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CAPTULO 2.3.14.

ENFERMEDAD DE NEWCASTLE

RESUMEN

La enfermedad de Newcastle (EN) est causada por virus especficos del paramixovirus aviar de
tipo I (APMV-1) que es un serotipo del gnero Avulavirus perteneciente a la familia
Paramyxoviridae. Existen nueve serotipos de paramixovirus aviar designados desde APMV-I a
APMV-9.

Se ha demostrado que el NDV es capaz de infectar ms de 200 especies de aves, pero la


gravedad de la enfermedad causada depende de cul sea el hospedador y la cepa del virus. Las
cepas menos patgenas pueden inducir una enfermedad grave si se exacerban por la presencia
de otros organismos o mediante condiciones ambientales adversas. El mtodo preferido de
diagnstico es el aislamiento del virus y su subsiguiente caracterizacin.

Identificacin del agente: Se preparan suspensiones en solucin antibitica de muestras


traqueales o cloacales (o heces) obtenidas de aves vivas o de heces y muestras de rganos
seleccionados procedentes de aves muertas que se inoculan en la cavidad alantoidea de huevos
embrionarios de aves de corral de 911 das de edad. Los huevos se incuban a 37C durante 4
7 das. El lquido alantoideo de cualquier huevo que contenga embriones muertos o moribundos,
cuando surgen, y todos los huevos al final del periodo de incubacin se ensayan para detectar
actividad hemoaglutinante.

Cualquiera de los agentes hemoaglutinantes debera probarse para demostrar la inhibicin


especfica con un antisuero monoespecfico frente al NDV. El NDV (APMV-1) puede mostrar
alguna relacin cruzada antignica con algunos otros serotipos del paramixovirus aviar,
particularmente el APMV-3 y el APMV-7.

La patogenicidad de cualquier nuevo virus aislado se puede evaluar mediante la determinacin del
ndice de patogenicidad cerebral. La patogenicidad de los aislamientos tambin se puede valorar
empleando tcnicas moleculares, p. ej. la reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin
inversa y la secuenciacin. El NVD est sometido a un control oficial en la mayora de pases y es
un virus muy fcil de propagar desde el laboratorio; de ah la necesidad de mantener las medidas
adecuadas de bioseguridad y seguridad humana; para determinar el grado necesario de tales
medidas es preciso llevar a cabo una evaluacin de riesgo.
Pruebas serolgicas: La prueba de inhibicin de la hemoaglutinacin es la ms ampliamente
utilizada en la serologa del NDV; su relevancia en el diagnstico depende del estado inmune
vacunal de las aves a ensayar y de las condiciones predominantes de la enfermedad.

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Dependiendo de la situacin de


la enfermedad, se emplean virus vivos de baja virulencia (lentognicos) o de virulencia moderada
(mesognicos) para la vacunacin de aves de corral. Tambin se utilizan vacunas inactivadas.

Las vacunas vivas se pueden administrar a las aves por diversas vas. Normalmente se preparan
mediante la extraccin de lquidos alantoideos/amniticos infectados procedentes de huevos
embrionarios de aves inoculados; algunas se preparan a partir de cultivos celulares infectados. Se
debera obtener el producto final de la expansin de los inculos original y de trabajo.

Las vacunas inactivadas se administran por va intramuscular o subcutnea. Habitualmente se


obtienen mediante la adicin de formaldehdo a preparaciones vricas infectivas o mediante
tratamiento con beta-propiolactona. La mayora de vacunas inactivadas se prepara para uso
mediante una emulsin con aceite vegetal o mineral.

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Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

Si se emplean formas patgenas del NDV para la produccin de vacunas o en estudios de desafo,
el servicio debera cumplir los requisitos de la OIE para los patgenos del nivel de Contencin del
Grupo 4.

A. INTRODUCCIN

La enfermedad de Newcastle (EN) est causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un
serotipo del gnero Avulavirus perteneciente a la subfamilia Paramyxovirinae, familia Paramyxoviridae. Los
paramixovirus aislados procedentes de especies aviares se han clasificado mediante pruebas serolgicas en
nueve serotipos designados desde APMV-1 a APMV-9; el virus de ND (NDV) se ha denominado APMV-1 (6).

Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endmica en muchos pases. La vacunacin profilctica


se practica en casi todos los pases productores de aves de corral a escala comercial.

Una de las propiedades ms caractersticas de las cepas diferentes del NDV es su enorme variacin respecto a
la patogenicidad para los pollos. Las cepas del NDV se agrupan en cinco patotipos sobre la base de los signos
clnicos observados en los pollos infectados (13, 15). Estos son:

1. Velognico viscerotrpico: es muy patognica en la que se observan frecuentemente lesiones intestinales


hemorrgicas;
2. Velognico neurotrpico: se presenta con mortalidad elevada, habitualmente seguida de signos
respiratorios y nerviosos;
3. Mesognico: se presenta con signos respiratorios y signos nerviosos ocasionales pero baja mortalidad;
4. Lentognico o respiratorio: se presenta con una infeccin respiratoria leve o subclnica;
5. Entrico asintomtico: normalmente consiste en una infeccin entrica subclnica.

Raramente los agrupamientos en patotipos son claros (6, 7), e incluso en infecciones de aves libres de
patgenos especficos (SPF), se puede apreciar un considerable solapamiento. Adems, puede tener lugar una
exacerbacin de los signos clnicos inducida por las cepas ms benignas si se superponen infecciones de otros
organismos o cuando se presentan condiciones medioambientales adversas.

Como los signos de la enfermedad clnica en pollos varan ampliamente y el diagnstico puede complicarse
posteriormente por las respuestas diferentes a la infeccin en los distintos hospedadores, los signos clnicos por
s solos no presentan una base fiable para el diagnstico de la EN. Sin embargo, los signos clnicos y las
lesiones asociadas con los patotipos virulentos proporcionarn una fuerte sospecha de enfermedad.

El virus de la enfermedad de Newcastle es un agente patgeno de los humanos. Las infecciones registradas no
suponen un riesgo para la vida y la debilidad que causan no dura ms de dos o tres das (18). Los sntomas que
con mayor frecuencia se han sealado en las infecciones humanas son la infeccin ocular, que normalmente
consiste en enrojecimiento de uno o de los dos ojos, lagrimeo excesivo, edema en los prpados, conjuntivitis, y
hemorragia de la membrana subconjuntival. Aunque el dao ocular puede ser bastante grave, las infecciones son
normalmente pasajeras y la cornea no se ve afectada. Los informes sobre otros sntomas en humanos infectados
con el NDV no estn tan bien documentados, pero apuntan a que a veces, puede presentarse un tipo de
infeccin ms generalizada que provoca escalofros, dolor de cabeza, y fiebre, con o sin acompaamiento de
conjuntivitis. Existen pruebas de que las cepas vacunales y las virulentas (para las aves) contra el NDV pueden
infectar y provocar sntomas clnicos en el hombre. No existe evidencia de contagio entre humanos.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
La EN, tal como se la define en la seccin B.1.f de este captulo, est sometida al control oficial en la mayora de
los pases y existe un gran riesgo de propagacin del virus desde el laboratorio; de ah que se deba llevar a cabo
una evaluacin de riesgo para determinar el nivel de bioseguridad y seguridad humana necesario para llevar a
cabo el diagnstico y la caracterizacin del virus. La instalacin debe cumplir los requisitos para el Grupo de
contencin adecuado, tal como se determina la valoracin de riesgos y como se esboza en el captulo 1.1.2 de
este Manual terrestre. Los pases que no tienen acceso a los laboratorios nacionales o regionales deben enviar
muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.

