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CARACTERIZACIN DE LA CEPA CrMFC1 Y SU

POTENCIAL BIORREMEDIADOR DE CROMO EN


CELDAS DE COMBUSTIBLE MICROBIANAS.
RUBY ESTELLA LUCUMI-BANGUERO
Neyla Bentez Campo PhD. (Directora)
Alexander Mora Collazos (Codirector)

Programa acadmico de Biologa


Facultad de ciencias naturales y exactas
Universidad del Valle
INTRODUCCIN
El cromo presenta cinco estados de valencia, de los cuales los
dos ms importante son el cromo (III) y (VI) que se
caracterizan por ser muy estables en la naturaleza.

Cr(VI) Cr(III)
Evelyne & Ravisanka 2014; Cheung & Gu 2007, Imgenes www.google.com.co
INTRODUCCIN
El uso antropognico de Cromo ha aumentado desde la
revolucin industrial.

Crdenas-Gonzlez et al. 2011; Cheung & Gu 2007, Imgenes www.google.com.co


INTRODUCCIN
Para el tratamiento de Cr(VI) se usan
diferentes mtodos como:
Resina de intercambio inico.
Filtracin.
Reduccin qumica.
Tecnologas amigables y sostenibles con el medio
ambiente:
Biorremediacin.
Celdas de combustibles microbianas.

Min & Logan 2004; Thygesen et al. 2011; Rehman et al. 2008; Crdenas et al. 2011; Imgenes www.google.com.co
INTRODUCCIN
Mecanismos de reduccin de Cr(VI). 1) Sistemas de transporte de sulfato, el
cromato es incorporado a las clulas
(codificado en el cromosoma)
2) Transportadores que provocan la
expulsin del cromato (codificados
por plsmidos)
3) Reduccin aerbica de Cr(VI),
requiere NADPH como donador de
electrones
4) Reduccin extracelular anaerbica
de Cr(VI) a Cr (III) (codificada en el
cromosoma)
5) Reduccin intracelular de Cr(V) a Cr
(III), puede causar estrs oxidativo y
dao a cidos nucleicos, protenas y
lpidos
6) Produccin de enzimas
detoxificantes (antioxidantes)
7) Dao en replicacin del DNA, de
transcripcin del RNA y expresin de
genes, generado por los derivados
del Cr (III)
8) Activacin del sistema de reparacin
de daos en el DNA

Tomada de: Ahemad 2014


INTRODUCCIN
En las CCM se usan aguas residuales orgnicas o
industriales para producir energa, a la vez que
los microorganismo producen la remediacin de
diferentes contaminantes.
Dos caractersticas importantes son:
Sustrato que se emplea.
Los microorganismos: Shewanella
oneidensis, Geobacter sulfurreducens,
Geobacter metallireducens, Rhodoferax
ferrireducens, Klebsiella pneumoniae,
Clostridium butyricum .
Lucumi, R.

Kim et al. 2002; Bond et al. 2002; Li et al. 2009; Vejarano 2012; Debabov 2008; Wang et al. 2008; Xing et al. 2008; Mora & Bravo 2017
PROYECTO DE INVESTIGACIN:
CARACTERIZACIN DE TRES AISLADOS BACTERIANOS DE AGUA RESIDUAL
INDUSTRIAL PROMISORIOS PARA LA BIORREMEDIACIN DE CROMO POR
MEDIO DE CELDAS DE COMBUSTIBLE MICROBIANAS

Convocatoria Interna 2014 -2016


GRUPOS DE INVESTIGACIN
BIOLOGA DE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
Departamento de Biologa

LABORATORIO DE INVESTIGACIN EN CATLISIS APLICADA Y SUPERFICIES


Departamento de Qumica

Facultad de Ciencias Naturales y Exactas


Universidad del Valle
OBJETIVO GENERAL

Caracterizar la cepa
bacteriana CrMFC1 y su
potencial biorremediador de
cromo en celdas de
combustible microbianas.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Determinar las caractersticas morfolgicas,
bioqumicas y moleculares de la cepa CrMFC1 aislada
del electro de una CCM.

Evaluar la tolerancia de la cepa CrMFC1 a la


presencia de cromo hexavalente y su capacidad para
reducirlo.

Medir el desempeo electroqumico del


aislado en celdas de combustible microbianas
(CCM).
Quitar las imgenes y dejar los
objetivos en una sola diapositiva
MTODOS
Prueba de pureza, en
medio slido y tincin
de Gram.

