UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL LISANDRO ALVARADO

DECANATO DE MEDICINA
MAESTRIA EN FISIOLOGIA

LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA

REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDAD

Trabajo presentado para optar al grado de

Magster Scientiarum

Por: JOSE LORENZO GARAY FLORES

Barquisimeto, 2006

i
 APROBACION DEL TUTOR

En mi carcter de tutor del trabajo LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA

DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE

COLINA DE ALTA AFINIDAD, presentado por el ciudadano JOSE LORENZO

GARAY FLORES para optar al grado de Magster Scientiarum en Fisiologa, considero

que dicho trabajo rene los requisitos y mritos suficientes para ser sometido a la

presentacin pblica y evaluacin por parte del jurado examinador que se designe.

En Barquisimeto, a los 26 das del mes de Enero de 2006.

____________________________
Prof. Nelson Loureiro, PhD

ii
LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA
REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDAD

Por: JOSE LORENZO GARAY FLORES

Trabajo de grado aprobado

________________________________ ________________________________
Dr. Nelson Enrique Loureiro D.S.

________________________________

Barquisimeto, ____ de ____________ de 2006

iii
 Agradecimientos

- A Dios y a toda mi familia, por el incondicional apoyo y compaa.

- Al Estado venezolano y a la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado,

por el apoyo dado para mi formacin y realizacin de este trabajo.

- Al Dr. Nelson Loureiro, por su profesionalismo, tenacidad en ensearme y por

querer compartir lo aprendido a lo largo de los aos.

- A la Seccin de Fisiologa y a la Unidad e Investigaciones de Fisiologa por

poner a mi disposicin toda su buena voluntad, estructuras y equipos.

- Al personal tcnico del Laboratorio de Fisiologa Celular, TSU Elis Mosquera y

William Lpez por la calidad de la colaboracin prestada para realizar este
trabajo.

- A los Brs. Regino Rodrguez, Daniela Petrucci, Jos A. Gutierrez, Maria Lis
Freites y Andrs Arteta por su generosa colaboracin.

- A la Dra. Carmen Militza Prez, por el apoyo prestado desde el extranjero en

estos aos.

- A la Unidad de Investigaciones de Bioqumica y al Dr. Rafael Bonfante por toda

la colaboracin prestada.

iv
 INDICE

PAG.
AGRADECIMIENTOS v
INDICE DE ILUSTRACIONES viii
RESUMEN ix

CAPITULO
I 1
INTRODUCCION 1

II
ANTECEDENTES 4
Acetilcolina 4
Sntesis de Acetilcolina 5
Colina Acetil Transferasa (ChaT) 6
Aporte de Acetil Coenzima A 6
Aporte de Colina 7
Almacenamiento y liberacin de Acetilcolina 7
Receptores Colinrgicos y Acetilcolinesterasa 8
El Transportador de Colina de Alta Afinidad (HAChT) 8
Clonacin del HAChT 11
HAChT: Funcionamiento y Regulacin de su Funcin 13
Dopamina y sus Receptores 17
Interacciones entre Sistema Colinrgico y Dopaminrgico en el Sistema 20
Nervioso Central
Retina y Sistema Colinrgico 24

III 27
MATERIALES Y METODOS 27
Materiales 27
Cultivos Celulares 29
Mantenimiento de los Cultivos Celulares 30
Determinacin de la Actividad del Transportador de Colina de Alta 30
Afinidad (HAChT)
Determinacin de las protenas en el pellet 32
Electroforesis y Western Blot 32
Anlisis de los datos 34

IV 35
RESULTADOS 35
Regulacin de la actividad HAChT en retina: Efecto del tratamiento de la 35
Dopamina
Regulacin de HAChT por los niveles de cAMP 40
Regulacin del HAChT por Adenosina 42

v
 Efecto del Pre Tratamiento de los cultivos celulares con Kainato o 44
Glutamato
Efecto del Tratamiento de los cultivos celulares con Esteres de Forbol 46
Electroforesis e Inmunodeteccin del HAChT en retina de pollo 47

V 48
DISCUSION Y CONCLUSIONES 48

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 60
ANEXOS
Currculum Vitae del Autor

vi
 INDICE DE ILUSTRACIONES

FIGURA PAG.

1 12
2 36
3 37
4 39
5 40
6 42
7 43
8 45
9 46
10 47
11 57

vii
 UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL LISANDRO ALVARADO

DECANATO DE MEDICINA

MAESTRIA EN FISIOLOGIA

LA FOSFORILACION INDUCIDA POR LA DOPAMINA Y SU PAPEL EN LA

REGULACION DEL TRANSPORTADOR DE COLINA DE ALTA AFINIDAD

Autor: Jos Lorenzo Garay Flores

Tutor: Nelson Enrique Loureiro D.S.

RESUMEN
El sistema colinrgico est involucrado en diversas funciones fisiolgicas, as como
en importantes afecciones del SNC. La actividad del Transportador de Colina de
Alta afinidad (HAChT) es la etapa limitante en la sntesis de acetilcolina. Otros
marcadores colinrgicos presinpticos como la Colina-acetil-transferasa (ChAT) y el
Transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) son regulados por aminocidos
excitatorios (AAEEs) y, en el caso de VAChT dicha regulacin implica
mecanismos de fosforilacin por PKC. El HAChT tambin presenta sitios
consensuales para fosforilacin por PKC y tambin por PKA. La fosforilacin de
HAChT por PKC induce cambios en su Vmax y en su ubicacin celular, aunque no
hay datos concluyentes acerca del papel que PKA tenga en la funcin del HAChT.
A las interacciones dopaminrgico-colinrgicas en el SNC se atribuye gran
importancia fisiolgica y fisiopatolgica (E. de Parkinson). La dopamina a travs de
receptores D1 induce aumento de los niveles de cAMP y activacin de PKA. En este
trabajo se demuestra que en cultivos celulares de retina embrionaria de pollo, la
dopamina no induce cambios en la actividad del HAChT ni regula tnicamente
dicha actividad.. Sin embargo qued aqu demostrado por primera vez que
incrementos en los niveles de cAMP (mediante inhibicin de la fosfodiesterasa, por
activacin de adenilatociclasa o tras agregar directamente Sp-cAMP) reducen la
actividad del HAChT. Se demuestra adems que la Adenosina (probablemente a
travs de receptores A2) reduce significativamente la actividad del HAChT en estos
cultivos. Se demuestra tambin que en retina la activacin de PKC (mediante steres
de forbol) reduce significativamente la actividad del transportador y que los
AAEEs (Glutamato y Kainato) tambin provocan una disminucin significativa del
mismo, probablemente mediante fosforilacin por PKC o PKA. Otros sistemas de
neurotransmisin deben explorarse para obtener ms datos sobre la regulacin
heterloga del terminal colinrgico en retina y otras regiones del SNC.

Palabras Clave: Transportador de Colina, Dopamina, Aminocidos excitatorios,

Protena cinasas.

viii
 CAPITULO I

INTRODUCCION

En el Sistema Nervioso Central, el sistema colinrgico participa en diversos

procesos fisiolgicos (memoria y aprendizaje, control del movimiento, estados
emocionales) as como en diversos trastornos neuropsiquitricos (Enfermedad de
Alzheimer, Enfermedad de Parkinson). Las interacciones entre el sistema colinrgico y
otros sistemas de neurotransmisin parecen tener gran importancia en estos eventos
fisiolgicos y fisiopatolgicos y sin embargo, los conocimientos acerca del control del
funcionalismo colinrgico y la regulacin del terminal colinrgico por parte de otros
sistemas de neurotransmisin son relativamente escasos.

La sntesis de la Acetilcolina depende en gran parte de la disponibilidad de colina,

provista desde el exterior de la neurona colinrgica a travs del Transportador de Colina
de Alta Afinidad (HAChT), cuya funcin es considerada como la etapa limitante en la
sntesis del neurotransmisor. Se deriva de esto que cambios en la actividad del HAChT
pueden influir notablemente en la sntesis de la acetilcolina y de la liberacin de esta,
como de hecho ocurre en presencia del inhibidor especfico del HAChT, Hemicolinio-3.

La presencia de sitios consensales para fosforilacin por PKA y PKC en la

estructura del HAChT han hecho pensar que un mecanismo probable de regulacin de
su actividad, y por ende del funcionalismo del terminal colinrgico, sea la fosforilacin
de HAChT por parte de estas Protena cinasas. Recientemente se ha demostrado que
HAChT es una fosfoprotena, capaz de reciclar entre la membrana plasmtica y el
compartimiento endosmico mediante endocitosis clatrino dependiente, y que adems
su fosforilacin por PKC modifica su ubicacin celular promoviendo su traslado al
compartimiento endosmico con la consiguiente disminucin de su actividad (Vmax.).
Sin embargo no han sido presentados datos concluyentes acerca de la posible regulacin
de la actividad del HAChT por parte de PKA.

ix
 A nivel de los ganglios basales, se encuentra gran cantidad de interneuronas
colinrgicas, y las interacciones entre los sistemas dopaminrgico y colinrgico parecen
ser de suma importancia en el control del movimiento. En la Enfermedad de Parkinson,
el dficit dopaminrgico primario se asocia a un incremento de la actividad colinrgica,
cuya atenuacin constituye una de los abordajes teraputicos comunes de la afeccin.
La dopamina, a travs e sus receptores D1 es capaz de incrementar la produccin de
cAMP y por lo tanto de aumentar la actividad de PKA. La potencial susceptibilidad del
HAChT para ser fosforilado por PKA, plantea la posibilidad de que la dopamina
induciendo la fosforilacin por PKA del HAChT sea capaz de modificar la captacin de
colina por parte de este y regular de este modo el funcionalismo colinrgico, no solo a
nivel de ganglio basales, o estriado ms especficamente, sino tambin en otras regiones
del SNC.

En el presente trabajo se estudia tal posibilidad, y se exploran adems otros

mecanismos de regulacin del HAChT por fosforilacin, empleando como modelo
biolgico los cultivos celulares de retina de embrin de pollo (tipo monocapa densa);
modelo que ha demostrado ser vlido en este tipo de estudios. Estos cultivos expresan
los diferentes marcadores colinrgicos as como dopaminrgicos y de otros sistemas de
neurotransmisin.

En estos cultivos celulares (en los que las clulas colinrgicas son clulas
amcrinas) se procedi a cuantificar la actividad HAChT en presencia de dopamina y de
otras sustancias (neurotransmisores y no) capaces de inducir la activacin de las vas de
fosforilacin por PKA y PKC y, por lo tanto potenciales reguladores de la actividad
HAChT y de la actividad del Terminal colinrgico.

x
 CAPITULO II

ANTECEDENTES

Acetilcolina

La acetilcolina es el neurotransmisor sintetizado y liberado por las neuronas

colinrgicas, que acta en las clulas nerviosas colinoceptivas y en las clulas de los
tejidos inervados por ellas. La estructura qumica de la acetilcolina es:

(CH3)3N+-CH2-CH2-O-CO-CH3

La actividad neurofisiolgica de la acetilcolina es conocida desde el inicio del

siglo XX, siendo la primera sustancia identificada como neurotransmisor (trabajos de
Dale, Loewi, Feldberg). Denominada en un principio con el vocablo alemn vagusstoff
(sustancia del vago) por sus efectos autonmicos, sucesivamente se comprob su
funcin como neurotransmisor en la unin neuromuscular y en el sistema nervioso
central. Es bien conocido su rol neurotransmisor en ganglios autnomos y en las
sinapsis posganglionares parasimpticos. La acetilcolina es adems el neurotransmisor
de las fibras colinrgicas que inervan la mdula suprarrenal y de las fibras
posganglionares simpticas que inervan las glndulas sudorparas, vasos sanguneos de
cara, cuello y msculo esqueltico.

A nivel central, las neuronas colinrgicas pueden encontrarse en dos formas: (a)
como neuronas de proyeccin, cuyos cuerpos celulares se encuentran en el tallo
cerebral superior y prosencfalo basal, o (b) como interneuronas (circuitos locales):
es el caso de las interneuronas que se encuentran en estriado o en ncleo accumbens.
Las primeras (a) neuronas colinrgicas de proyeccin en largas rutas provienen de

xi
 ocho ncleos, a su vez agrupados en dos reas: prosencfalo basal y tallo
cerebral superior (Nestler E., 2001).
El prosencfalo basal comprende:
(a) Ncleo septal medial (Ch1)
(b) Ncleo vertical de la banda diagonal (Ch2)
(c) Rama horizontal de la banda diagonal (Ch3)
(d) Ncleo basal de Meynert (Ch4)

Los ncleos colinrgicos del tallo cerebral son:

(a) Ncleo pednculo-pontino (Ch5)
(b) Ncleo tegmental laterodorsal (Ch6)
(c) Habnula medial (Ch7)
(d) Ncleo parabigeminal (Ch8)

Ch4: proyectan principalmente hacia corteza cerebral frontal, parietal y

temporal. Se piensa que esta proyeccin juega un papel influyente en la respuesta
cortical a la estimulacin sensorial y en el estado emocional.
Ch1, Ch2 y Ch3: proyectan a hipocampo y son consideradas importantes en los
mecanismos de memoria y aprendizaje.
Ch4, Ch5 y Ch6: proyectan a los ganglios basales, no obstante la ms importante
innervacin colinrgica estriatal es intrnseca; proviniendo de interneuronas
involucradas en algunos de los circuitos neurales de control del movimiento (tambin
denominados extra-piramidales).

Sntesis de Acetilcolina.

