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CROMATOGRAFA

INTRODUCCIN
La cromatografa es un mtodo analtico de purificacin y separacin de uno o varios
componentes de una solucin, especies qumicas en general de alta complejidad. al distribuirlos
entre dos fases no miscibles, una de las cuales se mueve excediendo de la segunda . En todo
proceso cromatogrfico se distingue una fase fija o estacionaria y otra que fluye o mvil
(disolvente).
La fase estacionaria no es un cuerpo totalmente inerte presenta cierta afinidad hacia la fase
mvil donde existen ciertas especies qumicos que se quedan y cuando ocurre esto se toman otros
mecanismos.
- La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido adsorbido sobre un material slido
para tornarlo esttico..
- La fase mvil puede ser un gas o un lquido lo cual se mantienen fijas en una superficie
slida.
En consecuencia, las mezclas de gases pueden separarse por cromatografa por gas y lquido y en
gas y slido, y las soluciones lquidas pueden separarse con las tcnicas de lquido en lquido y
lquido en slido

La cromatografa fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, Mikhail Tswett
en 1906, pero su uso no se generaliz hasta la dcada de 1930. El trmino cromatografa fue
ideado por tswett en 1906 a partir de dos palabras griegas chroma que significa color y graphen
que significa escritura.
- Tswett invent la cromatografa en columna en la cual emple la tcnica para separar
varios pigmentos vegetales que dan color a las hojas permitiendo que una mezcla de
disolvente transportara los pigmentos descendiendo por una columna empacada con un
material insoluble, de la ndole de almina, slice, almidn o carbn. En la actualidad esta
tcnica se aplica tambin para compuestos incoloros.
Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo
XX. A su vez, la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) comenz a desarrollarse en los
aos 1960, aumentando su importancia en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica
cromatogrfica ms empleada.
El uso de la cromatografa est ampliamente extendido en el anlisis de alimentos,
medicinas, sangre, productos petrolferos y de fisin radiactiva.

2. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS.

Los procesos cromatogrficos pueden clasificarse por:


1.- La naturaleza de sus fases:
La fase estacionaria puede ser lquida o slida.
La fase mvil gas o lquido.
As el proceso puede clasificarse como:
a) Cromatografa lquido lquido
Cromatografa en fase lquida
b) Cromatografa slido lquido
c) Cromatografa lquido gas
Cromatografa en fase gaseosa
d) Cromatografa slido - gas.
En que el segundo nombre se refiere al estado fsico mvil.
2.- Por su mecanismo de separacin:
a) Cromatografa de particin o reparto.
b) Cromatografa de adsorcin.
c) Cromatografa de intercambio inico.
d) Cromatografa gaseosa.
O tambin se pueden dividir segn la forma de contacto entre las fases se denomina:
cromatografa de columna; cromatografa plana.
- Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un
papel. Las principales tcnicas son:
- Cromatografa en papel.
- Cromatografa en capa fina
- Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn
el fluido empleado como fase mvil se distinguen:
- Cromatografa en lquidos.
- Cromatografa de gases.
Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC), del ingls High performance liquid chromatography), que es la tcnica cromatogrfica
ms empleada en la actualidad.
Cromatografa plana
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en papel
Cromatografa en columna
Tcnica Fase mvil Fase estacionaria
Cromatografa de gases Gas Slido o lquido
Cromatografa lquida Lquido (polar) Slido o lquido
En fase inversa (menos polar)
Cromatografa lquida Lquido Slido o lquido
En fase normal (menos polar) (polar)
Cromatografa lquida Lquido Slido
De intercambio inico (polar)
Cromatografa lquida Lquido Slido
De exclusin
Cromatografa lquida Lquido Slido
De absorcin
Cromatografa de Lquido Slido
Fluidos supercrticos
a) Lquido lquido o particin.
1. Cromatografa de lquidos b) Lquido slido o de adsorcin.
c) Intercambio inico.
d) Exclusin por tamao.
2. Cromatografa de gases a) Gas lquido.
b) Gas slido.

d) . Cromatografa de reparto o particin.