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Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

a) Aislamiento el virus (Prueba prescrita para el comercio internacional)


Muestras para el aislamiento vrico
Cuando las investigaciones de la EN son el resultado de la aparicin de enfermedad severa y mortalidad
elevada en grupos de aves, es corriente intentar el aislamiento del virus a partir de aves muertas
recientemente o aves moribundas que se sacrifican de forma indolora. Las muestras procedentes de aves
muertas deberan consistir en frotis oronasales, tanto como muestras procedentes de tejidos de pulmn,
riones, intestino (incluyendo contenidos), bazo, cerebro, hgado y corazn. Pueden ser recogidos
separadamente o en conjunto, aunque, habitualmente, las muestras intestinales se procesan de forma
separada de otras muestras.

Las muestras procedentes de aves vivas deberan incluir tanto frotis traqueales como cloacales; las ltimas
deberan estar visiblemente cubiertas de material fecal. Los pjaros pequeos y delicados pueden daarse
por el muestreo pero la recogida de heces frescas puede servir como alternativa adecuada.

En el caso de que sean limitadas las oportunidades de obtener muestras, es importante que se examinen
los frotis cloacales (o fecales) y los frotis traqueales (o tejido traqueal) tanto como los rganos o tejidos ms
afectados o asociados con la enfermedad clnica. Las muestras deberan tomarse en las etapas tempranas
de la enfermedad.

Se tendran que colocar las muestras en solucin salina isotnica tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0
7,4, que contenga antibiticos. Tambin se han utilizado medios basados en protena, como infusin de
cerebro-corazn (BHI) o caldo de triptosa con tampn Tris (TBTB), lo que puede incrementar la estabilidad
del virus, sobre todo durante el transporte. Los antibiticos pueden variar de acuerdo a las condiciones
locales, pero podra ser, por ejemplo, penicilina (2.000 unidades/ml); estreptomicina (2 mg/ml); gentamicina
(50 g/ml); y micostatina (1.000 unidades/ml) para frotis traqueales y de tejidos, pero a concentraciones
cinco veces superiores para frotis cloacales y de heces. Es importante reajustar la solucin a pH 7,0
7,4 despus de la adicin de los antibiticos. Si se quiere controlar Chlamydophila, se debe incluir
0,05 0,1mg/ml de oxitetracilina. Las heces y los tejidos tomados finamente deberan prepararse como
suspensiones al 1020% (p/v) en la solucin de antibitico. Las suspensiones deberan procesarse tan
pronto como fuera posible despus de una incubacin durante 12 horas a temperatura ambiente. Cuando
es impracticable el procesamiento inmediato, las muestras pueden conservarse a 4C hasta 4 das.

b) Cultivo del virus


Los lquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante la clarificacin
por centrifugacin a 1.000 g durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura que no exceda los
25C se inoculan en volmenes de 0,2 ml en la cavidad alantoidea de cada uno de al menos cinco huevos
embrionarios de aves SPF de 911 das de incubacin. Despus de la inoculacin, se incuban a 3537C
durante 47 das. Los huevos que contengan embriones muertos o moribundos cuando surgen, y todos los
huevos que permanezcan hasta el final del periodo de incubacin, deberan enfriarse primero a 4C y
probar los lquidos alantoideos para detectar actividad de hemoaglutinacin (HA). Los lquidos que den una
reaccin negativa deberan ser pasados en al menos un lote posterior de huevos.

c) Identificacin del virus


La actividad HA detectada en lquidos bacteriolgicamente estriles recogidos a partir de huevos inoculados
puede deberse a la presencia de cualquiera de los 16 subtipos de hemoaglutininas de los virus de la gripe A
o de los ocho restantes serotipos de paramixovirus. (El lquido no estril podra contener actividad HA
bacteriana). El NDV puede confirmarse empleando antisuero especfico en una prueba de inhibicin de la
hemoaglutinacin (HI). Habitualmente se utiliza el antisuero de pollo preparado contra una de las cepas del
NDV.

Las reacciones cruzadas en las pruebas HI entre el NDV y algunos otros APMV, especialmente los virus de
los serotipos APMV-3 y APMV-7 pueden causar algunos problemas que pueden resolverse empleando
controles adecuados de antgeno y antisuero.

d) ndice de patogenicidad
La variacin extrema en la virulencia de los diferentes aislamientos vricos de la EN y el uso generalizado
de vacunas vivas implica que la identificacin de un aislamiento como NDV a partir de aves que muestren
signos clnicos no confirma un diagnstico de la EN, por lo que tambin se requiere una valoracin de la
virulencia del aislamiento (vase seccin B.1.f. bajo el ttulo Definicin de la enfermedad de Newcastle).
En el pasado, se han utilizado pruebas como el promedio de muerte en huevos, la prueba de la
patogenicidad intravenosa, y las vacunaciones utilizadas en esas pruebas (27), pero por acuerdo
internacional, se utiliza la prueba de la patogenicidad intracerebral para la valoracin de la virulencia del

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virus. La definicin actual de la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE) (seccin B.1.e. ms
adelante) tambin reconoce los avances en la comprensin de lo que son las bases moleculares de la
patogenicidad y permite una confirmacin de la virulencia, aunque no la ausencia de virulencia, mediante
pruebas in vitro para determinar la secuencia de aminocidos en el punto de escisin de la protena FO.

ndice de patogenicidad intracerebral


i) El lquido alantoideo infectivo y fresco con un ttulo HA >24 (>1/16) se diluye 1/10 en solucin salina
isotnica estril sin aditivos, tales como antibiticos.
ii) Se inyectan por va intracerebral 0,05 ml del virus diluido en diez polluelos procedentes de huevos de
un grupo de aves SPF. En el momento de la inoculacin, estos polluelos deben tener ms de 24 horas
y menos de 48 horas.
iii) Las aves se examinan cada 24 horas durante 8 das.
iv) En cada observacin, las aves se puntan: 0 si es normal, 1 si est enferma y 2 si est muerta. Las
aves que estn vivas pero son incapaces de comer o beber deben sacrificarse y ser contabilizadas
como muertas en la observacin posterior. (Los individuos muertos deben puntuarse como 2 en cada
una de las observaciones diarias siguientes a la muerte).
v) El ndice de patogenicidad intracerebral (ICPI) es la puntuacin media por ave y por observacin
durante el periodo de 8 das.

Los virus ms virulentos presentarn ndices que se aproximan a la puntuacin mxima de 2,0, mientras
que las cepas entricas lentognicas y asintomticas presentarn valores prximos a 0,0.

e) Base molecular de la patogenicidad


Durante la replicacin, las partculas del NDV se producen con un precursor glicoproteico, F0, que tiene que
escindirse en F1 y F2 para que las partculas vricas sean infectivas. Esta divisin post-traduccional est
mediada por proteasas de la clula hospedadora. La tripsina es capaz de escindir F0 de todas las cepas
vricas de la EN.

