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Docente: Lic. Esp. Ronald Hosse S.

PRACTICA N 7
SEPARACION POR TECNICAS CROMATOGRAFICAS

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Al trmino del trabajo prctico, el alumno deber ser capaz de:

Separar componentes de una mezcla.

Armar y manejar adecuadamente las tcnicas cromatogrficas.
Utilizar correctamente mtodos de revelado de los cromatogramas.
Diferenciar las ventajas y desventajas entre los diferentes mtodos
cromatogrficos.

FUNDAMENTO TEORICO

La cromatografa es una separacin de una mezcla de dos o ms compuestos por

distribucin diferencial entre dos fases, una estacionaria y otra mvil.

Hay varios tipos de cromatografa, segn la naturaleza de las dos fases,:

Cromatografa slido-lquido.- Cromatografa en columna, en capa delgada

(fina) y en papel.
Cromatografa Lquido-Lquido y Gas Lquido.- Cromatografa en fase
gaseosa.

ADSORCION.-
Es la capacidad de una sustancia slida llamada adsorbente, para detener o
concentrar. Selectivamente sobre su superficie inmvil o estacionaria, gases, lquidos
que van en una disolucin en movimiento.
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El adsorbente debe tener las siguientes caractersticas:

1. Debe ser insoluble en el solvente que se va a utilizar.

2. No debe reaccionar con las sustancias que se van a separar.
3. Debe tener una composicin definida.
4. No debe actuar como catalizador.
5. Las partculas del adsorbente deben tener dimetro de 8 a 12 micras

Los adsorbentes mas utilizados son:

Adsorbentes muy activos.- Almina, carbn activado, arcilla.

Adsorbentes intermedios.- Gel de slice, CaCO3 MgO (magnesia) , Cal
apagada.
Adsorbentes dbiles.- Sacarosa, inulina, almidn, talco.

CARACTERISTICAS DEL DISOLVENTE.-

Deben tener las caractersticas esenciales como ser:

Incoloro
Voltil

Los disolventes apolares, permiten que el adsorbente detenga el soluto demasiado

fuerte, provocando con esto, que no puedan separarse selectivamente. En caso
contrario, cuando el disolvente presenta una constante dielctrica elevada, ocurre que
el disolvente arrastra a todo el soluto sin que puedan separarse adecuadamente.
Es conveniente realizar experiencias previas para encontrar el disolvente apropiado
(generalmente resultan mezclas de diversos disolventes) que dan constantes
dielctricas con valores intermedios.
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CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONAL

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA O CAPA DELGADA) (CCD TLC)

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OBJETIVOS

Conocer la tcnica de cromatografa en capa fina, c.c.f., sus caractersticas y

los factores que en ella intervienen.
Calcular valores de r.f. de varias sustancias.
Deducir, a travs del r.f., la relacin que existe entre la polaridad de las
sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.
Aplicar la tcnica de c.c.f. como criterio de pureza de las sustancias.
Aplicar la tcnica de c.c.f. como criterio parcial de identificacin de sustancias.

MATERIAL SUSTANCIA
Placas para cromatografa (portaobjetos) Tomate
Matraces Erlenmeyer de 10 ml o viales Zanahoria
Pipeta graduada de 10 ml Pasto comn
Probeta de 25 ml Flores (rosas rojas).
Frasco cmara Anaranjado de metilo
Agitador de vidrio Azul de metileno
Capilares
Esptula
Parrilla de resistencia cerrada
Lmpara de luz ultravioleta
Aspersor

EXTRACCION DE COMPUESTOS ACTIVOS

LA ZANAHORIA Y EL PASTO COMN.-

Triturar la mezcla con cloroformo o con etanol, filtrar y concentrar la muestra.

FLORES (ANTOCIANINAS) .-
Con etanol en medio cido.
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PREPARACION DE LAS PLACAS CROMATOGRFICAS.-

Soporte = portaobjeto,
Adsorbentes = 10 gramos de gel de slice mas agua o cloroformo o tetracloruro
de carbono.
En un vidrio de reloj preparar una suspensin bien dispersada y embadurnar el
portaobjetos (que deben estar limpios y secos previamente).
Las placar embadurnadas se secan y activan calentndolas a 80 100C
durante unos 15 minutos,
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APLICADORES DE LA SILICA GEL

REVELADO DE MANCHAS
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APARATO DE ASPERCION

INFORMACION

a) En cromatografa en capa fina, c.c.f., el grado de elucin de las sustancias

depende de su polaridad, as como de la polaridad del eluyente utilizado.

b) En c.c.f. despus de eluir y revelar una sustancia pura, sta se observa

como una mancha bien definida.

c) En cambio, sustancias impuras y mezclas dejan varias manchas o una

estela en su recorrido por la placa.

d) Sustancias iguales tienen el mismo comportamiento en c.c.f. bajo las

mismas condiciones experimentales.

