VALIDACIN Y CONFIRMACIN DE MTODOS 2011 Versin 1

Introduccin

El objetivo final de la validacin de un mtodo analtico es asegurar que los resultados de las
mediciones en los anlisis de rutina se encuentran lo suficientemente cerca del valor verdadero
(desconocido) del contenido del analito en la muestra. El laboratorio elige los mtodos de ensayo de
acuerdo con las reglamentaciones vigentes (cuando es pertinente), de acuerdo con los requisitos del
usuario final (cliente), o a requerimiento de ste.

Una vez elegido el mtodo existen tres posibilidades:

a) Que el mtodo sea normalizado y se aplique tal cual dice la norma.

b) Que el mtodo sea una modificacin de un mtodo normalizado.
c) Que el mtodo se haya desarrollado en el laboratorio o se haya obtenido de bibliografa.

Segn el caso elegido, el alcance de la validacin ser diferente:

Mtodo Parmetros de Validacin

a) Normalizado repetibilidad, veracidad, incertidumbre, lmite de deteccin (si aplica),
carta de control (material de referencia), participacin en ensayos de
aptitud.
b) Modificacin de un Dependiendo de la modificacin, se evalan que parmetros deben ser
mtodo normalizado verificados.
c) mtodo propio Evaluar todos los parmetros posibles, dependiendo del mtodo.

2) Parmetros de validacin.

Selectividad
Linealidad
Lmite de deteccin, Nivel crtico.
Lmite de cuantificacin
Precisin (repetibilidad y precisin intermedia)
Veracidad
Rango de trabajo
Robustez
Incertidumbre de medicin
Sesgo
Repetibilidad

Parmetros a validar segn el mtodo (caso c)

Tipo de mtodo
Parmetro Componentes
Cualitativo Trazas Propiedad fsica
mayoritarios
Selectividad x x x -
Linealidad - x depende depende
L.de deteccin x x - -
L.de cuantific. - x - -
Precisin - x x x
Veracidad - x x x
Rango - x x x
Robustez - x x x
Incertidumbre x x x x
Fernando Veyretou Esp. en Ing. en Calidad
 Efecto de las modificaciones al mtodo de ensayo sobre los parmetros de validacin (caso b)
Mtodo de extraccin Selectividad, veracidad
Matriz de la muestra Selectividad, veracidad, precisin, LD, LQ
Extensin del rango Linealidad, precisin
Cambios en el pH Robustez
Cambio de operador Repetibilidad, veracidad
Sistema de deteccin Selectividad, linealidad, rango de trabajo

3) Determinacin de los parmetros de validacin.

3.1) Selectividad especificidad.

Segn la tcnica analtica utilizada, se harn estudios de selectividad teniendo en cuenta lo

siguiente:
Como es impracticable considerar todas las interferencias posibles, se aconseja estudiar los
casos ms importantes (que produzcan ms interferencia) y probables. La selectividad de un
mtodo puede expresarse cuantitativamente por medio de la razn mxima tolerada (maximum
tolerated ratio - Trmx), que es la relacin entre la concentracin de interferencia (Cint)
respecto del analito (Ca), que produce un desvo en la respuesta analtica que produce un sesgo
en la estimacin de la concentracin del analito que cae fuera del intervalo de confianza que
deriva del clculo de la incertidumbre expandida. Esto no siempre es aplicable ya que
previamente hay que conocer la naturaleza de las posibles interferencias para poder realizar el
ensayo.
Llevar a cabo anlisis de:
a) Blanco de reactivos.
b) Soluciones de analito en el solvente adecuado segn la tcnica y en concentraciones
similares a las presentes en las muestras de ensayo.
c) Matriz libre de analito. (de ser necesario, preparar una matriz sinttica a partir de los
conocimientos previos de la muestra).
d) Matriz con agregado de analito (usar concentraciones similares a b).

3.2) Linealidad
Si corresponde, segn el mtodo analtico, realizar curva de calibracin de acuerdo a lo
siguiente.
a) El analista determina el mbito lineal en funcin de los conocimientos previos de la
magnitud a medir. Este debe ser tal que en la medida de lo posible caiga aproximadamente
en el centro de la curva.
b) Analizar al menos seis puntos de la curva, incluido el blanco.
c) Los puntos debern estar igualmente espaciados.
d) Hacer tres replicados de cada punto, en lo posible de manera aleatoria.

