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Extraccin de ADN y estudio de algunas de sus propiedades

RESUMEN

En este informe de laboratorio de bioqumica se presentan los resultados de la


extraccin y de la absorcin UV/Vis del ADN presente en la levadura, la cual su
rompimiento celular fue realizado con arena y su extraccin con Dodecil Sulfato
de Sodio (SDS) y cido etilendiaminotetraactico (EDTA). En la realizacin de la
practica se observaron los efectos del pH y de la temperatura en el ADN lo
cuales fueron medidos con la tcnica de absorcin UV-Vis para cuantificar su
concentracin.

INTRODUCCIN: hibridacin. La obtencin de ADN


nativo es difcil debido al tamao de
Una de las caractersticas de los la molcula y a la presencia de
seres vivos es su reproduccin; con enzimas hidroliticas.
este fin, se utilizan los cidos
nucleicos para almacenar y El ADN y el ARN absorben en el
transmitir la informacin gentica. ultravioleta. Las bases nitrogenadas
La biomolcula en la que se de los oligonucleotidos tienen
almacena la informacin en forma mximo de absorcin a 260 nm. Las
codificada es el cido protenas tienen mxima
desoxirribonucleico (ADN), con absorbancia a 280 nm, La pureza
excepcin de ciertos virus, que lo del ADN extrado puede
hacen en el ARN. determinarse por el cociente entre
la absorbancia a 260 nm y la
La informacin que hace a cada ser absorbancia a 280.
nico debe ser preservada y luego
transferida, a un nuevo ADN en las Las principales etapas del
clulas hijas, ya sea de la progenie aislamiento del ADN son: ruptura de
o del mismo individuo. las clulas por choque osmtico,
digestin enzimtica o por un
La obtencin de ADN o ARN puros mtodo mecnico suave, seguido
puede hacerse por mtodos del aislamiento del ncleo,
cromatografitos; intercambio inico, mitocondrias, virus u otras
tamiz molecular, afinidad, estructuras subcelulares que
electroforesis y ultracentrifugacin contengan ADN. Posteriormente las
en gradiente de densidad, o por protenas se disocian del ADN por la
accin de un detergente aninico o un virus se reproduce y
sales concentradas. Con frecuencia transmite a la descendencia la
se agregan agentes quelante para informacin que contiene. En
remover los metales. El pH se ajusta casi todos los organismos
a valores medianamente alcalinos celulares el ADN est organizado
para disminuir la interaccin en forma de cromosomas,
electrosttica con el ADN. situados en el ncleo de la
clula.
OBJETIVOS