Observaciones macro y Solucin de


microscpicas . glutaraldehdo al
2,5% en buffer
fosfato de sodio 0,1
M a pH 7,2.
Observacin del efecto del Cr
(VI) en la morfologa celular
Etanol desde el 10%
(MEB) hasta 100%.
Secadas agregando
Reactivacin de la cepa gotas de
en medio LB liquido. Caracterizacin hexametildisiloxano
bioqumica con kits
comerciales BBL Crytal y
(HMDS).
API 20 NE. Recubrieron con oro.

Vejarano 2012; Mora & Bravo 2017


Anlisis filogentico

Extra: Amplifico por Gel de


Ultraclean PCR agarosa Comparadas NCBI/
Microbial DNA el gen del ARNr 1,5%/ colectaron las secuencias.
isolation kit. 16S 27f y 1492R. Macrogen.

Soporte estadstico : rbol mtodo de:


Bootstrap de mxima parsimonia con 10,000 repeticiones . mxima verosimilitud
Mxima verosimilitud 1,000 repeticiones. utilizando el software
Anlisis de inferencia bayesiana con 1.000.000 re-muestreos. PAUP .
Establecimiento de las
condiciones de pH y
Temperatura para el
crecimiento.

Los datos fueron analizados con una prueba


de varianza de dos vas de medidas repetidas.
MTODO
Tolerancia al cromo hexavalente. Bioensayo de la remocin de Cr(VI).
Condiciones 37C x 24h.
CMI

Control positivo de crecimiento sin Cr (VI)


(DO).
Control negativo: caldo LB con Cr(VI)

Ramrez & Bentez 2013


Parmetros electroqumicos.

Se realizaron curvas de polarizacin


Mediciones:
Corriente (I) y Voltaje (V).

Los clculos se hicieron teniendo en cuenta


la ley de Ohm.
P= V*I.
DP =P/Acat
DI= A R
cat ex

Martnez et al. 2016 y Logan et al. (2008),).


MTODO
Parmetros electroqumicos.

CR(VI) 10mg/L
Corriente (I) y Voltaje (V)
usando una resistencia
de 1k.
Concentracin de Cr(VI)
Da 14 y 28.

Martnez et al. 2016 y Logan et al. (2008),).


MTODO
Extraccin del extracto libre de clulas (ELC).

Sau et al. 2010; Focardi et al. 2012,Imgenes www.google.com.co


MTODO
Actividad de la Cromato Reductasa presente en el ELC.

Fue estimada basndose en los


procedimientos utilizados por
Park et al. (2000) y Focardi et
al. (2012).

Park et al.2000 y Focardi et al. 2012


RESULTADOS Y DISCUSIN:
CARACTERSTICA DESCRIPCIN CARACTERSTICA DESCRIPCIN
Morfologa celular Bacilo corto Urea -
Morfologa de las colonias circulares 4MU--D-glucsido +

Gram Positiva -D-glucurnido -


Endospora - Enzimas
Movilidad + p-Nitrofenil fosfato +
pH de crecimiento 7 p-Nitrofenil maltosa +
Temperatura de crecimiento 35-40C p-Nitrofenil -galactosa +
CMI 160mg/L P-nitrofenil--D-celobiosido -

Pruebas Produccin de Oxidasa


Catalasa
+
+
P-n-p-- -glucsido
Prolina y Leucina nitroanilida
+
-
Produccin de Indol - Asimilacin
Bioqumicas Prueba de Voges Proscaver
Gelatinasa
-
+
Sacarosa
Trehalosa
-
+
cido piroglutmico + Glucosa -
Arginina + 4-nitrofenil-D-galactopiranosida +
Esculina + cido hexanodioico -
Fenilalanina - cido cprico -
Fermentacin de Glucosa + cido fenilactico -
Fosfato - Arabinosa -
Hidrlisis de Urea - Citrato trisdico -
Isoleucina - Fructosa +
Licuefaccin de la Gelatina + Glicerol +
L-triptfano - Gluconato potsico -
Metionina + Lactosa -
Nitrato potsico - Maltosa -
Produccin de H2S - Manitol -
Reduccin de Citrato - Manosa -
Triptfano / Valina - N-acetil-glucosamina +
Anlisis filogentico
La cepa CrMFC1
identifico como
Exiguobacterium
acetylicum.

