en
microorganismo a
concentraciones muy
prueba, colocar los
bajas (5 g/ml o menos).
discos de Optoquina
Pero puede inhibir otros Se considera prueba
sobre la superficie del
streptococos - positiva cuando hay
Optoquina rea sembrada y
hemolticos, solo en inhibicin del desarrollo
Streptococcus (Clorhidrato presionar suavemente
concentraciones bacteriano, alrededor
pneumoniae de para que este se
mayores. La zona de del disco de Optoquina.
etilhidroxicu- adhiera a la superficie.
inhibicin del crecimiento
prena) Invertir la placa e
se da cuando las clulas
incubar a
alrededor del disco son
35C durante 18 a 24
lisadas debido a cambios
horas en un frasco con
en la tensin superficial.
vela o en incubadora
de CO2.
ANEXO 12

PREPARACIN DEL ESTANDAR McFARLAND (1)

9.95 mL de H2SO4 + 0.05 mL de BaCl2 Estndar Mc


Farland 0.5%

Figura 62 Preparacin del Estndar McFarland.

Densidad celular aproximada de 1.5 X 108 microorganismos/mL.

Preparacin de la suspensin de Staphylococcus aureus, Pseudomona

aeruginosa y Streptococcus pneumoniae: 10 mL de caldo nutritivo +

cantidad necesaria de microorganismos.


ANEXO 13
MTODO DE KIRBY BAUER MODIFICADO (31)

Figura 63 Esquema del Mtodo de Kirby Bauer Modificado.


ANEXO 14
RESULTADOS DEL MTODO KIRBY BAUER MODIFICADO EN
Staphylococcus aureus.
FRACCIN n-HEXANO:ACETATO DE ETILO 70%.

0.5 % 1.05 %

2.1 % 3%

Figura 64 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Staphylocccus aureus.
FRACCIN ACETATO DE ETILO PURO.

0.5 % 1.05 %

2.1 % 3%

Figura 65 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Staphylococcus aureus.
FRACCIN METANOL PURO.

0.5 % 1.05 %

2.1 % 3%

Figura 66 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Staphylococcus aureus.
PATRONES Y CONTROLES

Patrn: Penicilina Patrn: Yodo 2%

Control Positivo Control Negativo

Blanco: Etanol 70 %

Figura 67 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Staphylococcus aureus.
ANEXO 15
RESULTADOS DEL MTODO KIRBY BAUER MODIFICADO EN
Pseudomona aeruginosa.
FRACCIN n-HEXANO:ACETATO DE ETILO 70%.

0.25 % 0.5 %

0.75 % 1.05 %

Figura 68 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Pseudomona aeruginosa.
FRACCIN ACETATO DE ETILO PURO.

0.25 % 0.5 %

0.75 % 1.05 %

Figura 69 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Pseudomona aeruginosa.
FRACCIN METANOL PURO.

0.25 % 0.5 %

0.75 % 1.05 %

Figura 70 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Pseudomona aeruginosa.
PATRONES Y CONTROLES

Patrn: Gentamicina Patrn: Yodo 2%

Control Positivo Control Negativo

Blanco: Etanol 70 %
Figura 71 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby
Bauer Modificado en Pseudomona aeruginosa.
ANEXO 16
RESULTADOS DEL MTODO KIRBY BAUER MODIFICADO EN
Streptococcus pneumoniae.
FRACCIN n-HEXANO:ACETATO DE ETILO 70%.

0.5 % 0.75 %

1.5 % 3%

Figura 72 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Streptococcus pneumoniae.
FRACCIN ACETATO DE ETILO PURO.

0.5 % 0.75 %

1.5 % 3%

Figura 73 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Streptococcus pneumoniae.
FRACCIN METANOL PURO.

0.5 % 0.75 %

1.5 % 3%

Figura 74 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Streptococcus pneumoniae.
PATRONES Y CONTROLES

Patrn: Ampicilina Patrn: Yodo 2 %

Control Positivo Control Negativo

Blanco: Etanol 70 %

Figura 75 Resultados de la evaluacin microbiolgica por el mtodo Kirby


Bauer Modificado en Streptococcus pneumoniae.
ANEXO 17

Cuadro 26 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO (32)

