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TECNICAS HISTOLOGICAS

Dr. BRUNO PERUZZO


UACH - 2017
RION DE CONEJO-ZONA CORTICAL H/E N7

CAPSULA

CORPUSCULOS RENALES

TUBULOS RENALES
ETAPAS DE PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE TEJIDOS PARA SU
OBSERVACION AL MICROSCOPIO OPTICO

FIJACION DEL TEJIDO

DESHIDRATACION E INCLUSION

OBTENCION DE LOS CORTES

MONTAJE DE LOS CORTES

TINCION DE LOS CORTES


FIJACION DEL TEJIDO
PROCEDIMIENTOS DE FIJACION

FIJACION POR INMERSION


(METODO RAPIDO UTILIZADO ESPECIALMENTE EN BIOPSIAS, NECROPSIAS, PIEZAS OPERADAS Y EN ANIMALES EXPERIMENTALES)

Previamente el animal muerto por choque traumtico o anestesia letal , las piezas de tejidos son rpidamente extradas
e inmersas en el o los Fijadores.

-Debido al limitado poder de penetracin de los Fijadores, las piezas de tejido deben ser del menor tamao posible.

-El tiempo de fijacin depender del tipo de Fijador y las caractersticas del tejido.

Pieza de Tejido idealmente de 2mm cbicos

Por lo general los FIJADORES penetran hasta


FIJADOR 1mm al interior de la pieza de tejido
HIGADO FIJADO EN BOUIN

Por Inmersin luego Por Perfusin Vascular


de una semana
DESHIDRATACION E INCLUSION
PROCEDIMIENTO DE DESHIDRATACION E INCLUSION

PROCEDIMIENTO DE DESHIDRATACION ( temperatura ambiente )

SACO DE GASA CON LOS BLOQUES DE TEJIDO FIJADOS LISTOS PARA LA


DESHIDRATACION E INCLUSION Cassettes de procesamiento de tejidos
ofrecidos en el mercado

Etanol 50% Etanol 70% Etanol 96% Etanol 100% Etanol 100% Etanol-Butanol Butanol puro

PROCEDIMIENTO DE IMPREGNACION E INCLUSION


( en estufa a 60C )

Butanol-Parafina Parafina pura


Medio de Inclusin LIQUIDO

Medio de Inclusin
Medio de Inclusin LIQUIDO SOLIDIFICADO

Medio de Inclusin
SOLIDIFICADO

Tejido impregnado e incluido en


Parafina slida o Paraplast solidificado
PROCEDIMIENTO PARA OBTENER LOS CORTES DEL TEJIDO

Bloque de Parafina y Pieza de Tejido


Bloque preparado para los CORTES
solidificados
OBTENCION DE LOS CORTES

MONTAJE DE LOS CORTES


PROCEDIMIENTO PARA OBTENER LOS CORTES DEL TEJIDO

Cortes salientes

Adhesivo de los cortes, previamente homogenizado


y secado sobre el Portaobjeto.
- Albmina de huevo
- Gelatina-Alumbre-Cromo
Bao con agua temperada aproximadamente
- Silano. etc
35- 40C

Bloque de Tejido fijado al


porta-espcimen

Los Cortes se dejan secar en estufa a 60C

Cortes salientes
PORTAESPECIMEN

BLOQUE DE TEJIDO INCLUIDO EN LA


PARAFINA SOLIDIFICADA

CUCHILLA
CORTES SALIENTES DE LA MUESTRA
DE APROXIMADAMENTE 7 Micras

CORTE FLOTANDO EN EL
BAO TERMORREGULADO

PORTAOBJETO CUBIERTO
CON LA CAPA DEL ADHESIVO
OTROS PROCEDIMIENTOS PARA CORTES DE MUESTRAS DE TEJIDOS

Cortes por Congelacin

Procedimiento que se utiliza principalmente cuando se debe determinar o identificar un componente celular-tisular que puede ser afectado por
la
FIJACION, DESHIDRITACION E INCLUSION, como ser la presencia de actividad enzimtica.
La muestra de tejido, antes de ser congelada ( -10,-20 C), es conveniente protegerla ( CRIOPROTECCION )de la formacin de microcristales de
agua que daan la integridad celular-tisular. Esto se logra por impregnacin del tejido en sucrosa o en productos ms elaborados como ser el
Tissue-Tex ofrecido en el mercado. Los cortes (entre 7-10 micras) son adheridos a un porta-objeto, donde pueden ser guardados en fro por
mucho tiempo, o pueden ser fijados adecuadamente para estos fines en acetona fra o etanol fro, con ello se logra una mayor integridad
morfolgica a la hora de realizar las tcnicas de tincin.
Cmara fra

