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5-6, julio-diciembre de 2014


ISSN 2314-2901 / revistasns@senasa.gov.ar

PRODUCCIN NACIONAL DE PECTINASAS DE ORIGEN FNGICO Y SU


APLICACIN AL PROCESAMIENTO FRUTIHORTCOLA

NATIONAL PRODUCTION OF PECTINASE FROM FUNGAL ORIGIN AND ITS


APPLICATION TO FRUIT AND VEGETABLE PROCESSING

Mara Luisa Franchi (Escuela de Produccin, Tecnologa y Medio Ambiente Sede Alto Valle de la Universidad
Nacional de Ro Negro), Dante Fratebianchi de la Parra (Centro de Investigacin y Desarrollo en Fermentaciones
Industriales [CINDEFI, CONICET La Plata, UNLP]), Graciela Noem Pose (Escuela de Produccin, Tecnologa y
Medio Ambiente Sede Alto Valle de la Universidad Nacional de Ro Negro) y Sebastin Fernando Cavalitto (Cen-
tro de Investigacin y Desarrollo en Fermentaciones Industriales [CINDEFI, CONICET La Plata, UNLP])

Resumen Abstract

En la Argentina no existe prcticamente produccin In Argentina there is practically no enzyme production


de enzimas a escala industrial, en su mayora se on an industrial scale, mostly they are imported,
importan, y esto influye directamente sobre los costos directly influencing production costs.
de produccin.
Concerning enzymes, pectinases are responsible for the
Respecto de las enzimas, las pectinasas son responsables degradation of pectin, a complex heteropolysaccharide,
de la degradacin de la pectina, un heteropolisacrido which is in the middle lamella and primary wall of the
complejo, que se encuentra en la lmina media y young plant cells.
primaria de las paredes de las clulas vegetales jvenes.
The country has frutihortcolas regions of excellence.
En el pas hay regiones frutihortcolas de excelencia. These productions generate a whole branch of
Estas producciones generan toda una rama de related industries, such as cider, juicers, wineries,
industrias relacionadas, como sidreras, jugueras, sweets, vegetable processors; where pectinases are a
bodegas, fbricas de dulces, elaboradoras vegetales, fundamental factor in the production process and its
etctera, en las cuales las pectinasas son un factor implementation in the reuse of the large amounts of
fundamental en el proceso de produccin, como by-products produced during processing.
tambin su aplicacin en la reutilizacin de las grandes
cantidades de subproductos que generan durante el Thus, the objective of our work is to produce
procesamiento. national pectinase of fungal origin and evaluate their
application to different fruit and vegetable processing.
As, el objetivo de nuestro trabajo fue producir pectinasas At the Research and Development Center for Industrial
nacionales de origen fngico y evaluar su aplicacin Fermentations (CINDEFI) has achieved the production
en los diferentes procesamientos frutihortcolas. En el of three polygalacturonases expressed by Aspergillus
Centro de Investigacin y Desarrollo en Fermentaciones kawachii(PG1),Geotrichum klebahnii(protopectinase
Industriales (CINDEFI) se ha logrado la produccin SE) andAspergillus sojae(PGzyme), and in the School
de tres poligalacturonasas expresadas porAspergillus of Production, technology and Environment Rio
kawachii(PG1), Geotrichum klebahnii (Protopectinasa Negro National University (UNRN) is studied its
SE)y porAspergillus sojae(PGzyme), y en la Escuela potential application to different fruit and vegetable
de Produccin, Tecnologa y Medio Ambiente Sede processing such as pectin extraction, tissue maceration
Alto Valle de la Universidad Nacional de Ro Negro and clarification of juices and wines.
(UNRN) se estudia su potencial aplicacin a los
diferentes procesamientos frutihortcolas, como por Keywords: pectinases, pectin extract, tissue maceration,
ejemplo la extraccin de pectina, la maceracin de fruit and vegetable products.
tejidos y la clarificacin de jugos y vinos.

Palabras clave: pectinasas, extraccin de pectina,


maceracin de tejidos, productos frutihortcolas.