PROCEDIMIENTO

Notas
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1) Para preparar las cromatoplacas se introducen dos portaobjetos juntos,

limpios y secos, en una suspensin de gel de slice al 35% en AcOEt.

2) Para aplicar las soluciones a las cromatoplacas utilice los capilares, los que
previamente deben ser estirados en la flama del mechero con el fin de que
tenga el dimetro adecuado.

3) Con un lpiz, marque ligeramente el contorno de las manchas para mejor

ubicacin de las mismas.

4) Para mayor claridad de los resultados, incluya en su informe los dibujos de

las cromatoplacas de todos los experimentos de esta sesin. Hgalos del
mismo tamao de las placas.

5) En este caso son soluciones de nipagin y nipasol respectivamente.

6) No marque la ubicacin de las manchas en la cromatoplaca hasta despus

de la separacin.

APLICACIN DE LA MUESTRA

Mediante una micropipeta colocar la muestra formando un punto o una

banda por toques sucesivos a 1 o 2 cm. de distancia del borde.
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La placa se coloca verticalmente o en un Angulo de 80 en una cmara

cromatogrfica que ya contiene el disolvente apropiado.

El disolvente debe quedar a unos 3 5 mm de distancia del punto en

que estn las muestras.

EQUIPO PARA CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

TABLA DE SOLVENTES DE CORRIMIENTO

MUESTRA DISOLVENTE
Carotenos Cloroformo, benceno o benceno-acetona
(7:3) ter de petrleo-acetona-ter etlico
(2:1:1)
Clorofila Benceno
Azul de metileno y Anaranjado de metilo Etanol mas gotas de benceno
Tinta roja y tinta azul Butanol-etanol amoniaco 2N (3:1:0.25)
Flores Etanol o Butanol acido actico agua
(4:1:5)
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PROCEDIMIENTO

El disolvente asciende por la placa arrastrando los componentes de la muestra,

cuando el frente del disolvente se aproxima a unos 10 -15 mm del extremo
superior de la placa, se retira esta.
La placa se seca a temperatura ambiente.

Examinar la placa visualmente, buscndose manchas coloreadas enseguida se

observa debajo de una luz ultravioleta.

Despus la placa se trata con un agente cromognico apropiado

COLORES DE REVELADO CON VAPORES DE AMONIACO

Flores : Vapores de Amoniaco

Flavonoides Amarillo
Antocianinas Azul
Chalconas , Auronas Amarillo - Rojo
Dihidroflavonas Anaranjado

Se miden las distancias recorridas por cada mancha y la recorrida por el

disolvente. El cociente de la distancia recorrida por la mancha sobre la
segunda nos da el Rf de la muestra y es una caracterstica para cada
sustancia.

Rf= Distancia recorrida por la mancha/Distancia recorrida por el disolvente

CROMATOGRAFIA EN PAPEL
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Separacin los colorantes componentes de la tinta negra (azul y rojo)

CROMATOGRAFIA EN PAPEL
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TECNICA:

Con la ayuda de una pipeta pasteur se echan 0,5 ml de una solucin de etanol
en el tubo 1
0,5 ml de agua en el tubo 2
0,5 ml de ter de petrleo en el tubo 3
0,5 ml de butanol etanol amoniaco (3:1:0,25) en el tubo 4

Nota: Tener cuidado de no mojar las paredes del tubo.

De una hoja de papel filtro se corta una tira del tamao del tubo de ensayo
(evitar tocar con los dedos)
Mediante una micropipeta o tubo capilar se procede a sembrar en el papel en
el que previamente ha sido sealado el lugar de partida.
Con la ayuda de unas pinzas se introduce el papel en el tubo de ensayo, de tal
forma que solamente el borde inferior de la tira de papel est en contacto con
el lquido.
Se tapa el tubo con un tapn de corcho.
Se introduce en el interior de un Erlenmeyer y de deja hasta que el disolvente
se encuentre a unos 5 mm de la parte superior.
Con la ayuda de unas pinzas se saca la tira de papel del interior del tubo y se
mide la distancia que ha recorrido el frente del disolvente a lo largo de la tira
del papel filtro.

