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Cuando se nace prematuramente, el feto se expone abruptamente a un nivel

de oxgeno arterial mucho mayor (Pa, O, 50-100 mmHg) en comparacin con


las condiciones intrauterinas (Pa, O, 25mmHg), lo que resulta en un aumento
en la produccin de especies reactivas de oxgeno (ROS) (Frank, 1985). ROS
tales como radicales superxido (O|), perxido de hidrgeno (HO) y
radicales hidroxilo (HO ) son productos normales de los procesos metablicos
aerbicos en la clula (Saugstad, 1990; Varsila, Hallman y Andersson, 1994; Yu,
1994) . Bajo condiciones fisiolgicas, estos ROS son destoxificados por varios
sistemas de defensa de enzimas antioxidantes (AOE), incluyendo enzimas
especficas tales como superxido dismutasa (SOD), glutatin peroxidasa (GPx)
y catalasa (Saugstad, 1990; Varsila y col. ). Si los ROS no son desintoxicados de
manera eficiente, pueden producirse interacciones con componentes celulares
tales como lpidos, protenas o ADN, causando dao celular o incluso muerte
celular (Frank, 1985, Janssen, Borm, Van Houten y Mossman, 1993; La
produccin y la actividad de AOEs aumentan notablemente en los das finales
antes del nacimiento, y an ms despus del nacimiento (Frank & Sosenko,
1987).
Sin embargo, cuando el organismo es inmaduro, la respuesta del sistema AOE
puede ser insuficiente, confrontando al recin nacido prematuro con estrs
oxidativo (Frank, 1985; Varsila et al., 1994). Este ltimo ha sido
Asociada con displasia broncopulmonar, retinopata, enterocolitis necrotizante
y hemorragia intracraneal (Saugstad, 1990).
Con el fin de estudiar la capacidad de la hiperoxia para inducir el sistema AOE
en sistemas de rganos inmaduros, se utiliz el modelo de embrin de pollo en
desarrollo. En este estudio el embrin de pollo fue expuesto a la hiperoxia en
los das 10, 14 y 18 del perodo de incubacin. Dado que el intercambio
gaseoso en el embrin de pollo ocurre a travs de microporos en la cscara del
huevo, la hiperoxia puede ser inducida fcilmente (Bissonnette & Metcalfe,
1987). Describimos los cambios en el desarrollo de SOD, GPx y catalasa en el
cerebro fetal, corazn, hgado, intestino y pulmones en condiciones fisiolgicas,
as como despus de la exposicin a la hiperoxia en tres momentos diferentes
durante la segunda mitad del perodo de incubacin total.
Productos qumicos
Se obtuvieron patrones purificados para SOD (eritrocitos bovinos, EC 1.15.1.1)
y catalasa (bovina, EC 1.11.1.6) de Boehringer Mannheim y para glutatin
peroxidasa (eritrocitos bovinos, liofilizados) de Sigma. Todos los dems
productos qumicos y reactivos eran de calidad analtica.
Protocolo Los huevos blancos Leghorn frtiles se incubaron a 38 C y 60% de
humedad. La concentracin de oxgeno en la incubadora podra aumentarse
hasta un 60%. La composicin de gas en el incubador se monitoriz
continuamente durante la incubacin. La exposicin del vulo a la hiperoxia
(fraccin de O inspirada (FI, O2) = 0 6) durante 3 h condujo a un cambio
significativo en Pa, O (a 52 6 mmHg; 28 mmHg) en la arteria corioalantoide,
similar a la Transicin de los niveles de Pa, O al nacer (Piiper, Tazawa, Ar &
Rahn, 1980). Durante la incubacin, los huevos fueron girados cada hora a lo
largo de su eje largo. Los embriones de pollo se dividieron en cuatro grupos:
control (n = 100) y tres grupos de prueba. En el grupo control, que se incub al
21% de O2, se midieron las actividades de SOD, GPx y enzima catalasa en el
cerebro, el corazn, el hgado, el intestino y los pulmones del da 10 al 21
(cada da, 10 embriones de pollo fueron decapitados, excepto en Das 13 y 17).