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Introduccin Estos microorganismos producen diferentes enzimas


en respuesta a las diferentes condiciones de crecimiento
Las enzimas son protenas cuya funcin biolgica es dadas. En la Argentina no existe una importante
catalizar las reacciones que suceden en las clulas. produccin de enzimas a escala industrial, son
Estas protenas tienen aplicaciones desde tiempo principalmente importadas.
remotos y actualmente son utilizadas por numerosas
industrias. La tecnologa enzimtica se presenta como
una alternativa biotecnolgica basada en el desarrollo
de productos de calidad homognea, ptimo
Aplicaciones de las enzimas pcticas
aprovechamiento de materias primas, celeridad en Las pectinasas poseen varias aplicaciones en diversas
procesos de produccin, disminucin de desperdicios industrias. La industria que ms se ha beneficiado con
y del deterioro del medio ambiente. La principal ellas es la alimentaria, particularmente la industria
ventaja que ofrece la aplicacin de las enzimas en procesadora de frutas y vegetales.
los procesos industriales se basa en su alto grado de
especificidad y adaptabilidad, volviendo los procesos El uso ms antiguo y an hoy ms difundido es,
ms eficientes, menos costosos y ms amigables con el junto con otro tipo de enzimas, en la optimizacin
medio ambiente. de los procesos de filtracin y clarificacin de jugos
(manzana, uva) (Kashyapet al., 2001).

La accin de estas enzimas sobre protopectina permite


Pectina su aplicacin para la extraccin de pectina de los
dems componentes del tejido vegetal, para la posterior
Entre los principales constituyentes de la pared celular
purificacin del producto, el cual es un aditivo
de los vegetales se encuentran las sustancias pcticas,
alimenticio altamente utilizado como gelificante y
una mezcla de polmeros cidos y neutros muy
estabilizante (Contreras Esquivelet al., 1997; Zapata
ramificados, denominadas genricamente pectinas.
Zapata et al., 2008). Adems, esta accin permite la
Los polmeros de dichas sustancias se caracterizan
maceracin de los tejidos vegetales (Nakamuraet al.,
por contener una alta proporcin de residuos de cido
1995; Zapata Zapata et al., 2007), cuyo objetivo es
galacturnico y son, probablemente, los polisacridos
producir pulpas de frutas y vegetales para ser utilizadas
de pared de mayor complejidad estructural.
como ingredientes en alimentos, fundamentalmente
Debido a la gran complejidad qumica de la pectina y para bebs y ancianos.
a su abundancia en la naturaleza, los microorganismos
En cuanto a la extraccin de pectina cabe destacar que
poseen una gran variedad de enzimas capaces de
la utilizacin de los mtodos convencionales consiste en
degradarla de alguna forma a fin de metabolizarla.
una hidrlisis cida y en caliente de la materia prima;
aunque lleva consigo algunos inconvenientes, como
manejo de altas temperaturas y reactivos altamente
Enzimas pcticas corrosivos, que deterioran los equipos y generan
problemas de contaminacin (Sakai et al., 1993).
Las enzimas que degradan pectina, llamadas
Por ello, es importante el diseo de la utilizacin de
comnmente pectinasas, constituyen un heterogneo
tratamientos alternativos, por ejemplo los enzimticos
y complejo sistema cataltico. Estas enzimas
mencionados anteriormente.
rompen los polisacridos complejos de tejidos
de la planta en molculas ms simples como son Por otra parte, se han usado diferentes tcnicas de
los cidos galacturnicos (Kashyap et al., 2001). maceracin, entre las cuales la maceracin enzimtica
Las poligalacturonasas (PGasas) hidrolizan cido tiene gran importancia, ya que permite la obtencin de
poligalacturnico sin esterificar (cido pctico o clulas independientes que conservan en gran medida
pectato) o esterificado con diferentes grados de su integridad (Biekman, 1992). De este modo, se espera
metoxilacin (Duvetteret al., 2009). Algunas de estas que dichas clulas conserven muchos de sus compuestos
enzimas pcticas son capaces de atacar la protopectina, intracelulares, entre los cuales se cuentan carotenoides,
la estructura insoluble presente en la pared celular vitaminas (C, B6, B9 y E) y compuestos fenlicos
del tejido vegetal, liberando al medio fragmentos de (flavonoides, cinamatos y taninos) (Aranceta, 2003).
pectina de alto peso molecular, a estas se las denomina Todos estos compuestos poseen beneficios directos sobre
protopectinasas (PPasas) (Sakaiet al., 1993). la salud y se ha comprobado que muchos de ellos tienen
una importante actividad antioxidante. Los fenmenos
La fuente principal de produccin de las pectinasas son
oxidativos pueden ocasionar rancidez en los alimentos
los hongos (principalmente del gnero Aspergillus).