A continuacin se muestran eluyentes y reveladores usados frecuentemente en

cromatografa.

ELUYENTES

VEGETALES:

Clorofila Benceno + gotas de Acetona

Carotenos Cloroformo
Tinta n-butano + etanol + NH3
Azul de metileno Etanol + benceno
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Naranja de Metilo
Fluorescena Etanol
Azul de metileno
Aceites ter de petrleo
Antocianinas n-butanol + acido actico + agua (4:1:5)

REVELADORES

Clorofilas Luz ultravioleta

Carotenos Luz ultravioleta
Flavonoides NH3
Antocianinas Solucin de NiSO4 + H2SO4 2 N.
Aceites esenciales Cmara de Yodo
Aldehdos o Cetonas 2-4, Dinitrofenilhidracina

CUESTIONARIO

1. Defina:
a. Cromatografa de reparto.
b. Cromatografa de gases
c. Cromatografa en capa delgada

2. Que se entiende por cromatografa, soporte, resolucin, desarrollo, disolvente,

sistema cromatogrfico, aplicacin, revelador, agente cromognico, frente de
disolvente, relacin de flujo, adsorcion, eluente, cromatograma, patrn de
caracterizacin, valores gua o valores relativos.

3. Un colorante desconocido se piensa que puede ser azul de metileno. Cmo

se podra comprobar esta suposicin, utilizando un procedimiento basado en
una tcnica cromatografica?

4. Cules son algunos de los mtodos que se emplean para la localizacin de

las bandas de adsorcin cuando una mezcla de compuestos incoloros se
somete a una cromatografa de este tipo?

5. Explique el significado de:

i. Adsorcin.
ii. Absorcin.
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iii. Eluir.

6. Que son los flavonoides y las antocianinas que existen en las flores.

7. Qu significa que una sustancia tenga: rf> 0.5? rf = 0.5?

rf<0.5?

8. En el experimento 4, cul de las dos formas de elucin permiti mayor

separacin de la mezcla?, a qu se debe esto?

9. Porqu la c.c.f. es un criterio parcial y no total de identificacin?.

10. Cul es el tratamiento que debe darse a soluciones de desecho?

Por ejemplo:
Solucin de p-hidroxiacetanilida en etanol,

Solucin de m-nitroclorobenceno en acetona,

Solucin de p-hidroxibenzoato de metilo en acetato de etilo

Solucin de p-hidroxiBenzoato de propilo en acetato de etilo?.

VIII BIBLIOGRAFIA

a) Moore J.A. and Dalrymple D.L.

Experimental Methods in Organic Chemistry
Second Edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976.

b) Brewster R.Q., Vander Werf C.A., Mc Ewen W.E.

Curso Prctico de Qumica Orgnica
2a. Ed., Ed, Alhambra, S.A., Madrid, 1979.

c) Robert R.M., Gilbert J.C. and Rodewald L.B.

Modern Experimental Organic Chemistry
Third Edition, Holt, Rinehart and Winston, N.Y., 1979.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
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OBJETIVOS

Conocer la cromatografa en columna como tcnica de separacin

de mezclas de sustancias, sus caractersticas y los factores que en
ella intervienen.

Utilizar la cromatografa en columna para la purificacin de una

sustancia contaminada con un colorante.

Controlar con cromatografa en capa fina el proceso de separacin

de mezclas por cromatografa en columna.

MATERIALES REACTIVOS
Frascos viales de 15 ml Azul de metileno,
Placas para cromatografa (portaobjetos) Gel de slice para columna
Vasos de precipitados de 250 ml Gel de slice para cromatografa en capa
fina,
Vaso de precipitados de 150 ml Acetato de etilo,
Pinzas de tres dedos con nuez Hexano,
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Bao mara elctrico con extensin Sulfato de sodio anhdro,

Refrigerante de agua con mangueras Yodo.
Matraz pera de una boca
T de destilacin
Tapn Quickfit
Colector
Embudo de vidrio
Pipeta Pasteur
Esptula
Columna para cromatografa
Frascos cmara
Probeta de 25 ml
Varilla de vidrio (50 cm de longitud)
Capilares
Algodn
Lmpara de luz U.V

INFORMACION

a) En la cromatografa en columna, las sustancias de diferente polaridad tienen

diferente grado de elucin.
b) Existe una relacin entre el orden de elucin de una sustancia en
cromatografa en capa fina y el orden de elucin de la misma en
cromatografa en columna.
c) El proceso de cromatografa en columna se controla por cromatografa en
capa fina, ya que muchas sustancias son incoloras y slo revelando se
tiene mejor informacin de la separacin.