Los grupos de ensayo tambin se incubaron a 21% de O2, pero se expusieron
en diferentes momentos a 60% de O $ $ durante 48 horas. El grupo de
ensayo 1 se expuso a O $ 60 $ a los das 10 y 11 (n = 80), el grupo de ensayo
2 se expuso a 60% de O en los das 14 y 15 (n = 60) y el grupo de ensayo 3
se expuso a 60% Das 18 y 19 (grupo de ensayo 3, n = 30). En todos los grupos
de ensayo, se iniciaron las primeras mediciones de las actividades de las
enzimas SOD, GPx y catalasa en el cerebro, el corazn, el hgado, el intestino y
los pulmones 24 h despus del inicio de la hiperoxia (en cada momento elegido
se decapitaron 10 embriones de pollo para las mediciones). En el grupo de
ensayo 1, se realizaron mediciones los das 11, 12, 14, 16, 18, 19, 20 y 21; En
el grupo de ensayo 2, se realizaron mediciones a los das 15, 16, 18, 19, 20 y
21; Y en el grupo de ensayo 3 se realizaron mediciones los das 19, 20 y 21.
Tissue preparation and enzyme determinations On each determined day, ten
chick embryos were removed from their eggs, decapitated, weighed and
classified using the HamburgerHamilton morphological maturity index
(Hamburger & Hamilton, 1951). Brain, heart, liver, intestine, and lungs were
dissected from the embryo, weighed and chilled in ice-cold 09% NaCl solution.
Subsequently, tissues were homogenized in 10 m potassium phosphate buffer
(4C, 136 g l KHPO and 178 g l NaHPO, titrated to pH 74,
supplemented with 30 m KCl and 1 m EDTA), using a Polytron Teflon
homogenizer (Brinkman, Westbury, NY, USA; 2 60 s at the highest speed), and
stored at 70C until AOE assays were performed.
Protein content was determined in an aliquot of tissue homogenate, according
to Bradford (1976), using bovine serum albumin (BSA) as standard. Remaining
homogenates were centrifuged at 12000 r.p.m. for 5 min at 4C, and the
resulting supernatants were analysed for SOD, GPx and catalase activity as
described previously (Janssen, Marsh, Absher, Borm & Mossman, 1990), using
standard spectrophotometric assays. AOE activity levels were corrected for
changes in protein content in the different organs.
CuZn-SOD was measured in chloroformethanol (3:5) preextracted samples,
using the inhibition of xantine (50 )-induced cytochrome C (10 ) reduction
at 415 nm. SOD activity was calculated from a semilogarithmic plot between
reaction rate and the log of a standard SOD. Samples were diluted to obtain
approximately 50% inhibition (Engelen, Borm, van Sprundel & Leenaerts,
1990).
Total GPx activity was measured at 340 nm for 3 min, using 03 m HO-
induced reduction of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
Catalase was measured at 240 nm for 3 min, using the linear decrease of HO
(10 m) at pH 70 in 50m phosphate buffer (68 g l KHPO and 89 g l
NaHPO, titrated to pH 70).
Activity was calculated using the the molar extinction coefficient of 00394
mmol cm. Statistics Data are presented as means s.d. Differences in AOE
levels in different organs during normal development were tested using the
MannWhitney U test. AOE levels in test groups were compared with the levels
on the same day in the control group using the MannWhitney U test.
Significance was accepted when P < 005.

Desarrollo de grupos de control El desarrollo normal de SOD y GPx en el


embrin de pollo en desarrollo (en el cerebro, el corazn, el hgado, el intestino
y los pulmones) se caracteriz por un rpido aumento de actividad durante el
20-30% final del tiempo de incubacin (Tablas 1 y 2). En contraste, la actividad
de la catalasa en estos rganos no aument durante la incubacin (Tabla 3).