La cromatografa de reparto como su nombre lo indica esta basada en la separacin de una


mezcla de sustancias mediante por distribucin o reparto existente entre la fase mvil
(disolvente) y la fase estacionaria, soportada sobre un slido adecuado. El disolvente puede ser
un lquido (cromatografa lquido lquido) o un gas (cromatografa gas - lquido)

Las tcnicas ms generales de la separacin (lquido lquido) se llevan a cabo sobre celulosa
o gl de slice hmeda, pudiendo realizarse en forma de tira de papel, capa fina o columna. El
medio en cada caso acta como soporte de agua, por lo que este tipo de cromatografa se
emplea fundamentalmente para separacin de sustancias solubles. Como ejemplo tpico
sealaremos la separacin de una mezcla de sustancias sobre una tira de papel filtro, como el
papel filtro posee fibras celulosas con un porcentaje de humedad, la separacin se lleva a cabo
al repartirse las sustancias entre la humedad de las celulosas y el flujo del disolvente sobre
ellos, el agua de las clulas permanece estacionaria, mientras que el disolvente circula sobre
ellos fase mvil..

En la autntica cromatografa de reparto el nico factor que influye en el


movindose un compuesto a lo largo del papel es la solubilidad relativa de este en la fase
mvil y en la estacionaria. Las sustancias que son solubles solo en el disolvente emigran a la
misma velocidad que en la parte frontal de este, mientras los que son solamente solubles en
agua permanecern en el origen de la cromatografa.
b)..Cromatografa de adsorcin .- La cromatografa de adsorcin, o lquido slido (CLS), es la
forma clsica de cromatografa de lquidos que introdujo Tsweet por vez primera a principios de
este siglo. Ms recientemente se ha convertido en un mtodo importante de HPLC. La adsorcin
es un fenmeno de superficie (adherencia) que se manifiesta por un aumento de concentracin en
la interfase que rodea al medio estacionario, es decir se refiere a la fijacin o retencin de la
sustancia entre la superficie de las dos fases. En (CLS), la fase estacionaria es un slido con
partculas de tamao pequeo como alumina, slice, almidn o talco activados. La fase mvil suele
ser un lquido orgnico puro o una mezcla de lquidos. En la mayora de los casos este tipo de
cromatografa se utiliza para separar solutos orgnicos. La separacin depende de diferencias en la
afinidad relativa de la superficie de la fase estacionaria y el lquido de elucin, hacia los solutos de
la muestra. Adems existe una competencia entre el eluyente y los solutos por ocupar sitios de
adsorcin.
Los mecanismos que participan en la cromatografa por adsorcin son:
Naturaleza de la muestra.
Naturaleza del adsorbente.
Naturaleza del disolvente

Generalmente las separaciones sobre adsorbentes dependen de la existencia del equilibrio


entre las molculas adsorbidas en la fase estacionaria y los que estn libres en el disolvente
movindose las molculas individuales entre las dos fases:
Fase estacionaria.- Es el lugar donde se produce la separacin de los componentes
(Lquido slido).
Fase mvil.- Es el vehiculo que transporta a la sustancia a travs de la fase estacionaria
sus estados son (lquido gas).
Soporte.- Lugar en el cul esta la fase estacionaria dependiendo del tipo de
cromatografa que se va ha realizar. El soporte no es un compuesto inerte tiene
afinidad, accin especfica sobre el compuesto ya sea para atraerlo o repelerlo, ejemplo,
geles orgnicos derivados de los polisacridos como la azarosa o simplemente carbn
activado.

El grado de retencin en la columna depender del tipo de absorbente slido y de su


superficie de contacto.
La cromatografa lquido slido por la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
tiene gran aplicacin en la separacin de compuestos orgnicos insolubles y relativamente no
polares con pesos moleculares menores de 5000.
Una caracterstica de la cromatografa de adsorcin que no tienen otros mtodos es la de
separar mezclas de ismeros.
d) Cromatografa de intercambio inico.- La cromatografa de intercambio inico tiene la
finalidad de realizar separaciones de sustancias inicas, tanto orgnicas como inorgnicas
(enzimas, protenas, cidos nucleicos y otras sustancias biolgicamente importantes), por
medio de materiales especiales de estructura porosa e insolubles. Estos contienen grupos de
reactivos que estn asociados a iones capaces de intercambiar con el medio que los rodea.