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y prdidas en su almacenamiento, as como daos Luego de un perodo de acumulacin de biomasa en


directos a la salud humana, promoviendo diferentes batch alimentado con glucosa como nica FCE, los
tipos de enfermedades crnicas (cncer, enfermedad cultivos se indujeron mediante la alimentacin del
de Alzheimer, enfermedades cardiovasculares, etc.), mismo medio con el agregado de galactosa (inductor
adems de aceleracin en los procesos normales de del promotor Gal1 del pYES2).
envejecimiento (Choksi et al., 2004). Los procesos
de maceracin qumica o mecnica provocan un alto Se estudi la expresin realizando dos perfiles de
rompimiento celular, lo que implica que las propiedades alimentacin cambiando la concentracin de glucosa
nutritivas de los tejidos se ven afectadas negativamente. y dos perfiles de induccin cambiando la velocidad de
flujo. Se aliment con 100g/l y con 300g/l de glucosa
a un flujo de 26ml/h y se indujo alternativamente
con100g/l de glucosa y 50g/l de galactosa a una
Objetivos
velocidad de 9ml/h y 27ml/h, respectivamente.
En este marco, y considerando que el mercado de las
La expresin de la PPasa SE de G. klebahnii se
enzimas ha tenido gran crecimiento desde los aos
estudi desarrollando sistemas de cultivos de tipo
setenta y que este ha sido paralelo con el desarrollo
batch alimentado y utilizando medios sintticos con
de un gran nmero de aplicaciones en la industria
glucosa y urea como fuentes de carbono y nitrgeno,
alimentaria, se decidi trabajar en la optimizacin de
respectivamente.
la produccin de tres pectinasas (PGI de Aspergillus
kawachii, PPasa SE de Geotrichum klebahnii y la Y por ltimo, para la evaluacin de la expresin de
PGzyme de Aspergillus sojae) obtenidas a partir del la PGzyme de A. sojae, se contina con los ensayos
Centro de Investigacin y Desarrollo en Fermentaciones en medios con cscara de naranja y sulfato de
Industriales (CINDEFI) y demostrar el amplio amonio como nica fuente de carbono y nitrgeno,
potencial de aplicacin que tienen en el procesamiento respectivamente.
frutihortcola (extraccin de pectina y maceracin de
tejidos vegetales). Todos los cultivos se realizaron a nivel de reactor en
un fermentador de 1,5l de capacidad (New Brunswick
Bioflo350, con control de O2disuelto y pH).
Optimizacin de los procesos productivos Las fermentaciones fueron monitoreadas tomando
muestras del biorreactor a intervalos regulares para
Materiales y mtodos
medir laDO600 y elpH. Adems se analiz la
Los cultivos en batch alimentado resultan mejores concentracin de biomasa (peso seco), el contenido
que los realizados en sistema batch debido a que de glucosa (mtodo enzimtico de glucosa oxidasa
en los primeros se obtienen mayores densidades de peroxidasa; Wiener Lab., Argentina) y de galactosa
microorganismos (biomasa) y adems no se produce (para el caso de la PGI) (mtodo enzimtico de
etanol, que provoca una disminucin del rendimiento. galactosa deshidrogenasa - -galactosidasa; Enzytec,
Saccharomyces cerevisiae presenta efecto Crabtree, es Scil Diagnostics GmbH, Alemania) y la produccin
decir, a partir de ciertas velocidades de crecimiento la de las enzimas (medida de act. enzimtica Somogyi-
levadura genera etanol aunque no se encuentre limitada Nelson) (Cavalittoet al., 1999; Contreras Esquivel J.
en O2. Esto se evita restringiendo la velocidad de C. y Voget C. E., 2004).
crecimiento. Los cultivos en sistema batch alimentado
son ideales para tal fin (Rojas, 2009).