La actividad de la enzima SOD aument a partir del da 15 y continu
aumentando hasta el final del perodo medido en todos los rganos, excepto en
el hgado. En el hgado, se alcanz el nivel mximo de actividad de la enzima
SOD al da 18 de incubacin. La actividad enzimtica en el cerebro y el corazn
fue significativamente mayor que en los pulmones y el intestino (P <0, 05).
La actividad de la enzima GPx aument constantemente desde el da 12 hasta
el final del periodo medido. Los niveles ms altos de actividad enzimtica GPx
se encontraron en el tejido heptico (P <0, 05). Todos los dems rganos
mostraron niveles similares de actividad de la enzima GPx.
La actividad enzimtica de la catalasa no mostr ningn cambio durante el
perodo medido y la actividad fue mucho menor que la de las enzimas SOD y
GPx (P <0, 05).
Las actividades enzimticas mximas de SOD, GPx y catalasa fueron
alcanzadas ms temprano en el hgado.
Grupos de prueba: cambios inducidos por hiperoxia Se observ un aumento en
la actividad de la enzima SOD en todos los rganos excepto en el cerebro
(Tabla 1). Las observaciones fueron notablemente similares en el corazn, el
hgado, el intestino y los pulmones. Se alcanz un aumento significativo en la
actividad de la enzima SOD 24 h despus del inicio de la hiperoxia en el grupo
de ensayo 1 y despus de 48 h en los grupos de ensayo 2 y 3. El aumento de la
actividad de la enzima SOD en los das 16-18 fue significativamente mayor en
el grupo de ensayo 2 comparado con Grupo de ensayo 1 (P <0,05). Se observ
un aumento en la actividad de la enzima SOD en embriones en el grupo de
ensayo 3 en los das 19 y 20. Sin embargo, debido a que todos los embriones
murieron cuando se detuvo la hiperoxia, los niveles de SOD no pudieron
medirse en el da 21. De ello se deduce que los niveles mximos de SOD y
duracin Del aumento significativo tambin podra no ser medido.
Curiosamente, en la hiperoxia del tejido cerebral indujo un aumento en la
actividad de la enzima SOD en el grupo de prueba 1 solamente. En los
embriones de pollo ms desarrollados, no se observ ningn incremento en la
actividad enzimtica despus del inicio de la hiperoxia. De hecho,
contrariamente a lo observado en todos los dems rganos, una Disminucin
en la actividad de la enzima SOD se observ en el cerebro (P <0, 05).
Se observ un aumento en la actividad de la enzima GPx en todos los rganos
slo en el grupo de ensayo 1 (Tabla 2). Este aumento ocurri 48 h despus del
inicio de la hiperoxia (P <0, 05) y su duracin fue de 3 das en el corazn, el
hgado y el intestino y
6 das en el cerebro. En el tejido pulmonar se observ un aumento significativo
en la actividad de la enzima GPX 24 h despus del inicio de la hiperoxia. Sin
embargo, el nivel de actividad enzimtica en el grupo de ensayo 1 disminuy
desde el da 19 hasta el 21 en el cerebro, desde el da 16 hasta el 21 en el
corazn, hgado e intestino y desde el da 14 hasta 21 en los pulmones (P
<0,05). Por el contrario, en el grupo de ensayo 2, en el corazn, el hgado, el
intestino y los pulmones, La actividad de la enzima GPx se observ durante 6
das (P <0, 05). Tambin, en el grupo de ensayo 3, se observ una disminucin
significativa en la actividad de la enzima GPx 24-48 h despus del inicio de la
hiperoxia en el cerebro, el corazn, el hgado y el intestino.