La acetilcolina es sintetizada a partir de dos sustratos, la colina y el acetil

coenzima A, en una nica reaccin, reversible, catalizada por la enzima Colina Acetil
Transferasa. (ChAT) (EC 2.3.1.6).

xii
Colina acetil transferasa (ChAT)

La Colina Acetil Transferasa (ChAT) se localiza con alta especificidad en

aquellas regiones del sistema nervioso en donde la sntesis de acetilcolina tiene lugar,
considerndosele por esto un confiable marcador colinrgico presinptico. A nivel
celular aparece localizada in vivo preferiblemente a nivel citoslico, soluble; sin
embargo se ha descrito una forma particulada de la enzima y una asociada a vesculas
sinpticas. La enzima purificada, en cerebro de rata presenta un peso molecular de 67 -
75 kDa y una Km para colina de 0,75 mM y para acetil CoA de 10 M. (Cooper J.,
1996). La actividad de la enzima aislada, en presencia de concentraciones ptimas de
cofactores y sustratos aparece muy por encima de la tasa de conversin de la colina a
acetilcolina, sugiriendo una represin de la actividad de ChAT in vivo. Tambin se ha
demostrado que los inhibidores de ChAT no reducen in vivo la sntesis de acetilcolina,
lo cual podra sugerir (a) ya sea la incapacidad e lograr concentraciones inhibitorias
efectivas localmente o (b) que no se est en presencia de la etapa limitante en la sntesis
del neurotransmisor (Siegel G. et al, 2006).

Aporte de Acetil Coenzima A

La AcetilCoA necesaria para la sntesis de acetilcolina proviene de tres fuentes:

(a) Piruvato formado por accin de la Piruvato deshidrogenada, proveniente de la
mitocondria, (b) Citrato, por accin de la Citrato liasa o del (c) Acetato, mediante la
Acetatotiocinasa. El sistema de transporte del AcetilCoA., formado principalmente en la
mitocondria, hasta la localizacin citoslica de la Chat ha sido propuesto como una
posible etapa limitante, regulada, en la sntesis del neurotransmisor.

xiii
Aporte de Colina:

La colina es el otro sustrato en la sntesis de la acetilcolina, y no es sintetizada en

las neuronas (Okuda T. & Haga T., 2003). Se sintetiza en el hgado, y es transportada al
cerebro (en forma libre o como fosfolpido). La mitad, aproximadamente, de la colina
empleada en la sntesis de acetilcolina, proviene de la hidrlisis de la acetilcolina por
accin de la acetilcolinesterasa. Otra parte de la colina proviene del catabolismo de la
fosfatidilcolina (aunque algunos [Tcek S., 1993] sealan que esta sera una fuente
poco probable). Estas fuentes de colina parecen ser particularmente importantes en el
Sistema Nervioso Central, dadas las dificultades con que la colina atraviesa la barrera
hemato-enceflica.

Todas las clulas de mamfero estn dotadas de un sistema de captacin de

colina de baja afinidad (LAChT: Low Affinity Choline Transporter), pues la colina no
es capaz de atravesar libremente las membranas celulares. La neurona colinrgica, sin
embargo posee un sistema especfico de captacin de colina de alta afinidad (HAChT:
High Affinity Choline Transporter), cuya funcin est estrechamente asociada a la
sntesis y liberacin de acetilcolina.

Almacenamiento y liberacin de Acetilcolina.

La acetilcolina, una vez sintetizada es almacenada en vesculas, gracias a la

accin del Transportador Vesicular de Acetilcolina (VAChT: Vesicular Acetylcholine
Transporter). Esta protena puede ser inhibida por el compuesto L-Vesamicol. La
captacin de acetilcolina por parte de las vesculas ocurre gracias a una ATPasa de
protones, en forma de un Contra-Transporte H+ - Acetilcolina. L-Vesamicol es capaz
de inhibir tambin la liberacin de acetilcolina, hecho que sustenta el concepto de que la
Vescula es el lugar desde donde se libera la acetilcolina. La liberacin de Acetilcolina
ocurre por exocitosis vesicular dependiente de calcio.

Receptores Colinrgicos y Acetilcolinesterasa.

A nivel post sinptico la acetilcolina acta sobre dos tipos de receptores:

xiv
 (a) Receptor Colinrgico Nicotnico: son canales con compuerta activada
por ligando; estn conformados por 5 subunidades organizadas
alrededor de un poro central. Su activacin por la acetilcolina conlleva
una rpida entrada de Na+ y Ca2+, con la consiguiente despolarizacin
celular.
(b) Receptor Colinrgico Muscarnico: son receptores metabotrpicos
pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a protenas G.
Se han clonado 5 tipos (M1 a M5): los M1, M3 y M5 se acoplan a
protenas Gq, activando Fosfolipasa C (PLC) mientras que M2 y M4 se
acoplan a Gi, inhibiendo la actividad de la adenilatociclasa; adems
producen una rpida activacin de los Canales de Potasio Rectificadores
dependientes de Protena G. (GIRKs).

La accin en la sinapsis de la acetilcolina termina al ser hidrolizada por la

enzima acetilcolinesterasa (AChE) (EC 3.1.1.7), a colina y acetato. AChE puede
hidrolizar hasta 1000 molculas de acetilcolina por segundo por molcula de AChE. Se
encuentra en el citoplasma y al hacia el exterior en la membrana celular, de modo que
puede actuar sobre la acetilcolina intra- y extracelular. El knock-out total del gen de
AChE, da lugar a ratones con temblores, dficit en el crecimiento y alteraciones
neurolgicas (Siegel G., 2006).

El Transportador de Colina de Alta Afinidad (HAChT).

Desde una perspectiva histrica, es a partir de los aos 60 y 70 del siglo

pasado, que diversos grupos de investigadores comenzaron a estudiar y caracterizar el
fenmeno de la captacin de colina, empleando principalmente sinaptosomas
preparados a partir de terminales nerviosos. Tatsuya Haga, en 1971 en su clsico trabajo
y Tesis Doctoral Synthesis and release of [14C]Acetylcholine in Synaptosomes,
reportaba que (a) la mitad de la colina marcada captada por sinaptosomas era utilizada
para la sntesis de acetilcolina, y que (b) esta proporcin adems dependa de la
concentracin de la colina marcada en el medio de incubacin, ocurriendo con
concentraciones en el rango micromolar (1 -5 M de colina). Adems seal que (c) la
cantidad de acetilcolina sintetizada por los sinaptosomas aumentaba en forma paralela

xv
con el incremento de la concentracin de Na+ en el medio de incubacin: y que (d) el
efecto del Na+ sobre la captacin de colina dependa de la concentracin de colina en el
medio. Es decir, pone en evidencia que en un determinado rango de concentraciones de
colina (cercana, adems, a la concentracin plasmtica de colina), aproximadamente la
mitad de la colina captada es empleada en la sntesis de acetilcolina, y que el efecto
estimulador del Na+ en el medio sobre el transporte de colina dependa de la
concentracin de esta ltima en el medio: es decir se trata de un efecto que es evidente
en ese mismo rango de concentraciones de colina (1 -5 M). Sucesivos trabajos, como
el de Henry Yamamura y Solomon Snyder en 1972, demuestran tras un anlisis de la
cintica del transporte de colina en estriado de rata, la presencia de dos componentes en
la captacin de colina: un componente de baja afinidad (LAChT), con una Km de ~ 90
M y uno de alta afinidad (HAChT), con una Km de ~ 1 M.

Simon J. y Kuhar M.J. en 1975 y 1976, analizan la dependencia inica y

metablica del HAChT reportando:

(a) La Dependencia de Sodio: la actividad de HAChT se reduca al disminuir

[Na+], con un mximo descenso de la captacin a [Na+] de 40 mM, y una
mxima actividad de HAChT a [Na+] de 150 mM (Fisiolgica).
(b) Dependencia de Potasio: Al omitir, en el medio empleado para medir la
actividad del HAChT, el KCl se evidenci una cada en la actividad del
HAChT, aunque no de la magnitud de la provocada por la deplecin del
NaCl. No obstante lleg a ser hasta de un 55 %.
(c) Dependencia Metablica: la integridad de la actividad de la ATPasa Na+-
K+ resulta necesaria dado que el tratamiento con Ouabana inhibe la
actividad HAChT; esto se debera a la necesidad de mantener el gradiente
electroqumico para el sodio, fuerza impulsora de ste sistema de transporte.

Estos mismos autores tambin evidenciaron en 1975, la asociacin existente

entre actividad neuronal y actividad del HAChT. Y ese mismo ao Murrin L.C. y Kuhar
M. demuestran la activacin del HAChT in vitro mediante el empleo de agentes
despolarizantes: ms especficamente observaron un aumento de la Vmax sin cambios
en la Km. Un dato importante es que los autores lograban prevenir dicha activacin
mediante el empleo del antagonista del calcio Nifedipina, resultado comprensible en su

xvi
plenitud solo a partir de los trabajos publicados dcadas despus acerca de ubicacin del
HAChT en la neurona colinrgica, como se expone en detalle ms adelante.

Otro aspecto que contribuye a caracterizar al HAChT y distinguirlo del LAChT

(adems de la diversa Km, as como la dependencia inica y energtica) es la
sensibilidad a la droga hemicolinio-3 (HC-3): 2,2-(4,4-bifenileno)-bis(2-hidroxi-4,4-
dimetilmorfolinio bromuro: un agente txico capaz de producir parlisis respiratoria y
bloqueo a nivel ganglionar, capaz de prevenir in vivo (solo in vivo) la sntesis de
acetilcolina. HC-3 acta selectivamente sobre el HAChT, sin interferir con la actividad
de la ChAT. Qued as evidenciado como ningn depsito endgeno de colina poda
sostener la sntesis del neurotransmisor, y la dependencia del aporte externo de colina.
Estos hallazgos ya sealaban a la actividad del HAChT, y la consiguiente disponibilidad
neuronal de colina, como la etapa limitante en la sntesis de acetilcolina.

Clonacin del HAChT.

En los aos 80 y 90 del siglo XX ulteriores hallazgos acerca de la distribucin

del HAChT vieron la luz, pero no es sino hasta el ao 2000 cuando Okuda T. et al
consiguen aislar un cDNA capaz de codificar para el HAChT del C. Elegans,
empleando la informacin disponible en el Proyecto Genoma y un sistema de expresin
en oocitos de Xenopus laevis. Los autores asumiendo que C.Elegans tena neuronas
colinrgicas y por ende presentaba el HAChT, asumieron que en C.Elegans, el HAChT
era tambin Na+ dependiente, y procedieron a expresar en los oocitos de Xenopus laevis
aproximadamente 30 cDNAs que se predeca codificaban para transportadores Na+
dependientes como: transportadores de neurotransmisores, transportadores de glucosa
Na+ dependientes, etc. Se trataba de transportadores hurfanos, dado que no se conoca
la molcula por estos transportada. Uno de los RNA obtenidos a partir de cDNA, al ser
inyectado indujo en los oocitos un incremento de 1.5 veces en la captacin de [3H]-
colina con respecto l control: este se presentaba adems en forma Na+ dependiente y
sensible al HC-3 (Okuda T. y Haga T., 2003).

El HAChT fue sucesivamente caracterizado en otras especies, observndose una

alta homologa en la estructura primaria, particularmente entre mamferos (incluyendo
al humano, con un 93 % de conservacin de la secuencia respecto al de rata),

xvii
presentndose como una protena de 580 aminocidos. El HAChT no presenta
homologa con la familia de transportadores de neurotransmisores: pertenece a la
llamada Familia de Simportadores de Na+ / soluto (SSF), como el SDGT (Sodium-
dependent Glucose Transporter), etc. Entre otros trabajos importantes est el de
Apparsundaram S. et al. (2000), quienes usando la secuencia del provista por Okuda T.
et al. (2000) as como informacin del Proyecto Genoma Humano clonaron un cDNA
humano que codifica para una protena de 580 aminocidos, una masa estimada en 63
kDa, punto isoelctrico = 4.9. La secuencia nucleotdica y aminoacdica de HAChT
humano est disponible en el GenBank, con N de acceso: AF276871. El gen que
codifica para HAChT fue localizado en el cromosoma 2 (2q12). HAChT presenta tras
estudiar la secuencia con diversos algoritmos una conformacin con 13 dominios
transmembrana, un dominio N-terminal extracelular y un extremo C-terminal
intracelular. Se evidencia adems la presencia de sitios consensales para fosforilacin
por
(a) Proten cinasa C (PKC): presentes en el dominio intracelular entre las asas 9
y 10 [Ser367 y Ser373]) as como a nivel C-terminal [Tre558].
(b) Proten cinasa A (PKA): presentes entre las asas 7 y 8 y en la regin C-
terminal [Ser522 y Ser 550].
(c) Adems de 12 residuos adicionales de serina y 10 de treonina que pueden
representar otros sitios de fosforilacin regulatoria.
(d) Tambin sitios para Glicosilacin de la protena.

Figura 1. El HAChT en la membrana plasmtica: sitios consensales

para fosforilacin por PKA y PKC y para glicosilacin de la protena.

xviii
 El HAChT se co-localiza con otros marcadores colinrgicos presinpticos
(ChAT, VAchT) en otros mamferos, como ha sido documentado en estudios de
hibridacin in situ, Northern Blot e Inmunohistoqumica (Misawa H. et al., 2001;
Kobayashi Y. et al, 2002).

Okuda T. et al, (2002) han descrito recientemente como la sustitucin de un

residuo de valina por isoleucina en el III dominio transmembrana de la protena,
provoca una disminucin de la Vmax del 40 % aproximadamente en el humano y en
C.Elegans, sin modificaciones en la afinidad por la colina, el NaCl o el [3H]-
Hemicolinio.

HAChT: Funcionamiento y Regulacin de su Funcin.