Se trabaj en el desarrollo de cultivos alimentados con


diferentes perfiles de induccin como estrategia para
mejorar la produccin de la poligalacturonasa PGI
recombinante de A. kawachii clonada en S. cerevisiae.

En este caso, se emple un medio sinttico con glucosa


como fuente de carbono y energa (FCE) y urea como
fuente de nitrgeno (FN).

Los ensayos se realizaron sobre un clon de S. cerevisiae


con el vector inducible pYES2.

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Extraccin de pectina
Materiales y mtodos
Para estudiar la capacidad de extraccin de pectina
de las pectinasas de A. kawachii, de G. klebahnii
y de PGzyme de A. sojae provistas por el CINDEFI
sobre productos frutihortcolas, se compararon los
rendimientos obtenidos con dichas enzimas con los
obtenidos por pectinasas comerciales y por extraccin
qumica.

Como primer paso, se obtuvieron las medidas


de actividad de las pectinasas en estudio
(polygalacturonasa PGI por A. kawachii, PPasa SE por
G. klebahnii y PGzyme de A. sojae) y de las enzimas
comerciales (una polygalacturonasa pura (BA) y
dos pooles enzimticos con alto grado de actividad
polygalacturonasa (J1 y J2), utilizando el mtodo de
Somogyi-Nelson (Cavalitto et al., 1999; Contreras
Esquivel J. C. y Voget C. E., 2004). Esto nos permiti
nivelar las actividades poligalacturonasas mediante la
realizacin de una adecuada dilucin para lograr que
Figura 1: Fermentador New Brunswick Bioflo 350, 2009, Mara los ensayos fueran comparables.
Luisa Franchi.
Se realiz el estudio de la capacidad de extraccin
enzimtica de pectina sobre residuos de peras (Winter
Bartlett) y manzanas (Granny Smith) del Alto Valle del
Resultados
Ro Negro, previamente seleccionados (Franchiet al.,
Los resultados obtenidos sealaron que la 2013).
condicin ms adecuada para la produccin de la
La metodologa aplicada fue descrita previamente
poligalacturonasa PGI recombinante de A. kawachii
por Zapata-Zapata (Zapata-Zapataet al., 2008). Se
fue la alimentacin con 100g/l de glucosa y un flujo
realiz la mezcla de orujo (1g) con solucin buffer
de 9ml/h en la induccin. En condiciones ptimas de
(1,5ml) a pH 4y cada enzima diluida correctamente
induccin se obtuvieron una actividad final de 80U/
para lograr una actividad poligalacturonasa final en la
ml, una concentracin final de biomasa de 7.06g/l y
solucin de 35U (2ml). Las muestras se agitaron en
una actividad especfica de 8500U/g.
un shaker de agitacin reciprocante (JEIO Tech BS-11)
Para el caso de la expresin de la PPasa SE de G. a 150golpes/min durante 6h a 37C.
klebahnii se encontr, en las condiciones ptimas de
La extraccin qumica de pectina se efectu por
trabajo, una actividad final de 180U/ml.
hidrlisis en medio cido, con un pH final de1,5. La
Cabe aclarar que en ninguno de los tres casos se solucin se dej hervir durante 40minutos.
produjo la enzima pectinesterasa (EC 3.1.1.11), que
A continuacin, en ambos mtodos, se aadi etanol
puede generar problemas en el tratamiento de vegetales
a las soluciones obtenidas previamente filtradas y se
debido a que libera metanol de la molcula de pectina.
secaron en horno a 40C hasta peso constante.
El estudio del mejoramiento de las condiciones de
A la pectina obtenida a partir de los diferentes mtodos,
cultivo de las enzimas analizadas permiti obtener un
se le realizaron anlisis para su caracterizacin. Esto
nivel de concentracin mayor que el alcanzado con los
se efectu determinando el grado de esterificacin
cultivos utilizados previamente.
y el contenido de cidos urnicos. Para el grado de
El aporte de este trabajo en cuanto a la optimizacin esterificacin se utiliz un mtodo titulomtrico con
de la produccin enzimtica es un primer paso para su el fin de determinar la cantidad de grupos carboxilos
escalado y, por ende, la posibilidad de comercializacin presentes en los restos de cido galacturnico. La
de enzimas de produccin nacional para la industria determinacin de los cidos urnicos posibilita
alimenticia. cuantificar el contenido de pectina mediante el