Se observ un aumento en la actividad de la enzima catalasa en todos los
rganos, excepto en el corazn, slo en el grupo de ensayo 1 (Tabla 3). Esto
ocurri 24-48 h despus del inicio de la hiperoxia
(P <0,05) y su duracin fue de 24 h en el intestino, 2 das en el cerebro y 5 das
en los pulmones y el hgado. En el grupo de ensayo 1, se observ una
disminucin de la actividad de la enzima catalasa en el corazn desde el da 11
hasta el 16 (P <0,05). En el grupo de ensayo 2, se observ una disminucin
significativa en la actividad de la enzima catalasa en el corazn, el hgado y el
intestino durante 5-6 das (P <0,05). En el grupo de ensayo 3, una disminucin
significativa en catalasanzyme activity in the liver, intestine and lungs was
observed on day 19, and on day 20 in the lungs (P < 005).
SCUSIN
Este estudio describe el desarrollo normal del sistema AOE primario (SOD, GPx
y actividad de la enzima catalasa) en el cerebro, corazn, hgado, intestino y
tejido pulmonar durante el
Segunda mitad del perodo de incubacin en el embrin de pollo, y los cambios
que indujo hiperoxia en este desarrollo. Para estudiar el efecto de la hiperoxia,
los embriones de pollo fueron expuestos a 60% de O durante 48 h en tres
momentos diferentes de su periodo de incubacin (das 10, 14 y 18). Este nivel
de exposicin a la hiperoxia se eligi porque el nivel de Pa, O obtenido fue
similar al de los niveles de Pa, O neonatal (Piiper et al., 1980). En el grupo de
control, se midieron los cambios de actividad AOE desde el da 10 hasta el da
21 del perodo de incubacin. En todos los grupos de ensayo, se comenz la
medicin de la actividad AOE 24 h despus del inicio de la hiperoxia, y
continuaron hasta el ltimo da de incubacin. Se encontr que la exposicin a
la hiperoxia dio lugar a un aumento de la actividad AOE. Esta respuesta a la
hiperoxia dependi de la AOE, el rgano, el tiempo de incubacin y los
momentos de exposicin.
Para estar preparado para el mundo relativamente enriquecido despus del
nacimiento, es necesario un aumento prenatal y una respuesta postnatal
rpida en la actividad AOE. No se conoce la causa de este aumento en la
actividad AOE, pero los posibles mecanismos implicados son: (a) el nivel de
PO, (b) la tasa de metabolismo oxidativo durante el desarrollo fetal, (c) el
estado maturacional de los tejidos y ( D) la concentracin de sustrato
enzimtico (Engelen et al., 1990, Wilson, Lui & Del Maestro, 1992). En el
embrin de pollo, PO aumenta de niveles mnimos en el da 4 a niveles mucho
ms altos en el da 10 (Freeman & Mission, 1970). Sin embargo, dado que se
produce una disminucin gradual de la PO y de la tasa metablica a partir del
da 10 o 12 en adelante, estos factores desempean un papel menos
importante en el aumento de la actividad de AOE (Freeman y Mission, 1970;
Prinzinger, Schmidt y Dietz, 1995). Sin embargo, se podra suponer que cuando
el sistema AOE inmaduro se expone a hiperoxia, el sistema de rganos
inmaduros podra activarse para aumentar el nivel de AOE.
Otros estudios han demostrado que los niveles de AOE aumentan durante la
parte final de la gestacin normal en otras especies, incluyendo el conejillo de
indias, conejo, rata, hamster o feto humano (Frank & Groseclose, 1984, Gerdin,
Tyden y Eriksson , 1985, Saugstad, 1990, Janssen et al., 1993). Sin embargo, en
estos estudios las primeras mediciones de la actividad AOE se realizaron 3 das
antes del nacimiento. En nuestro estudio, en el cual los niveles de AOE se
midieron desde el da 10 hasta el da 21, se encontr un aumento en la
actividad AOE durante el 20-30% final del tiempo total de incubacin (das 14-
21); Sin embargo, la actividad de la catalasa no aument.