Muestras congeladas directamente en un solvente orgnico


(hexano) inmerso en nitrgeno lquido, Estas posteriormente se
fijan al Porta-espcimen del Criostato.

CRIOSTATO

Porta-espcimen

Muestra inmersa en Tissue-Tek (crioprotector) congelada y


Muestra congelada adherida al montada directamente sobre el Porta-espcimen.
Cuchilla Porta-espcimen
Plano de Seccin Transversal

Plano de Seccin Sagital

Plano de Seccin Longitudinal


TINCION DE LOS CORTES
PROCEDIMIENTOS PARA PODER TEIR LOS COMPONENTE TISULARES

1- DESPARAFINAR
Tejido 2- HIDRATAR
3- METODOS DE TINCION
Parafina 4- MONTAJE Tejido Desparafinado
Extraible e Hidratado

XILOL 1
XILOL 2 ETANOL 100% 1 ETANOL 100% 2 ETANOL 96% ETANOL 70%

AGUA DESTILADA O TAMPON METODOS DE TINCION LAVADOS EN AGUA DESTILADA

ETANOL 70% ETANOL 96% ETANOL 100% 1 ETANOL 100% 2 XILOL- FENICADO XILOL 1 XILOL 2
(aclarador)
PROCEDIMIENTOS PARA PODER TEIR LOS COMPONENTE TISULARES

Batera de Desparafinado e Hidratacin

TODO ESTE PROCEDIMIENTO SE DEBE REALIZAR BAJO


CAMPANA DE SEGURIDAD Y CON LAS PRECAUCIONES DE
TRABAJAR CON SOLVENTES ALTAMENTE INFLAMABLES

Bateras de Deshidratacin y Montaje Canastillo con cortes a Desparafinar y Teir


Por afinidad qumica elemental:
Colorantes cidos: se unen a estructuras bsicas. La EOSINA (colorante cido) se une al citoplasma (estructura
bsica).
Colorantes bsicos: se unen a estructuras cidas. La HEMATOXILINA (colorante bsico) se une a ncleos -DNA,
(estructura cida).

De aqu se derivan los conceptos de:


BASOFILIA (filos = afinidad por) = afinidad por colorante bsico, la hematoxilina.

ACIDOFILIA o Eosinfilia = afinidad por colorantes cidos, la eosina.

Tcnica de Impregnaciones Metlicas:


Coloracin especial que utiliza sales metlicas como cloruro de oro, nitrato de plata (Impregnacin Argntica),
sales de cromo, originando precipitados metlicos.
La tcnica consiste en tratar el material (ejemplo, identificacin de fibras reticulares y neurofibrillas) con una
solucin de una sal reducible de plata y a continuacin con un agente reductor, que acta como los reveladores
de fotografas, convirtiendo la sal de plata en plata metlica, que torna de NEGRO a los componentes que la
toman.
Una sustancia es Argentafn cuando reduce la plata, y es Argirfila cuando la impregnacin es posible luego de
una reduccin con mordientes o formalina

Por Reaccin con Grupos Qumicos especficos (histoqumica):


Por Ej, La Reaccin del PAS. El Acido Perydico oxida los grupos hidroxilo 1-2 glicol formando aldehdos que
reaccionan con una leuco-fuschina incolora del colorante (reactivo de Schiff) convirtindola en color rojo visible.
- La Reaccin de Feulgen, para DNA, consiste en hidrolizar con HCl el anillo furansico del DNA y luego aplicar la
reaccin del PAS; dando como resultado la cromatina nuclear teida de color rojo-violceo.
TINCION GENERAL DE LOS COMPONENTES TISULARES CON Hematoxilina-Eosina
TINCIONES ESPECIFICAS DE LOS COMPONENTE TISULARES ( TEJIDO NERVIOSO)