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empleo del mtodo colorimtrico de m-hidroxidifenil PPasa SE extrajo en el caso de las manzanas
(mhdf) y la aplicacin de una curva patrn de cido aproximadamente un 20% ms que la enzima BA, y
galacturnico monohidrato (0-150mg/L). un 70% ms que las enzimas J1 y J2. PGzyme extrajo
un 50% ms que dos de las enzimas comerciales (J1 y
J2) en las manzanas. Por ltimo, en cuanto a las peras,
Resultados las dos enzimas extrajeron lo mismo que las enzimas
J1 y J2.
Los resultados demostraron que las tres enzimas
implicadas en el estudio presentaron adecuadas De las tres enzimas analizadas en el estudio, se observa
capacidades para la extraccin de pectina. En el caso que PGI posee mejor capacidad para la extraccin
particular de la enzima PGI de Aspergillus kawachii, de pectina, extrayendo de las manzanas un 40 % y
result ser excelente para la extraccin de pectina a un 60 % ms que las enzimas PPasa SE y PGzyme,
partir del orujo de manzanas y peras del Alto Valle de respectivamente. Y en cuanto a las peras extrajo un
Ro Negro. 80% ms que ambas enzimas.

En todos los casos PGI extrajo mayor contenido de pectina. Se puede mencionar que, como era de esperar, a partir
En cuanto a las manzanas, extrajo aproximadamente del anlisis del grado de esterificacin, las pectinas
un 20% ms que la extraccin qumica, un 50% ms obtenidas en todos los casos fueron de alto metoxilo.
que la enzima BA, y un 80% ms que las enzimas J1 y En la industria alimenticia esta es la pectina que se
J2. Y para las peras extrajo aproximadamente un 60% utiliza mayoritariamente.
ms que la enzima BA y que la extraccin qumica, y un
80% ms que las enzimas J1 y J2.

Figura 2: Extraccin enzimtica de pectina a partir de orujo de pera


y manzana (gr pectina /gr orujo), 2013, Mara Luisa Franchi.

Figura 3: Fotografas de pectina seca - Observacin al microscopio ptico (100x),


2013, Mara Luisa Franchi.

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En cuanto al contenido de cidos urnicos fue de Resultados


aproximadamente del 60 % en ambas frutas para
todas las enzimas en estudio. El tejido macerado obtenido en todos los casos
mostraba clulas intactas al microscopio. PPasa
Maceracin de tejidos vegetales SE present muy buena capacidad macerante. Sin
embargo, los resultados de PGI y PGzyme en cuanto
Materiales y mtodos
al rendimiento y su comparacin con las enzimas
Para estudiar la capacidad macerante de las pectinasas comerciales empleadas no fueron los esperados.
de A. kawachii, de G. klebahnii y de PGzyme de A.
Para el caso de PPasa SE, se obtuvo una maceracin
sojae provistas por el CINDEFI sobre productos
de ambos tejidos vegetales aproximadamente 45 %
frutihortcolas, se compararon los rendimientos
mayor que con J1, 55 % mayor que con J2 y 30 %
obtenidos con dichas enzimas con los obtenidos por
mayor que con BA.
pectinasas comerciales.
La cantidad de tejido macerado obtenido a partir de
Como primer paso, se obtuvieron las medidas de
zapallo y de manzana con las enzimas PGI y PGzyme
actividad de las pectinasas en estudio (polygalacturonasa
fue inferior al obtenido con las enzimas comerciales en
PGI por A. kawachii, PPasa SE por G. klebahnii y
aproximadamente un 50%.
PGzyme de A. sojae) y de las enzimas comerciales (una
polygalacturonasa pura (BA) y dos pooles enzimticos De las tres enzimas analizadas en el estudio, se observa
con alto grado de actividad polygalacturonasa (J1 y J2), que PPasa SE posee mejor capacidad macerante,
utilizando el mtodo de Somogyi-Nelson (Cavalitto permitiendo obtener aproximadamente un 70% ms
1999; Contreras Esquivel 2004). Esto nos permiti
nivelar las actividades poligalacturonasas mediante la
realizacin de una adecuada dilucin para lograr que
los ensayos fueran comparables.

