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Nombres y cdigos: Helber Eliecer Cano, Omar Gustavo Montero. Grupo: ______ Fecha: 03 de
Abril del 2017
1. Introduccin.
En todos los ambientes naturales del planeta tierra habitan mltiples organismos de diversos tipos y
actividad fisiolgica, que permiten, en asociacin con los seres inertes o factores abiticos la
existencia de los ecosistemas; desde el organismo ms grande, hasta parsitos, bacterias y hongos,
destacando de entre este grupo los hongos, organismos eucariotas que habitan en gran variedad de
superficies, en lechos y otras especies; cuyas formas vegetativas son extremadamente diversas
desde las ms simples formadas por una sola clula o con caractersticas, como la presencia de
estructuras filamentosas de mucho ms tamao y caractersticas morfolgicas complejas
diferenciadas. Desde el punto de vista de su supervivencia, los hongos son organismos hetertrofos y
obtienen los nutrientes por absorcin de un sustrato determinado. Por otra parte, es imposible dejar
de lado organismos como las bacterias, los cuales representan los individuos ms abundantes del
planeta, presentes en todos los hbitats del globo, con alto grado de adaptacin a condiciones
extremas como altas temperaturas, o incluso a entornos de alta salinidad; algunas con funciones
fundamentales como el reciclado de nutrientes y con un papel importante en los ciclos
biogeoqumicos. (Gonzales, 2015)
Objetivos.
1. Identificar los diferentes medios de cultivo y las condiciones de incubacin para el aislamiento de
microorganismos con caractersticas especficas.
2. Conocer y aplicar las diferentes tcnicas para el aislamiento de microorganismos (hongos y
bacterias), para la conservacin de cultivos a corto y mediano plazo.
3. Caracterizar algunas colonias obtenidas a partir del aislamiento de microorganismos obtenidos del
tejido vegetal y clasificarlos segn su gnero a partir de pruebas bioqumicas.
Metodologa.
Aislamiento de hongos y bacterias a partir de tejido vegetal:
Para realizar el procedimiento se utilizaron tomates de la variedad chonto para el caso de hongos y
cebolla de bulbo para el caso de bacterias, teniendo en cuenta que el tipo de aislamiento a utilizar,
est sujeto a la presencia o no de sintomatologa, es decir, si existe presencia de sintomatologa
asociada a una enfermedad, se realiza un aislamientos directo, de no ser as se procede al
aislamiento indirecto.
En el caso de hongos, para el aislamiento indirecto se procedi a lavar con agua corriente los frutos
de tomate chonto, y se secaron con una toalla de papel estril. Los tejidos de inters se obtuvieron
con la ayuda de un bistur estril, cortando fragmentos de tejido infectado y sano aproximadamente
de 5x5 mm. Estos fragmentos se sumergieron durante 30 segundos en etanol al 70 %,
posteriormente se sumergen en hipoclorito de sodio durante 30 segundos a una concentracin de 2%
con el fin de eliminar la flora normal presente en el tejido. Posteriormente, los fragmentos se
enjuagaron sumergiendolos en agua destilada estril para eliminar los residuos de desinfectante que
pudiesen interferir con el desarrollo normal del patgeno. Despus, bajo condiciones aspticas, se
secaron los fragmentos de tejido utilizando una toalla de papel estril, para eliminar los excesos de
humedad que contribuyen con la contaminacin del aislamiento; estos finalmente se transfieren a una
caja de Petri 5 explantes con medio de cultivo agar PDA, se incubaron durante 8 das a 25 0C. (Roa,
2010)
Para el aislamiento de bacterias se realiza el mismo tratamiento para la esterilizacin del material
vegetal, y cerca de un mechero se transfiere un de los explantes a un tubo PE con agua destilada, y
se macera hasta obtener una consistencia cremosa, posteriormente se toma una asada de la
suspensin y se siembra en medio de cultivo, teniendo en cuenta que para el caso de bacterias se
usa el medio de cultivo agar nutritivo, adicionalmente, cabe aclarar que para este aislamiento se
utiliz como material vegetal cebolla de bulbo; esta siembra se incuba a 28 0C.
