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PCR convencional o PCR de punto final

versus
PCR en Tiempo Real

PCR convencional no es cuantitativo

S Lobos C - U de Chile

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PCR clsico
z La cantidad de producto no
est relacionada con la
cantidad de DNA inicial
z Herramienta cualitativa
(presencia o ausencia)
z El bromuro de etidio es
poco sensible, cuando se
detecta ya se ha
sobrepasado la fase
exponencial

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Fases de la PCR

z Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto.


z Lineal: enlentecimiento,
enlentecimiento consumo de componentes
componentes, principio
de degradacin.
z Meseta: Parada de la reaccin, agotamiento de
componentes, degradacin de productos.

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Fases de la PCR

Logartmica

Lineal

4
Deteccin en la fase de meseta

Problemas de cuantificacin
en la fase de meseta

5
Tcnicas de cuantificacin
z Northern Blot

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PCR Competitivo o PCR Mimic
Early expression of p53 responsive genes (24h)

Bax

CD95/Fas

GAPDH
L C 6 8 10 12 M

Martn-Burriel et al. (2004)

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Necesidad de PCR en tiempo real
z N
Necesidad
id d dde cuantificar
tifi dif
diferencias
i d de
expresin de un mRNA (RT (RT--PCR)
z Disponibilidad de muy pequeas
cantidades de mRNA en algunasg p
prcticas
laboratoriales::
laboratoriales
z Clulas obtenidas de microdiseccin por lser
z Pequeas cantidades de tejido
z Biopsias embrionarias
z Especimenes de gran valor

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PCR en Tiempo Real
Nuevos q
qumicos
Deteccin de productos
Nuevas plataformas PCR en tiempo real
instrumentales

Permite observar la
cintica
de la reaccin

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Deteccin en la fase exponencial

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PCR en Tiempo Real
z Toma los datos mientras se producen.
z Cuantificacin ms exacta sin necesidad
de mtodos laboriosos.
z Existe
E i t una relacin
l i cuantitativa
tit ti entre
t lal
cantidad inicial y la cantidad de producto
PCR en un ciclo dado.

Curso PCR 2010

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Polymerase chain reaction (PCR)

12
Polymerase chain reaction (PCR)

13
Polymerase chain reaction (PCR)

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Fluorocromos:: SYBR Green
Fluorocromos
z Se intercala en el
surco menor del ADN
de doble cadena y
emite fluorescencia.
z No es equimolecular
equimolecular..
z Necesaria curva de
disociacin.

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Curva de disociacin

T Melting:
- Composicin de bases del
fragmento
g
- Tamao del fragmento.
-Tm dimeros < Tm fragmento

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Curva de disociacin

Muestras problema Controles negativos y sin RT

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Ventajas e inconvenientes
z PCR con SYBR G
Green:
z Ms barato
z Los mismos reactivos sirven para analizar
cualquier fragmento
z La especificidad viene dada nicamente por
los primers
z No es equimolecular
z Se necesita realizar una curva de disociacin

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Sondas TaqMan
z Actividad 5 exonucleasa de la Taq polimerasa.
z Reporter:: FAM, VIC.
Reporter
z Quencher:: TAMRA.
Quencher
z Importante tm (~70C).
z Equimolecular..
Equimolecular

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Real Time PCR: Sonda TaqMan

S Lobos C - U de Chile

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Polymerase chain reaction (PCR)

Fluorocromo + Quencher (absorbe la energa del fluorocromo cuando est


cerca fluorocromo no fluoresce)

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S Lobos C - U de Chile

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Ventajas e inconvenientes
z PCR con Sondas TaqMan:
TaqMan:
z Ms caro
z Utilizacin de sondas especficas para cada
fragmento a analizar
z La especificidad viene dada por los primers y
la sonda
z Es equimolecular
z No necesita curva de disociacin

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Aplicaciones de la PCR-
PCR-TR
z Cuantificacin:
z Absoluta
z Relativa

z D t
Determinacin
i i d
de mutaciones.
t i
z Ensayos +-
+- Diagnstico

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Glosario de trminos
z C
Cuantificacin:
tifi i
z Absoluta:
z Resultado final con unidades (carga viral, copias
de mensajero, copias de un gen,...).
z Se
S necesita
it una curva patrn
t absoluta.
b l t
z Relativa:
z Resultado sin unidades. Proporciona un
porcentaje de incremento o disminucin
(expresin gnica).
z Se necesita curva patrn (al menos para prueba
de primers).
primers).