Parece ser que las molculas F0 de los virus virulentos para los pollos pueden dividirse mediante una
proteasa del hospedador o proteasas encontradas en un rango amplio de clulas y tejidos y, de este modo,
extenderse a travs del hospedador daando rganos vitales, mientras que las molculas F0 en los virus de
baja virulencia estn limitadas en su ruptura a ciertas proteasas del hospedador, lo que resulta en la
restriccin de estos virus a replicarse solo en ciertos tipos de clulas hospedadoras.

La mayora de los NDV que son patognicos para los pollos tienen la secuencia 112R/K-R-Q-K/R-R116 en el
extremo C-terminal de la protena F2 y un residuo de F (fenilalanina) en la posicin 117, en el extremo N-
terminal de la protena F1, mientras que los virus de baja virulencia tienen secuencias en la misma regin
de 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y un residuo de L (leucina) en la posicin 117. Algunos de las variantes vricas
de la paloma examinadas (PPMV-1) tienen la secuencia 112G-R-Q-K-R-F117, pero tienen valores ICPI altos.
De modo que parece que existe el requerimiento de al menos un par de aminocidos bsicos en las
posiciones 116 y 115 ms una fenilalanina como residuo 117 y un aminocido bsico (R) en la posicin 113
si el virus muestra virulencia hacia los pollos.

Se han realizado diversos estudios empleando tcnicas moleculares para determinar la secuencia del punto
de escisin de F0 mediante la reaccin en cadena de la polimerasa de trascripcin inversa (RT-PCR), bien
en virus aislados o bien en tejidos y heces procedentes de aves infectadas, realizndose a continuacin el
anlisis del producto mediante el anlisis con enzimas de restriccin, la hibridacin con sonda o la
secuenciacin de nucletidos al objeto de establecer una prueba in vitro rutinaria para determinar la
virulencia (para una revisin vase ref.2). La determinacin de la secuencia de escisin de F0 puede
proporcionar una indicacin clara de la virulencia del virus y esto se ha incorporado a la definicin de la EN
(vase seccin B.1.f.).

En el diagnstico de la EN es importante entender que la demostracin de la presencia del virus con


mltiples aminocidos bsicos en el punto de escisin de F0 confirma la presencia de virus virulentos o
potencialmente virulentos, pero la falta de deteccin de virus o la deteccin de NDV sin mltiples
aminocidos bsicos en el punto de escisin de F0 empleando tcnicas moleculares, no confirma la
ausencia de virus virulentos. Una primera correspondencia mala o la posibilidad de que en una misma
poblacin estn mezclados virus virulentos y avirulentos, implica que todava ser necesario el aislamiento
del virus y una valoracin in vivo de su virulencia.

Los anlisis recientes de virus aislados en Irlanda en 1990 y los realizados durante los brotes de la EN de
19982000 en Australia han proporcionado una clara evidencia de que los virus virulentos pueden surgir a

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partir de virus progenitores de baja virulencia (5, 39). Tambin se ha generado de manera experimental un
virus virulento de la EN a partir de un virus de baja virulencia mediante pases en pollos (34).

f) Definicin de la enfermedad de Newcastle


Parece probable que la gran mayora de aves sea susceptible a la infeccin con NDV tanto de virulencia
alta como de virulencia baja para los pollos, aunque los signos clnicos observados en aves infectadas con
el NDV varan ampliamente y dependen de factores tales como: el virus, la especie hospedadora, la edad
del hospedador, la infeccin con otros organismos, el estrs medioambiental y el estado inmune. Bajo
algunas circunstancias la infeccin con los virus extremadamente virulentos puede provocar una mortalidad
repentina alta con signos clnicos relativamente escasos. As que los signos clnicos son variables y estn
influidos por otros factores de modo que ninguno puede considerarse patognomnico.

Incluso en los hospedadores susceptibles, tales como los pollos, los NDV muestran un rango considerable
de virulencia. Generalmente, la variacin consiste en grupos alrededor de los dos extremos en la prueba,
pero, por diversas razones, algunos virus pueden mostrar virulencia intermedia.

La variacin enorme en la virulencia y en los signos clnicos implica la necesidad de definir cuidadosamente
lo que constituye la EN para los propsitos de comercio, polticas y medidas de control. La definicin de la
EN actualmente en uso en todos los estados miembros de la Unin Europea es la que se contempla en la
Directiva 92/66/EEC (17, 20).

La definicin de la OIE para anunciar un foco de la EN es:

La enfermedad de Newcastle se define como una infeccin de aves causada por un virus del serotipo 1 del
paramixovirus aviar (APMV-1) que cumple uno de los criterios siguientes de virulencia:

a) El virus tiene un ndice de patogenicidad intracerebral (ICPI) en polluelos de un da (Gallus


gallus) de 0,7 o superior.
o
b) Se han demostrado en el virus mltiples aminocidos bsicos (o directamente o por deduccin)
en el extremo C-terminal de la protena F2 y un residuo de fenilalanina en la posicin 117, la cual
est en el extremo N-terminal de la protena F1. El trmino mltiples aminocidos bsicos se
refiere a que existen al menos tres residuos de arginina o lisina entre las posiciones 113 y 116.
La imposibilidad de demostrar el modelo caracterstico de residuos de aminocidos como se ha
descrito anteriormente requerira la caracterizacin del virus aislado mediante una prueba ICPI.

En esta definicin, los residuos de aminocidos se numeran desde el extreme N-terminal de la secuencia
de aminocidos deducida a partir de la secuencia de nucletidos del gen F0 donde las posiciones 113
116 corresponden de la 4 a la 1 a partir del punto de escisin.

g) Anticuerpos monoclonales
Se han utilizado anticuerpos monoclonales de ratn (MAb) dirigidos contra cepas del NDV en pruebas HI
para conseguir una identificacin rpida del NDV sin las posibles reacciones cruzadas con otros serotipos
APMV que pueden tener lugar con sueros policlonales. Se han creado MAb que dan reacciones en pruebas
HI y que son especficos para cepas particulares o variantes de aislamientos del NDV (4, 6, 9, 10).