Transferencia de hifas: se identifica la colonia con la mayor ocurrencia en el aislamiento con ayuda
del contador de colonias y procede a cortar trozos de micelio de aproximadamente 0.5 cm usando un
bistur previamente esterilizado, estos trozo son transferidos aun un tubo con medio de cultivo,
asegurndose que el trozo entre en contacto con el medio de cultivo, esto con el apoyo de una aguja
micolgica, sellar adecuadamente el recipiente e incubar durante 7 das a una temperatura de 25 0C,
al cabo de los cuales se realiza la observacin y comparacin de la nueva colonia con la inicial que
se tena en la caja de Petri.
Microcultivo: para la realizacin de este tipo de cultivos se ubica en el fondo de una caja de Petri
papel absorbente, sobre este se coloca un ngulo de vidrio para soportar la lmina portaobjetos,
adicionalmente, con la ayuda de un bistur previamente esterilizado cortar trozo de medio de cultivo
limpio de aproximadamente 1cmx1cm, y transferirlo a la lmina portaobjetos con las pinzas de
diseccin estriles, ubicndolo en el centro de la lmina; posteriormente, se realiza la inoculacin de
cada uno de los cuatro puntos del cuadrado de medio limpio, transfiriendo parte del micelio del hongo
al montaje mediante una aguja micolgica; colocar la lmina cubreobjetos sobre el trozo de agar, y
humedecer el papel absorberte, incubar a 25 0C durante una semana, procurando que durante el
tiempo de incubacin se mantenga hmedo el papel absorbente. Observar el montaje bajo el
microscopio.
Cultivo monosporico: para el caso del cultivo moosnporico se utilizaron aislamientos en cajas de
Petri, en las cuales ya se haba hecho una identificacin previa la colonia de mayor ocurrencia,
evitando los pasos iniciales requeridos para este cultivo, limitndose simplemente a la observacin de
puntos marcados en la caja de Petri bajo el microscopio con el objetivo de transferir una de las
esporas que probablemente germin a un nuevo medio de cultivo e incubar durante 7 das a una
temperatura de 250C, al final de los cuales se debe observar y comparar las caractersticas
macroscpicas.
Cultivos para bacterias
Tomar una muestra de una colonia de bacterias, la cual fue previamente aislada e identificada con un
asa bacteriolgica y suspender en 10 ml de agua destilada, agitar hasta homogenizar, tomar 100ul de
esta dilucin y suspender nuevamente en 10 ml de agua destilada, repetir hasta obtener una
suspensin bien diluida, finalmente con ayuda de un asa bacteriolgica realizar un rayado sobre la
superficie de un nuevo medio de cultivo, e incubar a 30 0C, observar a las 24, 48, 72 h y transferir las
colonias a un nuevo medio de cultivo, e incubar nuevamente a 30 0C
Adicionalmente durante la prctica se realizaron las pruebas de germinacin, las cuales consisten en
la siembra de patgenos en tres diferentes hospederos, zanahoria, arroz y trigo, estos fueron
inoculados con sclerotium sp (zanahoria) y penicillium sp (trigo), incubados durante 8 das a
temperatura ambiente en tarros compoteros sellados con papel aluminio, esto con el objeto de
observar la especificidad de los patgenos frente a los hospederos.
Resultados y discusin
4.1. Sntomas. Describa los sntomas de la enfermedad que el grupo asoci con un posible
hongo y con una posible bacteria y a partir de las cuales se realizaron los aislamientos,
adicionalmente, especifique el hospedante a parir del cual se realizaron los aislamientos y el
origen de la muestra (Tabla 1). Relacione las sintomatologas observadas con las enfermedades
reportadas en la literatura para este hospedante y segn su anlisis mencion cul podra ser el
agente causal de las alteraciones observadas (Tabla 1).
