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Evolucin y transmisin de tuberculosis resistente a

frmacos en una poblacin rusa
Nicola Casali1, Vladyslav Nikolayevskyy1, Yanina Balabanova1, Simon R Harris2, Olga Ignatyeva3,
Irina Kontsevaya3, Jukka Corander4, Josephine Bryant2, Julian Parkhill2, Sergey Nejentsev5, Rolf D Horstmann6,
Timothy Brown1 & Francis Drobniewski1,7

Los mecanismos moleculares que determinan la transmisibilidad (contagio) y la prevalencia de tuberculosis resistente a frmacos
en una poblacin fueron investigados, a travs de secuenciacin de todo el genoma, a partir de 1.000 aislamientos de pacientes
obtenidos de forma prospectiva en Rusia.
Dos terceras partes pertenecan al linaje de Pekn (o Beijing), que estaba dominado por dos clados homogneos. Los genotipos
multi-drogo resistentes (MDR) se encontraron en el 48% de los aislados en general y en el 87% de los clados principales.
2014 Nature America, Inc. All rights reserved.

La mutacin ms comn rpoB se asoci con fitness-compensatory mutations en rpoA o rpoC, y se identific una nueva sustitucin
compensatoria intragnica. (lee anexo 1 ya.. :D explica mutaciones compensatorias, y aptitud o fitness o eficacia biolgica; hace
referencia a la contribucin relativa de descendientes de un individuo a la siguiente generacin , en este paper la traduccin seria: la
eficacia biolgica de las mutaciones compensatorias en rpoA o rpoC se asoci a la mutacin rpoB que es la ms comn.)
La proporcin de casos de MDR (multi-drogo resistentes) con XDR (extremadamente resistente a drogas) fue de 16% en total, con
65% de aislamientos MDR que albergan mutaciones eis, seleccionadas por terapia con kanamicina, lo que puede impulsar el
desarrollo de cepas con virulencia aumentada.
La combinacin de resistencia a frmacos y mutaciones compensatorias mostradas por los principales clados confiere resistencia
clnica sin comprometer la eficacia biolgica (fitness) y la transmisibilidad (contagio), demostrando que adems de las debilidades
del programa de control de la tuberculosis, factores biolgicos pueden impulsar la persistencia y propagacin de la tuberculosis
MDR y XDR en Rusia y otros pases.

La tuberculosis es la segunda causa de muerte por enfermedad infecciosa Por lo general, el valor de la eficacia biolgica se correlaciona
despus del VIH. En 2011, se estim que haba 8,7 millones de nuevos inversamente con la frecuencia de una mutacin en los aislamientos
casos y 1,4 millones de muertes por enfermedad1. La creciente prevalencia clnicos8. Las mutaciones compensatorias que mitigan los efectos
de la resistencia a los medicamentos es un grave problema de salud deletreos de las mutaciones que confieren resistencia tambin son
pblica que amenaza los avances en el control de la tuberculosis sensible importantes para determinar la transmisibilidad de genotipos especficos9.
a frmacos2 Globalmente, se estima que el 4% de los casos nuevos y el Los estudios que utilizan tasas de agrupamiento (clustering)
20% de los casos tratados previamente tienen tuberculosis MDR, definida epidemiolgico molecular para evaluar el valor de transmisin de los
como resistencia a al menos rifampicina e isoniazida, con las proporciones genotipos asociados a la resistencia informan resultados variables 10,11, lo
ms altas en Europa oriental y Asia central1. Los casos MDR requieren que sugiere que el valor de la eficacia biolgica pueden verse afectada por
tratamiento prolongado y costoso con frmacos txicos de segunda lnea, la epistasis: es decir, cuando el efecto fenotpico de una mutacin depende
y las tasas de fracaso y mortalidad del tratamiento son altas2-4. Las cepas de la presencia o ausencia de otras mutaciones en el mismo genoma12. O
XDR, que son cepas MDR con resistencia adicional a cualquier sea cuando la expresin de uno o ms genes dependen de la expresin de
fluoroquinolona y al menos un agente inyectable de segunda lnea otro gen... :D
(kanamicina, amicacina o capreomicina), se han encontrado en todas las La secuenciacin del genoma completo ofrece el poder de rastrear los
regiones del mundo1. Globalmente, la proporcin de casos de tuberculosis mecanismos evolutivos que promueven el desarrollo y la transmisin de
MDR con tuberculosis XDR ha alcanzado el 9%. En el Reino Unido, se la resistencia a los frmacos dentro de las poblaciones de patgenos con
informaron 26 casos de XDR entre 1995 y 2011; El 45% (9/20) de los una resolucin sin precedentes. La evidencia de la seleccin adaptativa en
pacientes con pas de origen conocido procedan de Europa del Este5. En respuesta a la terapia antibitica puede ser encontrada identificando
los ltimos aos se ha observado una amenazadora acumulacin de homoplasias (mutaciones que surgen de forma independiente varias veces
reportes de cepas "totalmente" resistentes a los frmacos, que no son dentro de una filogenia) o loci que estn sujetos a mutacin frecuente13-15.
susceptibles a ningn frmaco probado6. Mediante la identificacin de todos los cambios que se producen en
La prevalencia de la tuberculosis resistente a los frmacos depende de la un genoma, es posible descubrir poliformismos co-ocurrentes que
tasa de adquisicin de mutaciones que confieren resistencia (resistencia contribuyen a los fenotipos de resistencia o significan efectos
adquirida) y de la tasa de transmisin de cepas resistentes a frmacos epistaticos 12.
(resistencia primaria). En Mycobacterium tuberculosis, la resistencia a los La alta incidencia de la tuberculosis MDR y XDR en Samara 3,16,
frmacos surge a travs de mutacin cromosmica, tpicamente dando una regin con ms de 3 millones de ciudadanos en Rusia, brind la
como resultado un valor de eficacia biolgica considerado como una tasa oportunidad de estudiar la emergencia y propagacin de la resistencia
de crecimiento reducida in vitro7. a los antibiticos dentro de una poblacin.