Se han empleado tablas de MAb para establecer perfiles antignicos de aislamientos del NDV basndose
en si reaccionan o no con los virus. Se ha demostrado que es un mtodo valioso para agrupar y diferenciar
los aislamientos del NDV y ha sido particularmente de valor para entender la epidemiologa de los brotes (9,
10).

h) Estudios filogenticos
En los ltimos aos el desarrollo de tcnicas mejoradas para la secuenciacin de nucletidos, la
disponibilidad de datos de la secuencia de ms NDV en bases de datos informatizadas y la demostracin
de que incluso longitudes de secuencia relativamente cortas pueden dar resultados significativos en anlisis
filogenticos, han conducido a un incremento considerable en tales estudios. Se ha detectado una
diversidad gentica considerable, pero los virus que comparten parmetros temporales, geogrficos,
antignicos o epidemiolgicos tienden a encuadrarlos en linajes o grupos taxonmicos especficos, y se ha
comprobado que esto es importante para valorar tanto la epidemiologa global como la propagacin local de
la EN (4, 8, 19, 28, 32, 33, 38, 41, 43, 44)

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Aunque en el pasado los estudios filogenticos han sido impracticables como herramienta rutinaria, en la
actualidad la mayor disponibilidad y el incremento en la velocidad de obtencin de resultados empleando
kits sofisticados y disponibles comercialmente para la RT-PCR y secuenciadotes automticos permite que
tales estudios se encuentren dentro de los equipamientos de muchos ms laboratorios de diagnstico y que
puedan proporcionar resultados significativos que sean contemporneos en lugar de retrospectivos (2).
Aldous et al. (4) propusieron que la genotipificacin de los aislamientos del NDV formaran parte de la
caracterizacin diagnstica del virus para los laboratorios de referencia mediante la produccin de la
secuencia de 375 nucletidos del gen F, que incluye el punto de escisin del F0, de forma rutinaria para
todos los virus y la comparacin de las secuencias obtenidas con otros aislamientos y 18 virus
representativos de los linajes y sublinajes reconocidos. Ese anlisis permitira una rpida valoracin
epidemiolgica de los orgenes y la propagacin de los virus responsables de los brotes de EN.

i) Tcnicas moleculares para el diagnstico


Adems del uso de la RT-PCR y de otras tcnicas similares para la determinacin de la virulencia de los
NDV (vase seccin B.1.e.) o para estudios filogenticos (vase seccin B.1.h.), han habido varias
publicaciones sobre el uso de tales tcnicas moleculares para detectar el NDV en muestras clnicas, con la
ventaja de la demostracin extremadamente rpida de la presencia del virus e incluso de su virulencia si se
emplean cebadores que cubran la parte del genoma que codifica el punto de escisin de F0 (12, 20, 21).

Se debera tener cuidado en la seleccin de muestras clnicas ya que algunos estudios han demostrado
falta de sensibilidad en la deteccin de los virus en algunos rganos y particularmente en las heces (20, 21,
23, 25). Como ocurre en la determinacin de la virulencia, es importante que tales tcnicas no se empleen
solas para registrar un resultado como negativo en las investigaciones en las que se sospeche la EN (30).
Con frecuencia se utilizan frotis traqueales u orofarnegos como muestras de eleccin porque son fciles de
procesar y por lo general, contienen poco material orgnico extrao que pueda interferir con la recuperacin
y amplificacin del ARN mediante la PCR. No obstante, tambin se han utilizado con cierto xito muestras
de tejidos y de rganos e incluso las heces. El sistema utilizado para la extraccin del ARN tambin influir
en la eficacia de la RT-PCR con muestras clnicas, y se debe procurar escoger los kits comerciales ms
adecuados o validados para las muestras a examinar.

Normalmente se han utilizado sistemas de RT-PCR para amplificar una porcin especfica del genoma que
tienen un valor aadido; por ejemplo, amplificando parte del gen F que contiene el punto de escisin del FO
de manera que el producto pueda utilizarse para valorar la virulencia (3, 14, 23, 25, 29, 37, 38). El principal
inconveniente de la utilizacin de la RT-PCR para el diagnstico estriba en la necesidad del procesamiento
que sigue a la amplificacin debido a la contaminacin potencial del laboratorio y la contaminacin cruzada
de las muestras.

Una de las estrategias que se siguen para no tener que realizar el procesamiento post-amplificacin
consiste en la utilizacin de las tcnicas de la RT-PCR (rRT-PCR) en tiempo real. La ventaja de estas
pruebas es que la rRT-PCR basada en el uso de sondas de hidrlisis fluorognica o de tinciones
fluorescentes hace innecesaria la fase de procesamiento post-amplificacin y se pueden obtener los
resultados en menos de 3 horas. La aplicacin ms eficaz de las pruebas de la rRT-PCR se realiz en
EE.UU. cuando ocurrieron los brotes de EN en 20022003, cuando se aplic la prueba descrita por Wise et
al. (46), que mostr una sensibilidad del 95% en comparacin con el aislamiento del virus para ms de
1.400 muestras. La prueba se realiza con tres conjuntos de cebadores y sondas que se utilizan en
reacciones independientes: un conjunto de cebadores/sondas para la matriz que est diseado para
detectar la mayora de las cepas del NDV, un conjunto de cebadores/sondas de fusin con los que se
puede identificar cepas virulentas del NDV (incluyendo muchos virus PPMV-1) y un conjunto de
cebadores/sondas diseados para detectar cepas de virus de baja virulencia. Primero se examinan las
muestras con los cebadores/sondas de la, luego se ensayan las muestras positivas con las de baja
virulencia y con la fusin y los conjuntos de cebadores/sonda para confirmar la presencia de los virus de
poca virulencia y los de mucha virulencia, respectivamente. Los cebadores y las sondas del mencionado
informe fueron validadas en cepas lentognicas, mesognicas y velognicas que se encuentran
habitualmente en los Estados Unidos de Amrica. En el momento lgido del brote, se ensayaron entre
1.000 y 1.500 muestras cada da mediante rRT-PCR. La desventaja de la rRT-PCR es que, actualmente,
los termocicladores especiales que se precisan son demasiado caros, lo que obliga a muchos laboratorios a
descartar el empleo de este sistema.

Una cuestin adicional es que, mientras que la mayor parte de los aislamientos del NDV estn muy
relacionados genticamente, se ha demostrado que algunos son genticamente diferentes. Por ejemplo, un
grupo de virus adscrito al genogrupo 6 por Aldous et al. (4) y ulteriormente a la Class I por Czegledi et al.
(24), es tan diferente de todos los dems aislamientos de NDV, p. ej. de los virus de la Clase II (24) que se
necesitan diferentes cebadores para sus deteccin mediante pruebas de RT-PCR.

Al igual que para establecer la virulencia, es importante que no se utilicen solo las tcnicas PCR para
registrar un resultado negativo en las investigaciones de la EN sospechosa.

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2. Pruebas serolgicas

El NDV puede emplearse como un antgeno en una variedad amplia de pruebas serolgicas, lo que permite que
se utilicen las tcnicas de neutralizacin o de enzimoinmunoensayo (ELISA) y HI para valorar el nivel de
anticuerpos en las aves. En la actualidad, la prueba HI es la ms ampliamente utilizada para la deteccin de
anticuerpos contra el NDV en las aves, aunque muchos productores de aves de corral utilizan kits de ELISA
comerciales para valorar los niveles de anticuerpos tras la vacunacin

En diferentes laboratorios se practican variaciones de los procedimientos para las pruebas HA y HI. Los
siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulacin de plstico y fondo en V en las que el
volumen final para ambos tipos de prueba es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS
isotnico (0,1 M), pH 7,07,2, y RBC procedentes de un mnimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen
igual de solucin de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre procedente de aves no
vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al NDV). Las clulas se
deberan lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensin al 1% (clulas empacadas v/v). Debera
realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antgenos y de los
antisueros.

a) Pruebas de hemaglutinacin y de inhibicin de la hemaglutinacin


Los sueros de pollo raramente dan reacciones positivas no especficas en esta prueba y es innecesario cualquier
pretratamiento de los sueros. Los sueros procedentes de especies distintas a las de los pollos a veces pueden
causar aglutinacin de los eritrocitos (RBC) de pollo, as que esta propiedad debera determinarse primero, y
posteriormente extraer mediante adsorcin del suero con RBC de pollo. Esto se realiza adicionando 0,025 ml de
RBC de pollo empacados a cada 0,5 ml de antisueros, agitando suavemente y dejndolos durante al menos
30 minutos; a continuacin los RBC se precipitan mediante centrifugacin a 800 g durante 25 minutos y se
decantan los sueros adsorbidos.