Si la Km de la Colina Acetil Transferasa (ChAT) por la colina resulta in vivo

igual a la determinada para la enzima aislada, es de esperarse que la sntesis de
acetilcolina se incremente con una mayor disponibilidad de colina; la disminucin en la
sntesis y liberacin de acetilcolina, que como se ha dicho, ocurre en presencia del
inhibidor especfico del HAChT, HC-3, sin que se altere la actividad de la ChAT o del
VAChT, indica que la actividad del HAChT es el factor limitante en la sntesis de
acetilcolina; por lo menos en cuanto a regulacin a corto plazo se refiere.
En los ltimos dos aos, han sido grandes los aportes hechos para comprender
mejor la regulacin del funcionamiento del HAChT. Hasta hace poco era
completamente desconocido el mecanismo mediante el cual un incremento en la
actividad neuronal colinrgica se asociaba a un aumento de la Vmax del HAChT,
aunque ya algunos autores (Saltarelli M. et al. en 1987) haban sealado como en
condiciones despolarizantes (usando 40 mM de KCl en slices de estriado de rata) se
incrementaba la actividad de HAChT as como en ensayos de unin, la Bmax del [3H]-
Hemicolinio-3 sin cambios en la Kd: indicando la presencia de ms sitios de unin
(HAChT) en estas condiciones: sugiriendo en dicha ocasin los autores la posibilidad de
que hubiera transportadores ocultos, pues el [3H]-Hemicolinio-3 se une al HAChT
que se encuentra expuesto (y funcional) en la membrana plasmtica.

xix
 En el 2003, Ferguson S. et al. y Ribeiro F.M. et al., en trabajos diferentes,
demostraron que, no obstante ser una protena funcional al encontrarse en la
membrana plasmtica, el HAChT:

(a) Se encontraba sorpresiva- y principalmente a nivel intracelular,

especficamente localizada en el compartimiento endosmico y a nivel de una
sub poblacin de las vesculas sinpticas, donde se co-localiza con el
Transportador Vesicular de Acetilcolina (VAChT).
(b) Se demostr adems que la despolarizacin desencadena un incremento en la
actividad HAChT, asociado a un incremento del nmero de HAChT en la
membrana plasmtica sinptica.
(c) Que este aumento (de la Vmax de HAChT y su densidad en la membrana) es
Ca2+ dependiente y sensible al pretratamiento con Toxina Botulnica, indicando
como la fusin de las vesculas sinpticas a la membrana plasmtica es
indispensable para que ocurra este incremento en la captacin de colina tras la
despolarizacin.
(d) Que HAChT se encuentra constantemente reciclando entre el compartimiento
endosmico intracelular y la membrana plasmtica: trasladndose a esta ltima
en las vesculas sinpticas involucradas en la liberacin de acetilcolina (junto a
VAChT), para posteriormente regresar al compartimiento endosmico por
endocitosis dependiente de Clatrina.

Estos hallazgos explican el mecanismo fisiolgico, antes desconocido, que

asocia el incremento de la actividad neuronal al aumento de la captacin de colina va
HAChT- en la neurona colinrgica. En su conjunto, adems, esto significa un rol
fisiolgico novedoso de las vesculas sinpticas en la homestasis del neurotransmisor.

Otro importante descubrimiento, ms reciente an, ha sido el de Gates J. et al.

(2004). Estos investigadores evidenciaron por primera vez en sinaptosomas de
hipocampo y estriado de ratn, que:

(a) El HAChT es una fosfoprotena, cuya presencia en la superficie

celular y su actividad transportadora est regulada por la Protena

xx
 cinasa C (PKC) y por la actividad de las Proten-Fosfatasas 1 y 2A
(PP1/PP2A).
(b) Que la activacin de PKC mediante el empleo de los steres de
Forbol, - PMA (Miristolato-Acetato de Forbol ) y - PdBu
(Dibutirato de Forbol ) a la dosis de 1 M induce una disminucin
de la Vmax de HAChT en forma dosis y concentracin dependiente,
sin cambios en la Km.
(c) El tratamiento de los sinaptosomas con los inhibidores de PP1/PP2A,
cido Okadaico (OKA) y Calyculina A (Cal A) produjo un patrn de
modificacin de la actividad HAChT similar al obtenido con steres
de forbol.
(d) La activacin de PKC y la inhibicin de PP1/2A, reducen la
presencia de HAChT en la superficie celular en ms de un 30%.

Estos autores, sin embargo, no observaron cambios en la cantidad de HAChT

presente en la membrana celular ni en su Vmax mediante el empleo del inhibidor de
PKC Staurosporina (1 M, 45), lo que podra indicar la ausencia de una inhibicin
tnica, por parte de PKC. Este dato, visto el efecto que el solo tratamiento con OKA o
Cal A tienen sobre estos parmetros, sugiere que otros mecanismos de fosforilacin
puedan intervenir regulando tnicamente la localizacin intracelular y el funcionalismo
del HAChT.

No obstante el trabajo de Gates J. et al. aqu mencionado, constituya la ms

completa documentacin existente en la literatura acerca de la fosforilacin como
mecanismo de regulacin del HAChT, debe tenerse en cuenta que la estructura del
HAChT no presenta nicamente sitios consensales para fosforilacin por PKC, y muy
poco se ha dilucidado el papel que otras Protena cinasas jueguen en este sentido.

Ya desde la pasada dcada de los 90 algunos trabajos haban presentado

resultados que, a veces sin confirmar o hasta siendo algunos contradictorios entre ellos,
haban sealado el posible papel de PKC en la regulacin del HAChT: Ford B. et al
(1999) evidenci en rebanadas de cerebro de Limulus que el tratamiento con -PMA o
-PdBu disminuan la captacin de colina. Issa A. et al. (1996) demuestran la inhibicin
del HAChT mediante el empleo de Acido Okadaico y Caliculina A, sugiriendo el rol

xxi
modulador de la actividad fosfatsica en la sntesis de acetilcolina. Pero por otra parte,
Vogelsberg V. et al. (1997) evidencian un incremento de la actividad HAChT y unin
de [3H]-HC3 en sinaptosomas de hipocampo, estriado y corteza frontal de ratn tras
inyectar a nivel cerebro ventricular db - AMP cclico (db-cAMP), un anlogo del
segundo mensajero AMP cclico (cAMP). Adems presentan datos adicionales
(aumento de actividad HAChT con el inhibidor de fosfodiesterasas IBMX, con
Forskolina) que indicaran un rol estimulante sobre la actividad de HAChT, de la
fosforilacin por parte de la Protena cinasa A (PKA). No obstante, los resultados
obtenidos en presencia de cido Okadaico contradicen a Issa A. et al (1996) e incluso al
recientsimo trabajo de Gates J. et al. (2004), dado que reportan un efecto estimulante
sobre HAChT del tratamiento con cido Okadaico. Los resultados de Vogelsberg V. et
al. (1997), por dems, no han sido confirmados ni por los mismos autores ni por otros
grupos ms recientemente. Chatterjee T. y Bhatnagar R. (que haban sugerido la
presencia de dos estados funcionales distintos para el HAChT), en 1990 sealan la
conversin en presencia de ATP, y a travs de un mecanismo dependiente de calcio, de
todos los sitios de unin para [3H]-HC3 a un estado de baja afinidad, conversin que era
prevenida por Gossypol (inhibidor de PKC), pero no por Staurosporina, ni por
Trifluoperazina inhibidor de Proten cinasa dependiente de Calmodulina (CaM cinasa).
Por otra parte los autores demostraron que tanto Gossypol como la Trifluoperazina
inhiban la captacin de colina en sinaptosomas, mientras que la Staurosporina era
ineficaz en ese sentido. En otro trabajo, Yamada et al. (1991) demuestran como en
condiciones despolarizantes (KCl 40 mM), la trifluoperazina (TFP) inhibe ya sea el
aumento de Bmax (sin cambios en Kd) en la unin de [3H]-HC3 (anteriormente
demostrado por Saltarelli et al. en1988), como el incremento en la captacin de colina
inducido por la despolarizacin.

Este ltimo resultado, con el conocimiento actual, podra atribuirse, al menos

parcialmente, al efecto inhibidor de la TFP sobre la CaM cinasa que fosforila la
Sinapsina I en la vescula sinptica: al quedar en forma no fosforilada, la Sinapsina I fija
la vescula sinptica al citoesqueleto, impidiendo su liberacin y por ende la
incorporacin de un mayor nmero de transportadores HAChT (que se encuentran en la
vescula) a la membrana plasmtica. Esto dara cuenta del efecto preventivo de TFP
sobre el aumento de la captacin de colina en condiciones despolarizantes.

xxii
 Resultan por otra parte evidentes, al analizar retrospectivamente la literatura, las
contradicciones existentes entre estos diversos trabajos. Solo los resultados publicados
por Gates J. et al. (2004) con respecto al rol de la fosforilacin del HAChT por PKC en
sinaptosomas, evidenciando con diversas metodologas el rol fisiolgico de este
mecanismo en la homestasis de la colina y con la evidencia directa de HAChT como
fosfoprotena, parecen presentarse como hecho cientfico asentado, mientras que poco o
nada se ha profundizado en el posible rol de las Protenas cinasas A (PKA) y/o Ca2+ /
Calmodulina dependiente (CaM cinasa).

Dopamina y sus Receptores.

La Dopamina es una catecolamina sintetizada a partir del aminocido precursor

tirosina. La tirosina, concentrada en las neuronas dopaminrgicas es convertida en L-
dihidroxifenilalanina (L-DOPA) mediante hidroxilacin en la posicin 3 por parte de la
enzima Tirosina Hidroxilasa (TH): esta enzima es la etapa limitante en la sntesis de
catecolaminas; se presenta como un homotetrmero que requiere Fe2+ como cofactor,
as como oxgeno molecular y tetrahidrobiopterina. En las neuronas dopaminrgicas se
expresa otra enzima, la DOPA descarboxilasa, ms correctamente denominada
Descarboxilasa de Aminocidos Aromticos (AADC, por las siglas en ingls): esta
enzima, que requiere del cofactor Piridoxal fosfato y se localiza a nivel citoplasmtico,
cataliza la remocin del grupo carboxilo de la L-DOPA para formar Dopamina y CO2,
ltima etapa en la sntesis del neurotransmisor.

En el cerebro de rata, se distinguen 3 ncleos dopaminrgicos principales:

(a) Sustantia Nigra (pars compacta): proyectan al n. caudato y putamen

(neoestriado), formando el sistema dopaminrgico Nigro-estriatal.
(b) rea Tegmental Ventral: proyectan a estructuras del sistema lmbico: n.
accumbens, corteza prefrontal y cingulata, formando el sistema
dopaminrgico meso-limbo-cortical.
(c) Ncleo Arcuato hipotalmico: involucrada en la regulacin endocrina, va
hipfisis, en el denominado sistema dopaminrgico tuberoinfundibular.

xxiii
 El sistema dopaminrgico meso-limbo-cortical, aparece involucrado en los
mecanismos de refuerzo gratificacin en las drogas de abuso y como blanco de accin
de drogas antipsicticas (Kandel E. et al, 2001).

El Sistema Nigro-estriatal est involucrado en el control del movimiento

voluntario y la Enfermedad de Parkinson, siendo la dopamina liberada a nivel estriatal
un componente crtico en estos circuitos de los ganglios basales: la muerte de neuronas
dopaminrgicas en la Sustantia Nigra (pars compacta; las neuronas de la pars reticulata
son esencialmente GABArgicas) como ocurre en la Enfermedad de Parkinson, se
traduce en una disminucin de los niveles de dopamina a nivel estriatal y graves
alteraciones de la motilidad.
El estriado recibe aferencias excitadoras glutamatrgicas desde la corteza, que
inervan dos grandes grupos de neuronas GABArgicas de proyeccin espinosa media a
este nivel:
(a) Un grupo que coexpresa Dinorfina y Sustancia P y proyecta
directamente a la parte interna del Globo Plido (GPi) y la pars
reticulata de la Sustantia Negra.(SNr).
(b) Otro que expresa encefalina y neurotensina enva prolongaciones
indirectamente al GPi y SNr, por medio de proyecciones al segmento
externo del Globo Plido (GPe) y al ncleo SubTalmico (STn) y
desde aqu a los ncleos de eferencia (GPi y SNr).

Las estructuras de eferencia (GPi y SNr) proyectan al tlamo y este, finalmente a

la corteza. La va directa proporciona una retroalimentacin positiva y la indirecta una
retroalimentacin negativa en el circuito ganglios basales tlamo. La activacin de la
va directa hace que las neuronas activas del GPi y que tnicamente inhiben, se
inactiven produciendo deshinibicin transitoria del tlamo; la activacin de la va
indirecta aumenta la inhibicin. La activacin de la va directa facilita el movimiento,
mientras que la activacin de la indirecta lo inhibe.

Las neuronas dopaminrgicas de la Sustantia Nigra (pars compacta) proyectan a

las neuronas estriatales que activan ambas vas modulndolas: las neuronas estriatales
que proyectan a la va directa presentan receptores D1 (que facilitan la transmisin) y las
que lo hacen a la va indirecta presentan receptores D2. La inervacin dopaminrgica

xxiv
disminuye la inhibicin tlamo-cortical que finalmente facilita los movimientos
iniciados a nivel cortical. (Kandel E., 2001). No obstante, se debate existe an sobre el
preciso rol funcional de la dopamina en el estriado.

Los Receptores de la Dopamina clonados son 5, D1 a D5 , pertenecientes a la

Superfamilia de receptores acoplados a protenas G y se clasifican en dos grandes
subgrupos:
(a) Tipo D1: comprende los receptores D1 y D5. Actan acoplados a protena Gs
y presentan alta afinidad por benzazepinas como SCH-23390. Su activacin
se asocia a un incremento de la actividad de la adenilatociclasa (AC), con
aumento del AMP cclico (cAMP) intracelular, y activacin de la PKA.
(b) Tipo D2: incluye los receptores D2, D3 y D4. Se acoplan a protena Gi, con
inhibicin de la AC y disminucin de la produccin intracelular de cAMP.

Interacciones entre Sistema Colinrgico y Dopaminrgico en el Sistema

Nervioso Central.