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Figura 1. Cobertura de la poblacin de pacientes con tuberculosis.
a) Se muestran las ubicaciones de la Regin de Samara en Rusia (rojo) y
los Estados blticos (Lituania (Li), Letonia (Lv) y Estonia (E)). (b, c) El
nmero de aislamientos secuenciados de cada territorio (verde) y ciudad
(azul, Samara City (Sm), Togliatti (T) y Syzran (Sz)) de Samara Oblast
(b) o distrito de Samara City C) se muestra dentro del crculo
correspondiente. El rea de cada crculo refleja la cobertura de la regin
(el nmero de aislamientos secuenciados en relacin con el nmero de
casos de tuberculosis notificados).
En este estudio prospectivo, el ms grande de su tipo ya informado, se
utiliz la secuenciacin de todo el genoma para investigar los
mecanismos moleculares que subyacen a la resistencia, la
compensacin de la aptitud o fitness y la epistasis positiva que juntos
determinan la transmisibilidad y la prevalencia de cepas resistentes a
los frmacos. El anlisis comparativo con aislados XDR del Reino
Unido se refiri al origen de la tuberculosis altamente resistente a
frmacos en este pas de baja prevalencia.
RESULTADOS
Estructura de la poblacin
Durante un perodo de 2 aos (2008-2010), se recogieron
prospectivamente 2334 cepas de M. tuberculosis de pacientes
individuales que vivan en Samara, Rusia. Se secuenciaron los genomas
de 1000 aislamientos.
La comparacin de los datos epidemiolgicos de los pacientes indic
que esta muestra era representativa de toda la poblacin y cubra la
distribucin de pacientes con tuberculosis en toda la regin (Figura 1 y
Tabla 1).
Para la comparacin, se seleccionaron 28 secuencias de un estudio de
ms de 2.000 pacientes de Londres con tuberculosis, procedentes de 90
pases diferentes, como representantes de la poblacin mundial 17,18. Se
incluyeron cinco cepas fenotpicas XDR aisladas de pacientes del Reino
Unido en 2011, as como un aislado de Estonia que representa el clon
que domina la poblacin de M. tuberculosis de este pas 19.
Las lecturas del mapeo para cada aislamiento frente a la secuencia de
referencia H37Rv identificaron un total de 32.445 SNPs en regiones no
repetitivas del genoma, incluyendo 238 SNPs asociados con resistencia
a frmacos. Estos sitios variables se utilizaron para reconstruir una
filogenia de mxima verosimilitud (Fig. 2 y Conjunto de datos
suplementarios 1).
La topologa de los rboles fue coherente con la estructura filogentica
global de M. tuberculosis sensu stricto que comprende cuatro linajes
principales 20, 21.
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De los 1.000 aislamientos de Samaran, 642 pertenecan al linaje de Pekn, 355
pertenecan al linaje euro-americano, 2 pertenecan al linaje de Asia Central
(CAS) y un nico aislado perteneca al linaje africano-oriental (EAI), reflejando
las proporciones observadas en toda la poblacin de pacientes samaranos.
En comparacin con los aislamientos dispares de Pekn del Reino Unido, la
mayora de las secuencias de Samaran Beijing formaron un grupo monofiltico
que denominamos sublinaje de Europa del Este 18 (Figura 1) consistente con una