Generalmente son empleados tres tipos de materiales para las separaciones de sustancias, las
zeolitas, resinas y geles de intercambio inico. La diferencia entre ellos se debe a su naturaleza de
los grupos y su micro estructura.
d) Cromatografa Exclusin (o por tamao).-
Se basa en la exclusin por tamaos. Como se aplica a la separacin de macromolculas
soluble en agua de importancia biolgica.
La tcnica se la conoce como cromatografa de filtracin en gel. El proceso al que nos
referimos aqu la distribucin de solutos entre la fase acuosa dentro de las partculas de gel y agua
exterior.
A primera vista podramos decir que no es precisamente un proceso el hecho de transferir un
soluto de una fase acuosa a otra pero la selectividad respecto a los diferentes solutos se alcanza en
base al tamao de sus poros. Una molcula del soluto es suficientemente pequea para entrar con
libertad a la fase gel.

d) Cromatografa de Gases.- La cromatografa de gases es una tcnica analtica utilizada en


la separacin, identificacin y medida de los componentes de una mezcla. Se basa en la
diferencia de velocidades de migracin de los componentes de una mezcla, al ser
arrastrados por un gas inerte a travs de un tubo relleno de un material adecuado.
El mtodo de Cromatografa de Gases fue iniciado por los cientficos ingleses
A. T. James y A. J. P. Martn en 1941. Comenz a utilizarse en varios laboratorios a partir de
1950. Los cromatgrafos de gases se emplean en gran escala en el anlisis de mezclas orgnicas
complejas, como las que se encuentran comnmente en derivados del petrleo, aceites esenciales,
perfumes sabores, sustancias de origen biolgico, insecticidas y pesticidas, cidos grasos, etc. El
tiempo de anlisis vara y puede ser de minutos a horas; siendo para la gran mayora de los anlisis
entre 5 y 15 minutos. El tamao de la muestra tambin vara entre unos pocos microlitos y varios
mililitros pudiendo en este ltimo caso recogerse componentes de la mezcla. Se puede detectar la
presencia de sustancias hasta en 10-12 gr, o analizarse componentes en concentracin del orden de
90%.
Como se puede observar la Cromatografa de Gases sobre sale sobre otras tcnicas
analticas por su gran versatilidad tanto en lo que se refiere a tipos de trabajo, como tambin a la
naturaleza y cantidad de muestra. Podemos decir, en general, que la cromatografa de gases se
puede emplear para analizar mezclas de compuestos que vaporicen o se volatilicen a temperaturas
entre por debajo de 0 C hasta 450 C, y para cualquier sustancia que pueda calentarse dando una
presin de vapor de unos 30 mms de mercurio sin alterarse o descomponerse.
La Cromatografa de Gases es, en muchos casos, el nico mtodo que permite separar en
una sola operacin ms de 100 componentes de una mezcla. Empleada en combinacin con
espectrofotometra infrarroja o espectrometra de masas permite aislar e identificar los
componentes de una mezcla; con pocas modificaciones se puede emplear para purificar y obtener
sustancias del ms alto grado de pureza.
Cromatografa en Columna.- La fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo estrecho a
travs del cual se hace pasar la fase mvil por presin o gravedad. La fig. muestra
esquemticamente como dos sustancias A y B se separan en una columna por cromatografa por
elucin. La elucin implica el transporte de una especie a travs de una columna por la adicin
continuada de nueva fase mvil. Como se indica en la figura, una porcin de la muestra, contenida
en la fase mvil, se introduce en la parte superior de la columna (tiempo tO) y a continuacin los
componentes de la misma se distribuyen entre las dos fases. La introduccin de fase mvil
adicional (el eluyente) hace que la fase mvil que contiene una parte de la muestra se mueva
hacia abajo por la columna, donde tiene lugar un posterior reparto entre la fase mvil y las
porciones nuevas de fase estacionaria (tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribucin
entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en que inicialmente se ubicaba la
muestra. Sucesivas adiciones de fase mvil hacen descender las molculas de analito por la
columna en una serie continua de transferencias entre las fases estacionaria y mvil. Sin embargo,
debido a que el movimiento de los componentes de la muestra solo puede ocurrir en la fase mvil,
la velocidad promedio con la que la especie migra depende de la fraccin de tiempo que reside en
esta fase. Esta fraccin es pequea para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase
estacionaria (el compuesto B en la figura) y es grande cuando es ms probable la retencin en la
fase mvil (componente A). En el mejor de los casos, la diferencia de velocidad que resulta hace
que se separen los componentes de la mezcla en dos bandas, o zonas, que se extienden a lo largo
de la columna (ver tiempo t2). El aislamiento de las especies separadas se consigue haciendo pasar
suficiente fase mvil a travs de la columna hasta que las bandas individuales salen de ella,
pudiendo as detectarse o recogerse independientemente (tiempos t3 y t4).
Si un detector que responde a la presencia del analito se coloca al final de la columna, y se
representa su seal en funcin del tiempo (o del volumen de fase mvil aadido), se obtiene una
serie de picos como se muestra en la parte inferior de la figura. Este grfico se denomina
cromatograma y es til tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo.
COMPARACIN DE LA CROMATOGRAFA DEL LQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIN Y LA CROMATOGRAFA DE GAS LQUIDO
CARACTERSTICAS DE AMBOS MTODOS

Eficaz, muy selectivo y ampliamente aplicable.