Realizar la extraccin del ADN de


la levadura.
Determinar la pureza del ADN Estructura del ADN
mediante la relacin del
absorbancia a 260 nm y 280 nm. Cada molcula de ADN est
Calcular la cantidad de ADN
constituida por dos cadenas o
obtenido
bandas formadas por un elevado
nmero de compuestos qumicos
1. MARCO TERICO llamados nucletidos. Estas cadenas
forman una especie de escalera
retorcida que se llama doble hlice.
El ADN es el que contiene el Cada nucletido est formado por
mensaje gentico para toda la tres unidades: una molcula de
funcin y organizacin celular. azcar llamada desoxirribosa, un
Es, en definitiva, la molcula que grupo fosfato y uno de cuatro
controla todos los procesos posibles compuestos nitrogenados
vitales para los seres vivos, llamados bases: adenina (abreviada
adems de ser el principal como A), guanina (G), timina (T) y
constituyente de los citosina (C). La molcula de
cromosomas celulares. desoxirribosa ocupa el centro del
nucletido y est flanqueada por un
Material gentico de todos los
grupo fosfato a un lado y una base
organismos celulares y casi
al otro. El grupo fosfato est a su
todos los virus. El ADN lleva la
vez unido a la desoxirribosa del
informacin necesaria para
nucletido adyacente de la cadena.
dirigir la sntesis de protenas y
Estas subunidades enlazadas
la replicacin. Se llama sntesis
desoxirribosa-fosfato forman los
de protenas a la produccin de
lados de la escalera; las bases estn
las protenas que necesita la
enfrentadas por parejas, mirando
clula o el virus para realizar sus
hacia el interior, y forman los
actividades y desarrollarse. La
travesaos.
replicacin es el conjunto de
reacciones por medio de las Los nucletidos de cada una de las
cuales el ADN se copia a s dos cadenas que forman el ADN
mismo cada vez que una clula o establecen una asociacin
especfica con los correspondientes rompimiento de la pared celular se
de la otra cadena. Debido a la produce mediante fraccionamiento
afinidad qumica entre las bases, los mecnico con perlas de vidrio,
nucletidos que contienen adenina seguido por una purificacin usando
se acoplan siempre con los que una mezcla de fenol-cloroformo. Sin
contienen timina, y los que embargo, cuando se procesa un
contienen citosina con los que gran nmero de muestras, el uso de
contienen guanina. Las bases perlas de vidrio es insuficiente.
complementarias se unen entre s
por enlaces qumicos dbiles Querol et l. (1992) presentan un
llamados enlaces de hidrgeno. protocolo de extraccin de ADN,
En 1953, el bioqumico donde el rompimiento celular se
estadounidense James Watson y el lleva a cabo mediante lisis con la
biofsico britnico Francis Crick enzima Zimolasa, y la liberacin del
publicaron la primera descripcin de ADN no requiere el uso de fenol-
la estructura del ADN. Su modelo cloroformo. Esta metodologa ha
adquiri tal importancia para sido
comprender la sntesis proteica, la ampliamente acogida ya que
replicacin del ADN y las elimina el uso del fenol.
mutaciones, que los cientficos
La enzima Beta-glucoronidasa es
obtuvieron en 1962 el Premio Nobel
usada rutinariamente para la
de Medicina por su trabajo.
hidrlisis de glucurnidos de orina,
Extraccin del ADN en levaduras plasma y otros fluidos, antes del
anlisis por inmunoensayos,
Numerosos mtodos para la espectrometra de masas,
extraccin de ADN de levaduras se cromatografa de gases, HPLC, y
han descrito (Kurtzman y Fell, otros medios.
1998). stos se diferencian
bsicamente en qu procedimiento La Beta-glucoronidasa cataliza la
ha sido utilizado para la lisis de la reaccin Beta-D-glucuronsido +
pared celular de la levadura, y qu H2O D-glucuronato + Alcohol (Xu
protocolo es usado para la et l., 2002). En levaduras, esta
purificacin del ADN. Casi todos los enzima ha sido usada para obtener
mtodos empleados son variaciones protoplastos en diferentes especies
tanto de procedimientos de y con distintos propsitos (Torres-
agitacin con perlas de vidrio Bauz y Riggsby, 1980).
(Hoffman y Winston, 1987; Ros-
Chumillas et l., 2007) como de lisis MATERIALES Y METODOLOGA:
de pared celular por tratamiento 2 tubos para centrifuga
enzimtico Pipeta de 5 mL, 2 mL
(Querol et l., 1992). Probeta de 25 mL
Erlenmeyer 250 mL
Hoffman y Winston (1987) proponen Arena lavada
un protocolo en el cual el Frasco lavador
2 balones aforados de 25 mL CALCULOS Y RESULTADOS:
Pipeta Pasteur
Tubos de ensayo Para el desarrollo de esta prctica
Mortero con pistilo se tom 5,0 g de levadura.
Solucin cido
Para la cuantificacin del ADN se
etilendiaminotetraactico (EDTA)
Solucin de Dodecil Sulfato de emple un espectrofotmetro de
Sodio (SDS) reflectancia mediante el cual se
Solucin de Perclorato de Sodio desarroll las medidas respectivas
(6M) de absorbancia a 260 nm. Y 280
Solucin Cloroformo-Alcohol nm. para determinar la pureza.
24:1
Centrifuga Concentracin de ADN
Espectrofotmetro de
g
reflactancia | 260nm| x F . dilucion x 50
mL
Para la extraccin del ADN presente g
de ADN =
en la levadura se inici con 5g el mL
cual fue molido vigorosamente con
arena lavada en un mortero, el g g
homogenizado fue agregado en un de ADN =1.113 x 100 x 50
mL mL
erlenmeyer ms 30 ml de EDTA y 2
ml de SDS a 60 C durante 10
minutos, la solucin se enfri y se
g
de ADN =5565
agregaron 5 mL de de Perclorato de mL
sodio y una mezcla de 40 ml de
Cloroformo:Alcohol (24:1), la
solucin se agit durante 15
minutos mecnicamente con el Cantidad de ADN obtenido
erlenmeyer tapado, la mezcla fue
transferida a 2 tubos de centrifuga
g
equilibrados por peso
centrifugados por 10 minutos. Se
y g de ADN= ADN ( mL ) x Volumen tota
retir la capa acuosa del
centrifugado y se situ en un g
g de ADN=5565 x 25 ml
erlenmeyer con 70 mL de etanol y mL
se agito manualmente y el material
fibroso que precipit se recolect.
g de ADN=139125
Se prepar una solucin stock con el
ADN con un factor de dilucin de
100, la cual fue repartida de a 1.5
mL para cada medicin de
Determinacin de la pureza
temperatura y a diferentes valores
del ADN
de pH.
Abs260nm = 1.113 A continuacin se presentan los
Abs280nm = 0.638 valores de la absorbancia con
respecto a diferentes valores de
1.113 temperatura:
=1.74 Tabla 2. Absorbancia para el ADN a diferentes valores
0.638
de temperatura