sola expansin relativamente reciente de este linaje en la regin.
El agrupamiento bayesiano gentico de la poblacin 22 defini los dos clados
ms grandes que encajan dentro del linaje Beijing-clado A y el clado B- que
comprenda 264 y 119 aislamientos, respectivamente (Figura 2). Fuera de estos
clados, la mayora de los aislados restantes de Beijing eran miembros de grupos
ms pequeos; 60% (387/642) de todos los aislamientos de Beijing difieren de
su ltimo antepasado comn por 5 o menos SNPs (Figura 3). La parte occidental
de Samara est geogrficamente aislada por el ro Volga. La comparacin de la
poblacin aislada en el oeste con la del resto de la regin mostr una reduccin
significativa en la proporcin de aislamientos de clado A (18% versus 28%, P =
0,04, Figura 4 y Tabla 2 complementarias).
El linaje euro-americano mostr una diversidad de nucletidos
significativamente mayor ( = 0.0042, s.d. = 0.00018, 95% confidence interval
(CI) = 0.00380.0045 que el linaje de Pekn ( = 0.0022, s.d. = 0.00039, 95%
CI = 0.00150.0030). Menos aislados euroamericanos eran miembros de grupos
estrechamente relacionados; 39% (137/355) se diferenciaron de su ltimo
antepasado comn por 5 o menos SNPs (P <0,001). Aunque la diversidad global
dentro del linaje euro-americano an no ha sido bien caracterizada, Homolka et
al.23.
Aunque la diversidad global dentro del linaje euro-americano todava no ha sido
bien caracterizada, Homolka et al.23 identificaron ocho sublinajes basados en
SNP que eran ampliamente concordantes con clasificaciones basadas en huellas
dactilares moleculares. Se identificaron cuatro de estos sublinajes en Samara
(Haarlem, LAM, Ural y tipo S), mientras que el 36% de los aislados no se podan
clasificar por este esquema (Fig. 2). Se han utilizado cortas distancias genticas
entre aislamientos para inferir la probabilidad de transmisin directa. 24. En
nuestro conjunto de datos, cuatro pares de pacientes con aislamientos
secuenciados compartan hogares. Dentro de tres de estos hogares, los aislados
del paciente eran casi idnticos, con cero, dos y tres SNPs separando cada par,
consistente con la transmisin intrafamiliar o la infeccin de una fuente comn
24
.
Figura 2. Filogenia de mxima verosimilitud de 1.035 cepas de M. tuberculosis
basadas en 32.445 sitios variables. Se indican los cuatro linajes de M. tuberculosis:
Beijing, CAS, Euroamericanos y EAI. Las sublineas definidas por el SNP en Europa
y los principales clados de Pekn estn a la sombra. El nodo ancestral del sublineaje
de Europa Oriental de Beijing se indica con una estrella. Las lneas de puntos radiales
muestran las posiciones de los aislados del Reino Unido; Aquellos con un fenotipo
XDR estn marcados con crculos blancos. La cepa estonia est indicada por un
crculo azul lleno. La posicin de la secuencia de referencia H37Rv est marcada con
"R." El sublineaje de Europa del Este, el clado A y el clado B tenan 100% de soporte
de arranque (conjunto de datos suplementario 1).
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Figura 3 Distribucin filogentica de genotipos que confieren