MEDIO DE CULTIVO PREPARACIN


Disolver 146.5 g/Lt, esterilizar en
autoclave (15 min. a 121C) y verter en
Agar Chapman placas. pH 0.2. Las placas con medios
de cultivo son claras e incoloras.
Disolver 58 g en 0.95 Lt, esterilizar en
autoclave (15 min. a 121C), enfriar a 45-
Agar Baird Parker 50C, aadir mezclando 50 mL de
emulsin de yema de huevo telurito y
eventualmente, 50 mg/Lt de
Sulfametacina, pH 6.8 0.2.
Disolver 44.5 g/Lt, esterilizar en autoclave
Agar Cetrimide (15 min. a 121C) y verter en placa. pH
7.2 0.2
Disolver 37 g en un Lt, de agua destilada,
llevar a ebullicin agitando
frecuentemente hasta conseguir una
completa disolucin. Esterilizar en
Base Agar Sangre autoclave (15 min. a 121C). Enfriar a
50C y aadir 5-7% (60mL) de sangre de
carnero desfibrinada estril, precalentada
a 37C. Mezclar suavemente y verter en
placas de petri estriles.
Disolver 34 g/Lt, esterilizar con cuidado
en autoclave, enfriar eventualmente a 45-
50C para incorporar del 5-10% de
Agar Muller-Hinton sangre desfibrinada. Verter en placas. pH
7.4 0.2.Las placas con medio de cultivo
sin sangre son claras y de color amarillo.
Suspender 13 g en 1Lt de agua destilada
o desionizada, mezclar bien, distribuir y
Caldo Nutritivo esterilizar a 121C por 15 min.
Disolver 40 g en 1 Lt de agua
desmineralizada por calentamiento en un
bao de agua hirviendo o en bao de
Tripticasa Soya Agar vapor; tratar en autoclave ( 15 min. a
121C), verter placas.
ANEXO 18
MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y SOLVENTES.
MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y SOLVENTES.

Material Vegetal
- Goma-resina de Eucalyptus citriodora.

Cepas de Referencia
- Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
- Staphylococcus aureus ATCC 25923
- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Material de Laboratorio
- Agitadores de vidrio
- Beakers (250, 100, 50, 30 mL)
- Embudos de vidrio
- Ampollas de separacin (125, 60 mL)
- Erlenmeyers (500, 250mL)
- Probetas (100, 25, 10 mL)
- Vidrio reloj
- Tubos de ensayo
- Tubos de ensayo con rosca
- Pipetas Mohr (5 y 1 mL)
- Pipetas volumtricas (5.0, 1.0 mL)
- Baln fondo redondo de 500 ml
- Cajas de petri
- Laminas portaobjetos
- Frasco de vidrio color mbar con tapn de rosca (500 mL)
- Asas bacteriolgicas
- Guantes de asbesto
- Pipeteadores
- Mecheros Bunsen
- Aros metlicos
- Trpode
- Capsula de porcelana
- Mortero y pistilo
- Esptula metlica
- Microesptula
- Gradilla para tubos
- Malla de asbesto
- Bao Mara
- Pinzas (para crisol, de extensin y de soporte)
- Papel filtro
- Papel toalla
- Papel aluminio
- Tirro
- Etiquetas
- Plumones
- Fsforos
- Mangueras para entrada y salida de agua
- Gabacha, mascarilla, gorro y guantes estriles

Equipo
- Autoclave: de vapor hmedo, Webeco 1978, serie 72244. De
aire seco, presin, modelo 25EG, serie 99033-005.
- Estufa Thelco: modelo 3542, serie 21-AF-10
- Balanza analtica Mettler: modelo PM400, serie SNR1243297.
- Balanza granataria: marca Cenco Central Schentific Company.
Triple Beam Balance USA. PAT.No. 2,729.439 capacity 2610g
- Hot plate fisher: modelo -75h, serie 557101947
- Microscpio: marca Tisher Micromaster, modelo
Input:11GUEOH2125
- Refrigeradora marca CETRON
- Rotaevaporador Bchi R-205
- Aparato soxhlet de 2 Lt

Reactivos y Solventes

- Diclorometano
- Alcohol etlico 95%
- Acetato de etilo
- Indicador rojo de metilo
- -Naftol
- Hidrxido de potasio 5 o 10%
- Nitrato bsico de bismuto
- ter etlico
- n-hexano
- Alcohol isoproplico
- Acetona calidad reactivo
- Acetona industrial
- Metanol
- Peroxido de hidrogeno 30%
- Cristal violeta slido
- Alcohol-cetona
- Lugol
- Safranina
- Amoniaco
- Agua destilada
- Silica gel (0.015- 0.040 mm)

Medios de Cultivo

- Agar Muller-Hilton
- Agar tripticasa soya
- Agar citrato
- Agar Staphylococcus 110
- Agar tres azcares y hierro
- Caldo rojo de metilo
- Caldo voges-proskauer
- Caldo urea
- Medio de Movilidad
- Agar Sangre
- Agar cetrimide
- Plasma sanguneo
- Solucin salina estril