La complejidad y significado funcional de las interacciones entre el sistema

dopaminrgico y colinrgico en el sistema nervioso central, as como la extensin de
estas interacciones, no ha sido an aclarada. Un ejemplo de la importancia que un
mejor conocimiento de stas puede tener, lo constituye en el ser humano la enfermedad
de Parkinson (EP). Esta es una comn afeccin descrita por vez primera hace casi 200
aos. El sistema colinrgico tiene un rol crucial en el control del movimiento que ejerce
el estriado y, como es de esperar, esta regin contiene algunos de los ms altos niveles
del sistema nervioso central de acetilcolina, receptores colinrgicos y otros de sus
marcadores. La administracin de antagonistas de los receptores colinrgicos representa
una de los primeros pasos teraputicos en la enfermedad de Parkinson. La mejora de
los sntomas observada sugiri la hiptesis de que el defecto subyacente fuera un
desbalance entre los sistemas dopaminrgico y colinrgico, consecuencia de la prdida
de neuronas dopaminrgicas. Hoy en da se sabe que la prdida de terminales
dopaminrgicos interfiere sobre la actividad colinrgica, aunque en un modo menos
protagnico, desde el punto de vista fisiopatolgico, que el anteriormente propuesto
(Calabresi P. et al, 2000).

xxv
 El cuerpo estriado presenta adems interneuronas (que inervan ampliamente a
sus neuronas de eferencia) de diferentes tipos: unas colinrgicas grandes y otras ms
pequeas (productoras de GABA, somatostatina, NO y neuropptido Y). Estas
interneuronas modulan la actividad GABArgica de las neuronas de proyeccin
espinosa media as como de los terminales glutamatrgicos y dopaminrgicos que
inervan al estriado. Estas interneuronas parecen tienen gran importancia en el efecto de
inhibicin tnica ejercido por el estriado: Se postula que la actividad neta de las
neuronas estriatales de proyeccin (GABArgicas) sera resultado del equilibrio entre el
efecto inhibidor de la dopamina y el efecto excitatorio de la acetilcolina (va receptores
muscarnicos): esto podra contribuir a explicar que antagonistas muscarnicos mejoren
la sintomatologa en la EP, dado que en presencia de un dficit de actividad inhibitoria
de la dopamina a nivel estriatal, prevalecera en modo suprafisiolgico el efecto
excitatorio de la acetilcolina; efecto que los antagonistas muscarnicos, aplicados
teraputicamente, podran evitar (Nestler E., 2001).

Se postula para la EP que la prdida de las aferencias dopaminrgicas desde la

Sustantia Nigra (pars compacta) hasta el cuerpo estriado, induce una mayor actividad de
la va indirecta y una menor actividad de la va directa, debido a los diferentes efectos
de la dopamina sobre ambas vas, a travs de los receptores dopaminrgicos D1 y D2
respectivamente. Se ha demostrado que la denervacin crnica dopaminrgica afecta en
modo importante la neurotransmisin a nivel estriatal, sin que se haya podido dilucidar
hasta la actualidad con precisin el modo en que esto ocurre.

La fuente principal de acetilcolina a nivel estriatal son las grandes interneuronas

colinrgicas (20 50 M), las cuales forman parte de una extensa red neural, donde
ellas representan el 1 2 % del tota l de la poblacin neuronal. Poseen una arborizacin
dendrtica ms extensa que las neuronas de proyeccin, lo que indica el rol que pueden
jugar integrando las diversas aferencias al estriado y proyectando sobre extensas reas y
mltiples poblaciones neuronales. Estas interneuronas (no obstante la mayor parte de las
aferencias que reciben son fibras glutamatrgicas de origen cortical y talmico) reciben
aferencias dopaminrgicas (Calabresi P. et al, 2000), cuyo papel no ha sido an
dilucidado del todo. Imperato A. et al (1993) en experimentos realizados empleando la
tcnica de microdilisis cerebral en estriado de rata, evidenciaron un incremento en la

xxvi
liberacin de acetilcolina tras la administracin de neurolpticos (sulpiride, haloperidol
y clozapina). La administracin del antagonista de los receptores D1, SCH23390, redujo
la liberacin de acetilcolina al ser administrado solo y fue capaz de prevenir el
incremento en la liberacin de acetilcolina al ser administrado 5 minutos antes que el
haloperidol. Estudios electrofisiolgicos (Zborsky L. et al., 1993) han evidenciado
como la administracin sistmica de agonistas D1 increment la tasa de disparo (firing
rate) en un 83 % a nivel de plido ventral (rea con abundante poblacin colinrgica),
mientras que antagonistas D2 selectivos la disminuyeron en un 62 %. Otro estudio que
sugiere un rol regulador de la dopamina sobre la funcin colinrgica en estriado es el de
Rodrguez - Puertas et al. (1994) quienes analizando el estado de diversos marcadores
colinrgicos en la EP, estudiaron, entre otros marcadores, la unin de 3H-hemicolinio-3
en estriado y a nivel de corteza frontal de pacientes con EP, evidenciando un incremento
de Bmax para 3H-hemicolinio-3 en corteza frontal del 60 % en los pacientes con EP
respecto a los controles y en estriado incrementos del 59 % en n. caudato y 145 % en
putamen. Ha sido tambin descrita una reduccin en la actividad de la colina acetil
transferasa (ChAT) a nivel de corteza prefrontal en pacientes con EP, especialmente en
los casos asociados a marcado dficit cognitivo (Mattila P. M., 2001). Resultados como
estos sugieren que en la EP el llamado desbalance estriatal entre actividad
dopaminrgica y colinrgica ocurre no solamente por el dficit dopaminrgico y la
consiguiente prevalencia (por omisin) de la actividad colinrgica; sino que el dficit
en la seal dopaminrgica proveniente de la Sustantia Nigra (pars compacta) ocasiona
una incremento en la actividad colinrgica, cuya atenuacin mejora las condiciones en
el paciente.

A pesar de estos datos, resulta verdaderamente escaso el conocimiento

disponible acerca de las vas de sealizacin mediante las cuales la dopamina producira
cambios en la actividad de la neurona colinrgica, y si estas interacciones ocurren en
igual forma en otras regiones el sistema nervioso central. A nivel de prosencfalo basal,
estudios de marcaje con anticuerpos anti-tirosina hidroxilasa (TH) sugieren que al
menos una subpoblacin de neuronas septohipocampales colinrgicas recibira aferencia
dopaminrgica, presentando receptores D1 y D2. El significado fisiolgico de estas
interacciones permanece an sin esclarecer.

xxvii
 No obstante se hayan presentado evidencias de una posible regulacin de la
actividad colinrgica a travs de la ChAT como el de Mattila P. M. en la EP, ya
mencionado o el de Loureiro D. S. et al., (2001), sobre regulacin de ChAT por parte de
aminocidos excitatorios, la etapa limitante en la sntesis de acetilcolina, como ya se
dijo, es el aporte de colina a travs del HAChT; no hay datos disponibles, hasta la fecha,
acerca de la posible regulacin de la neurona colinrgica por parte de la dopamina a
travs de mecanismos de fosforilacin / defosforilacin de protenas. La dopamina,
como se seal antes, es capaz de modificar la actividad de la adenilatociclasa en uno u
otro sentido actuando a travs de los receptores tipo-D1 o tipo-D2, acoplados
funcionalmente a protenas Gs y Gi respectivamente, y por ende de modificar los
niveles de cAMP intracelulares: aumentndolos (va tipo-D1) o disminuyndolos (tipo-
D2). El HAChT es una fosfoprotena, capaz de ser fosforilada por PKC (Gates J. et al,
2004) lo que induce cambios en su localizacin celular y en la actividad captadora de
colina de la neurona colinrgica. No se han presentado an evidencias sobre posibles
sustancias capaces de modificar en modo heterlogo la actividad del terminal
colinrgico actuando mediante esta va. De igual manera, la eventual fosforilacin del
HAChT por parte de Proten cinasa A y las eventuales consecuencias de esto,
permanecen sin esclarecer.

La capacidad de la dopamina de regular a travs de sus receptores los

mecanismos de fosforilacin, va cAMP - PKA, aunado al hecho demostrado de la
presencia de sitios consensales para PKA en la estructura del HAChT, hacen surgir la
posibilidad de que un mecanismo de regulacin de la actividad colinrgica por parte de
la dopamina pueda ser el de la fosforilacin / defosforilacin del HAChT: esto podra
modificar la actividad del HAChT, la disponibilidad de colina (etapa limitante) y,
finalmente, la produccin de acetilcolina en la neurona colinrgica.

Retina y Sistema Colinrgico.

En la retina existen diferentes poblaciones celulares, organizadas en capas.

Tres clases principales de neuronas se distinguen:
(a) Fotorreceptores: Bastones y Conos, que se encuentran en la Capa
Nuclear Externa CNE).

xxviii
 (b) Interneuronas: Clulas Amcrinas, Clulas Bipolares y Clulas
Horizontales que ocupan la Capa Nuclear Interna (CNI).
(c) Clulas Ganglionares: situadas en la Capa Ganglionar (CG).

Los fotorreceptores, clulas bipolares y horizontales forman sinapsis entre ellas

en la Capa Plexiforme Externa (CPE); por su parte, las clulas amcrinas, bipolares y
ganglionares forman sinapsis entre s en la Capa Plexiforme Interna (CPI). El flujo de
seales tiene sentido Vertical, en cuanto a la informacin que desde los
fotorreceptores va a las Clulas Bipolares y desde estas hasta las Clulas Ganglionares
(cuyos axones conforman el nervio ptico) y sentido Horizontal mediante los
contactos sinpticos establecidos por las Clulas Horizontales en la CPE y por las
Clulas Amcrinas en la CPI. (Kandel E., 2000).

Si adems de tomar en cuenta estas poblaciones mayores de neuronas

retinianas, se tiene cuenta de los diversos sistemas de neurotransmisin que se expresan
dentro de cada uno de estos fenotipos celulares pueden entonces distinguirse
aproximadamente 50 subtipos de neuronas retinianas (Guimares M.Z.P. et al., 2001).
Las Clulas de Mller, constituyen otro grupo celular, de tipo glial, que atraviesa
completamente los diferentes estratos de la retina y recientemente (Fisher A. y Reh T.,
2001) se ha demostrado su potencial como fuente para la regeneracin neuronal
retiniana.

La retina de pollo expresa los diferentes marcadores colinrgicos, pre- y post-

sinpticos. El receptor colinrgico nicotnico (nAChR) aparece tempranamente en la
retina de pollo; algunos tipos de nAChR se evidencian hasta dos das antes que la
actividad ChAT (Torro A. y Britto L., 2002). El receptor colinrgico muscarnico est
presente ya en embriones de pollo de 5,5 das y aumenta hasta alcanzar un mximo a la
edad de 13 14 das (Bmax de 320 fmol / mg de protena, en ensayo de unin de [3H]-
Quinuclidinillbenzilato ([3H]-QNB)), con una distribucin similar a la descrita para el
nAChR y actividad colinestersica (Sugiyama H. et al., 1977). En 1977, Baughman R. y
Bader C. evidenciaron, mediante estudios autoradiogrficos con [3H]-Colina y
determinacin indirecta de la actividad HAChT, la presencia de clulas colinrgicas en
la retina de pollo adulto a nivel de Capa Nuclear Interna, correspondiendo a clulas
amcrinas y Capa Ganglionar, donde las clulas colinrgicas son clulas amcrinas

xxix
desplazadas. Estas clulas proyectan hacia la Capa Plexiforme Interna, como se
evidencia empleando el marcaje para la colinesterasa o mediante la unin de [3H]-QNB
(Sugiyama H. et al., 1977). Otros marcadores presinpticos son evidenciables en retina
de pollo, como la ChAT, (cuya inmunoreactividad tambin aparece localizada nivel de
Capa Nuclear Interna y Capa Ganglionar) o el VAChT cuya deteccin mediante
Inmunoblot es posible en retina de pollo adulto o en embriones de ms de 19 das
(Loureiro D.S. et al, 2002). En cultivos celulares monocapa de retina de embrin de
pollo, un 5 - 10 % del total de las clulas, aproximadamente, son clulas amcrinas
colinrgicas. (Puro et al., 1977). En este tipo de cultivos (monocapa), las neuronas
provenientes de embriones de pollo de 8 -9 das de edad (E 8-9), son capaces, al cabo de
varios das, de desarrollar los diferentes marcadores colinrgicos: captacin de [3H]-
Colina mediante HAChT, conversin de [3H]-Colina en [3H]-Acetilcolina, liberacin de
[3H]-Acetilcolina en respuesta a estmulos despolarizantes y expresin de actividad
ChAT, en niveles comparables a los presentados por la retina intacta. No obstante, en
los cultivos monocapa (y no en los agregados) se observa una disminucin importante
de la actividad ChAT a partir del 7 da en cultivo (C7), as como de la liberacin de
[3H]-Acetilcolina tras estimular con KCl 44 mM. La actividad HAChT, por el contrario,
no sufre alguna disminucin significativa entre los das 4 y 12 en cultivo. Esta
desdiferenciacin colinrgica es prevenida en cultivos monocapa mediante el
tratamiento con medio condicionado proveniente de cultivos agregados de 6 a 10 das
(C6-10), y no de cultivos C3, indicando esto que la estabilizacin del fenotipo colinrgico
en cultivo requiere de seales externas en un perodo especfico y crtico de tiempo, as
como una adecuada interaccin entre diversas poblaciones celulares, que s se da en los
cultivos agregados (De Mello F. et al., 1990). Las clulas colinoceptivas en la retina
incluyen clulas bipolares, ganglionares y amcrinas, mientras que las clulas amcrinas
pueden ser tambin dopaminrgicas y GABArgicas, glicinrgicas o purinrgicas

Los cultivos celulares de retina de embrin de pollo han demostrado ser un

modelo biolgico experimental vlido y verstil para el estudio de las interacciones
neuronales a nivel del Sistema Nervioso Central. Es un cultivo primario sencillo en su
montaje, y en el que (si se mantienen las condiciones adecuadas) las clulas retinianas
se dividen, desarrollan y presentan caractersticas muy similares a las que presentan las
clulas en la retina intacta. En este trabajo se emplean cultivos celulares primarios, del

xxx
tipo monocapa densa, de embriones de pollo de 8 das de edad, en el que se evidencian
tanto las neuronas como las clulas gliales tpicas del tejido retiniano.

xxxi
 CAPITULO III

MATERIALES Y MTODOS

Materiales.

cido Ascrbico, Riedel De Haen.

cido Glutmico, Sigma.

Acrilamida, Promega.

Adenosina, Sigma.

Albmina srica bovina (BSA), Santa Cruz.

Anticuerpo Policlonal Anti-HAChT de Rata, obtenido en conejo, Chemicon.