SOD est presente en rganos que son altamente vulnerables a ROS (Munim,
Asayama, Dobashi, Suzuki, Kawaoi y Kato, 1992). Curiosamente, encontramos
que los niveles de AOE eran sorprendentemente ms altos en el hgado que en
los otros rganos. Esto puede explicarse por la gran capacidad de
metabolizacin y desintoxicacin de este rgano, por ejemplo, la tasa de
liberacin extramitochondrial de HO es aproximadamente dos rdenes de
magnitud mayor en el hgado que en el cerebro (Wilson et al., 1992). En este
estudio, la hiperoxia indujo un aumento de 2 a 10 veces en la actividad de la
enzima SOD en todos los rganos, con la excepcin del cerebro. Este aumento
observado en la actividad AOE fue mayor cuando la hiperoxia se aplic
posteriormente en el desarrollo fetal. Una posible explicacin de la falta de
induccin de la actividad AOE en el tejido cerebral podra ser la disminucin del
flujo sanguneo cerebral causada por la hiperoxia. Se ha descrito una
disminucin en el flujo sanguneo cerebral debido a la vasoconstriccin
cerebral, causada por hiperoxia, en recin nacidos prematuros expuestos al
80% de oxgeno durante la fase inicial
Estabilizacin en la sala de partos (Leahy, Cates, MacCallum y Rigatto, 1980,
Lunstrm, Pryds y Greisen, 1995). Sin embargo, no hay datos disponibles para
apoyar la hiptesis de que la vasoconstriccin cerebral se produce durante el
perodo perinatal. Otra explicacin de la falta de induccin de la actividad SOD
del cerebro por hiperoxia podra ser la inhibicin o eliminacin de superxido,
p. Su reaccin con el xido ntrico (NO) (Radi, Beckman, Bush & Freeman,
1991). Esta reaccin es ms de 3 veces ms rpida que la dismutacin
enzimtica de los radicales superxido catalizados por SOD (kSOD = 2 $ $ ,
Radi et al., 1991). Adems, tambin se ha encontrado que el producto de
reaccin ONOO (peroxinitrito) inactiva la actividad SOD (MacMillan-Crow,
Crow, Kerby, Beckman y Thompson, 1996). Por el contrario, la administracin
de acetato de plomo (1,25 y 2, 5 mol (kg de peso de huevo)) a embriones de
pollo de 14 das aument significativamente la actividad de AOE en todos los
rganos, incluido el cerebro (Somashekaraiah, Padmaja y Prasad, 1992). Esto
podra explicarse por las altas dosis de acetato de plomo y el agotamiento de
glutatin en este estudio.

La induccin de GPx y la actividad catalasa se observ slo en embriones de


pollo expuestos a hiperoxia en los das 10 y 11 del perodo de incubacin
(grupo de ensayo 1). Curiosamente, en los grupos de ensayo 2 y 3, los niveles
de GPx y catalasa enzima actividad disminuy en comparacin con el grupo de
control. Diferentes cambios en la actividad enzimtica entre los tres AOEs en el
desarrollo del embrin de pollo podra explicarse por las diferencias en la
regulacin de la expresin gnica durante el perodo de incubacin (Clerch &
Massaro, 1992; Chen & Frank, 1993). CuZn-SOD y catalasa se regulan a un
nivel pretranslacional y su aumento en la actividad se asocia con un aumento
en la concentracin de ARNm (Clerch & Massaro, 1992, 1995; Chen & Frank,
1993). Por el contrario, GPx se regula en un nivel de traslacin o
postraduccional y los cambios en la concentracin de GPx son causados por un
aumento en la estabilidad del mRNA. Sin embargo, todos los estudios sobre la
expresin gnica de AOEs se han realizado durante el 20% final del perodo de
incubacin y postnatalmente (Clerch & Massaro, 1992, 1995; Chen & Frank,
1993). La regulacin de la expresin gnica AOE diferencial durante el
desarrollo perinatal temprano, en el que se observaron diferencias importantes
en comparacin con el embrin de pollo ms desarrollado, nunca se ha
estudiado.