En diferentes laboratorios se practican variaciones de los procedimientos para las pruebas HA y HI. Los
siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulacin de plstico y fondo en V en las que el
volumen final para ambos tipos de prueba es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS
isotnico (0,1 M), pH 7,07,2, y RBC procedentes de un mnimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen
igual de solucin de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre procedente de aves no
vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al NDV). Las clulas se
deberan lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensin al 1% (clulas empacadas v/v). Debera
realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antgenos y de los
antisueros.

Pruebas de hemaglutinacin
i) Se distribuyen 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico y fondo en
V.
ii) A cada pocillo se adicionan 0,025 ml de la suspensin vrica (p. ej. lquido alantoideo infectivo). Para
una determinacin precisa del contenido de HA, se debera hacer a partir de una serie de diluciones
muy cercanas a una inicial, p. ej. 1/3, 1/5, 1/7, etc.
iii) A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de la suspensin vrica en volmenes de
0,025 ml.
iv) Posteriormente se adicionan a cada pocillo 0,025 ml de PBS.
v) En cada pocillo se dispensan 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v).
vi) La solucin se mezcla golpeando suavemente la placa. Se dejan estticos los RBC durante unos
40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. aproximadamente a 20C, o durante 60 minutos a 4C si las
temperaturas son altas, considerando que los RBC control deberan sedimentar de una forma distinta.
vii) La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de una corriente en
forma de lgrima de los RBC. Debera leerse la titulacin a la dilucin ms alta a la que se de una HA
completa (sin corriente); esto representa 1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a
partir del rango inicial de diluciones.

Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin


i) Se dispensan 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico y fondo en
V.
ii) Se adicionan 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.
iii) A lo largo de la placa se realizan diluciones dobles del suero en volmenes de 0,025 ml.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 7


Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

iv) A cada pocillo se aaden 4 HAU de virus/antgeno en 0,025 ml y la placa se deja durante un mnimo
de 30 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20C, o 60 minutos a 4C.
v) A cada pocillo se aaden 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v) y, despus de mezclar suavemente,
los RBC se dejan estticos unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20C, o durante
unos 60 minutos a 4C si las temperaturas del ambiente son altas, considerando que los RBC control
deberan sedimentar de una forma distinta.
vi) El ttulo de HI es la dilucin mayor de suero que causa la inhibicin completa de 4 HAU de antgeno.
La aglutinacin se valora inclinando las placas. Debera considerarse que muestran inhibicin solo
aquellos pocillos en los que la corriente de RBC se produce a la misma velocidad que los pocillos
control (que contienen 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS).
vii) La validez de los resultados debera evaluarse frente a un suero control negativo, que no debera
presentar un ttulo >1/4 (>22 o >log2 2 cuando se expresa como el recproco), y un suero control
positivo para el cual el ttulo debera encontrarse entre una de las diluciones del ttulo conocido.

El valor de la serologa en el diagnstico est relacionado claramente con el estado inmune esperado de las
aves afectadas. Los ttulos de HI pueden considerarse positivos si hay inhibicin a una dilucin del suero de
1/16 (24 o log2 4 cuando se expresa como el recproco) o superior contra 4 HAU de antgeno. Algunos
laboratorios prefieren usar 8 HAU en las pruebas de HI. Mientras esto se permita, afectar a la
interpretacin de los resultados de modo que un ttulo positivo ser 1/8 (23 o log2 3) o superior. Se debera
incluir una nueva titulacin del antgeno en todas las pruebas para verificar el nmero de HAU utilizadas.

Los ttulos de HI pueden emplearse para evaluar el estado inmune de un grupo de aves. En grupos
vacunados que estn siendo controlados serolgicamente, es posible identificar respuestas anamnsicas
como resultado de una infeccin de desafo con el virus de campo (13), pero se debera proceder con gran
cautela porque se pueden producir variaciones por otras causas. Por ejemplo, se ha demostrado que las
infecciones por el virus APMV-3 de pavos vacunados contra el NDV darn por resultado ttulos
sustancialmente elevados frente al NDV (11).

b) Enzimoinmunoensayo
Se dispone comercialmente de una variedad de kits de pruebas ELISA que se basan en diversas
estrategias para la deteccin de anticuerpos contra el NDV, incluyendo ELISA indirecto, tipo sndwich y de
bloqueo o competitivo, que emplean MAb. Al menos uno de los kits utiliza una subunidad antignica.
Habitualmente estas pruebas se han validado y evaluado por el fabricante y, por tanto, es importante que
para su uso, se sigan cuidadosamente las instrucciones especificadas. Las pruebas HI y ELISA pueden
medir los anticuerpos contra diferentes antgenos; dependiendo del sistema utilizado, la prueba ELISA
puede detectar anticuerpos contra ms de un antgeno, mientras que el uso de la prueba HI probablemente
se limita a los anticuerpos contra la protena de la EN. No obstante, algunos estudios de tipo comparativo
han demostrado que los ELISA son reproducibles y tienen sensibilidad y especificidad altas; se ha
demostrado que correlacionan bien con la prueba HI (1). Los ELISA convencionales tienen la desventaja de
que es preciso validar la prueba para cada especie de ave con la que aquella se utiliza. En los ELISA
competitivos normalmente se utilizan MAb que, debido a su especificidad para los epitopos individuales,
puede ser que no reconozcan todas las cepas del APMV-1.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO


Se ha publicado una descripcin detallada de todos los aspectos de las vacunas del NDV, incluyendo su
produccin y usos (11, 13) y debera consultarse para conocer los detalles de los procedimientos que aqu se
recogen. En el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias, se indican las directrices para la
produccin de este tipo de vacunas. Las directrices dadas aqu y en el captulo 1.1.8 pretenden ser de carcter
general y pueden complementarse en el caso de que existan requisitos regionales y nacionales.

En esta seccin se considerarn vacunas convencionales y comerciales vivas e inactivadas, porque todava se
emplean universalmente. Sin embargo, se debera recordar que existen muchos trabajos recientes sobre la
aplicacin de tcnicas de biologa molecular en la produccin de nuevas vacunas y hay constancia del xito en la
obtencin de inmunidad protectora con virus recombinantes de la viruela aviar, el virus vacunal, el virus de la
viruela de la paloma, el herpesvirus del pavo y las clulas aviares en las que se expresan el gen HN, o el gen F,
o los dos genes, del NDV. En algunos pases se ha autorizado el uso de varios de estos virus recombinantes.