Muestr Temperatura Absorbanci


a [C] a
Los valores comprendidos entre 1.8 1 20 0.292
y 2.0 indican un alto grado de 2 37 0.295
pureza cidos nucleicos, valores
3 60 0.295
4 70 0.306
entre 1.8 y 1.9 indican una alta 5 80 0.34
pureza de ADN y un valor por 6 82 0.35
encima de 2.0 indica contaminacin 7 84 0.36
por ARN y valores por debajo de 1.8 8 88 0.376
contaminacin del extracto con
9 90 0.391
[2]
protenas.
En base a estos resultados se
realizo la curva de de Abs versus el
Efecto del pH pH y versus la temperatura,
obtenindose lo siguiente:
A continuacin se presentan los
0.5
valores de la absorbancia con
respecto a diferentes valores de pH: 0.4

0.3
pH
Tabla 1. Absorbancia para el ADN a diferentes valores
0.2 Temp
de pH
0.1
Muestr pH Absorbanci
a a 0
1 8.5 0.23 0 20 40 60 80 100
2 9.5 0.25
3 10.5 0.348
4 11.5 0.483 Grfico 1. Absorbancia versus pH y temperatura
5 12.5 0.29
ANLISIS DE RESULTADOS

Pureza del ADN

Efecto de la temperatura
Valor lit .Valor exp
de error= x 100
Valor lit .
1.801.74 Como se puede purificar el
de error= x 100
1.8 ADN de un extracto de
levadura?
de error=3.33
Se puede utilizar una solucin de
cloroformo-fenol, en vez de
PREGUNTAS cloroformo-alcohol para
desnaturalizar las protenas
Diga cual ADN tiene mayor presentes en el extracto[3]
Tm? ADN con GC = 63% o
ADN con GC =41%
Conclusiones
Qu funcin desempea el
SDS, Cloroformo, Alcohol
isoamlico, Perclorato de
Sodio, EDTA en la extraccin
de ADN? Bibliografa

La funcin del SDS permiti la [1][3] Osorio-Cadavid, Esteban;


degradacin de los componentes Ramrez, Mauricio; Andrs Lpez,
celulares para poder liberar el William; Mambuscay, Luz Adriana.
ADN. EL EDTA impide la Estandarizacin de un protocolo sencillo
precipitacin temprana del ADN para la extraccin de ADN genmico de
Levaduras. Revista Colombiana de
atrapando cualquier in presente
Biotecnologa, Vol. XI, Nm. 1, julio,
en la solucin. El perclorato de
2009, pp. 125-131
sodio se utiliza como quelante
del ADN. Debido a que el ADN [2] ELOSEGI,A. Conceptos y tcnicas
puede contener impurezas de en ecologa. Editorial los autores.
tipo proteico se desnaturalizan Bilbao-Espaa, 2009, p. 190
utilizando cloroformo y se
mantienes en el alcohol
isoamilico lo cual se puede [4] VIRGILI, Rafael. VIDAL, Jos.
separar por medio de la Genoma Humano. Nuevos avances
centrifugacin. [4] en investigacin, diagnostico y
tratamiento. Ediciones Universitat
de Barcelona, Espaa 2006, pgs.
33-34