resistencia y compensatorios.
La filogenia de 1.000 aislamientos rusos se representa a la
izquierda; Los linajes se colorean como en la Figura 2. Las
primeras 16 columnas representan loci de resistencia a
frmacos. "P" seguido de un nombre de gen subscrito indica
mutaciones que afectan a la regin promotora del gen. Para el
gen rRNA 16S, rrsstr se refiere al bucle del tallo 530 y 915
regiones implicadas en la resistencia a la estreptomicina49, y
rrsinj se refiere a las regiones aguas abajo asociadas con la
resistencia a los agentes inyectables de segunda lnea36. Las
bandas coloreadas representan diferentes polimorfismos e
incluyen mutaciones previamente identificadas y nuevas
descritas en este estudio. Las ltimas tres columnas muestran
SNPs no sinnimo en los genes RNA polimerasa rpoABC, con
exclusin de los de la RRDR. Los genotipos mostrados se
presentan en su totalidad en la tabla adicional 4.

Los pacientes de la cuarta familia estaban infectados

con aislados no identificados (183 SNPs diferentes).
Adems del par de hogares, 30 pares adicionales de
aislamientos, 3 grupos de 3 aislamientos y 1 grupo de 5
aislamientos no presentaron diferencias SNP dentro del
grupo. Los pacientes con aislados idnticos residan en
la misma regin de Samara en slo 20 de estos 35
grupos. Al c las direcciones de los pacientes,
encontramos que los pacientes con cepas idnticas
vivan hasta 136 km de distancia (Figura 5). Esto es
importante
XDR de cuatro pacientes britnicos procedentes de los
Estados blticos eran miembros de la sublnea de
Europa del Este, dos pertenecientes al clado B y uno
perteneciente al clado A, lo que sugiere que las
infecciones pueden haberse adquirido durante estancias
en su pas de origen O dentro de las comunidades
simptricas en el Reino Unido (Fig. 2).
En apoyo de esta conjetura, el quinto aislamiento XDR,
de un paciente chino, no era un miembro del sublineage
Europa Oriental. El aislamiento estonio tambin era
miembro del clado B.
La correlacin de los datos de fingerprint (huella
genmica) por (minisatlites) o nmero variable de
repeticiones en tndem (VNTR) indic que esta cepa es
la misma que predomina en el noroeste de Rusia18,19,25.
Los aislados de Europa Oriental estuvieron
estrechamente relacionados entre s, con aislamientos de diferentes Un total de 70 aislamientos tuvieron mutaciones en el promotor del
pases separados por tan slo 13 SNPs (Tabla 3). opern fabG1-inhA que confieren resistencia cruzada de bajo nivel a
isoniazida y sus anlogos estructurales, etionamida y protionamida27.
Prevalencia de genotipos MDR Como se determin mediante la reconstruccin filogentica, la
Una filogenia de mxima similitud de los 1.000 aislamientos rusos mutacin inhA surgi en un mutante katG en 44 de los aislamientos.
fue reconstruido y anotado con la resistencia a los genotipos de Es improbable que la terapia con isoniazida seleccione para
resistencia (Fig. 3 y Cuadros adicionales 4-6). mutaciones que confieren resistencia de bajo nivel en presencia de un
El locus de resistencia a frmacos mutado ms comnmente, en el SNP que confiere resistencia de alto nivel, lo que indica que la
codn 315 de katG, que confiere resistencia a alto nivel a mayora de estos SNPs promotores fueron adquiridos en respuesta al
isoniazid26, fue sustituido en 74% (478/642) de aislados de Beijing tratamiento con etionamida o protionamida.
y en 30% (106/355) de aislamientos euroamericanos (P <0,001, Fig. Las mutaciones en la regin determinante de la resistencia a la
4 y Tabla Suplementaria 7). rifampicina de 81 bp (RRDR) de rpoB son predictores precisos de la
Un nuevo SNP sin sentido en el codn 668 tambin medi la resistencia a la rifampicina en M. tuberculosis28. Dentro de esta
resistencia, consistente con el requisito de KatG para la activacin regin, se identificaron 20 SNP no sinnimos y 2 pequeas deleciones,
del pro-frmaco. que afectaron a 70% (430/642) de Beijing y 19% (67/355) de
Todos (478) de los mutantes katG de Beijing codificaban una aislamientos euro-americanos (P <0,001). El genotipo ms comn de
sustitucin p.Ser315Thr, mientras que 11% (12/106) de aislados resistencia a la rifampicina, que codifica una sustitucin p.Ser450Leu,
euro-americanos codificaban 1 de 3 sustituciones alternativas en el se encontr en el 90% (390/435) de aislados de Beijing con
codn 315 (P <0,001). mutaciones RRDR y en 67% (45/67) de aislados euro-americanos (P
<0,001 ).
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Figura 4 Prevalencia de mutaciones de resistencia a frmacos y asociacin

con linaje. La proporcin de aislamientos que albergan polimorfismos en
cada locus de resistencia a frmacos se subdividi por linaje. Los asteriscos
indican diferencias significativas entre los linajes (P <0,05, tabla adicional
7). Los datos se basan en los polimorfismos detallados en la tabla adicional
4.