Descripcin del
Tipo sntoma
sntoma Posible
rgano
Planta Origen de la agente
afectad (necrosis, clorosis,
Hospedante muestra Sea lo ms detallado causal
o alteracin de desarrollo,
posible (distribucin porque?
marchitamiento)
en planta y rgano)
4.2. Aislamientos. Analice los resultados obtenidos, mencionando aciertos y desaciertos del proceso y
aspectos que modificara para un prximo trabajo de este tipo. En la Tabla 2, presente los resultados obtenidos.
Describa las colonias aisladas a partir de los explantes y para el caso de hongos determine la frecuencia de
aislamiento.
Tipo de
Resultados Indique la colonia
aislamiento Es seleccionada para
realizado (describa las candidato a realizar las curvas de
Medio
caractersticas ser el agente crecimiento/microcul
de directo/indirect Frecuenci
macroscpicas de causal de la tivo (hongos) o
cultivo o a de la (s)
colonias obtenidas sintomatolog pruebas bioqumicas
emplead colonia (s)
a partir de los a inicialmente (bacterias)
o fue acertado
explantes (hongos) descrita?
el
macerado de tejido Porque? Cules fueron los
procedimiento?
(bacterias) criterios de seleccin?
Porque?
H
O
N
G
O
S
B
A
C
T
E
R
I
A
S
4.3. Identificacin del agente causal ms probable. Para hongos, describa las estructuras
observadas en los microcultivos. Coinciden las estructuras observadas con las esperadas del
posible agente causal segn los sntomas observados en la literatura? (Tabla 3). Para bacterias,
incluya en su reporte los resultados obtenidos para la tincin de Gram Coinciden las estructuras
observadas con las esperadas del posible agente causal segn los sntomas observados en la
literatura? (Tabla 3). Si el hongo empleado para el microcultivo o la bacteria tienen una
procedencia diferente a los aislamientos de su muestra original (punto 4.1.), mencione la
informacin que tenga disponible y que aporte en el proceso de identificacin, para ello tenga en
cuenta la informacin que se le solicita en los puntos 4.1 y 4.2.
Descripcin
Fotografa Describa de forma detallada las estructuras observadas,
corresponden a lo reportado en la literatura para el posible
(escoja la mejor y que mejor represente
agente causal asociado a la enfermedad inicialmente
la descripcin de estructuras obtenidas
descrita y a partir de la cual se realizaron los asilamientos?
en el microcultivo (hongos) o resultado
No olvide entregar una lmina fijada producto de su
de la tincin de Gram (bacterias) no
microcultivo (esto solo para hongos). Para bacterias
olvide incluir la amplificacin (4x, 10x,
mencione las pruebas bioqumicas que le permitieron
40 x o 100x) en la que logr
aproximarse al gnero; estos resultados debe coincidir con
lo presentado en la Tabla 4 para la bacteria problema
H
O
N
G
O
S
B
A
C
T
E
R
I
A
S
Genero Genero
Genero 1: Genero 3: Genero 4:
2: problema
Prueba 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1
Tincin de Gram
Prueba KOH
Forma
Produccin de
catalasa
Prueba de
Oxidasa
Requerimiento
de oxigeno
Utilizacin de
azucares y
liberacin de
sulfuros
Hidrlisis de
gelatina
Hidrolisis de
almidn
Produccin de
pigmentos
fluorescentes
Pigmentos
amarillos en
YDCA
Observaciones
4.5. Efecto del medio de cultivo en el crecimiento in vitro de hongos fitopatgenos.
De los sub-cultivos del hongo de inters en tres medios diferentes (Agar Papa Dextrosa, Agar
Agua y Agar Sauro), presente en una grfica los resultados del crecimiento radial en los diferentes
medios y analice los resultados obtenidos. Corresponden las caractersticas macroscpicas a los
de la colonia inicialmente aislada?, Si es distinta a qu se puede atribuir la diferencia?, incluya
fotografas del tiempo de evaluacin, puede ser la primera observacin, una intermedia y la final.
6. Referencias bibliogrfica