Anticuerpo anti-IgG de conejo, obtenido en cabra, Chemicon.

Aprotinina, Sigma.

Azul de Bromofenol, USB.

Bisacrilamida, Sigma.

Bradford (Solucin), BioRad.

Dimetilformamida, Sigma.

Dopamina HCl, Sigma.

DTT, Sigma.

EHNA (erythro-9-Amino--hexyl--methyl -9H- purine -9-ethanol
hydrochloride), Sigma

Forskolina, Sigma.

HC-110, Kodak.

Hemicolinio-3, ICN.

Isobutil-metilxantina (IBMX), Sigma.

xxxii

Kainato, Sigma.

Leupeptina, Sigma.

Luminol, Sigma.

Metanol, Merck.

Minimal Essential Medium (MEM), Sigma.

Pargilina, Sigma.

PdBu (Dibutirato de Forbol), Sigma.

Pelcula MIN-R, Kodak.

Perxido de hidrgeno, IQE.

Persulfato de Amonio, Promega.

PMA (Miristolato-acetato de forbol), Sigma.

PMSF, Sigma.

POPOP, Sigma.

PPO, Sigma.

Raclopride, Sigma.

SDS, Sigma.

SCH23390, Sigma.

Sp-cAMPS (Sp-adenosina 3,5-monofosfotioato cclico), Sal de
trietilamonio, Sigma.

Suero Fetal Bovino, Gibco BRL.

Sulfato de Eserina (Fisostigmina), Sigma.

TEMED, USB.

Tripsina, Gibco BRL.

Tween 20, Riedel De Haen

[3H]-Colina, NEN. (Actividad: 75 Ci / mmol).

4-Bifenilfenol, Merck.

xxxiii
Cultivos Celulares.

Se prepararon cultivos celulares primarios del tipo monocapas densas a partir de

retinas de embrin de pollo. La preparacin de los cultivos celulares se llev a cabo
segn la metodologa descrita por De Mello et al, (1990), modificado. Huevos frtiles
obtenidos de gallinas de la raza Issa-Brown fueron colocados frescos en un incubador
ad hoc (a 38 C, ventilado, humidificado y con rotacin) por un perodo de ocho das.
Posteriormente, en campana de flujo laminar (y previo lavado externo con isopropanol)
los huevos fueron abiertos, los embriones extrados con pinzas estriles y colocados en
una cpsula de Petri. Se descartaron aquellos embriones cuyo tamao no se
correspondiera con el apropiado para la edad, as como aquellos que presentaban
cualquier otro tipo de desviacin con respecto al aspecto externo normal.

Sucesivamente, se disecaron los ojos de estos embriones removiendo el parpado

y separando sutilmente el ojo del resto de la cabeza. Los ojos se colocaron en otra
cpsula de Petri con solucin salina isotnica de Hanks libre de calcio y magnesio
(CMF), con osmolaridad y pH fisiolgicos. Todo el procedimiento se llev a cabo
dentro de una campana estril de flujo laminar horizontal. Se removieron (mediante
diseccin manual con pinzas) cuidadosamente el cristalino y el humor vtreo y se
procedi a abrir el globo ocular.

La retina, distinguible por su caracterstico color blanco perla, se separ

(levantndola desde la periferia hacia el centro del globo ocular) gradualmente del resto
del ojo hasta quedar nicamente unida a este por el nervio ptico, que finalmente fue
seccionado.

Las retinas as obtenidas se colocaron en un tubo de baquelita y fueron

sometidas a digestin con tripsina al 0,05 %, por un lapso aproximado de diez minutos a
37 C. Se centrifugaron entonces a 500 g por 1 minuto, descartndose el sobrenadante
para interrumpir la reaccin. Las retinas as digeridas fueron resuspendidas en medio de
cultivo: Minimal Essential Mdium (MEM) o Basal Medium Eagle (BME) con 5 % de
Suero Fetal Bovino y Gentamicina (50 g /mL). La disociacin final se llev a cabo de
forma mecnica, pipetando dicha suspensin unas doce veces aproximadamente contra
el fondo del tubo de baquelita, evitando cuidadosamente el burbujeo. La suspensin

xxxiv
celular obtenida fue diluida en el volumen final de medio de cultivo (aproximadamente
10 - 15 x 106 clulas por ml de medio). Finalmente se procedi a colocar en cada
cpsula de Petri estril de 35 mm de dimetro 2 mL de la suspensin celular.

Mantenimiento de los Cultivos Celulares.

Las clulas en cultivos se colocaron en incubador, a 37 C, aire al 5% de CO2 y

ambiente saturado de vapor de agua. Al cabo de 24 horas de haber realizado los cultivos
celulares, se procedi a observar las clulas y sustituir el medio de cultivo con medio
nuevo (previamente llevado a 37 C). Sucesivamente se procedi a sustituirlo cada 48
horas hasta el momento del empleo en los diversos experimentos. En algunas ocasiones
se procedi a determinar la actividad de la ChAT (mtodo de Fonnum (1975)
modificado (Loureiro D.S. et al., 2001), para confirmar la presencia de otros
marcadores colinrgicos presinpticos en las clulas en cultivo.

Determinacin de la Actividad del Transportador de Colina de Alta Afinidad

(HAChT).

La determinacin de la actividad del HAChT se llev a cabo mediante

experimentos de captacin de colina tritiada ([3H]-Colina) por un lapso limitado de
tiempo en las clulas en cultivo. Antes de realizar los experimentos se observaron con
un microscopio invertido las placas de petri, con la finalidad de detectar y excluir de los
experimentos placas que presentaran signos de contaminacin, sufrimiento celular o
reas anormalmente despobladas de clulas. Se procedi entonces a retirar el medio de
cultivo (acondicionado a 37 C) y a agregar el medio en el que se realizara la
incorporacin, que fue el MEM (Minimal Essential Mdium) con Sulfato de Eserina a
la concentracin de 50 M; el volumen final fue en todos los casos de 1 mL. La
concentracin de colina en el MEM es de 7,16 M. Independientemente del tratamiento
dado a las clulas, en el tiempo 0 se procedi a aadir la [3H]-Colina en la cantidad
de 0,1 Ci por placa, y cronometrar el tiempo pasado por las clulas en presencia de la
colina radioactiva. Todo el tiempo (exceptuando el momento de agregar las drogas o la
[3H]-Colina), las clulas permanecieron en el incubador a 37 C. Transcurrido el tiempo
debido se procedi a retirar el medio de incubacin y as eliminar la [3H]-Colina no
captada por las clulas. Para asegurar esta eliminacin, se lav 5 veces cada placa con

xxxv
CMF + Sulfato de Eserina 50 M, (a pH 7,4 y osmolaridad 300 mOsm / L) empleando 2
mL para cada lavada por placa. Se observaron nuevamente las clulas, prestando
particular atencin a detectar desprendimientos, vacuolizacin, retraccin u otros signos
de sufrimiento celular.

En una segunda fase se cosecharon las clulas de las placas mediante un

cosechador de goma. Esto se hizo en un volumen final de 500 L de agua pentadestilada
para inducir la ruptura celular por shock osmtico y evitando cuidadosamente la prdida
de clulas en el proceso. Fueron entonces transferidas a viales Eppendorf, en las que
fueron sometidas a 3 ciclos de congelamiento / descongelamiento (a 70 C y +37 C)
para completar la lisis (y liberar la radiactividad) en el medio. Se centrifugaron a 12.000
r.p.m. por 15 minutos en una microcentrfuga luego de lo cual se tomaron 100 L del
sobrenadante, que se colocaron en filtros de fibra de vidrio: esto se hizo por triplicado
para cada vial (placa). El pellet y el resto del sobrenadante se congelaron para
posteriormente determinar el contenido de protenas del mismo. Los filtros se secaron
en una estufa a 100 C por un lapso de 90 minutos aproximadamente, y despus se
disolvieron en 5 mL de cocktail de centelleo, para finalmente ser contados en un
Contador lquido de centelleo.

La actividad del sistema de captacin de colina de baja afinidad se determin

midiendo la captacin de colina en presencia del inhibidor especfico del HAChT
Hemicolinio-3 a la concentracin de 50 M (Loureiro D.S. et al, 2001). La actividad del
HAChT se expresa en picomoles de colina por miligramo de protena por minuto (pmol
/ mg /min).

Determinacin de las protenas en el pellet:

Se determinaron mediante el mtodo de Lowry (Lowry O.H. et al, 1951): para

una adecuada digestin de las protenas del pellet antes de la determinacin, una vez
descartado el resto de sobrenadante de cada vial, se aadieron 200 L de NaOH 1M a
cada vial, agitando y dejando reposar por una noche. Las muestras se prepararon
aadiendo 10 L de esta suspensin a 190 L de agua pentadestilada. Como estndar se
utiliz albmina srica bovina (BSA) y las lecturas se hicieron en espectrofotmetro
(Spectronic 20) a 750 nm.

xxxvi
 Electroforesis y Western Blot.

Preparacin de las muestras: Se prepararon muestras a partir de retinas de

embrin de pollo de diferentes edades para la (E 7-15) as como hipocampo-estriado de
ratas Sprague-Dawley adultas. La muestras se prepararon en Buffer de homogenizacin
(Buffer de Homogenizacin: Tris base 20 mM, MgCl2 10 mM, CaCl2 0,6 mM, EGTA
0,5 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, aprotinina 5 g/mL, leupeptina 2 g/mL y Triton X-
100 al 0,05 %; pH 7,4) y se procedi a la determinacin de protenas segn el mtodo
de Bradford (Bradford M.M., 1976). Luego se diluyeron en Buffer SDS 3X (Buffer
SDS 3X: para 10 mL= Glicerol 3 mL, Dodecil Sulfato de Sodio SDS- 0,9 g, Tris 0,5 M
pH 6,8- 3,75 mL, Azul de Bromofenol 0,1% 0,3 mL y agua pentadestilada hasta
completar el volumen final) hasta alcanzar una concentracin final de protenas de 5
g/mL.
Las muestras fueron sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8 %,
(minigeles de 12 x 8 cm) de 1,5 mm de espesor. Se colocaron las muestras de retinas de
embrin de pollo y cerebro de rata (hipocampo-estriado) en la cantidad de 200 g
aproximadamente. Paralelamente se coloc el marcador de peso molecular en cada uno
de los geles. La electroforesis se llev a cabo en un tanque (MiniProtean II, BioRad)
lleno de Buffer de Corrida (14,4 g de Glicina, 3 g Tris base, SDS 1 g para 1 L en agua
pentadestilada) a 110 V y a temperatura ambiente, con una duracin promedio de 100
minutos. Culminada la electroforesis, se procedi a colocar cada gel en contacto directo
con una membrana de nitrocelulosa (Amersham) y se procedi a la transferencia a 80 V
por cuatro horas dentro de refrigerador, en un tanque (BioRad) lleno de Buffer de
Transferencia (14,4 g de Glicina, 3 g Tris base, 1 mL de SDS 10 % y 200 mL de
Metanol para 1 L en agua pentadestilada) fro. Las membranas fueron mantenidas en
Buffer de Transferencia por 30 minutos antes de ser usadas.

Culminada la transferencia, se descartaron los geles (en alguna ocasin se

procedi a su tincin con azul de Coomassie brillante para verificar la eficacia de la
transferencia) y se procedi a teir las membranas con rojo de Ponceau con la finalidad
de observar las bandas correspondientes a las protenas transferidas, incluyendo los
marcadores de peso molecular. Sucesivamente se lavaron con TTBS (Solucin Buffer
Tris Tween 20: 50 mM Tris base, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 y Tween 20 al 0,05 %)

xxxvii
hasta remover el colorante y se procedi al bloqueo de las membranas. El procedimiento
ms comn fue el de incubar en TTBS + 5 % de leche descremada por 90 minutos en
agitacin leve. Se procedi a lavar las membranas con TTBS y sucesivamente se
colocaron en presencia de anticuerpo primario Anti-HAChT Humano y de rata,
policlonal (Chemicon) obtenido en conejo. Esto se hizo diluyendo el anticuerpo
primario 1:333 o 1:500 en TTBS + BSA 1 % y dejando las membranas en incubacin
por toda una noche (overnight) en agitacin constante y a temperatura ambiente. Tras
lavar las membranas con TTBS por 3 veces, se procedi a incubarlas con Anticuerpo
secundario (Chemicon) anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rbano
(obtenido en cabra) en una dilucin 1:3000 en TTBS + BSA 1% + Leche descremada 1
% por una hora, a temperatura ambiente y en agitacin constante. Se lavaron las
membranas con TTBS por 3 veces y se procedi a detectar la unin del anticuerpo
mediante quimioluminiscencia en pelcula Kodak y revelado con HC-110 (Kodak).

Anlisis de los datos.

Los resultados obtenidos se expresan en su mayora como promedio ES,

indicando el nmero de experimentos. En algunos casos se presentan como porcentaje
respecto del control. El anlisis estadstico se realiz mediante prueba t de Student o
ANOVA de una va (utilizando la prueba de Bonferroni como test Post-hoc) mediante
software estadstico (GraphPad Software, San Diego, CA).

xxxviii
 CAPITULO IV

RESULTADOS

Regulacin de la actividad HAChT en retina: Efecto del tratamiento de la

Dopamina.

Con la finalidad de verificar el efecto del tratamiento con Dopamina sobre la

actividad del HAChT en retina, se procedi inicialmente a tratar los cultivos celulares
(E8C6-7) con dopamina 100 M e IBMX 500 M (Lankford K. et al., 1988; DeMello
M.C.F. et al., 1982) por un perodo aproximado de 60 minutos. Los experimentos se
llevaron a cabo en presencia de Pargilina 100 M (un inhibidor de la Monoamino
oxidasa MAO-, que impide el rpido metabolismo de la dopamina agregada) y de
cido ascrbico 100 M (un agente antioxidante, que impide la oxidacin de esta
catecolamina), los controles tambin fueron tratados con Pargilina y cido ascrbico
100 M. El tratamiento con IBMX, una metilxantina que inhibe las fosfodiesterasas,
tiene como finalidad impedir la conversin del cAMP a 5-AMP. La dopamina usada
se prepar fresca antes de cada experimento. La actividad HAChT promedio medida en
presencia de dopamina e IBMX fue de 15,2 0,85 pmol / mg /min, contra un valor de
23,02 1,45 pmol / mg /min obtenido en las placas de control; significando esto una
reduccin (estadsticamente significativa, p < 0,0001) del 34 % de la actividad del
transportador. (Figura 2).

