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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas


Departamento de Microbiologa
Laboratorio de Gentica Microbiana

Prctica 1 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE DNA


CROMOSMICO DE UN MICROORGANISMO Gram -
PROFESORES: Equipo 3 Seccin 1 5QV1

Mora Ramirez Sergio Estrada Linarez Marlen


Salvador
Del Toro Martnez Luis David
Esteva Garca Martha Elena
Gamboa Contreras Alain
Gmez Guzman Octavio
Espaol Espaol Francisco

INTRODUCCIN
El DNA es una biomacromolcula que contiene informacin, la cual dirige
el funcionamiento de las clulas y que se transmite a la progenie.
Consiste en una secuencia especfica de bases nitrogenadas.
El DNA est formado por dos cadenas de polinucletidos enrrolladas una
alrededor de la otra para formar una doble hlice. Cada nucletido,
monmero del DNA est formado por una base nitrogenada (prica o
pirimdica), un azcar (desoxirribosa) y fosfato. Los mononucletidos
estn unidos mediante enlaces fosfodister. Estos enlaces unen el grupo
5hidroxilo de la desoxirribosa de un nucletido con el grupo 3 hidroxilo
de otro nucletido mediante un grupo fosfato. La orientacin
antiparalela de las 2 cadenas de polinucletidos permite que se formen
enlaces de hidrgeno entre las bases nitrogenadas que estn orientadas
hacia el interior de la hlice, considerando as 2 clases de apareamiento
de bases en el DNA: adenina (purina) se aparea con la timina
(pirimidina) mediante 2 puentes de hidrgeno, y la guanina (purina) se
aparea con la citosina (pirimidina) mediante 3 puentes de hidrgeno.
El DNA es una molcula relativamente inerte desde el punto de vista
qumico, contribuyendo a la estabilidad de su estructura helicoidal
diversas clases de enlaces no covalentes:
1. Interacciones hidrofbicas El agrupamiento de los componentes
de las bases de los nucletidos dentro de la doble hlice es un
factor estabilizador en la macromolcula tridimensional debido a
que minimiza sus interacciones con el agua.
2. Enlaces de hidrgeno El efecto cremallera acumulativo de los
puentes de hidrgeno formados entre las bases nitrogenadas
mantiene a las cadenas en la orientacin complementaria
correcta.
3. Apilamiento de bases Una vez que las cadenas antiparalelas se
han acercado mediante apareamiento de bases, el apilamiento
paralelo de las bases heterocclicas aproximadamente planas
estabiliza las molculas debido al efecto acumulativo de fuerzas
de Van der Waals.
4. Interacciones eletrostticas La superficie externa del DNA que se
denomina esqueleto azcar fosfato, posee grupos fosfato de carga
negativa. La repulsin entre los grupos fosfato cercanos se
minimiza por los efectos de cationes divalentes y molculas
policatinicas1
En clulas procariticas el DNA est localizado en un nucloide que no
est separado del resto de la clula por una membrana.
El aislamiento de DNA es una tcnica esencial en biologa molecular que
se ha vuelto muy importante con la demanda en incremento de
construccin de genomas, secuenciacin y anlisis PCR en laboratorios
de investigacin. El aislamiento es el primer paso en el estudio de
secuencias especficas de DNA, en el anlisis estructural del genoma y la
expresin de genes. La cantidad, calidad e integridad del DNA afectar
directamente estos resultados.
El propsito de aislar DNA es separarlo del resto de componentes
celulares, resultando en una preparacin homognea que represente la
informacin gentica completa contenida dentro de una clula2.
Para aislar este componente macromolecular de clulas bacterianas se
deben cumplir 3 aspectos generales:
1. Romper de manera eficiente tanto la pared celular, como la
membrana de la bacteria.
2. Trabajar bajo condiciones que inhiban enzimas degradativas como
las nucleasas liberadas durante la ruptura de la clula.
3. Emplear un procedimiento fraccionario que separe el DNA de otros
componentes celulares, en una pureza y rendimiento
3
satisfactorios .
Una vez obtenido el DNA es importante caracterizarlo y determinar el
rendimiento mediante espectrofotometra. Una caracterstica del DNA es
que absorbe luz en el rango ultravioleta a 260 nm y se puede estimar su
concentracin en esta longitud de onda.
Para estimar la pureza del DNA se considera una proporcin de la
absorbancia a 260 nm y 280 nm o 230 nm, que es en donde absorben
luz las protenas y los enlaces peptdicos respectivamente. Esta
proporcin debe ser cercana a 1.8 para que se considere un DNA puro4.

OBJETIVOS

Aislar DNA cromosmico de una bacteria Gram .