Sobre la base de estos genotipos, el 66% (422/642) de Pekn y el

17% (61/355) de los aislados europeos tienen un fenotipo MDR
predicho (P <0,001). La proporcin de aislamientos que fueron
MDR en clado A y clado B combinado fue significativamente
mayor que para el resto del linaje Beijing (332/383 frente a 90/259,
P <0,001).

Mutaciones compensatorias en aislamientos MDR

Se investig la aparicin de mutaciones compensatorias en rpoA y
rpoC18 en aislados portadores de mutaciones de resistencia a la (16/435 frente a 4/565, P = 0,001). Las mutaciones que afectan al
rifampicina. Se identificaron 14 diferentes SNPs nonsynonymous residuo ms comnmente sustituido, Thr187, se adquirieron
en rpoA, 11 de los cuales se encontraron en aislamientos que independientemente al menos siete veces, proporcionando una
contienen la mutacin rpoB que codifica p.Ser450Leu (equivalente fuerte evidencia de que rpoA est sujeto a presin selectiva positiva.
a la sustitucin p.Ser531Leu en Escherichia coli), emergiendo
significativamente ms frecuentemente en este fondo gentico

Figura 5 Distribucin de la resistencia a rifampicina y sustituciones de aminocidos compensatorias en las subunidades RNA polimerasa RpoA, RpoB
y RpoC. Las mutaciones que confieren resistencia se agrupan en la regin RRDR de rpoB. Todas las otras sustituciones representadas son alteraciones
compensatorias importantes que co-ocurrieron con la alteracin de p.Ser450Leu en RpoB.

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ANEXO 1 5.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES

DIRECTAS INTRAGNICAS
5 REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES 1. Introduccin de un desfase de signo opuesto al
BACTERIANAS de la primera mutacin restauracin de la pauta de
Las variaciones fenotpicas producidas por las lectura alterada por una previa mutacin de desfase
mutaciones no-silenciosas son transmisibles a la de lectura (frameshift). La nica zona alterada tras
descendencia. Es decir, una vez producido el cambio, la mutacin supresora sera la que queda entre ella y
ste es permanente, pero no necesariamente la 1 mutacin. Si esta zona es corta y no es esencial
irreversible (como ya dijimos, solamente las grandes para la actividad biolgica, se puede restablecer el
delecciones son irreversibles). fenotipo primitivo.
La reversibilidad de las mutaciones suele 2. Supresiones en el mismo codn que qued
deberse a una segunda mutacin que restaura el afectado por la 1 mutacin, de modo que se codifica
fenotipo original. Esta 2 mutacin puede ser de dos un aminocido distinto del silvestre y distinto del aa.
tipos principales, y varios subtipos: del primer mutante, pero que restaura la
1) Reversin (en sentido estricto), que restaura el funcionalidad de la protena. A este tipo de supresin
genotipo original. Esto equivale a una retromutacin se la denomina tambin pseudorreversin.
(back-mutation). 3. Mutacin puntual compensatoria en un sitio
2) Supresin: la 2 mutacin suprime los efectos distante respecto de la primera mutacin: la 2
de la 1 pero no restaura el genotipo original. Por lo mutacin compensa a la 1, de modo que se restaura
tanto, tras la mutacin supresora, la clula queda con la estructura tridimensional y/o el centro activo de la
dos mutaciones. La supresin se clasifica a su vez en: protena
a) Supresin indirecta: no se corrige el producto
del primer gen, pero la 2 mutacin anula las
consecuencias fenotpicas. Ejemplos:
i) Se abre una nueva va para la sntesis del
producto afectado por la 1 mutacin.
ii) El producto mutado de la 2 mutacin puede
sustituir al producto de la primera.
iii) Se provoca un cambio en el medio intracelular,
que hace que el producto alterado de la primera
mutacin vuelva a ser funcional.
b) Supresin directa: la 2 mutacin corrige el
producto del primer gen mutado. Puede ser de dos
tipos principales:
i) Supresin intragnica: la 2 mutacin ocurre
en el mismo gen donde ocurri la primera.
ii) Supresin intergnica (= extragnica): la
mutacin supresora afecta a otro gen, que suele ser
uno de los genes implicados en la maquinaria de
traduccin del ARNm: ARNt y protenas ribosmicas.

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