Chaturvedi et al. (2008); Chaturvedi & Shivaji (2006); Zhu et al. (2013); Schumann et al. (2002) y Aliabadi et al. (2014).
Temperatura y pH en el crecimiento
Temperatura*pH; LS Means
Current effect: F(12, 520)=2,5133, p=,00321
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
0,6
pH 5

0,5
pH 6
pH 6,5
Esta especie presenta
una temperatura de
Crecimiento (D.O 550nm)

pH 7
pH 7,5
0,4
crecimiento entre 15-
0,3
45C.
Rango de tolerancia de
0,2
pH de 4-10.
0,1

0,0
28 30 35 40

Temperatura (C)

Vishnivetskaya et al. (2009) y Selvakumar et al. (2010); Okeke (2008) y Aliabadi et el (2014)
Influencia del Cr (VI) en la morfologa celular

Echeverry (2016), Sarangi & Krishnan (2008), Singh et


al.(2015), Recillas et al. (2010), Morais et al. (2011),
Mendoza et al. 2015; Olarte & Cristiano 2012
Tolerancia al cromo hexavalente (CMI).
La cepa E. acetylicum
CrMFC1 present una
tolerancia al Cr(VI) de
160mg/L.
Esto esta asociado a los
diferentes mecanismos de
resistencia que se han
reportado para los
microorganismos.
CMI

Thatoi et al. 2014; Morais et al. 2011


Reduccin de cromo hexavalente
Reduccin de cromo hexavalente
CEPA [Cr(VI)] Tiempo

Exiguobacterium acetylicum CrMFC1 10mg/L 11h

Exiguobacterium sp. GS1 (Okeke 2008) 200mg/L 12h

Exiguobacterium sp. ZM-2 (Alam & Malik 2008) 36,77mg/L 16h

Exiguobacterium sp. KCH5 (Sarangi & Krishnan (2008) 73.8mg/L 48h

A pesar del efecto en la morfologa no se caus inhibicin del crecimiento celular.


Inhibicin en crecimiento se atribuye a:
toxicidad del metal.
Activacin de los mecanismos de detoxificacin.
Aumenta la fase de adaptacin (lag).

Viti et al. 201; Thatoi et al. 2014) e Islas y Bojrquez (2011)., Zhu et al. 2008; Islas & Bojrquez 2011; Sarangi & Krishnan 2008
Desempeo electroqumico sin cromo
Desempeo electroqumico

Colonizacin del ctodo.


Cantidad de nutrientes.
Uso de resistencias.

Parkash 2016; He et al. (2005); Watson & Logan (2011), y Martnez-Santacruz et al. (2016)
Desempeo electroqumico con cromo

Wu et al. (2015); Huang et al. (2011); Li et al. (2009), Crdenas et al. (2011); Wu et al. (2015) y Wang et al. (2008).
Ensayo de la Cromato Reductasa.

Sarangi & Krishnan (2008),Elangovan et al. 2006; Kannan et al. 2012; Bae et al. (2005), Dey & Pul 2016; Dey & Paul 2013; Dey et al. 2014
CONCLUSIONES
La cepa nativa E. acetylicum CrMFC1
mostro la capacidad de tolerar y reducir
Cr(VI), a travs de procesos que
involucran la accin de cromato
reductasas.
Adems, demostr capacidad
electroqumica en presencia y ausencia
de cromo hexavalente en celdas de
combustible microbianas.
Mostrando su potencial para la
biorremediacin Cr(VI) en sistemas
acoplados a CCMs.
QUITAR LA FIGURA
Recomendacin
En futuros estudios se recomienda
evaluar la produccin de energa de la
cepa E. acetylicum CrMFC1, usando
mayores concentraciones de cromo
hexavalente, para poder analizar el efecto
del dicromato por ms tiempo en la
produccin de energa.
Adems evaluar su potencial en aguas
residuales.

QUITAR LA FIGURA
Agradecimientos.
A Dios y mis padres por su apoyo incondicional, a mis
amigos y compaeros por todos y cada uno de los
momentos vividos durante este proceso.
A la profesores Enrique Bravo por darme la
oportunidad de estar en el proyecto y la profesora
Neyla Bentez por el acompaamiento durante este ao
al igual que Alexander Mora.
A la Universidad del Valle por la financiacin del
proyecto.
Al personal del Laboratorio de Investigaciones
Microbiolgicas por el uso de las instalaciones y la
asesora durante la ejecucin del proyecto.