COLUMNA CROMATOGRAFICA
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PROCEDIMIENTO

Se le proporcionar 0.5 g de una mezcla slida, de la cual separar el producto

principal, por cromatografa en columna.

Para empacar la columna sujtela en el soporte con las pinzas.

Engrase la llave y mantngala en posicin de cerrado.
Introduzca hasta el fondo un pequeo pedazo de algodn ayudndose
con la varilla de vidrio,
Agregue 10 ml de Acetato de Etilo y presione suavemente el algodn
para que quede bien colocado y sin burbujas (nota 1).
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Prepare una suspensin de 15 g de Gel de Slice para columna en 50

60 ml de Acetato de Etilo y agite durante 5 minutos para eliminar las
burbujas.
A travs del embudo vierta la suspensin en la columna golpeando
ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme (nota 2).
Abra la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de
no dejar secar la Gel de Slice (nota 3).
En el vaso de 150 ml disuelva la mezcla problema con la mnima
cantidad de Acetato de Etilo, y ayudndose con el agitador virtala con
cuidado, para que quede colocada uniformemente por encima de la Gel
de Slice, abra la llave para que salga eluyente y se adsorba la muestra
aplicada, cuidando que no se seque la Gel de Slice, eluya la mezcla
con Acetato de Etilo.
Colecte fracciones (eluatos) de 10 ml de los frascos viales y controle la
separacin, haciendo cromatografa en capa fina a cada una de las
fracciones ante una muestra de referencia (testigo) como se indica en la
siguiente figura.
Eluya las cromatoplacas en mezcla de Hexano-Acetato de Etilo (1:1),
revele con luz U.V.
En cada cromatoplaca observe el cambio de la intensidad de coloracin
de la mancha del producto principal.
La elucin y separacin termina en el momento en que no aparece
mancha.
En un matraz rena las fracciones que contengan la misma sustancia
(nota 4).
Para recuperar la sustancia destile el exceso de disolvente, utilizando
una destilacin simple, calentando con un bao mara elctrico, deje en
el matraz pera un residuo de 5 ml aproximadamente y virtalo en un
vaso que termine de evaporar en la campana.
Pese el producto recuperado, calcule el rendimiento y entrguelo al
maestro.
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NOTAS.

1) La columna se puede preparar agregando 10 ml del eluyente indicado y

despus colocar en el fondo de la columna un pedazo de algodn o fibra de
vidrio ayudndose con una varilla de vidrio presionando suavemente sin
apretar el algodn.
2) Otra alternativa para colocar el algodn o fibra de vidrio en la columna es
con la ayuda del vaco.
3) La columna tambin se puede empacar agregando primero el disolvente a
la columna y despus la gel de slice.
4) Mantenga siempre el nivel del eluyente 2 cm por arriba del nivel del gel de
slice.
5) Rena las fracciones que no contienen producto principal, en el frasco que
le indique el maestro.
CUESTIONARIO.

1. Por qu el producto principal eluy y el colorante se adsorbi en la fase

estacionaria?
2. S se desea recuperar el colorante adsorbido, qu debe hacerse?
3. Qu debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia
en una cromatografa en columna?
4. La recuperacin cuantitativa del producto principal, sera ms completa s se
recogieran fracciones mayores o menores de 10 ml porqu?
5. Qu tratamiento debe darse a residuos de disolvente orgnico como Acetato
de Etilo, para desecharlos?
6. Es recuperable la gel de slice para columna?
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VIII. BIBLIOGRAFIA

a) Moore J.A. and Dalrymple D.L.

Experimental Methods in Organica Chemistry
Second Edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976.

b) Brewster R.Q., Vander Werf C.A. y Mc Ewen W.E.

Curso Prctico de Qumica Orgnica
2a. Ed. Ed. Alhambra S.A., Madrid, 1979

c) Roberts R.M., Gilbert J.C. and Rodewald L.B.

Modern Experimental Organic Chemistry, Third Edition,
Holt, Rinehart and Winston, N.Y. 1979.

d) Abbott D. y Andrews R.S.

Introduccin a la Cromatografa
3a. Ed. Alhambra S.A., Madrid, 1970.