La maceracin por enzimas de A. kawachii, de G.


klebahnii y de PGzyme de A. sojae se realiz sobre
tejidos de zapallos y manzanas provenientes de la
produccin frutihortcola regional. Estos tejidos
fueron seleccionados por su potencial aplicacin a la
produccin de alimentos funcionales para infantes y
gerontes.

Los ensayos de maceracin de tejidos se realizaron


con la metodologa de Nakamura y col. (Nakamuraet
Figura 4: Maceracin enzimtica de zapallo - Tejido Macerado y
al., 1995). La tcnica consisti en cortar 3g de los Sobrenadante, 2013, Mara Luisa Franchi.
tejidos en cilindros (:4mm, longitud:5mm) con
un sacabocados a los cuales se agregaron 5mL de de tejido macerado de ambos vegetales que las enzimas
solucin buffer y se agitaron en un shaker de agitacin PGI y PGzyme.
reciprocante (JEIO Tech BS-11), a 185golpes/minuto
durante 1h a 30C. Posteriormente, se agregaron Se prev continuar con los ensayos de maceracin
5mL de cada enzima diluida convenientemente para empleando una mayor actividad PGasa, y se espera
lograr una actividad poligalacturonasa en la solucin obtener mejores resultados.
final de 40U y se continu la agitacin por 3h. Luego
se filtr la solucin con un tamiz Tyler de malla N.20. Cabe destacar que como estos estudios forman parte de
El tejido no macerado (TNM) retenido en el tamiz, un proyecto integral, se evaluar tambin la actividad
fue llevado a estufa a 60C hasta peso constante. Se de las tres enzimas en la clarificacin de jugos y vinos
separaron el tejido macerado (TM) del sobrenadante contemplando, adems, en funcin de los resultados
(S) mediante centrifugacin a 4000rpm por 20min. El obtenidos, la posibilidad de escalado de la produccin
TM y el S fueron secados en estufa a 60C hasta peso de las enzimas hasta nivel de reactor piloto.
constante (Zapata-Zapataet al., 2008).

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Conclusin Duvetter, T.; Sila, D.N.; Van Buggenhout, S.; Jolie,


R.; Van Loey, A. y M. Hendrickx (2009),
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se Pectins in Processed Fruit and Vegetables: Part
concluye que es factible la produccin nacional de I -Stability and Catalytic Activity of Pectinases,
enzimas, particularmente pectinasas, para su posterior Comprehensive Reviews in Food Science and
aplicacin a procesos industriales que involucren la Food Safety Volumen 8, pp.75-85.
produccin frutihortcola.
Franchi, M. L.; Fara, C. M.; Marzialetti, B.; Segura,
Qued demostrado que las enzimas implicadas en A.; Pose G. y S. Cavalitto (2013), Evaluacin
estos estudios se comportaron de igual o mejor forma del contenido de pectina en manzanas, peras
que las comerciales que se encuentran en el mercado. y membrillos de la produccin frutcola en al
Con el aporte de estas enzimas de produccin nacional, Alto Valle de Ro Negro; La Alimentacin
se conseguira disminuir los costos de los productores, Latinoamericana 305, pp.60-63.
ya que actualmente estas se consiguen a travs de
importaciones, lo cual se traduce en un mayor gasto Kashyap, D. R.; Vohra, P. K.; Chopra, S. y R. Tewari
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De esta manera, se lograra obtener productos de Technology Volume 77 (3), pp.215-227.
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