Las cepas vricas de la EN empleadas en las vacunas comerciales de virus vivos se encuadran en dos grupos:
vacunas lentognicas tales como Hitchner-B1, La Sota, V4, NDW, I2 y F, y vacunas mesognicas, tales como
Roakin, Mukteswar y Komarov. Las cepas de ambos grupos han sido seleccionadas y clonadas para satisfacer

8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008


Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

los diferentes criterios en su produccin y aplicacin. Todos los virus de vacunas mesognicas tienen dos pares
de aminocidos bsicos en el punto de escisin F0 y valores ICPI de aproximadamente 1,4. Esto significa que
las infecciones de aves con estos virus entraran dentro de la definicin propuesta para la EN (seccin B.1.f.)
pero como estas vacunas se emplean principalmente en pases donde la EN es endmica, este hecho puede
que no excluya necesariamente su uso. Algunos pases han dispuesto que solo se puedan utilizar cepas
lentognicas del NDV en las vacunas (42).

El servicio de produccin de vacunas debera operar bajo los procedimientos y prcticas apropiados de
bioseguridad. Si la EN, como se define en la seccin B.1.f. de este captulo, se utiliza para la produccin de
vacunas o para estudios de desafo de la vacuna, la parte del servicio donde se realice el trabajo debera cumplir
los requisitos para los patgenos del nivel de Contencin del Grupo 4, como se recoge en captulo 1.1.2 de este
Manual.

La mayora de vacunas con virus vivos crecen en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios de aves pero
algunas, notablemente algunas cepas mesognicas, se han adaptado a una variedad de sistema de cultivos de
tejidos.

Las vacunas con virus vivos pueden administrarse a las aves incorporndolas en el agua de bebida,
administrndose como un spray grueso o mediante instilacin conjuntival o intranasal. En los Estados Unidos de
Amrica se ha autorizado una vacuna lentognica para uso in ovo. Algunas cepas mesognicas se obtienen por
inoculacin intradrmica en la membrana del ala. Se han preparado vacunas que dan resultados ptimos
mediante la aplicacin de vas especficas. En general, las vacunas vivas ms inmunognicas son ms virulentas
y, por tanto, es ms probable que causen efectos secundarios adversos. Por ejemplo, la vacunacin con la cepa
La Sota causar problemas considerablemente mayores en aves susceptibles jvenes que la cepa Hitchner-B1,
aunque La Sota induce una respuesta inmune ms fuerte.

Las vacunas inactivadas se consideran ms caras que las vacunas vivas y su empleo entraa la manipulacin e
inyeccin de aves individuales. Se preparan a partir de lquido alantoideo al que se inactiva su infectividad
mediante la adicin de formaldehdo o beta-propiolactona. Se incorpora en una emulsin con aceite mineral y se
administra por va intramuscular o subcutnea. As las aves individuales reciben una dosis estndar. No se
produce la propagacin subsiguiente del virus ni reacciones respiratorias adversas. Se utilizan tanto cepas
virulentas como avirulentas como inculo vrico aunque, desde el punto de vista del control de la seguridad, el
uso de estas ltimas parece menos adecuado. Como despus de la administracin no se produce la
multiplicacin vrica, se requiere una cantidad de antgeno para la inmunizacin mucho mayor que en el caso de
la vacunacin con virus vivos. Es importante un rendimiento elevado de virus para producir una vacuna potente,
y, para este propsito, es muy adecuada la cepa Ulster 2C.

La duracin de la inmunidad depende del programa de vacunacin elegido. Una de las consideraciones ms
importantes que afectan a los programas de vacunacin es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jvenes
que puede variar considerablemente de granja a granja, de lote a lote y entre pollos individuales. Por esta razn,
se emplean diversas estrategias. O los pjaros no se vacunan hasta las 24 semanas de vida cuando la mayora
de ellos ser susceptible, o se vacunan con 1 solo da de vida por instilacin conjuntival o mediante la aplicacin
de un spray grueso. Se establecer una infeccin activa en algunas aves que persistir hasta que la inmunidad
maternal decrezca. Entonces, se llevar a cabo una revacunacin 34 semanas ms tarde. Se ha demostrado
que las vacunas inactivadas tambin pueden ser empleadas adecuadamente para vacunar polluelos de 1 da
que tienen cierto grado de inmunidad maternal (15, 17), y los mejores resultados se han obtenido cuando a los
polluelos maternalmente inmunes de 1 da se les da una combinacin de vacunas viva e inactivada, comparada
con vacunas vivas o inactivadas dadas de forma separada (14, 16). La vacunacin de aves de 1 da totalmente
susceptibles, incluso con las vacunas vivas ms suaves, puede provocar en enfermedad respiratoria,
especialmente si estn presentes en cantidad significativa bacterias patgenas comunes.

Normalmente se practica una vacunacin despus de 3 semanas de vida solo en gallinas de crianza y gallinas
de puesta. Se debera llevar a cabo con intervalos de suficiente frecuencia para mantener una inmunidad
adecuada. Los programas de vacunacin emplean con frecuencia vacunas con virus vivos un poco ms
patognicos para reforzar la inmunidad de las usadas inicialmente. Tambin pueden usarse estas vacunas vivas
ms patognicas despus de una vacunacin inicial con vacunas inactivadas en emulsin de aceite.

Cuando se disea un programa de vacunacin, debera tenerse en consideracin el tipo de vacuna utilizada, el
estado inmune y de enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de proteccin requerido en relacin a cualquier
posibilidad de infeccin con el virus de campo bajo las condiciones locales (13). Aqu se indican dos ejemplos de
programas de vacunacin que pueden utilizarse en diferentes circunstancias de enfermedad. Para el primer
ejemplo, cuando la enfermedad es leve y espordica se sugiere que se adopte el siguiente orden de vacunacin:
vacuna viva Hitchner-B1 mediante administracin conjuntival o de spray a 1 da de edad; vacuna viva Hitchner-B1
o La Sota a los 1821 das de vida en el agua de bebida; vacuna viva La Sota en el agua de bebida a las
10 semanas de vida y una vacuna inactivada en emulsin de aceite en el momento de la puesta. Para el
segundo ejemplo, cuando la enfermedad es severa y ms extendida, se adopta el mismo protocolo ya indicado

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 9


Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

hasta los 21 das de vida y a esto le sigue la revacunacin a los 3542 das de vida con la vacuna viva La Sota
en el agua de bebida o como spray; esta revacunacin se repite a las 10 semanas de vida con una vacuna
inactivada (o una vacuna viva mesognica) y de nuevo se repite en el momento de la puesta (13).

1. Control del inculo

a) Caractersticas del inculo


El primer principio a considerar cuando se selecciona una cepa para una vacuna viva del NDV es si se va a
usar como vacuna primaria o secundaria, siendo su patogenicidad la principal consideracin. Los mtodos
de aplicacin y frecuencia de uso son consideraciones vlidas. El uso de MAb ha demostrado una variacin
considerable en la antigenicidad de cepas diferentes (9, 10). Esto puede indicar la necesidad de adaptar las
vacunas ms cuidadosamente a virus antignicamente relacionados con cualquier virus de campo
predominante.