Evaluar la linealidad del mtodo por medio de una inspeccin visual de la recta, grfico de
residuos y estadstica de la regresin. En funcin de los resultados obtenidos y de las
caractersticas de la muestras, se determinar posteriormente la estrategia a seguir en las
mediciones de rutina, es decir, el uso de un solo punto, algunos o todos los puntos de la
calibracin.

Fernando Veyretou Esp. en Ing. en Calidad

 Estimacin de los parmetros de la regresin:

Medir las respuestas analticas de los patrones de concentracin conocida, por triplicado (n=3).
Para el caso en que se miden 6 patrones por triplicado, el nmero de niveles de diferentes
concentracin (p) es 6, y el nmero total de puntos de la recta de calibrado (m) es 18.

El anlisis de los datos, implica el clculo de la pendiente A y la ordenada al origen B de la

recta de regresin, ajustada a la ecuacin y = A x + B . Los valores estimados de A y B se
calculan mediante:

Qxy ( x x)( y y)
i i
A= = i =1
m
(1)
( x x)
Qxx 2
i
i =1

B = y A x (2)

donde xi es la concentracin de cada uno de los m patrones, x es el promedio de las

concentraciones de calibrado, yi es la respuesta en cada punto e y es el promedio de las
respuestas de los patrones de calibrado.
Adems de A y B, se calcula el desvo estndar de estos parmetros, mediante las siguientes
frmulas:

sy/ x
sA = (3)
Qxx

2
1 x
sB = s y / x + (4)
m Qxx

siendo el desvo estndar de los residuos de la regresin:

( y y)
i
2

sy / x = i =1
(5)
m2

donde yi es la respuesta experimental a cada patrn e y i representa la respuesta estimada en

cada punto, o sea, y = Ax + B . i i

Estos parmetros dan una idea de la bondad de la regresin. Es deseable que s y / x sea lo ms
pequeo posible, a pesar que su valor est limitado por el ruido instrumental. La distribucin de
los residuos, es decir el modo en que los valores ( yi y) debe ser analizada, hacer un grfico
para ver la adecuacin de los datos al modelo lineal.

Observacin: el coeficiente de correlacin, a pesar de su amplio uso como indicador de

linealidad, resulta engaoso e inapropiado para este fin, y no debe ser usado (ref 2 A3)

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 3.3) Lmites de deteccin y cuantificacin.

El lmite de deteccin que es la mnima concentracin detectable de manera confiable por la

tcnica, se calcula en funcin del desvo estndar de la concentracin predicha para una
muestra blanco (s0). Para estimar este valor, se usa la siguiente ecuacin:

2
sy / x 1 1 x
s0 = + + (6)
A n m Qxx

usualmente se usa n=3, como ya se mencion antes.

El lmite de deteccin es igual a: LOD = 2 t 0,05;m-2 s0
El valor t, se obtiene de la tabla de distribucin Student:

TABLA 1
Dist t 1 cola alfa=0,05
GL t GL t
1 6,31 13 1,77
2 2,92 14 1,76
3 2,35 15 1,75
4 2,13 17 1,74
5 2,02 18 1,73
6 1,94 20 1,72
7 1,89 23 1,71
8 1,86 27 1,70
9 1,83 32 1,69
10 1,81 39 1,68
11 1,80 52 1,67
12 1,78 77 1,66
infinito 1,64

El lmite de cuantificacin LOQ, que es la mnima concentracin cuantificable en forma

confiable, se toma como la concentracin correspondiente a 10 veces el desvo estndar:
LOQ = 10 s0
Por lo que se asegura que el desvo estndar relativo (DSR) para una concentracin igual al
LOQ sea del 10%, el que se toma como el mximo DSR aceptable para cuantificar.

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 3.4) Precisin y precisin intermedia.

Es conveniente (en caso que sea posible) utilizar tres niveles de concentracin (bajo, medio,
alto) cubriendo el rango de trabajo con un nmero n de replicados en cada nivel de
concentracin m.
Es conveniente que n se encuentre entre 2 y 5. Se analizan n replicados de cada muestra de
nivel m durante un mnimo de 5 das ( p). No es necesario que sean das seguidos.
Con estos datos se realiza un anlisis de la varianza (ANOVA) del cual se puede obtener una
estimacin de la repetibilidad (precisin) y precisin intermedia, y compararlas, considerando
los diferentes das como principal fuente de variacin.
Clculo de la varianza de repetibilidad:

p n

( z
i =1 j =1
ij zi ) 2
S r2 = (7)
p (n 1)
n

z
j =1
ij

siendo z i =
n

la varianza entre das se calcula:

p

(z i z )2
S r2
S B2 = i =1
(8)
p 1 n
p n

z
i =1 j =1
ij

siendo z =
pn

y la varianza de precisin intermedia se calcula:

