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Fitopatologa Molecular

Curso 2012

BIOLOGA MOLECULAR DE
BACTERIAS FITOPATOGNICAS
Sumario

Interacciones planta-bacteria
La planta y su sistema defensivo
Bacterias fitopatgenas

Regulacin de factores de virulencia

Estrategias para desarrollar resistencia a


bacterias mediante ingeniera gentica
- Genes de resistencia
- Quorum quenching

Referencias

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas
Interacciones planta-bacteria

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas
Interacciones
planta-bacteria Eventos de sealizacin
que regulan la interaccin planta-bacteria

Resistencia
Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
a bacterias
fitopatgenas
La interaccin
planta-bacteria No se produce enfermedad cuando:
no siempre - La planta atacada no puede proveer los requerimientos
. necesarios para la multiplicacin del patgeno (resistencia
determina el . de no-hospedante)
desarrollo de - La planta posee defensas estructurales o bioqumicas
una enfermedad . preformadas. Slo los patgenos especializados
. completan una infeccin exitosa
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la
. planta y el patgeno resulta restringido en la zona inicial
. de la infeccin (resistencia especfica)
- Las condiciones externas cambian y el patgeno muere
. antes de llegar a una etapa en que la infeccin es
. irreversible

Se produce enfermedad cuando:

- Las condiciones externas son desfavorables


Resistencia - Las defensas preformadas son inadecuadas
a bacterias
fitopatgenas - La planta no detecta al patgeno y por ende no se producen
. respuestas defensivas inducidas (o se producen tardamente)
La especificidad
del patgeno
bacteriano y de
los genes de
resistencia de
la planta
determinan
diferentes tipos
de interaccin

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas

Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.


El modelo gen
El modelo de resistencia gen por gen (Flor, ca. 1940)
por gen explica
los casos de
compatibilidad de
incompatibilidad
planta-patgeno

Resistencia
a bacterias Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.
fitopatgenas Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr
del patgeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
La planta y su sistema defensivo

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas
El sistema inmune en plantas

1) Inmunidad inducida por molculas asociadas al patgeno (PTI):


Receptores de membrana (PRRs) que reconocen MAMPS o PAMPs. Ej.
Flagelina.

2) Inmunidad inducida por efectores del patgeno (ETI):


-Directo reconocimiento a travs de NB-LRR protenas (R)
ETI es una respuesta tipo PTI pero acelerada y amplificada que induce
resistencia y en general HR
Modelo de zigzag que cuantifica la respuesta de defensa

Jones and Dangl, 2006 nature. 444: 323


Localizacin
de protenas
de resistencia
y esquema
de sus
dominios
funcionales

Resistencia
a bacterias
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
fitopatgenas
Modelo de interaccin protena R/factor de avirulencia:
hiptesis de la protena guardiana

Interaccin

Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.


La planta y su sistema defensivo

Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistmica Adquirida (SAR)


en el sistema de genes RPS2-avrRPt2/RPM1-avrRPM1

Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.


Las respuestas Procesos defensivos inmediatos, locales y sistmicos
defensivas comprendidos en una respuesta inducible
inducibles por
patgenos
comprenden
diversos
mecanismos
moleculares

Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.

- Engrosamiento de la pared celular


- Induccin de genes involucrados en la sntesis
Respuesta de metabolitos secundarios
Resistencia defensiva - Sntesis de tioninas
a bacterias - Sntesis de protenas relacionadas con la defensa
fitopatgenas a patgenos
- Sntesis de cido salicilico Induccin de Resistencia
Sistmica Adquirida (SAR)
Genes involucrados en resistencia local a patgenos

Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.


Genes involucrados en resistencia sistmica a patgenos

Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.


Elicitor
Detection

Linear 1-3 glucan Flagellin

Necrotrophic Biotrophic
pathogen pathogen

Jasmonic
Salicylic
acid
acid
Ethylene

Necrotroph resistance Biotroph resistance

Biotroph susceptibility PDF 1.2 PR 1 Necrotroph susceptibility


Las Bacterias y los PAMPs (pathogen-
associated molecular pattern) Inducen el cierre
estomtico

Bacterias fitopatogenas

Bacterias y PAMPs
Bacterias fitopatgenas

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas
Las TOP 10
bacterias
Fitopatgena
s segun MPP

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Pseudomonas syringae pv.
tomato

Mansfield et al., Mol Plant Pathol.


2012 Aug;13(6):614-629.
Ralstonia solanacearum

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Agrobacterium tumefaciens

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Xanthomonas oryzae (oryzae)

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Xanthomonas campestris pathovars

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


XANTHOMONAS AXONOPODIS

Xanthomonas axonopodis pv. manihotis

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Infeccin por
Xanthomonas
axonopodis
(cancro de
los ctricos)

Resistencia
a bacterias Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
fitopatgenas

Sntomas de cancrosis en fruto, hoja y ramas de un Citrus.