Dado el marcado efecto inhibidor de la dopamina + IBMX sobre la actividad

HAChT, se procedi a realizar experimentos de Curva Dosis Respuesta, con la
finalidad de determinar la eventual dosis dependencia de dicho efecto. Se montaron
experimentos en forma similar a los descritos para dopamina 100 M + IBMX 500 M,
pero esta vez con concentraciones de dopamina de 10, 20, 50 y 100 M (con IBMX 500
M en todos los casos). Tales experimentos, aunque confirmando el efecto inhibidor del

xxxix
tratamiento con dopamina + IBMX, no evidenciaron alguna dosis dependencia de
dicho efecto: los valores promedio obtenidos en esta serie de experimentos fueron de
25,71 1,56 pmol / mg /min en las placas control y 17,02 1,52 (dopamina 10 M),
16,06 1 (dopamina 20 M), 19,1 1,19 (dopamina 50 M) y 19,78 1,24 pmol / mg
/min (dopamina 100 M) (Figura 3) existiendo una diferencia estadsticamente
significativa entre los valores de actividad HAChT obtenidos en las placas control y
todas las placas tratadas con dopamina (10, 20, 50 o 100 M) + IBMX 500 M, aunque
sin diferencias entre los valores de actividad HAChT obtenidos con diferentes dosis de
dopamina + IBMX 500 M.

25
HAChT (pmol/mg/min)

20
*
15

10

0
Control Dopamina+IBMX

Figura 2. Efecto de la dopamina (100 M) + IBMX (500 M) sobre

la actividad HAChT en cultivos celulares de retina de embrin de
pollo (E8C6-7). Cada columna representa la Media EE de los
resultados obtenidos en 4 experimentos independientes realizados por
duplicado con 3 cuantificaciones por placa. (*) p < 0,005.

xl
 30
*

HAChT (pmol/mg /min)

20

10

0
control 10 M 20 M 50 M 100 M
Concentracin Dopamina

Figura 3. Curva dosis respuesta de actividad HAChT en presencia

de diferentes concentraciones de dopamina + IBMX 500 M en
cultivos celulares de retina de embrin de pollo (E8C6-7). Cada
columna representa la Media EE de los resultados obtenidos en 3
experimentos independientes realizados por duplicado con 3
cuantificaciones por placa. (*) p < 0,05: al comparar los valores
control con cada uno de los valores obtenidos en los cultivos tratados
se observ una diferencia significativa con cada una de las dosis; sin
embargo no se observ alguna diferencia significativa (p=n.s.) al
comparar, entre ellos, los valores obtenidos en los cultivos tratados.

En vista de la ausencia de dosis dependencia en el efecto de la dopamina +

IBMX, no obstante se haya descrito para cultivos celulares de retina de embrin de
pollo de esta edad que la acumulacin de cAMP en respuesta a la dopamina ocurre en
forma dosis dependiente (DeMello M.C.F. et al., 1982) se procedi a medir el efecto
inhibidor de la dopamina 100 M + IBMX 500 M sobre la actividad HAChT, en
presencia de un antagonista de los receptores dopaminrgicos tipo-D1, (+)-SCH23390
en la concentracin de 1 M durante 60 minutos. Este es capaz de inhibir en esta
concentracin la acumulacin de cAMP inducida por dopamina 200 M en cultivos
celulares de retina de embrin de pollo (Do Nascimento J. et al., 1997). La actividad
HAChT se redujo significativamente al tratar las placas con dopamina 100 M + IBMX
500 M, con valores de 18,6 4, pmol / mg /min respecto a los 23,02 4,2 pmol / mg

xli
/min de las placas control. Sin embargo este efecto inhibidor no se modific
significativamente en ningn sentido al aadir al tratamiento con dopamina e IBMX el
antagonista D1 (+)-SCH23390 (17,9 3,77 pmol / mg /min).

Dado que el bloqueo de los receptores D1 no modific el efecto inhibidor de la

dopamina + IBMX (ni potencindolo ni revirtindolo), se procedi a cuantificar el
eventual efecto de la dopamina endgena sobre la actividad basal de HAChT, a travs
de los receptores D1 y D2. Para esto se determin la actividad HAChT en cultivos
tratados con antagonistas de los receptores dopaminrgicos del tipo-D1 ((+)-SCH23390
1 M) o de los tipo-D2 (Raclopride 2 M; Guimares M.Z.P. et al., 2001). Los
resultados se muestran en la Figura 5.

Ni el empleo de antagonistas D1 o D2 tuvo algn efecto sobre la actividad basal

del HAChT en los cultivos celulares, descartndose la posible influencia de la dopamina
endgena sobre la actividad basal del HAChT.

30
*
HAChT (pmol/mg/min)

20

10

0
X

0
l
tro

39
M
IB
on

23
A+

H
C

SC
D

X+
M
IB
A+
D

Figura 4. Efecto del (+)-SCH23390 (1 M) sobre el efecto inhibidor del

tratamiento con dopamina 100 M + IBMX 500 M en la actividad
HAChT de cultivos celulares de retina de embrin de pollo (E8C6-7).
Cada columna representa la Media EE de los resultados obtenidos en 3

xlii
 experimentos independientes realizados por duplicado con 3
cuantificaciones es por placa. (*) Se observ una diferencia significativa
entre los valores control y los tratados (p < 0,005), pero ninguna
diferencia significativa entre estos ltimos (p = n.s.).

25
HAChT (pmol / mg /min)

20

15

10

0
ol

M
tr
on

1
e

0
C

id

39
pr

23
lo

H
ac

SC
R

Figura 5. Efecto del tratamiento de los cultivos celulares con (+)-

SCH23390 1 M o con Raclopride 2 M sobre la actividad HAChT de
cultivos celulares de retina de embrin de pollo (E8C6-7). Cada columna
representa la Media EE de los resultados obtenidos en 3
experimentos independientes realizados por duplicado con 3
cuantificaciones es por placa. No se observ ninguna diferencia
estadsticamente significativa entre estos 3 grupos.

Regulacin de HAChT por los niveles de cAMP.

Dada la reproducibilidad del efecto inhibidor del tratamiento con Dopamina 100
M + IBMX 500 M, as como la imposibilidad de revertir dicho efecto mediante
antagonistas dopaminrgicos y la falta de efecto sobre la actividad basal de HAChT de
estos antagonistas, se procedi a evaluar el efecto que pudiera tener nicamente la
inhibicin de las fosfodiesterasas mediante la cuantificacin de la actividad HAChT en

xliii
presencia del solo IBMX 500 M. Se llevaron a cabo paralelamente experimentos con
el solo vehculo (DMSO), descartndose efectos inespecficos. El tratamiento con
IBMX 500 M indujo una reduccin estadsticamente significativa (p < 0,0005) en la
actividad HAChT. Esta fue del 32 % aproximadamente: porcentaje de inhibicin similar
al observado con el tratamiento dopamina 100 M + IBMX 500 M (34 %). Figura 6.

Sucesivamente, se procedi a determinar si la reduccin en la actividad HAChT

observado tras la inhibicin de la actividad fosfodiestersica poda ser reproducido a
travs de otros medios capaces de incrementar los niveles de cAMP. Se trataron cultivos
celulares con un anlogo del cAMP, el Sp Adenosina-cAMP, capaz de atravesar
libremente la membrana plasmtica y resistente a la accin de la fosfodiesterasa, a la
concentracin final de 100 o 200 M (Gallo G. et al., 2002) durante 45 60 minutos. El
tratamiento de los cultivos con este anlogo del cAMP indujo una reduccin
significativa (p < 0,005) de la actividad HAChT en un 29 % aproximadamente. Figura
6.

Adicionalmente la estimulacin de la adenilatociclasa endgena mediante el

tratamiento de los cultivos celulares con Forskolina 40 M (Lankford L. et al, 1988) +
IBMX 500 M (agregados 30 a 60 minutos antes de cuantificar la actividad HAChT)
redujo la actividad HAChT en un promedio del 69 %, duplicando el efecto observado
con IBMX 500 M. Figura 6.

xliv
 20

HAChT (pmol / mg / min)

15
** *
10
**
5

0
X

X
M

M
M

M
cA
IB

IB

cA

IB

IB
ol

+
+
ol

FK
FK
tr

tr
on

on

ol
C

tr
on
C

Figura 6. Efecto del tratamiento de los cultivos celulares de retina de

embrin de pollo (E8C6-7) con Isobutil-metilxantina (IBMX) 500 M,
Sp-cAMP (100 200 M) y Forskolina (40 M) + IBMX 500 M
sobre la actividad HAChT. (**): p < 0,0005. (*): p < 0,005.

Los experimentos anteriores demuestran como el incremento de la concentracin

intracelular de cAMP, ya sea inhibiendo su catabolismo (IBMX), aadindolo
directamente (Sp-cAMP) o estimulando su sntesis (Forskolina) induce inhibicin de la
actividad HAChT.

Regulacin del HAChT por Adenosina.

Se conocen 4 subtipos de receptores para adenosina (P1): A1, A2A, A2B y A3, todos
pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a Protenas G (GPCR`s). Los
subtipos A2A y A2B estn acoplados a Gs, por lo que su activacin promueve el
incremento de los niveles de cAMP. En la retina de pollo (a partir del da 14 de edad
embrionaria) as como en cultivos celulares de retina de la misma especie (E8C6-7), la
adenosina es capaz de incrementar los niveles de cAMP independientemente del efecto
de la dopamina (Paes R. et al., 1982; Paes R. et al., 1992). En vista de los resultados
antes obtenidos se procedi a cuantificar la actividad del HAChT tras incubar las clulas
en cultivo con Adenosina 100 M. Los experimentos se realizaron en presencia o no de

xlv
un inhibidor de la Adenosina Deaminasa: EHNA 10 M (erythro-9-Amino--hexyl--
methyl-9H-purine-9-ethanol hydrochloride) (Martins Ferreira J. y Paes R., 2001).
Figura 7.

20
HAChT (pmol / mg /min)

*
16

12

0
l

A
ro

N
t

H
on

+E
C

na
si
no
de
A

Figura 7. Efecto del tratamiento de los cultivos celulares de retina de

embrin de pollo (E8C6-7) con Adenosina 100 M + EHNA 10 M,
sobre la actividad HAChT. (*) p = 0.016. Cada columna representa la
Media EE de los resultados obtenidos en 4 experimentos
independientes realizados por cuadruplicado con 3 cuantificaciones es
por placa.

El tratamiento con Adenosina 100 M + EHNA 10 M indujo una reduccin

estadsticamente significativa de la actividad del HAChT con valores en las placas de
control de 15,58 1,231 pmol / mg /min y en las tratadas 13,47 1,04 pmol / mg /min
significando esto una reduccin del 14 % aproximadamente. El tratamiento con
Adenosina 100 M no produjo cambios significativos con respecto al control (aunque se
aprecia disminucin de la actividad HAChT), as como el EHNA 10 M solo.

Efecto del Pre Tratamiento de los cultivos celulares con Kainato o Glutamato.

Recientemente se ha demostrado que los Aminocidos Excitatorios (AAEE) pueden

ser importantes en la regulacin de la neurona colinrgica, demostrndose que pueden

xlvi
inhibir la actividad de la ChAT (Loureiro D.S. et al., 2001), as como la unin de [3H]-
Vesamicol al VAChT en cultivos de retina de pollo (Loureiro D.S. et al., 2002). Los
AAEE pueden inducir activacin de PKC a travs de receptores ionotrpicos o
metabotrpicos, y evidencias recientes sealan que en algunos tipos de clulas tambin
incrementan los niveles de cAMP travs de receptores metabotrpicos glutamatrgicos
(mGluRs) tipo-I (Hoffpauir B. y Gleason E., 2002).

Bajo estas premisas se procedi a cuantificar la actividad del HAChT tras haber
mantenido los cultivos celulares en presencia de Glutamato (500 M - 1 mM) o Kainato
(100 500 M) (Loureiro D.S. et al., 2001) por espacio de 15 a 30 minutos. El
Glutamato y el Kainato se retiraron al cabo de este lapso de tiempo, cambiando el medio
de incubacin y se procedi a la determinacin. Los resultados se aprecian en la Figura
8. Estos fueron obtenidos a partir de 5 experimentos independientes realizados por
duplicado o triplicado.

100
% de Actividad HAChT

* *
75

50

25

0
Control Glutamato Kainato

Figura 8. Efecto del Pre Tratamiento de los cultivos celulares de retina

de embrin de pollo (E8C6-8) con Glutamato o Kainato sobre la
actividad del HAChT. (*) p < 0,05. Cada columna representa la Media
EE de los resultados obtenidos en 5 experimentos independientes
realizados por duplicado o triplicado con 3 cuantificaciones es por
placa.

xlvii
 El Pre Tratamiento de los cultivos celulares con Glutamato indujo una reduccin de
la actividad del HAChT del 26 % aproximadamente, con valores de 15,12 6,18 pmol /
mg /min en los controles y 11,12 4,66 pmol / mg /min en los cultivos pre tratados. El
Pretratamiento con Kainato redujo la actividad del HAChT en un 24 %
aproximadamente, obtenindose valores de 36,24 5,15 pmol / mg /min en las tratadas
y 27,63 4,05 pmol / mg /min en sus pares control. Se realizaron as mismo
experimentos de captacin de [3H]-Colina hasta 24 horas despus de haber mantenido
los cultivos celulares en presencia de Glutamato o Kainato, obtenindose valores
equivalentes a los obtenidos en los controles, excluyndose as que las disminuciones de
actividad HAChT pudieran atribuirse a muerte celular.

Efecto del Tratamiento de los cultivos celulares con Esteres de Forbol.