S Ri2 = S r2 + S B2 (9)

Calcular los desvos estndar de las varianzas mencionadas, obteniendo la raz cuadrada de las
mismas.
Calcular los desvos estndar relativos para cada parmetro:

SDr
RSDr = (10)
z
SDRi
RSDRi = (11)
z

Para comparar la variabilidad entre das con la repetibilidad, se hace un test de Fischer:
Se calcula la varianza entre das ( sE2 ) pero sin corregir por la repetibilidad ( sr2 ):

(z i z )2
S E2
S E2 = i =1
ni y se calcula es estadstico F: F =
p 1 Sr2
el valor F, se compara con el de la tabla F para =0.05 con p-1 grados de libertad en el
numerador y pn-p grados de libertad en el denominador.(Tabla 2).
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 Tabla 2
Tabla de Fischer alfa = 0,05
GL Num 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
GL Den
1 161 199 216 225 230 234 237 239 241 242
2 18,5 19,0 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 19,4 19,4
3 10,13 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,79
4 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04 6,00 5,96
5 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,74
6 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,06
7 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64
8 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35
9 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14
10 4,96 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,98
11 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,85
12 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,91 2,85 2,80 2,75
13 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,67
14 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,60
15 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,54
16 4,49 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,54 2,49
17 4,45 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,45
18 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,41
19 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,38
20 4,35 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,35
21 4,32 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 2,37 2,32
22 4,30 3,44 3,05 2,82 2,66 2,55 2,46 2,40 2,34 2,30
23 4,28 3,42 3,03 2,80 2,64 2,53 2,44 2,37 2,32 2,27
24 4,26 3,40 3,01 2,78 2,62 2,51 2,42 2,36 2,30 2,25
25 4,24 3,39 2,99 2,76 2,60 2,49 2,40 2,34 2,28 2,24
30 4,17 3,32 2,92 2,69 2,53 2,42 2,33 2,27 2,21 2,16
35 4,12 3,27 2,87 2,64 2,49 2,37 2,29 2,22 2,16 2,11
40 4,08 3,23 2,84 2,61 2,45 2,34 2,25 2,18 2,12 2,08
50 4,03 3,18 2,79 2,56 2,40 2,29 2,20 2,13 2,07 2,03
60 4,00 3,15 2,76 2,53 2,37 2,25 2,17 2,10 2,04 1,99
80 3,96 3,11 2,72 2,49 2,33 2,21 2,13 2,06 2,00 1,95
100 3,94 3,09 2,70 2,46 2,31 2,19 2,10 2,03 1,97 1,93

Este mismo estudio de comparacin de varianzas, puede realizarse utilizando las herramientas
estadsticas de Excel Anlisis de la varianza de un factor.

Si el valor F calculado es mayor que el F de tabla, quiere decir que hay diferencia significativa
entre las varianzas y esto requiere un estudio para analizar las causas de tal diferencia y su
posterior eliminacin.

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 3.5) Veracidad

Se puede estimar a partir de estudios interlaboratorios, materiales de referencia certificados, o

sobre material fortificado (Spike).

En caso que se cuente con un material de referencia certificado (MRC) se realizan un nmero n
de determinaciones del mencionado material. Cada determinacin incluye todo el proceso
analtico. Si no se cuenta con el MRC, se realiza un fortificado sobre una matriz sin analito, o
sobre una muestra que contiene analito, pero deber realizarse el anlisis antes y despus del
fortificado.

Se determina el sesgo de la siguiente forma:

Sesgo = X X ref (12)

X
o expresado como recuperacin: R = (13)
X ref

Se evala mediante una prueba t si la diferencia es estadsticamente significativa (=0,05)

X X ref
t= (14)
s
(uref ) + ( ) 2
2

siendo:
Xref: Valor del MRC
X : promedio de las determinaciones experimentales.
Uref: incertidumbre estndar del valor de referencia.
S: desviacin estndar de las determinaciones experimentales.
N: nmero de determinaciones experimentales.