Se ha introducido una vacuna viva basada en la cepa V4 del NDV, seleccionada por su estabilidad al calor,
para combatir los problemas especficos asociados con la crianza del pollo campero en los pases en
desarrollo. La intencin es que esta vacuna pueda estar protegida por el alimento para los pollos que se
alimentan de restos. Hasta la fecha, los ensayos realizados en diferentes pases han producido resultados
mezclados; bien puede ser que los factores locales sean extremadamente importantes afectando al xito de
esta estrategia (35, 40). Ms recientemente se ha desarrollado la vacuna I2 termoestable especficamente
para la vacunacin de los pollos camperos; actualmente se recomienda que esta vacuna se suministre
mediante gota al ojo (9).

El uso de vacunas vivas puede estar restringido por la legislacin. Por ejemplo, la Decisin de la Comisin
93/152/EEC (18, 21) restringe el uso de vacunas en los estados miembros de la Unin Europea desde el
1 de Enero de 1995 a aquellos para los que el inculo original se ha probado y muestra tener un ICPI <0,4
si se administran a cada ave no menos de 107 dosis infectivas de huevo (EID50), o <0,5 si se administran a
cada ave no menos de 108 EID50. De manera similar, la Comisin de Estndares de la OIE ha
recomendado que mientras en principio las vacunas deberan tener un ICPI < 0,7 para poder explicar la
variabilidad entre distintos ensayos y laboratorios, se tendra que admitir un margen de seguridad con
objeto de que las cepas vricas del inculo original para la fabricacin de vacunas no tengan un ICPI que
exceda el valor 0,4 (30, 35).

La consideracin ms importante en la seleccin de un inculo para preparar una vacuna inactivada es la


cantidad de antgeno producida cuando crece en huevos embrionarios; raramente es rentable concentrar el
virus. Se han usado tanto cepas virulentas como lentognicas para preparar vacunas inactivadas, pero las
primeras ofrecen un riesgo innecesario porque supone la manipulacin de grandes cantidades de virus
virulentos as como el peligro de una inactivacin inadecuada y la posible contaminacin consiguiente. Este
riesgo est contemplado en la Decisin de la Comisin 93/152/EEC (18, 21), que restringe el uso de virus
para la fabricacin de vacunas inactivadas en los estados miembros de la Unin Europea a partir del 1 de
enero de 1995 a aqullos para los cuales se ha probado el inculo original y muestra tener un ICPI <0,7 si
se administra a cada ave no menos de 108 EID50. Algunas cepas lentognicas crecen hasta niveles muy
altos en los huevos. Se pueden obtener ttulos excepcionalmente elevados mediante la cepa Ulster 2C, la
cual se recomienda como inculo para la vacuna inactivada (22, 26). Sin embargo, cuando se usan como
inculos las cepas Hitchner B1, La Sota o F se consiguen vacunas inactivadas con xito comercial.

b) Mtodo de cultivo
Se establece un inculo original y a partir del mismo un inculo de trabajo. Si la cepa se ha clonado
mediante dilucin limitante o seleccin en placa, el establecimiento de un cultivo maestro solo puede
implicar la produccin de un gran volumen de lquido alantoideo infectivo (como mnimo 100 ml), que puede
conservarse en forma de alcuotas liofilizadas (0,5 ml).

c) Validacin como vacuna


A los virus del inculo de origen desconocido se les debera realizar pases a travs de huevos SPF y ser
clonados antes de producir el inculo original. Tambin puede ser conveniente algn pase a travs de
pollos SPF (11, 13). En cualquier caso, despus de su preparacin, el inculo original se debera comprobar
su esterilidad, seguridad, potencia y presencia de agentes extraos. Algunos pases tambin exigen
estudios mediante pases retrospectivos para la vacuna viva del NDV a fin de asegurarse de que no
aumenta la patogenicidad como consecuencia de su circulacin entre pjaros (42).

10 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008


Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

2. Mtodo de produccin

Para la produccin de la vacuna, primero se establece un inculo de trabajo, a partir de cualquiera de los lotes de
vacuna producidos, mediante la expansin de una alcuota del inculo original hasta un volumen suficiente para
permitir la produccin de la vacuna durante 1218 meses. Es mejor conservar el inculo de trabajo de forma
lquida a una temperatura de 60C o inferior porque el virus liofilizado no siempre se multiplica hasta un ttulo
alto en el primer pase subsiguiente (11, 13).

La mayora de las vacunas de la EN se producen en huevos embrionarios de ave y las vacunas de virus vivos
deberan producirse en huevos SPF. El mtodo de produccin es la propagacin del virus asptica y a gran
escala; todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad.

Es habitual diluir el inculo de trabajo en PBS estril, pH 7,2, de modo que aproximadamente se inoculan 103
104 EID50/0.1 ml en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios SPF de 9 o 10-das de vida. A continuacin se
incuban a 37C. Se deberan desechar los huevos que contengan embriones muertos en las 24 horas. El tiempo
de incubacin depender de la cepa vrica utilizada y se predeterminar para asegurar una produccin mxima
con el nmero mnimo de muerte de embriones.

Los huevos infectados deberan enfriarse a 4 C antes de recogerse. Se quitan las partes superiores de los
huevos y se aspiran los lquidos alantoideos despus de la eliminacin del embrin. Debera evitarse la inclusin
de cualquier resto de yema o de albmina. Se deberan conservar todos los lquidos inmediatamente a 4 C y
comprobar la ausencia de contaminacin bacteriana antes de preparar grandes cantidades para la liofilizacin o
inactivacin. Normalmente, las vacunas vivas se liofilizan. La metodologa depende de los aparatos utilizados y
de la pericia de los fabricantes, pero esta es una etapa muy importante ya que una liofilizacin inadecuada
resulta tanto en prdidas de ttulo como en un periodo de validez reducido.

En la produccin de vacunas inactivadas, se trata el lquido alantoideo recogido con formaldehdo (una
concentracin final tpica es 1/.1.000) o beta-propiolactona (una concentracin final tpica es 1/2.0001/4.000). El
tiempo requerido debe ser suficiente para asegurar que est libre de virus vivos. La mayora de vacunas
inactivadas no se concentran; el lquido alantoideo inactivado normalmente se emulsiona con aceite mineral o
vegetal. Generalmente, las frmulas exactas son secretos comerciales.

Generalmente, las vacunas inactivadas basadas en aceite se preparan como emulsiones primarias de agua en
aceite. Habitualmente, la fase oleosa consiste en nueve volmenes de aceite mineral altamente refinado, tal
como Marcol 52, Drakeol 6VR y BayolF, ms un volumen de agente emulsionante, tal como Arlacel A, Montanide
80 y Montanide 888 (31, 36). La fase acuosa es el virus inactivado al que se le adiciona un emulsionante no
inico como Tween 80. Normalmente la relacin fase oleosa a fase acuosa es de 1:1 hasta 1:4. Los fabricantes
se esfuerzan para conseguir un balance entre el efecto adyuvante, la viscosidad y la estabilidad. Si la viscosidad
es demasiado alta, la vacuna ser difcil de inyectar; si es demasiado baja, la vacuna es inestable.

3. Control del proceso

Cada lote de vacuna con virus vivo debe probarse en cuanto a su viabilidad y potencia. Para aqullas producidas
en huevos, el control ms importante del proceso es comprobar la ausencia de contaminacin bacteriana y
fngica. Esto es necesario debido a la aparicin ocasional de huevos en estado de putrefaccin que pueden no
ser detectados hasta el momento de la recogida.