Caracterizar el DNA aislado estableciendo su espectro de


absorcin.

Determinar la concentracin y el grado de pureza del DNA


obtenido.
Analizar la influencia de algunos factores que influyen sobre la
temperatura de fusin del DNA empleando el programa
bioinformtica DNA MAN.

METODOLOGA

Se realizaron las siguientes modificaciones en el protocolo de las


pginas 4 y 5 del manual de Experimentos en gentica microbiana:
- Se adicionaron 5 L de RNAsa a la suspensin de clulas de E. coli.
- La emulsin de clulas lisadas y fenol se centrifug a toda la
velocidad de la centrfuga durante 10 minutos.
- Se adicionaron 1000 L de etanol absoluto frio a la fase acuosa
que se obtuvo despus de centrifugar el sobrenadante sin
protenas con la mezcla cloroformo-alcohol isoamlico (24:1).
- El DNA aislado se disolvi en 50 L de agua destilada estril.
- Se utilizaron 3 L de la solucin de DNA aislado para obtener las
lecturas de absorbencia en el NanoDrop.

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN Y PUREZA DE LA


SOLUCIN DE DNA AISLADO

Concentracin de cadena sencilla de DNA

As260 nm Dnde:
c
Ae b c = Concentracin (g/mL)

Ae = ndice de absorcin especfica (22,500 para el DNA)


7.99
c
22500 1

c3.551 x 10 4 gmL Concentracin de cadena sencilla


1 g ----- 1x10-6 g/mL de DNA: 355.111 g/mL
3.551x10-4 g ----- ____ g/mL

Concentracin de DNA de doble cadena

1 unidad de As260 nm de 50 g/mL de DNA de


= doble cadena
DNA de doble cadena

7.99 unidades de As260 nm ___ g/mL de DNA de Concentracin de DNA de doble


de DNA de doble cadena = doble cadena cadena: 399.5 g/mL

Pureza de la solucin de DNA

A s260 nm 7.99 Pureza de la solucin de


Pureza Pureza DNA aislado = 1.77
As 280nm 4.5
A s260 nm
Pureza 7.99 Pureza de la solucin de
As 230nm Pureza
6.10 DNA aislado = 1.31

RESULTADOS

Tabla 1. Lecturas de absorbencia a diferentes longitudes de onda de la


solucin de DNA aislado de la cepa W3350 de E. coli

Longitud de Absorbancia Longitud de Absorbancia


onda (nm.) onda (nm.)
230 6.10 270 6.87
240 6.01 280 4.5
250 7.3 290 2.12
260 7.99 300 0.64
8.6
8.1
7.6
7.1
6.6
6.1
5.6
5.1
4.6
Absorbancia
4.1
DNA aislado DNA nativo
3.6
3.1
2.6
2.1
1.6
1.1
0.6
225 235 245 255 265 275 285 295 30

Longitud de onda (nm.)


Figura 1. Espectro de absorcin de la concentracin de cidos nucleicos de la solucin de DNA aislado a partir de la
cepa W3350 de E. coli.

Tabla 2 Influencia de la variacin en el % de Guanina Citosina en la


Tm.
Secuencia %GC Tm
TATAAATATTTAATTAATTT 0% 37C
TCCCAGTACGATTCACTAGG 50% 55.3C
GGGCCCGCGGCCCGCGCCGG 100% 88.2C

Tabla 3 - Influencia de la variacin en la secuencia de nucletidos en la


Tm.
Secuencia %GC Tm
GATCGTCAGTCAGTCAGTCAGATCGTCAGTCAG 50% 78.6C
TCAGTCA
GGAACCTTCCGGAATTCCGGAATTCCGGAATT 83.5C
CCGGAATT
GGGGAAAATTTTCCCCTTTTGGGGAAAATTGG 82.9 C
AACCCCCC

Secuencia %GC Tm Nm. De


nucletid
os
GCTAGCTAGCTAGCTA 50% 40.4C 16
GCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTA 50% 55.9C 24
GCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCT 50% 63.8C 32
A
Tabla 4 Influencia de la variacin en la secuencia de nucletidos en la
Tm.

1.24

1.19

1.14

Absorbancia a 260 nm 1.09

1.04

0.99

0.94
65 70 75 80 85

Temperatura C

Figura 2 Grfico de desnaturalizacin del DNA

DISCUSIONES

Posterior a la obtencin de DNA cromosmico, el factor ms importante


a conocer es la concentracin y la pureza del mismo, determinndolo
por un mtodo espectrofotomtrico en el rango de luz ultravioleta. El
pico de absorbancia mximo del DNA estndar se encuentra a 260
nm, variando de un DNA a otro DNA. La absorcin en el rango de luz
ultravioleta es una propiedad de las bases pricas y pirimdicas, as que
el pico de absorbancia mximo de un DNA en particular depende de su
composicin de bases5. Cada una de las bases nitrogenadas tiene su
propio espectro de absorcin, por tanto contribuyen de manera diferente
a la propiedad total de absorcin de luz UV de una molcula de DNA6.