Tincin por Impregnacin Argntica (sales de plata). Neurofibrillas

TINCIONES ESPECIFICAS DE LOS COMPONENTES TISULARES (TEJIDO CONECTIVO)

Metenamina Plata de Gomori (lmina basal) Tincin Impregnacin Plata (Fibras Reticulares)
TINCIONES ESPECIFICAS DE LOS COMPONENTES CELULARES

*SE OBSERVAN ESPECIFICAMENTE TEIDAS LAS


CELULAS CALICIFORMES PRESENTES . EN EL EPITELIO
DEL INTESTINO DELGADO.

*ADEMAS SE OBSERVA COMO EL PRODUCTO SECRETADO


CUBRE LA SUPERFICIE DEL MISMO EPITELIO

Tincin de PAS para Glicgeno y Muco polisacridos Neutros (Epitelio intestinal)

Reaccin de Feulgen , Tincin Especfica para DNA ( higado, marca nuclear en hepatocitos )
TINCIONES ESPECIFICAS DE LOS COMPONENTES TISULARES (TEJIDO CONECTIVO)

Tincin de Van Giesson para fibras colgenas Tincin de Orceina para fibras Elsticas (arteria)

Tincin de Van Gieson (fibras elsticas) VAN GIESSON (Fibras Elsticas)


TINCIONES ESPECIFICAS DE LOS COMPONENTES TISULARES (TEJIDO CONECTIVO)

TRICROMICO DE MASSON (Diferenciacin, Tejido Muscular y Conectivo)


TINCION INMUNOCITOQUIMICA

Tincin INMUNOCITOQUIMICA identificando las Tincin por INMUNOFLUORESCENCIA


Clulas Clara del epitelio del bronquolo terminal contra GLU-R (neurona). Microscopio Confocal

Tincin INMUNOCITIQUIMICA contra Insulina contrastada Tincin INMUNOCITOQUIMICA contra MCH clase II
con Hematoxilina (islotes de Langerhans pncreas) de la clula de Langerhans
TINCION INMUNOCITOQUIMICA

Tincin INMUNOCITOQUIMICA contra Neurofilamentos


Tincin INMUNOCITOQUIMICA contraTirosina hidrosilasa
en cerebro de rata
en cerebro de rata

Tincin INMUNOCITIQUIMICA contra GFAP, marcador Tincin INMUNOCITOQUIMICA doble contra Somatostatina
de Astrocitos en cerebro de rata (clulas teidas de rojo) y Serotonina (clulas teidas de caf)
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Las molculas fluorescentes (FLUOROCROMOS) absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra
longitud de onda ms larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a travs
de un filtro que slo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre
un fondo oscuro.
-Existe diferentes tipos de FLUOROCROMOS o marcadores qumicos fluorescentes con los que podemos marcar e identificar los
componentes celulares y tisulares de nuestro inters.
-Los FLUOROCROMOS ms utilizados: Isotiocianato de Fluorescena ( FITC) con emisin fluorescente de color verde
Rodamina con emisin fluorescente de color rojo

Tincin fluorescente doble, utilizando un Fluorocromo para material nuclear (color azul) y antitubilina marcada con FITC (color verde).
Utilizando los filtros adecuados, en la misma clula es posible visualizar la emisin por separado o simultanea de ambos Fluorocromos

FLUORESCENCIA
A TRAVES DE
MICROSCOPIA
CONFOCAL

Inmunofluorescencia contra tubulina utilizando Inmunofluorescencia triple contra laminina marcado con FITC
un segundo anticuerpo marcado con FITC y contra actina marcada con RODAMINA.
MICROSCOPIA LASER CONFOCAL

CELULA EN ANAFASE VISTA A TRAVES DE FLUORESCENCIA CONFOCAL.


- FLUOROCROMO MARCADOR DE MATERIAL NUCLEAR EN AZUL.
- FLUOROCROMO MARCADOR DE Beta-TUBILINA EN AMARILLO.
( Imagen de 34 planos celulares )