La SOD puede ser particularmente importante como proteccin contra la
toxicidad aguda temprana del oxgeno de animales prematuros y, por lo tanto,
es inducida antes que la GPx o la catalasa (Crapo y Tierney, 1974; Yam, Frank y
Roberts, 1987). Sin embargo, un aumento en la actividad de la enzima SOD sin
induccin de GPx o catalasa podra dar como resultado un aumento en el
perxido de hidrgeno y los radicales hidroxilo, debido a la reaccin de Haber-
Weiss (Ditelberg, Sheldon, Epstein y Ferriero, 1996). Un desequilibrio en la
proporcin de SOD a GPx y catalasa puede, por lo tanto, resultar en un
aumento de la peroxidacin de lpidos (De Haan, Cristiano, Ianello & Kola,
1995). La hiperoxia aplicada a ratas adultas y prematuramente administradas
condujo a la induccin de enzimas SOD en tejido pulmonar (White, Ghezzi,
McMahon,
J. C. van Golde y otros J. Physiol. 509.1294
Dinarrello y Repine, 1989; Chen, Whitney y Frank, 1994). Nuestro estudio
corrobor este hallazgo. Sin embargo, los niveles de GPx y catalasa tambin
aumentaron en las ratas prematuramente entregadas, un hallazgo que no se
observ en embriones de pollo. En otro estudio, la exposicin de los embriones
de pollo a la hiperoxia (60%) durante 72 h en los das 16-18 del perodo de
incubacin no dio como resultado un aumento de los niveles de peroxidacin
lipdica (Stock, Silvernail & Metcalfe, 1990). Esta ausencia de peroxidacin
lipdica pudo haber sido el resultado de un aumento en la actividad AOE, como
se observ en nuestro estudio. Esto es apoyado por la presencia de lesin
pulmonar y la ausencia de un aumento en la actividad AOE en conejos
prematuros expuestos a hiperoxia 3 das antes del final de la gestacin (Frank y
Sosenko, 1991).
Hemos demostrado que la hiperoxia en el embrin de pollo en desarrollo
induce un aumento temporal en la actividad AOE. Este aumento depende de la
AOE, el rgano, el tiempo de incubacin y el tiempo de exposicin a la
hiperoxia. En otros estudios, queda por determinar si este aumento en la
actividad AOE es suficiente para evitar el dao celular. Adems, los estudios de
la regulacin de la expresin gnica diferencial proporcionara ms informacin
sobre el desarrollo del sistema de defensa AOE durante el desarrollo perinatal.
Aunque los resultados obtenidos utilizando este modelo animal son
interesantes, se necesitan ms estudios para determinar si nuestras
observaciones son relevantes para el ser humano prematuro.
Importante
Sin embargo, se podra suponer que cuando el sistema AOE inmaduro se
expone a hiperoxia, el sistema de rganos inmaduros podra activarse para
aumentar el nivel de AOE. La SOD puede ser particularmente importante como
proteccin contra la toxicidad aguda temprana del oxgeno de animales
prematuros y, por lo tanto, es inducida antes que la GPx o la catalasa
Hemos demostrado que la hiperoxia en el embrin de pollo en desarrollo
induce un aumento temporal en la actividad AOE. Este aumento depende de la
AOE, el rgano, el tiempo de incubacin y el tiempo de exposicin a la
hiperoxia. En otros estudios, queda por determinar si este aumento en la
actividad AOE es suficiente para evitar el dao celular. Adems, los estudios de
la regulacin de la expresin gnica diferencial proporcionara ms informacin
sobre el desarrollo del sistema de defensa AOE durante el desarrollo perinatal.
Aunque los resultados obtenidos utilizando este modelo animal son
interesantes, se necesitan ms estudios para determinar si nuestras
observaciones son relevantes para el ser humano prematuro.