El valor de t, se compara con el valor tabulado para n-1 grados de libertad y nivel de
significacin =0,05. (TABLA 3)

TABLA 3
Dist t 2 colas alfa=0,05
GL t GL t
1 12,71 13 2,16
2 4,30 14 2,14
3 3,18 15 2,13
4 2,78 16 2,12
5 2,57 17 2,11
6 2,45 18 2,10
7 2,36 19 2,09
8 2,31 20 2,09
9 2,26 21 2,08
10 2,23 22 2,07
11 2,20 23 2,07
12 2,18 24 2,06

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 Si el valor del t calculado es menor que el t de la tabla, se concluye que no hay diferencia
significativa. Si existiera diferencia significativa, los resultados de las mediciones se corregirn
por el factor correspondiente o si se decide no corregir, el sesgo se contemplar en el clculo de
la incertidumbre de la medicin.
Ver el procedimiento de clculo de incertidumbre, para la inclusin de estos datos en su
clculo, como as tambin los datos obtenidos de estudios interlaboratorios.

Muestras fortificadas:
Proceder de manera similar, aunque en este caso, hay que calcular la incertidumbre de la
muestra fortificada que se calcula combinando la incertidumbre del certificado del fabricante,
y la incertidumbre debida al procedimiento de fortificado. Ver procedimiento de clculo de
incertidumbre. Recordar que se pueden combinar incertidumbres que tengan las mismas
unidades, caso contrario hay que transformarlas en incertidumbres relativas, hacer la
combinacin de las incertidumbres, y luego volver a transformarla en incertidumbre estndar
para aplicar la frmula (14).

3.6) Rango de trabajo

El rango de trabajo queda definido en funcin del intervalo de valores de la magnitud que fue
evaluado en los puntos precisin y veracidad.

3.7) Robustez

Personal responsable del laboratorio, establecer qu parmetros del mtodo de ensayo podran
ser crticos y se realizarn ensayos con dichos parmetros modificados.
Se realizar una cantidad n de ensayos (mnimo 3) en las condiciones habituales del mtodo y
una cantidad igual de ensayos con los parmetros modificados. Se calcularn las medias y los
desvos estndar de ambos grupos de mediciones y se realizar una prueba t para diferencia de
medias. Si el valor del estadstico t es mayor que el valor crtico para un =0.05 y 2(n-1) grados
de libertad, se considerar que el parmetro modificado afecta la medicin.

X1 X 2
t= (15)
s12 + s22
n
t: estadstico t, se compara con el valor de la tabla 3 para 2(n-1) GL.

Si el t calculado es mayor que el t de la tabla, se considera que el factor modificado afecta a la

medicin.
Alternativamente, si existieran varios factores a considerar, se podr realizar un anlisis de la
varianza de dos o ms factores, utilizando un diseo factorial. En este ltimo caso, deber
intervenir personal con los conocimientos estadsticos adecuados.

3.8) Incertidumbre de medicin

Ver clculo de incertidumbre por separado en otro documento.

3.9) Sesgo
ver 3.5

3.10) Repetibilidad
ver 3.4

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 4) Informe de validacin

Se realiza un informe de validacin, en el que se indicar la siguiente informacin:

Alcance de la validacin: Parmetro a medir (analito, propiedad fsica o qumica, ndice, etc),
matriz de la muestra y rango de validacin.

Instrumental utilizado. Detallar los equipos utilizados y su identificacin. Detallar otros

materiales como ser matraces, buretas, etc y su correspondiente identificacin.

Muestras utilizadas, materiales de referencia y reactivos indicado el lote siempre que sea
posible.

Personal involucrado en las mediciones y que realiz el informe de validacin (nombre y

apellido).

Las mediciones realizadas incluyendo los registros que correspondan (por ej cromatogramas).
En caso de utilizar equipos similares, especificar en qu equipo se hizo cada medicin.

Los resultados obtenidos y las conclusiones.

Fecha, firma y aclaracin del personal responsable de aprobar el informe.

Referencias

(1) Gua para validacin de mtodos de ensayo. DC-LE-05 V.2 11/06/2008 O.A.A.

(2) Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl.
Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835-855, 2002 M. Thompson et al.

(3) A practical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty and
accuracy profiles. A Gustavo Gonzlez, M. ngeles Herrador. Trends in Analytical
Chemistry, Vol. 26, No. 3, 2007.

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 INFORME DE VALIDACIN

1) Alcance:
Parmetro a medir:
Rango:
Matriz:

2) Instrumental utilizado:
Equipos:
Otro instrumental:

3) Muestras patrn, estndares y/o materiales de referencia.

4) Reactivos:
Droga: Fabricante: Lote:

5) Mediciones:

6) Resultados:

7) Conclusiones:

8) Personal involucrado

9) Elaborado por: Fecha:

10) Aprobado por: Fecha:

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