Con la finalidad de comprobar si mediante activadores de PKC era posible lograr

inhibiciones similares a las obtenidas con AAEEs, as como para verificar si en retina
la regulacin del HAChT por PKC tena caractersticas similares a las descritas en
sinaptosomas de hipocampo y estriado de ratn (Gates J. et al., 2004), se sometieron
cultivos celulares a tratamiento con 12-Miristato 13-acetato de Forbol (-PMA) o 12,
13-dibutirato de Forbol (-PdBu) por perodos de 60 minutos en la concentracin de
200 nM 1 M (-PMA) y 1 2 M (-PdBu). Los resultados se presentan en la Figura
9.

40
HAChT (pmol / mg /min)

30 *

20

10

0
Control Ester Forbol

xlviii
 Figura 9. Efecto del tratamiento de cultivos celulares de retina de
embrin de pollo (E8C6-8) con Esteres de Forbol. Cada columna
representa la Media EE de los resultados obtenidos en 5 experimentos
independientes realizados por duplicado con 3 cuantificaciones es por
placa. (*) p < 0,005.

El tratamiento de los cultivos con Esteres de Forbol redujo la actividad del HAChT
en modo significativo, obtenindose en los controles un valor promedio de 34,81 4,83
pmol / mg /min y en los cultivos tratados 24,28 4,5 pmol / mg /min. (30 % de
diferencia). Se realizaron paralelamente experimentos en presencia del solo vehculo
con la finalidad de depurar los resultados del efecto inespecfico del mismo (etanol).

Electroforesis e Inmunodeteccin del HAChT en retina de pollo.

Dado que hasta la fecha no se ha caracterizado estructuralmente ni molecularmente,

el HAChT en el sistema nervioso central de aves, se llev cabo una electroforesis en
gel de poliacrilamida seguida de transferencia e inmunodeteccin en muestras de retina
de pollo usando un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a HAChT de rata.

No obstante se haya empleado el anticuerpo en tejido proveniente de una especie no

mamfero, fu posible el reconocimiento de una banda que corresponde en peso
molecular (60 kDa) al estimado para el HAChT (Pollo E15), junto a la de muestras
provenientes de hipocampo y estriado de rata (Figura 10).

Figura 10. Inmunodeteccin del HAChT en hipocampo-estriado de rata

y en retina de embrin de pollo de 15 das de edad.

xlix
 CAPITULO V

DISCUSION Y CONCLUSIONES

En el presente trabajo se intent evidenciar el posible rol que la dopamina podra

ejercer en la regulacin del funcionalismo colinrgico a travs de mecanismos de
fosforilacin que afectaran la actividad del HAChT. Las premisas para explorar tal
posibilidad fueron principalmente dos: por una parte el conocimiento de las importantes
interacciones entre los sistemas colinrgico y dopaminrgicos en el sistema nervioso
central, (especialmente a nivel de ganglios basales y en la fisiologa del control del
movimiento) y por otra la presencia en la estructura del HAChT de sitios potenciales
para su regulacin mediante el mecanismo de fosforilacin / defosforilacin, en el que,
potencialmente, la dopamina podra intervenir; estas fueron ya explicadas
detalladamente (Antecedentes).

El aumento de los niveles de cAMP inducidos por dopamina a travs de receptores

D1 aparece temprano durante el desarrollo de la retina de embrin de pollo,
observndose ya al 7 da de desarrollo embrionario (Marques A. y Garcia De Mello F.,
1990). Los cultivos celulares de retina de embrin de pollo (E8C6), acumulan cAMP en
forma dosis dependiente en respuesta a la estimulacin con dopamina tras 10 minutos
de estimulacin, obtenindose un efecto mximo con 100 M (De Mello M.C.F. et al.,
1982). Por otra parte, mediante marcaje autoradiogrfico con [3H]-SCH23390, los
receptores D1 aparecen localizados (en retinas de embriones de 12, 14 y 16 das, y
pollos de 3 das) a nivel de las capas plexiformes externa, interna y Capa Ganglionar
(Marques A. y Garcia De Mello F., 1990); es de hacer notar que las clulas amcrinas
colinrgicas establecen sus contactos sinpticos preferentemente a nivel de la capa
plexiforme interna, y los cuerpos de una parte de ellas se localizan en la capa ganglionar
(Baughman R. y Bader C., 1977).

l
 Los resultados aqu presentados, sin embargo, descartan el posible rol regulador de
la dopamina sobre el HAChT en los cultivos celulares de retina de embrin de pollo:
(a) El efecto inhibidor sobre el HAChT que tiene la estimulacin de los
receptores D1 con dopamina 100 M + IBMX 500 M, no es diferente al
obtenido al tratar los cultivos celulares con el solo IBMX, indicando que la
dopamina per se carece de algn efecto en este sentido. La probable
inactivacin de la dopamina por oxidacin o degradacin por la enzima
MAO fue descartada al usar cido ascrbico 100 M y atmsfera con CO2 al
5 %, lo que origina una leve acidificacin del medio y mediante el uso de
Pargilina. Adems la dopamina empleada en los experimentos siempre se
prepar pocos minutos antes de iniciarlos excluyndose la posible oxidacin
y degradacin de esta durante el almacenamiento en solucin.
(b) Tampoco se observ ninguna diferencia al emplear diferentes dosis de
dopamina, siendo esta, como se ha dicho, capaz de incrementar los niveles
de cAMP en forma dosis dependiente (De Mello M.C.F. et al., 1982).
(c) La ausencia de variaciones en la actividad HAChT con respecto a los
controles al tratar los cultivos celulares con antagonistas dopaminrgicos D1
(SCH23390) o D2 (Raclopride) indican la ausencia de un efecto regulador de
base, o tnico, de la dopamina sobre el HAChT a travs de de estos
receptores en uno u otro sentido. Tambin se descarta una posible accin de
base ejercida por la dopamina sobre HAChT a travs de sus receptores D2 (e
inhibicin de la adenilatociclasa) vista la ausencia de cambios de la
actividad del transportador en presencia de Raclopride.

Queda claro que las clulas amcrinas colinrgicas en la retina no son sensibles ni a
la estimulacin con dopamina ni al bloqueo de receptores dopaminrgicos D1 o D2, y
que por lo tanto no son dopaminoceptivas y no pueden ser reguladas por clulas
dopaminrgicas.

No obstante la retina forme parte del Sistema Nervioso Central (SNC) y los cultivos
celulares de retina de embrin de pollo constituyan un modelo adecuado para el estudio
de las interacciones celulares en el SNC (De Mello F. et al, 1990), estos resultados no

li
permiten de ninguna manera excluir la posibilidad de que en otras regiones del SNC la
dopamina pueda regular la funcin colinrgica a travs de mecanismos como el
hipotizado. Una posibilidad que cabe explorar es la de emplear otros modelos biolgicos
en los que hayan sido documentadas interacciones colinrgico dopaminrgico, tal
podra ser el caso de realizar experimentos de incorporacin de colina en rebanadas de
estriado de mamfero y caracterizar en estos el eventual efecto de la dopamina sobre la
actividad del HAChT.

En este trabajo se obtuvo un claro efecto inhibidor del IBMX 500 M sobre la
actividad del transportador en los cultivos tratados nicamente con esta metilxantina
inhibidora de las fosfodiesterasas, indicando que variaciones en los niveles
intracelulares de cAMP y la consiguiente activacin de PKA intervenan en la
regulacin de la actividad del HAChT. En 1997, Vogelsberg V. et al., propusieron la
regulacin de HAChT por cAMP y mecanismos de fosforilacin; estos resultados no
fueron confirmados ulteriormente y sobre todo el efecto del cido okadaico,
estimulando el HAChT, reportado por ellos fu posteriormente contradicho por varios
autores (Issa A. et al., 1996; Gates J. et al., 2004).

El potente efecto inhibidor de Forskolina, un activador de la adenilatociclasa, sobre

el HAChT (70 %) y adicionalmente el producido por un anlogo del cAMP resistente a
la fosfodiesterasa, confirman la hiptesis segn la cual el HAChT puede ser regulado
mediante fosforilacin PKA dependiente.

Estos resultados constituyen la primera demostracin de que la actividad del

HAChT es susceptible de ser tambin regulada por los niveles de cAMP y
fosforilacin inducida por PKA, produciendo un efecto similar al inducido por PKC
(Gates J. et al., 2004). Se plantea as la dplice regulacin, de la actividad del HAChT
por mecanismos de fosforilacin / defosforilacin, por PKC y PKA, caracterizados por
una disminucin de la actividad del transportador asociada a la activacin de estas
protena cinasas.

En el caso de fosforilacin por PKC, la activacin inducida con steres de forbol en

sinaptosomas de hipocampo y estriado de ratn, fue suficiente para reducir la expresin
del HAChT en la superficie celular (o de sinaptosomas) en aproximadamente un 30 %, y

lii
para reducir la actividad HAChT en porcentajes variables entre 33 % en hipocampo y
38 % en estriado (Gates J. et al, 2004). Los datos obtenidos en este trabajo en cuanto a
reduccin de la actividad HAChT va PKC son similares (30 %) a los reportados
previamente. Sin embargo al analizar el efecto aqu evidenciado, de la activacin de
PKA de mediante IBMX, Sp-cAMP y Forskolina + IBMX, sorprende el dato de que la
activacin de adenilatociclasa con Forskolina 40 M es capaz de producir una
inhibicin del 70 % en comparacin con la obtenida con solo IBMX 500 M (32 %), de
forma que el tratamiento con IBMX potencia el efecto de la Forskolina. El efecto
inhibidor descrito en la fosforilacin del HAChT mediada por PKC en sinaptosomas de
cerebro de ratn, no tiene la intensidad del efecto PKA dependiente demostrado aqu.
No se puede atribuir tal diferencia, al hecho de que en los experimentos de Gates J. et
al. hubieran empleado sinaptosomas y nosotros clulas ntegras ya que en este trabajo,
se estimularon cultivos celulares (idnticos a los usados en los experimentos con
forskolina) con Esteres de Forbol (-PMA y -PdBu) obtenindose inhibiciones de la
actividad HAChT del orden del 30 %, similares a las de Gates J. et al. Por otra parte,
puede descartarse la posibilidad de que el efecto se deba a causas inespecficas como la
citotoxicidad, visto que la concentracin de Forskolina fue la misma usada por Lankford
L., De Mello F. y Klein W., 1988 en cultivos celulares de retina de embrin de pollo de
igual etapa de desarrollo sin que se hayan reportado efectos txicos. Adems en
cultivos de clulas PC12 se observan incrementos dosis dependiente de cAMP tras
estimular los cultivos celulares con Forskolina hasta concentraciones de 75 M (Florio
C. et al., 1999). En todo caso, niveles elevados de cAMP se han asociado a un rol anti-
apopttico en retinas de rata recin nacida (Varella M. et al., 1999).

Una vez descartado que, en los cultivos celulares aqu empleados, la dopamina acte
como probable regulador de la actividad HAChT en los terminales colinrgicos a travs
del incremento de cAMP y la activacin de PKA, cabe explorar otros
neurotransmisores. Entre los diversos sistemas de neurotransmisin localizados a nivel
de retina, y que actan a travs de receptores acoplados a protena Gs, est la
Adenosina, que a travs de sus receptores A2 aparece como un posible (o uno de los
posibles) candidato (s) en la mediacin de este efecto. La Adenosina es una sustancia
neuroactiva en el SNC y abundante en retina, es capaz de promover incrementos de
cAMP en cultivos celulares de este tejido, al cabo de 24 horas de haber sido plaqueadas

liii
las clulas (E8C1), y puede captada y liberada muy tempranamente en dichos cultivos
(Paes R. et al., 2003).

En este trabajo la Adenosina 100 M + EHNA 10 M (un inhibidor de la Adenosina

Deaminasa) produjo una inhibicin promedio de la actividad del HAChT de un 14 %,
aproximadamente, en los cultivos celulares. Este resultado constituye la primera
evidencia de que la Adenosina es capaz de regular la actividad del HAChT. El EHNA
10 M no tuvo ningn efecto sobre el transportador al ser empleado solo, descartndose
cualquier efecto inespecfico atribuible a este.

La magnitud del efecto observado con Adenosina es, sin embargo, inferior a las
obtenidas con IBMX, cAMP o Forskolina. A este respecto cabe destacar que la
Adenosina acta en la retina no solo a travs de receptores acoplados a protenas Gs
(A2), pues a travs de los A1, por los que adems presenta mayor afinidad que por los
A2 (Nestler E., 2001), reduce los niveles de cAMP (Paes R. et al., 1992). En retina de
mamferos as como en la de pollo, la Adenosina endgena y los receptores A1 se
localizan nivel de la Capa Ganglionar y la Capa Plexiforme Interna, asocindose por
ende a neuritos y conexiones sinpticas que involucran a clulas amcrinas, bipolares o
ganglionares. No se puede descartar que la adenosina pueda haber interactuado con
receptores A1 en clulas amcrinas colinrgicas y que el efecto neto final observado
sobre la actividad del HAChT en este trabajo, podra en realidad atribuirse a la
sumatoria de dos efectos opuestos entre s, con cierta predominancia del efecto mediado
por los A2: es decir, no se puede aqu excluir que los diversos receptores de adenosina
podran estar activndose simultneamente. La posibilidad de discernir entre los efectos
de la Adenosina mediados por receptores A1 o A2 sobre el HAChT, permitira
profundizar en el rol de esta como regulador fisiolgico del terminal colinrgico: otros
autores (Santos F. et al., 1998), por ejemplo, han reportado disminucin de la liberacin
de [3H]-Acetilcolina estimulada con KCl tras haber tratado cultivos de retina de
embrin de pollo con Adenosina Deaminasa, logrando sin embargo revertir dicho efecto
mediante agonistas A1, a travs de mecanismos cAMP independientes. Por estas razones
se recomienda el tratamiento de los cultivos celulares con agonistas / antagonistas de los
receptores A1 y / o A2 durante la cuantificacin del efecto de la Adenosina sobre el
HAChT: un incremento del efecto inhibidor de la Adenosina en presencia de
antagonistas A1, por ejemplo, podra dar una medida ms precisa de la mxima

liv
capacidad de la Adenosina de regular el HAChT y de esta forma conseguir grados de
inhibicin similares a los obtenidos con Forskolina + IBMX..