Como se observa en la figura nmero 1, el espectro de absorcin de DNA


se construy en el rango de longitudes de onda de 230 a 300 nm,
teniendo puntos muy importantes dentro del espectro, como el valor de
absorbancia a 230 nm que corresponde al pico de absorcin de los
enlaces peptdicos, a 260 nm que corresponde al pico de absorcin del
DNA y a 280 nm, que corresponde al pico de absorcin de las protenas,
todos estos datos brindados por el equipo NanoDrop.

Observando el espectro de absorcin del DNA aislado, podemos notar


que el pico de absorcin mxima se encuentra a 260 nm y que, adems
hay valores de absorcin en 230 nm y 280 nm, lo que indica la presencia
de protenas y enlaces peptdicos. Contrastando el espectro obtenido
con el reportado en bibliografa, se puede observar que el espectro
obtenido sigue la misma tendencia que el reportado, adems en los 2
espectros se nota la absorcin mxima a 260 nm, y valores de
absorbancia a 230 y 280 nm, por lo que se puede suponer que la
molcula aislada efectivamente fue DNA con lo que respecta a
caracterizacin. Del espectro reportado en bibliografa, es pertinente
destacar que la presencia de protenas y enlaces peptdicos se
contempla dentro del mismo, siendo de esta manera relativamente
normal que en el aislamiento de DNA se encuentren tanto protenas
como enlaces peptdicos sin que afecten la forma del espectro7.

En lo que respecta a la concentracin del DNA aislado, como se observa


en la seccin Determinacin de concentracin y pureza de la solucin
de DNA aislado se realizaron 2 clculos diferentes para conocer la
cantidad de DNA obtenida. En ambas frmulas se utiliza el valor de
absorbancia a 260 nm como eje central. En la primer forma para calcular
se utiliz el valor de ndice de absorcin especfica, obteniendo un valor
de 355.111 g/ml de DNA de cadena sencilla, y en la segunda forma se
utiliz una proporcin de 50 microgramos de DNA por cada unidad de
absorbancia, obteniendo un valor de 399.5 g/mL de DNA de doble
cadena. El equipo NanoDrop entreg un valor de concentracin de DNA
en solucin y corresponde al obtenido por la proporcin, esto debido a
que en la proporcin se especifica que el valor de la concentracin que
se calcula es de DNA de doble cadena, lo que no especifica la primer
frmula.

Continuando con la determinacin de pureza, se realizaron 2 relaciones;


una de absorbancia a 260 nm con respecto a la absorbancia a 280 nm y
otra de la absorbancia a 260 nm con respecto a la absorbancia en 230
nm. La pureza que se obtuvo a partir de la relacin As 260/As230 fue menor
a la esperada (2.0), lo que indica que las lecturas de absorbancia que
se registraron en el NanoDrop corresponden a la luz que absorbieron
tanto el DNA cromosmico, como contaminantes que probablemente
quedaron presentes en la solucin (pptidos, fenol, protenas,
compuestos aromticos, etc.). Lo anterior explica que, aunque la
concentracin de DNA aislado fue alta, la pureza que se determin no
fue la ptima. La pureza que se obtuvo de la relacin As 260/As230 fue de
1.31 por lo tanto, suponemos que la solucin de DNA aislado estaba
contaminada por pptidos y compuestos aromticos que tienen una
absorbancia alta a 230 nm8.
En el caso de la pureza que se obtuvo por la relacin As 260/As280 fue de
1.77, menor a la esperada (>1.8) lo que indica que tambin hay
presencia considerable de protenas 9 (las cuales tienen un mximo de
absorbancia a 280 nm por los aminocidos aromticos: triptfano,
fenilalanina y tirosina). Uno de los errores que se identificaron fue que
en la fase de desproteinizacin se adicion un volumen menor de fenol
del que est indicado en el protocolo.

Utilizando el programa bioinformtico DNA-Man, se disearon 9


oligonucletidos como se observa en las tablas 2,3 y 4, con el fin de
analizar diversos factores que afectan en el valor de Tm del DNA.