Solo se necesita una muestra pequea.
Puede no destruir la muestra.
Se adopta fcilmente el anlisis cuantitativo.

VENTAJAS DEL HPLC

Puede separar muestras no voltiles y trmicamente inestables.


Por lo general se aplica a iones inorgnicos.

VENTAJAS DE CROMATOGRAFA GAS LQUIDO

Se emplea un equipo sencillo y poco costoso.


Es rpida.
Su resolucin es inigualable (en columnas capilares).

3. CROMATOGRAFA EN PAPEL

Como su nombre lo indica es la separacin que se realiza sobre hojas de papel cromatogrfico en
al que vara el espesor y la velocidad del flujo. La cromatografa es una tcnica analtica y
cuantitativa que ha alcanzado un alto grado de desarrollo y modalidades en los laboratorios de
qumica y bioqumica en sus diversas aplicaciones, la cromatografa sirve para preparar
compuestos qumicos diferentes a partir de mezclas multidiferentes. Por ejemplo es capaz de
identificar y separar los 350 compuestos que dan su sabor y bouquet caracterstico al caf.

En cromatografa existen dos fases:


- Fase estacionaria.
- Fase mvil.
-
Para realizar una prctica se debe tomar en cuenta los siguientes pasos.

1. Muestra para cromatografa.


2. Aplicacin de la muestra sobre papel.
3. Eleccin del disolvente.
4. Tcnica descendente o ascendente.

MUESTRA PARA CROMATOGRAFA

Las muestras elegidas se aplican sobre un papel en forma de solucin para los slidos y disuelve
en una pequea cantidad de disolvente adecuado.

APLICACIN DE LA MUESTRA SOBRE EL PAPEL

Una vez elegido el tamao y la calidad de papel que se va a utilizar se dibuja con un lpiz una
lnea paralela al lado por el que va a comenzar la cromatografa, se marca un nmero de pequeas
cruces sobre la lnea a distancias iguales 2,5 a 3,0 cm. Las muestras se aplican sobre el papel
mediante un tubo capilar o hilo de platino en la posicin adecuada ( el punto de la muestra no
deber exceder ms de 5 milmetros de dimetro). Una vez que se han secado las manchas sobre el
papel estn listos para el desarrollo, nombre que se da al proceso en el que un disolvente fluye a
travs del papel produciendo una separacin.

ELECCIN DEL DISOLVENTE.

El disolvente para el desarrollo depende de las sustancias que se van a separar.

Tenemos:
Hexano.
Tetracloruro de carbono.
Benceno.
Acetona.
Dicloro metano.
Cloroformo. Aumento del efecto eluente

ter etlico.
Acetona d etilo.
Isopropanol.
Etanol.
Metanol.
Agua.
TCNICA
La tcnica puede ser ascendente o descendente, todo desarrollo se lleva a cabo en un recipiente
hermticamente cerrado.
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA
Los mtodos de cromatografa plana incluyen la cromatografa en capa fina (TLC), cromatografa
en papel (PC), y la eletrocromatografa (EC). Proporciona una tcnica rpida y conveniente para
reconocer la pureza de una sustancia o analizar mezclas.
La tcnica se basa en el diferente grado de retencin sobre un adsorbente (silica de gel,
almina, etc.)de distintas sustancias cuando estas se fraccionan entre el adsorbente y un solvente.
La distinta retencin (adsorcin) es manifestada en la diferente movilidad sobre la superficie del
adsorbente pasando a la fase lquida (solvente). Los compuestos con distinta movilidad aparecen
en distintos puntos del cromatograma como manchas separadas.
En trminos cuantitativos la movilidad de un compuesto es expresada por su valor de Rf:
Distancia recorrida por la sustancia
Rf = ----------------------------------------------
Distancia recorrida por el solvente

Los valores de Rf estn en funcin de tres importantes variables.


1. La naturaleza y actividad del adsorbente.
2. El solvente.
3. La adsorbabilidad (polaridad) del compuesto

En todos los casos se emplea una capa horizontal y relativamente delgada de un material
que es a la vez soporte, o que se coloca sobre una superficie de vidrio, plstica o metlica, la fase
mvil se mueve a travs de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o
con un potencial elctrico.