Para las vacunas inactivadas debe probarse la eficacia del proceso de inactivacin en huevos embrionarios,
tomando 25 alcuotas (0,2 ml) de cada lote y realizando pases cada tres veces a travs de embriones SPF (11,
13).

4. Control de lotes

La mayora de los pases han publicado especificaciones para el control de la produccin y comprobacin de las
vacunas del NDV (p. ej. ref. 29, 34), que incluyen la definicin de las pruebas obligatorias en vacunas durante y
despus de su manufactura.

Es necesario probar la infectividad de las vacunas con virus vivos para conseguir que se administren los niveles
adecuados de virus. Habitualmente se titula el virus en huevos embrionarios de aves hasta conseguir la EID50.
Esto implica realizar diluciones a la dcima del virus; se inoculan 0,1 ml de cada dilucin en entre cinco y siete
huevos embrionarios de aves de 910 das de vida. Despus de 57 das de incubacin a 37C, los huevos se
enfran y se prueban para demostrar su actividad hemoaglutinante, que es una indicacin de la presencia del
virus vivo. La EID50 a punto final se calcula empleando una formula estndar tal como la de SpearmanKrber
(10, 12).

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 11


Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

a) Esterilidad
Las pruebas para determinar que los materiales biolgicos estn estriles y libres de contaminacin se
encuentran en el captulo 1.1.2

b) Inocuidad
El uso de pollos para la comprobacin de las vacunas supone la inoculacin de diez o ms aves de la edad
indicada que procedan de un grupo SPF. Se administrarn diez dosis de vacuna viva por va
supraconjuntival a cada ave y a continuacin las aves se mantendrn en observacin durante 21 das.
Ningn pollo debera mostrar signos clnicos serios y ninguno debera morir por causas atribuibles a la
vacuna (19, 22). Como alternativa, se utiliza se utiliza la parte pre-desafo de la prueba de potencia descrita
ms adelante como prueba de inocuidad y, si aparecen reacciones desfavorables debidas al producto, se
considera la prueba como no concluyente y se repite la prueba de inocuidad. Si la repeticin no es
satisfactoria, el lote se etiqueta como insatisfactorio.

En el caso de las vacunas inactivadas, se administrar una dosis doble por la va recomendada a diez aves
de 3 semanas de edad y se mantendrn en observacin durante 2 semanas para comprobar la ausencia de
signos clnicos de enfermedad o lesiones locales.

c) Potencia
Se han propuesto varios mtodos para comprobar la potencia de las vacunas del NDV. Se ha subrayado la
importancia de usar una adecuada cepa de desafo para la valoracin (11, 13). Las cepas de desafo
adecuadas son la Herts 33 o la GB Texas. Para las vacunas vivas, el mtodo recomendado (19) supone la
vacunacin de 10 o ms aves SPF u otras completamente susceptibles algunos pases especifican
20 aves (22) a la mnima edad recomendada por la va sugerida, empleando la dosis mnima
recomendada. Despus de 1421 das, cada ave vacunada y diez aves control se desafan por va
intramuscular con 105 LD50 (dosis letal 50%) del virus de desafo de la EN. La vacuna pasa la prueba si al
cabo de 10 das el 90% de los pollos vacunados sobrevive sin sntomas de enfermedad, pero todos los
controles mueren en 6 das.

Para las vacunas inactivadas, se emplean pollos SPF o susceptibles de 2128-das. Se inyectan por va
intramuscular tres grupos de 20 aves con volmenes de vacuna equivalentes a 1/25, 1/50 y 1/100 de una
dosis. Se mantiene un grupo de diez pollos como control. Se desafan todas las aves mediante inyeccin
intramuscular de 106 LD50 del virus de desafo de la EN, 1721 das ms tarde. Se observan los pollos
durante 21 das. La PD50 (dosis protectora 50%) se calcula mediante mtodos estadsticos estndar. La
prueba solo es vlida si todas las aves control de desafo mueren en 6 das. La vacuna cumple con la
prueba si la PD50 no es menos que 50 por dosis y si el lmite de confianza menor no es menos que 35 PD50
por dosis. Algunas autoridades de control aceptan una prueba solo a 1/50, por razones de sanidad animal.

No es necesario repetir la prueba de potencia en cada lote si se ha demostrado que ha pasado la prueba un
lote representativo del producto final procedente del inculo original.

d) Duracin de la inmunidad
El nivel de inmunidad alcanzado con cualquier dosis nica o rgimen de vacunacin de la EN, variar
enormemente tanto con la vacuna como con la especie hospedadora. Es extremadamente complejo y difcil
de evaluar el nivel de inmunidad requerido en un hospedador dado (p. ej. para proteger contra la muerte, la
enfermedad, las prdidas de produccin de carne o huevos). Generalmente, se debera hacer alguna
evaluacin de la longevidad de los anticuerpos del suero y adoptarse regmenes de vacunacin para
mantener estos por encima de un nivel aceptable (11, 13).

e) Estabilidad
El producto o vacuna final, cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, debera mantener su
potencia durante al menos 1 ao. Las pruebas de estabilidad acelerada, tales como la reduccin de la
infectividad seguida de la incubacin a 37C durante 7 das (26, 31), pueden utilizarse como una gua para
las capacidades de almacenaje de un lote de vacuna viva. Las vacunas en emulsin de aceite, tambin
deberan someterse a un agente acelerador mediante almacenamiento a 37C, durante un mnimo de un
mes, sin separacin de las fases acuosa y oleosa. Los EE.UU. exigen que se compruebe la estabilidad en
tiempo real para algunos de los primeros lotes de la vacuna del NDV. Normalmente se comprueban tres
muestras de la vacuna muerta y 10 de la vacuna viva. Las vacunas con virus vivos deben emplearse
inmediatamente despus de su reconstitucin. Las vacunas inactivadas no se deben congelar.

12 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008


Captulo 2.3.14. Enfermedad de Newcastle

f) Conservantes
En muchos pases, para las vacunas vivas no se deben incluir conservantes en el producto vivo liofilizado,
pero los conservantes antimicrobianos pueden incorporarse en el diluyente utilizado para reconstituir la
vacuna. Una alternativa en EE.UU. es permitir el uso de ciertos conservantes, a condicin de que se
indiquen en el etiquetado.

g) Precauciones (riesgos)
Las vacunas vivas de la EN pueden representar un riesgo para los humanos. Se ha informado de que los
NDV, tanto los virulentos como los poco virulentos para los pollos, han infectado a humanos, causando
normalmente conjuntivitis aguda despus de la introduccin directa en el ojo. Habitualmente, las infecciones
son transitorias y no afectan a la crnea.

Las vacunas en emulsin de aceite mineral representan un riesgo serio para el vacunador. La inyeccin
accidental de humanos debera tratarse con prontitud mediante la incisin y el lavado de la zona, como para
el caso de una herida por inyeccin de grasa.

5. Pruebas sobre el producto final

a) Inocuidad
Vase la seccin C.4.b. arriba

b) Potencia
Vase la seccin C.4.c. arriba.

REFERENCIAS

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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Newcastle (vase el cuadro en la parte 3
de este Manual de animales terrestres o consltese una lista ms actualizada en la pgina web de la OIE:
www.oie.int).

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