Erwinia amylovora

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 ;13(:614-629.

http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it/Erwini
a%20amylovora.pdf
Xylella fastidiosa

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Dickeya (dadantii and solani))

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Pectobacterium carotovorum (and P.
atrosepticum)

Mansfield et al., Mol Plant Pathol. 2012 Aug;13(6):614-629.


Esquema de
una bacteria Principales componentes de la ultraestructura
fitopatgena de una bacteria fitopatgena tpica

Resistencia
a bacterias
Adaptado de: Llacer et al., Patologa Vegetal, 1996.
fitopatgenas
Bacterias fitopatgenas

Microscopa
electrnica
de una
clula de
Xhantomonas
con un flagelo
polar
500
nm

Microscopa
electrnica
de una
clula de
Pseudomonas
con flagelos
lofotricos
Microscopa electrnica de barrido de clulas
de Pseudomas syringae adheridas a la
superficie de un fruto de peral. Pueden
observarse las fimbrias que sirven como
elementos de unin.
Tomado de: Llacer et al., Patologa Vegetal, 1996.
Ciclo biolgico
de una bacteria
fitopatgena
con fase epfita

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas

Tomado de: Llacer et al., Patologa Vegetal, 1996.


Bacterias fitopatgenas observadas al microscopio de barrido

Ingreso y dispersin de fitobacterias por aperturas naturales

2 m

Tomado de: Llacer et al., Patologa Vegetal, 1996. Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Microscopa de barrido de la superficie Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudando


del envs de una hoja de peral. de los estomatas de hojas de cerezo infectadas
Se observan numerosas bacterias
colonizandola cavidad subestomtica
Micrografas de bacterias fitopatgenas

La mayor parte de las bacterias fitopatgenas se acumula


en el espacio extracelular o en el tejido vascular

A B A B
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Microscopa electrnica de Xanthomonas Microscopa electrnica de una seccin longitudinal (A)


campestris colonizando una hoja y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci
de Brassica. Las bacterias estn en el espacio intercelular del mesfilode hojas de tabaco.
generalmente rodeadas de un polisacrido
extracelular (EPS) y proliferan en estrecho
contacto con las paredes celulares (CW)
Factores bacterianos requeridos
para la patogenicidad
SIDEROFOROS FITOTOXINAS

GENES
EXOPOLISACARIDOS BACTERIA hrp

EXOENZIMAS FITOHORMONAS

BACTERIOCINAS
Genes hrp

Bttner D, Bonas U EMBO J. 2002 Oct 15;21(20):5313-22.


Genes hrp

Bttner D, Bonas U EMBO J. 2002 Oct 15;21(20):5313-22.


Conocidos efectores de Xanthomonas y otros fitopatogenos

Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:3743
Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:3743
Cdigo de unin al ADN de los efectores TAL

Heidi Scholze and Jens Boch. 2010. Virulence 1:5, 428-432


Las Bacterias y los PAMPs (pathogen-
associated molecular pattern) Inducen el cierre
estomtico
Fitotoxinas producidas por Pseudomonas spp

Bender et al., MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS,1999, p. 266292


Los estomas entonces.

-Las clulas guardianas pueden percibir a las bacterias y para ello el


receptor FLS2

-Para evitar la respuesta inmune que involucra a las clulas guardianas la


bacteria produce factores de virulencia especficos que le permiten reabrir
los estomas como una estrategia importante de patogenicidad.

-Los estomas, como parte de un sistema inmune integral, actan como


barreras de infecciones bacterianas.
Sntomas de algunas enfermedades bacterianas

Infeccin de tubrculos de papa


por Streptomyces scabies (escaras)

Infeccin de tubrculos de papa por Erwinia


carotovora subsp. atrosptica (podredumbre blanda)
Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.
Regulacin de factores de virulencia

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas
Un gran nmero
de bacterias Quorum sensing
Gram se
Mecanismo de comunicacin comunitario detectado
comunican . para diversas especies de bacterias
sintetizando,
Capacidad de los microorganismos de percibir y
secretando y . responder a la densidad poblacional a travs de la
respondiendo a . produccin de molculas difusibles de reducido peso
. molecular
compuestos
difusibles

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas Molculas seal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
El incremento de una poblacin bacteriana determina una
elevada concentracin de factores difusibles

Regulacin gnica dependiente de la densidad poblacional

Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.


El mecanismo Modelo simplificado de la transduccin
de quorum de seales en quorum sensing
sensing es
mediado por
moleculas
difusibles
como las acil-
homoserin
lactonas

Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.

Resistencia Clula bacteriana: protena I (azul), responsable de la sntesis de las seales


a bacterias difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; valos verdes). La protena R
fitopatgenas (rojo), sufre un cambio conformacional cuando se une a la seal A-HSL; acta
entonces como regulador transcripcional, alterando su afinidad por secuencias
promotoras especficas de los genes regulados por HSLs (lux box) .
Componentes
de la red Regulacin de factores de virulencia
en Ralstonia solanacearum
sensorial de
regulacin
en Ralstonia
solanacearum

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas

Modificado de: Scel, Annu. Rev. Phytopathol.,2000.