Con respecto al efecto del % de G+C en el valor de Tm, se percibe que,


al aumentar la cantidad de guanina y citosina en la cadena, aumenta la
temperatura de fusin. Esto suena lgico, debido a que entre G y C se
forman 3 puentes de hidrgeno y al verse aumentada su presencia en la
cadena, se ver aumentado el nmero de puentes de hidrgeno, por lo
que se requerir una mayor cantidad de energa para romper estos
enlaces.

En tanto al efecto de la variacin en la secuencia de nucletidos (Tabla


3) se observan cambios muy pequeos de uno o 2 grados, requiriendo
una mayor temperatura de fusin cuando la guanina y citosina se
localizan en la parte media de la secuencia de nucletidos. El
incremento de la temperatura de fusin se debe a la distribucin de G y
C en la cadena. En las regiones ricas en G y C, al estar apilados los
dmeros de G y C interaccionan mejor hacindose ms estables 10 y por lo
tanto la temperatura requerida para separar las cadenas de DNA ser
mayor.

Finalizando con el efecto de la longitud de la cadena (Tabla 4) La


temperatura de fusin de las cadenas va en aumento a medida que su
longitud crece debido a que aumenta la cantidad de puentes de
hidrgeno, tanto como los formados entre Adenina y Timina, como los
formados entre Guanina y Citosina, lo que implica suministrar una
cantidad mayor de energa para separar las 2 hebras de DNA.
En la ltima parte de esta prctica se dise una grfica de
desnaturalizacin del DNA. Siguiendo las indicaciones del artculo se
construy esta grfica de forma sigmoidal. En la parte media cuenta con
una parte recta que significa el aumento de absorbancia en alrededor
del 35%, abarcando aproximadamente 4 grados, que es el efecto
hipercrmico. Este efecto ocurre debido a que al romperse los puentes
de hidrgeno de la mitad de la molcula, las bases pricas y pirimdicas
quedan expuestas, aumentando la interaccin materia energa y por
tanto aumentando la absorbancia. A partir de esta grfica se calcula la
Tm, la cul no se calcul por efectos del programa informtico utilizado
que impide interpolar en una grfica sigmoidal. Si no que por lo contrario
los realizamos juntos en el saln.
CONCLUSIONES
La molcula aislada y caracterizada por espectrofotometra UV es
DNA.
La concentracin de la solucin de DNA aislado de doble cadena
fue de 399.5 g/mL y la pureza de 1.77.
La temperatura media de fusin se ve alterada por la distribucin
de la guanina y citosina en la secuencia de nucleotidos.
La temperatura de fusin depende del contenido de guanina
citosina en una cadena, de manera directamente proporcional.
Entre ms larga sea una secuencia de nucletidos, mayor ser su
valor de Tm.
La curva de desnaturalizacin del DNA es de forma sigmoidal y en
su parte recta muestra el efecto hipercrmico.

REFERENCIAS

1 McKee Trudy, 2003, Nucleic acids en Biochemistry, the molecular


basis of life, 3 edicin, McGraw Hill, captulo 17, pp 564-567

2- Surzycki Stefan, General aspects of DNA isolation and purification en


Basic techniques in molecular biology, captulo 1, pp 1-2

3 Isolation of bacterial DNA [internet] [Acceso el da 10 de Septiembre


de 2016] disponible en:
http://www.chem.uky.edu/courses/che554/5_MolBio/DNAisolationChpt19.
pdf

4 Alejos Velzquez Laura Patricia, Extraccin y purificacin de DNA


[internet] [Acceso el da 10 de Septiembre de 2016] disponible en:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf

5 Determination of DNA concentration and purity by ultraviolet


spectrophotometry [internet] [Acceso el da 10 de Septiembre de 2016]
disponible en:
https://people.rit.edu/rhrsbi/GEPages/LabManualPDF5ed/09%20UV
%20Absorption.pdf

6 Cuantificacin de oligonucletidos y cidos nucleicos por


espectroscopa UV [internet] [Acceso el da 10 de Septiembre de 2016]
disponible en: http://www.ibt.unam.mx/sintesis/cuantificacion.html
7 Spectrophotometry of DNA [internet] [Acceso el da 10 de
Septiembre de 2016] disponible en:
http://www.csus.edu/indiv/r/rogersa/quant3.pdf

8 - Elosegi A. Conceptos y tcnicas en ecologa fluvial. Fundacin BBVA,


2009 pp. 190

9 - Surzycki Stefan, General aspects of DNA isolation and purification en


Basic techniques in molecular biology, captulo 1, pp 24

10 - Thomas M. Devlin. Bioqumica: Libro de Texto con Aplicaciones


Clnicas, Volumen 2. Reverte, 2000. Pp. 579

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