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Glosario de trminos
z Referencia:
z Seal utilizada para normalizar el experimento.
z Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).
z Activa: endgena ((housekeeping
housekeeping)) o exgena (construccin).
z Calibrador:
z Muestra q
que usamos p
para comparar
p las dems.

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Glosario de trminos
z Standard (patrn):
z Muestra de concentracin conocida que
nos permite construir la curva de
calibrado.
z Threshold
Th h ld (umbral):
( b l)
z Ct es el ciclo en el cual se detecta un
incremento significativo de Rn
(fluorescencia). El sistema empieza a
detectar la seal asociada al incremento
exponencial de producto PCR (Fase
exponencial)

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Aplicaciones de la PCR-
PCR-TR
z Glosario de trminos.
z Cuantificacin:
z Absoluta
z Relativa
R l ti
z Determinacin de mutaciones.
z Ensayos +-
+-

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Mtodos de cuantificacin
z Curva estndar
z Delta Ct
z Mtodo de Pfaffl

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Curva estndar

30
Curva estndar

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Curva Patrn
z y=ax+b
y=
y ax+b.. Y
ax+b Y=Ct
Y=Ct,, X
Ct X=log
log [DNA]
[DNA].
z Relaciona cada concentracin con su Ct.
z Propia de cada pareja de primers
primers..
z La pendiente depende de la eficiencia de los
primers y no debera cambiar entre
experimentos:
z 100% (a=
(a=--3.32).
z 75% (a=
(a=--4).
z Aceptable:--3 -4.
Aceptable:
z a> -3 contaminacin por fluorescencia.

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Curva Patrn
z Correlacin ((R2)):
z R2=1 (perfecta).
z R20.97 (0.99).
z Seleccionar el umbral donde R2 sea mxima.
z Mantener el umbral entre experimentos.
z N de rplicas:
z Al menos 2 rplicas por muestra.
z Desviacin estndar 0.38
z Muestra:
z Curva absoluta: muestra de [ conc
conc]] conocida.
z Diluciones 1/5.

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1. Cuantificacin Absoluta
z Validacin de la curva patrn:
p
z La precisin de la cuantificacin depender de la
precisin de los patrones.
z Patrones:
z DNA plasmidial.
plasmidial.
z DNA genmico.
genmico
z Productos PCR.
z Grandes oligonucletidos comerciales.
z Resultado final relativo a una unidad de inters:
z Copias/ng de RNA
Copias/ng
z Copias/g tejido
tejido, copias/ml sangre
sangre.
z Copias/genoma.
z Copias/ clula.

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1. Cuantificacin Absoluta
z Posibles curvas de calibrado (Expresin
gnica):
z Productos de RT-
RT-PCR u oligonucletidos:
z Rpido, conocimiento preciso de [DNA].
z Inestable, problemas en la reamplificacin.
reamplificacin.
z DNA recombinante:
z Muy estable, sin problemas de amplificacin, talla
similar a transcritos.
z Construccin del DNArec
DNArec,, no tiene en cuenta la
eficacia de la RT.
z RNA recombinante:
z Mimetiza la situacin real de retrotranscripcin (aadir
RNA background
background).).
z Muy inestable, clonacin complicado, purificacin,
problemas de almacenamiento.

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1. Cuantificacin Absoluta
z P t crticos
Puntos ti de
d la
l curva patrn:
t
z DNA o RNA puro y muy concentrado.
z Exactitud en la medida de la concentracin
inicial (7 veces).
z Pipeteo apropiado: dilucin del DNA o RNA
original hasta concentraciones similares a las
muestras biolgicas (106-1012).
z Estabilidad de las muestras patrn (RNA).

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2. Cuantificacin Relativa
z Curva patrn:
z Sencillez en la preparacin.
z La cantidad de producto (n veces) se refiere a
la obtenida en el calibrador (1x)
(1x).
z No hay unidades.
z Se puede utilizar cualquier tipo de patrn para
la obtencin.

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2. Cuantificacin Relativa
z P t crticos
Puntos ti de
d la
l curva patrn:
t
z Dilucin adecuada del RNA o DNA patrn.
z La utilizacin de las mismas muestras en
placas distintas permite comparar resultados.
z Se pueden utilizar patrones DNA para anlisis
de RNA.
z Se necesitan curvas patrn para el gen de
estudio y el control endgeno.

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