En vista de estos resultados, tambin se puede plantear la posibilidad que en los

experimentos con IBMX (una metilxantina como la cafena) como inhibidor de las
fosfodiesterasas, este podra tambin haber actuado como antagonista de los receptores
A1, (Nestler E., 2001) produciendo dos efectos a la vez, uno impidiendo el catabolismo
del cAMP y el otro favoreciendo indirectamente la unin de la adenosina a los
receptores A2 (acoplados a Gs y activacin de PKA). Se recomienda por ello evitar el
empleo de metilxantinas para lograr inhibir las fosfodiesterasas y usar en este tipo de
experimentos el inhibidor Ro20-1724, especfico para la fosfodiesterasa de cAMP.

Resulta interesante el hecho de que los receptores para adenosina A2 y,

especficamente A2A, se expresan especialmente en ganglios basales (estriado dorsal, n.
accumbens), donde hay una gran presencia de neuronas (interneuronas) colinrgicas, en
las que la regulacin del HAChT a travs de estos receptores podra ser de gran
importancia fisiolgica y fisiopatolgica. Tal como se sugiri para la dopamina, pudiera
caracterizarse este efecto de la adenosina sobre el HAChT en modelos biolgicos
(rebanadas de estriado de rata) que permitan el estudio de la interaccin purino-
colinrgica a nivel de ganglios basales.

En los cultivos celulares de embrin de pollo ha sido demostrado que los AAEEs
pueden inducir cambios notables en marcadores presinpticos colinrgicos diferentes al
HAChT. Loureiro D.S. et al., 2001, aprovechando la alta resistencia de estos cultivos a
los efectos neurotxicos de los AAEEs, demostraron como la actividad de la ChAT
poda ser inhibida hasta en un 85 % tras mantener los cultivos celulares hasta por 16
horas en presencia de Kainato (150 M), Glutamato (1 mM) o AMPA (100 M),
aunque con este ltimo los autores reportan una inhibicin mxima inferior al 60 %.
Este efecto no se observ tras adicionarlos directamente en el homogenizado de las
clulas, requirindose as la integridad celular. Dicho efecto es especfico para las
clulas colinrgicas y no constituye un efecto de los AAEEs sobre las otras poblaciones
de clulas amcrinas, pues no afecta otros sistemas de neurotransmisin caractersticos
de estas clulas retinianas. Este efecto inhibidor de los AAEEs sobre la ChAT
demostr adems ser reversible y estar mediado tanto por receptores glutamatrgicos

lv
ionotrpicos como metabotrpicos de tipo-I, a travs de mecanismos que involucran a la
NO sintasa y se presentan como calcio dependientes, descartndose la participacin de
las vas de sealizacin celular ms comunes, como la fosforilacin. Tambin se ha
demostrado (Loureiro D.S. et al., 2002) como los AAEEs pueden participar en la
regulacin del VAChT, y ms especficamente que el Kainato (100 M por 5 horas) es
capaz de reducir la unin de [3H]-(-)Vesamicol (un indicador del funcionalismo del
VAChT) hasta en un 53 % en cultivos celulares agregados (E8C11) de retina de pollo.
Este efecto fue potenciado por el tratamiento previo de los cultivos con cido okadaico
(10 nM) y prevenido completamente con el tratamiento de los cultivos con un inhibidor
de PKC, el BIM (Bisindolylmaleimide hydrochloride; 200 nM), indicando que dicho
efecto era dependiente de la activacin de PKC. Las clulas amcrinas reciben
inervacin glutamatrgica desde las clulas bipolares y expresan receptores tanto
ionotrpicos como metabotrpicos (Duarte C.B. et al., 1998). El Kainato es capaz de
inducir en cultivos celulares de retina de embrin de pollo (E8C3-12) la produccin de IP3
y DAG, mediante mecanismos que requieren del calcio extracelular (Reis R. et al.,
1995) y por ende de activar PKC e inducir fosforilacin del VAChT y otras protenas.

En otro trabajo (Kritofikova Z. y Klaschka J., 1997) evidenciaron una disminucin

de la actividad HAChT en sinaptosomas de hipocampo de rata, inducida por AAEEs,
pero solo empleando concentraciones extremadamente altas (10 mM)de glutamato en el
medio y descartando (los mismos autores) que tal resultado pudiera reflejar eventos
fisiolgicos y atribuyndolo finalmente a un importante efecto neurotxico.

Los resultados aqu presentados demuestran que en cultivos celulares de retina de

embrin de pollo, tanto Kainato como Glutamato, en concentraciones que ya se han
demostrado no txicas en este modelo, promueven una significativa reduccin de la
actividad del HAChT. Como se seal ya, se realizaron paralelamente experimentos en
los que tras haber sometido a los cultivos celulares al tratamiento con los AAEEs por
perodos de 15 30 minutos, los mismos se mantuvieron hasta por un lapso de 24 horas
en el incubador, luego de haber retirado el glutamato o el kainato, al final se determin
la actividad HAChT encontrndose valores similares a sus pares control no tratados con
AAEEs; de esta forma se excluye que la neurotoxicidad y muerte celular sean la causa
de la reduccin de la actividad del transportador. El hecho de que la actividad del
HAChT haya sido determinada luego de retirar los AAEEs del medio y sustituir el

lvi
mismo antes de aadir la [3H]-Colina (Pre-Tratamiento), excluye la posibilidad de que
la despolarizacin inducida por los AAEEs (en caso de permanecer en el medio durante
la medicin de la actividad HAChT) promoviera la liberacin de la [3H]-Acetilcolina
neoformada a partir de la [3H]-Colina, con disminucin de la radioactividad intracelular
y obtencin de una falsa baja actividad del HAChT.

Este resultado, aunque novedoso, de alguna manera no debera representa una

sorpresa visto el efecto de regulacin en sentido inhibitorio que diversos trabajos han
venido atribuyendo a los AAEEs sobre los otros marcadores colinrgicos presinpticos,
y especialmente a nivel de retina. El hecho de que los AAEEs reduzcan tambin la
actividad del HAChT cuya actividad es la etapa limitante en la sntesis de acetilcolina
pareciera indicar un patrn de regulacin en sentido negativo del sistema glutamatrgico
sobre el funcionalismo colinrgico. Si este patrn es exclusivo de la retina o representa,
por el contrario, un modo de interaccin presente en otras regiones del sistema nervioso
representa una interrogante de suma importancia.

Un probable mecanismo a travs del cual los AAEEs podran producir este efecto
es el de la activacin de PKC: ya sea a travs de receptores metabotrpicos (mGlurs tipo
I) o ionotrpicos (tipo AMPA /KA). Como se ha visto, la fosforilacin de HAChT por
PKC inducida con steres de forbol en sinaptosomas de cerebro de rata (o en cultivos
celulares de retina, como se ha demostrado aqu) induce disminucin de la actividad del
transportador. Esta disminucin de la actividad de HAChT ocurrira, en base a las
evidencias ms recientes (Ribeiro F. et al., 2003; Ferguson S. et al., 2003; Gates J. et
al., 2004; Ribeiro F. et al., 2005) por un proceso de endocitosis dependiente de clatrina
(regulado y activado probablemente por la fosforilacin del HAChT) que requiere de la
integridad de un dominio di-leucina ubicado en la porcin carboxi-terminal del HAChT.
No pueden, sin embargo, excluirse otros posibles mecanismos a travs de los cuales los
AAEEs podran reducir la actividad del HAChT: hay evidencias de que los receptores
glutamatrgicos metabotrpicos tipo I al ser activados pueden, adems de producir
incrementos de IP3 y calcio intracelular, tambin estimular la produccin de cAMP en
algunos tipos de clula (Hoffpauir B. y Gleason E., 2002) Es necesario, para establecer
con claridad el modo en que este efecto ocurre y la importancia de los diversos tipos de
receptor involucrados, emplear diversos agonistas y antagonistas de los receptores
glutamatrgicos, as como la caracterizacin del efecto de los AAEEs sobre el HAChT

lvii
en presencia de inhibidores de PKA (H-89, por ejemplo) y PKC (Staurosporina).
Tambin se hace necesario evaluar este efecto en otras regiones del SNC y verificar si
estos resultados pueden ser extrapolados a estas. En este trabajo se propone un modelo
de regulacin del HAChT por parte del cAMP similar al descrito anteriormente para la
regulacin va PKC. Figura 11.

Figura 11. Esquema del probable mecanismo de reduccin de la

actividad del HAChT dependiente de cAMP PKA (C = unidades
catalticas de PKA; R = unidades regulatorias de PKA. HAChT=color
naranja; AC=adenilatociclasa).
Es necesario tambin involucrar al PACAP (Polipptido Activador de la
Adenilatociclasa Pituitaria). Este es un pptido de 38 aminocidos, aislado por primera
vez en extractos de hipotlamo ovino por su capacidad de estimular la produccin
hipofisiaria de cAMP. Pertenece a la Superfamilia de pptidos que conforman el VIP
(Polipptido Intestinal Vasoactivo), Glucagn, GRH (Hormona liberadora de
Somatotropina) y la Secretina (Vaudry D. et al., 2000) El PACAP es un pptido
neuroactivo, con amplia distribucin en el sistema nervioso y tambin en la retina,
donde se ha localizado (en rata) particularmente a nivel del cuerpo celular de Clulas
Ganglionares. Los receptores del PACAP estn acoplados a protenas G y desde un
punto de vista farmacolgico se dividen en 2 clases: Tipo-I: (PAC-1) especficos para
PACAP, cuya activacin se asocia a incremento de la produccin de cAMP, activacin

lviii
de Fosfolipasa C y movilizacin de calcio; y los Tipo-II: (VPAC1 y VAC2) activados
por PACAP y por VIP, acoplados a la adenilatociclasa, capaces de incrementar la
produccin de cAMP. En la retina de pollo se han caracterizado recientemente dos
tipos: PAC1 y VPAC (Carrazzoni J. et al., 2005). Las retinas de embriones de 6 das ya
son capaces de expresar PAC1, (acoplados a la adenilatociclasa): a partir de los 8 das
PACAP a la concentracin de 10 nM es capaz de promover incrementos de hasta 10
veces en la produccin de cAMP, capacidad que se mantiene hasta los 12 das de edad
para sucesivamente disminuir hasta los 16 das, edad en la que PACAP solo es capaz de
promover un incremento de 2 veces en los niveles de cAMP. Mediante
inmunohistoqumica ha sido recientemente demostrado que en retinas de embrin de
pollo PACAP se localiza en los cuerpos de clulas amcrinas en la Capa Nuclear
Interna, y en la Capa Plexiforme Interna, donde se evidencia mediante microscopa
confocal co-localizacin con la inmunoreactividad para la enzima Tirosina Hidroxilasa
(TH), marcador de clulas dopaminrgicas en la retina, en las que PACAP sera un
factor importante en sostener la expresin de esta enzima (y desarrollar por completo el
fenotipo dopaminrgico).

Sera interesante, vistas la ubicacin de la inmunoreactividad para PACAP (a nivel

de Capa Plexiforme Interna y Capa Nuclear Interna), as como las caractersticas
funcionales de sus receptores: capaces de incrementar tanto los niveles de cAMP
(activando PKA) como de activar la Fosfolipasa C (y activar va DAG la PKC), estudiar
el efecto de este neuropptido sobre la actividad del HAChT y, en general, sobre la
expresin de los diversos marcadores colinrgicos en la retina de pollo.

Vistos en su conjunto, los resultados obtenidos en el presente trabajo constituyen

evidencia de que, al menos en el tejido retiniano, otros neurotransmisores (AAEEs,
Adenosina) pueden intervenir en la regulacin del funcionalismo del terminal
colinrgico a travs de cambios en la actividad del HAChT mediados por fosforilacin.
Es necesario, sin embargo, continuar explorando la posibilidad de que otros sistemas,
como el de PACAP, estn involucrados en la regulacin heterloga del terminal
colinrgico tanto en retina como en otras regiones del SNC. Una mayor comprensin de
los fenmenos fisiolgicos que regulan la actividad colinrgica, probablemente sea la
herramienta ms til para entender y tratar las diversas afecciones del Sistema Nervioso
en los que el sistema colinrgico est involucrado.

lix
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 RESUMEN CURRICULAR DEL AUTOR

APELLIDOS: Garay Flores

NOMBRES: Jos Lorenzo

NACIONALIDAD: Venezolana
LUGAR Y FECHA DE NACIMIENTO:
Puerto Cabello (Venezuela) 18 de Septiembre de 1965.

ESTUDIOS REALIZADOS:

- Secundaria
o Institucin: Colegio San Vicente de Pal. Barquisimeto. Venezuela.
o Ao: 1977 1982.
o Ttulo: Bachiller en Ciencias.

- Universitarios
o Institucin: Universidad de los Estudios de Papua, Facultad de
Medicina y Ciruga. Italia.
o Ao: 1983-1989
o Ttulo: Doctor en Medicina y Ciruga
o Nota obtenida: Mxima de Calificaciones y Matrcula de Honor

- Otros Estudios
o Maestra en Fisiologa (en curso actualmente). UCLA. Venezuela.
o Curso de Capacitacin Pedaggica. UCLA. Venezuela. Aprobado (225
horas).

- Cargo Actual
o Profesor de Fisiologa (Agregado) en la Universidad Centroccidental
Lisandro Alvarado Desde el 01 07- 1994.

- Trabajos recientes (relacionados con la lnea de Investigacin):

Posible rol regulador de PKA sobre el Transportador de colina de alta afinidd

en cultivos celulares de retina. (2004) 54 Convencin anual de AsoVAC.
Venezuela.

Regulacin del Transportador de Colina de lata afinidad por Aminocidos

excitatorios en cultivos celulares de retina. (2004) 54 Convencin anual de
AsoVAC. Venezuela.

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