Otros sistemas de regulacin de virulencia en bacterias

Regulacin en Xanthomonas campestris

Gentileza de J. Maxwell Dow


Baja densidad celular Alta densidad celular
No/bajo DSF DSF

DSF
RpfC H-HisK RpfC H-HisK
D-Rec RpfF D-Rec RpfF
HPt
H H-HPt
RpfG D-Rec RpfG D-Rec
HD-GYP HD-GYP
Baja produccion de DSF Autoinduccion de DSF sintesis
No sintesis de factores de virulencia De
Factores de virulencia
RpfG D- Rec
HD-GYP
Degradacin enzimtica
Reduce los niveles de di-GMP cclico

di-GMP Cclico di-GMP Cclico

Formacin o dispersin Snthesis de enzimas extracelulares ,


de Biofilm sntesis de EPS
Formacin de biofilm
Motility

Ryan et al 2006. PNAS 103: 1123-1134.


Estrategias para desarrollar resistencia
a bacterias mediante ingeniera gentica

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas
La expresin del gen BS2 en tomate confiere
resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria

Control Transgnico BS2


Crecimiento bacteriano [log ufc/cm2)]

Tomado de: Tai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999.
Das despus de la inoculacin
Xcv (+ avrBS2) Xcv (+ avrBS2)
Transformacin
de arroz Resistencia a la
control infeccin de
con el gen transgnicas
Xanthomonas oryzae pv.
de resistencia oryzae en plantas
transformadas con el
Xa21 gen Xa21
A: cultivar Minghui 63-12
B: cultivar IR72-82

control
C
transgnicas

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
La interferencia
de la Posibles blancos y estrategias para interferir en la
comunicacin entre bacterias (quorum quenching)
comunicacin
entre bacterias
es una posible
estrategia
de resistencia
antimicrobiana

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Mecanismos que afectan la regulacin
mediada por homoserin lactonas

Enzimas degradadoras de A-
- HSLs

Organismo Molcula Funcin

Variovax paradoxus Actividad aminoacilasa DegradaA-HSLs

Bacillus sp. 240B1 A-HSLs lactonasa Degrada A-HSLs


Gen aiiA

Molculas imitadoras de las A- HSLs

Delisea pulchra Furanonas halogenadas Se unen a receptores de A-HSLs


Inhibenquorum sensing

Plantas superiores Diferentes compuestos Afectan sistema de quorum


(arroz, arveja, etc) sensing

Organismos A-HSLs oportunistas

Salmonella enterica Homlogos de protena Lux-R Reconocen las A -HSLs


(patgeno humano) Noproducen A- HSLs producidas por otros org.

Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.


Transformacin de plantas de papa con el gen
de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.

Cortes transversales de tubrculos de papa


inoculados con Erwinia carotovora.
A la izquierda: tubrculo de planta no transformada.
A la derecha: tubrculo de planta transformada con el
gen aiiA.

Inoculacin de hojas con Erwinia carotovora SCG1.


Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiA
Abajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas
Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.
Las plantas A B
que expresan
A: detalle de una hoja
N-acil-homo de una planta
transgnica infectada
serin lactona con Erwinia carotovora
B: hoja de una planta
exhiben luego de la infeccin

mayor
resistencia
a Erwinia
carotovora
Porcentajes de
infeccin observados
para dos lneas
transgnicas (barras
verde y anaranjada) y
de una planta control,
no transgnica (barra
violeta).

Resistencia
a bacterias
fitopatgenas

Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.


Referencias 1. Carmona, M.J., Molina, A., Fernndez, J.A., Lpez-Fando, J. J. and
Garca Olmedo, F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco
confers enhanced resistance to bacterial pathogens. The Plant Journal,
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2. De Gray, G., Rajasekaran, K., Smith, F., Sanford, J. and Daniell, H.
Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to
control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology, 127:852-
862, 2001.
3. Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B. and Zhang, L.H.
Quenching quorum-sensing-dependent bacterial Infection by an N-acyl
homoserine lactonase. Nature, 411:813-817, 2001.
4. Fray, R.G. Altering Plant-Microbe interactions through artificially
manipulating bacterial Quorum-sensing. Annals of Botany, 89:245-248,
2002.
5. Loh, J., Pierson, E.A., Pierson, L.S., Stacey, G. and Chatterjee, A.
Quorum sensing in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant
Biology, 5:1369-1375, 2002.
6. Mae, A., Montesano, M., Koiv, M. and Palva, E.T. Transgenic Plants
producing the bacterial pheromone N-acyl-homoserine lactone exhibit
enhanced resistance to the bacterial phytopathogen Erwinia carotovora.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 14:1035-1042, 2001.
7. Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen,
M.C., Stall, R.E. and Staskawicz, B.J. Expression of the Bs2 pepper
Resistencia
a bacterias gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato. Proceedings
fitopatgenas of the Natural Academy of Sciences U.S.A., 96:14153-14158, 1999.