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PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA NCh3087.c2007

Miel de abejas - Determinacin de la actividad de diastasa

Prembulo

El Instituto Nacional de Normalizacin, INN, es el organismo que tiene a su cargo el

estudio y preparacin de las normas tcnicas a nivel nacional. Es miembro de la
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION
PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos
organismos.

Este proyecto de norma se estudi a travs del comit tcnico Miel, dentro del marco del
proyecto BID-ATN/ME-8532-RG, para establecer el mtodo de ensayo de determinacin de la
actividad de diastasa en miel de abeja.

Este proyecto de norma es idntico a la versin en ingls de la recomendada por la Norma

Internacional CODEX STAN 12 - 1981, Rev. 1 (1987), Rev. 2 (2001), Revised Codex
Standard for Honey - 2.2.2 Determination of diastasa activity after Schade: Chapter 1.6.1
Determination of diastasa activity after Schade - Harmonized Methods of the European Honey
Commission - Apidologie - Special Issue 28, 1997.

Para los propsitos de este proyecto de norma se han realizado los cambios editoriales que se
indican y justifican en Anexo C.

El proyecto de norma NCh3087 ha sido preparado por la Divisin de Normas del Instituto
Nacional de Normalizacin.

Los Anexos A, B y C no forman parte del proyecto de norma, se insertan slo a ttulo
informativo.

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PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA NCh3087.c2007

Miel de abejas - Determinacin de la actividad de diastasa

1 Alcance y campo de aplicacin

1.1 Esta norma establece el mtodo para determinar la actividad de diastasa en la miel de
abejas.

1.2 Este mtodo puede ser usado para todas las muestras de miel de abejas.

2 Referencias normativas

El documento referenciado siguiente es indispensable para la aplicacin de esta norma.

Para referencias con fecha, slo se aplica la edicin citada. Para referencias sin fecha se
aplica la ltima edicin del documento referenciado (incluyendo cualquier enmienda).

NCh426/2 Agua grado reactivo para anlisis - Especificaciones - Parte 2: Anlisis

fsico-qumico y microbiolgico de agua potable, aguas crudas y aguas
residuales.

3 Trminos y definiciones

Para los propsitos de esta norma, se aplican los trminos y definiciones siguientes:

3.1 actividad de diastasa en miel: tiempo de reaccin, en el cual una masa definida de
miel degrada una cantidad dada de almidn hasta un punto final preestablecido. Se indica
como nmero de diastasa (ND).

3.2 nmero de diastasa: cantidad de enzima en 1 g de miel que degrada a 0,01 g de

almidn en el punto final preestablecido, en 1 h a 40C, bajo las condiciones indicadas en
este mtodo. Los resultados son expresados en unidades Gothe (o unidades Schade) por
gramo de miel

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4 Principio del mtodo

Valoracin colorimtrica de una solucin estndar de almidn, capaz de desarrollar, con yodo,
un color en un rango definido de intensidad al actuar sobre la enzima de la muestra bajo
condiciones estndar. La disminucin del color azul se mide a intervalos, mediante un
espectrofotmetro. Se utiliza un grfico de la absorbancia en funcin del tiempo, o una
ecuacin de regresin para determinar el tiempo t x requerido para lograr la absorbancia
especificada, 0,235.

5 Aparatos

Los equipos que correspondan deben tener mantenimiento, calibracin y/o verificacin
vigente.

5.1 Balanza analtica, con resolucin de 0,1 mg.

5.2 Espectrofotmetro, que permita efectuar mediciones a 660 nm.

5.3 Celdas del espectofotmetro, de 1 cm.

5.4 Bao de agua termorregulado, controlado a 40C 0,2C.

5.5 Material volumtrico clase A, segn corresponda.

5.6 Tamiz de acero inoxidable, malla de 0,5 mm.

5.7 Pesa filtro, de 5 cm de dimetro y 3 cm de altura.

5.8 Cronmetro.

6 Reactivos y soluciones

6.1 Agua para anlisis, Clase 2 segn NCh426/2.

6.2 Solucin de cloruro de sodio

Disolver 2,9 g de cloruro de sodio en agua y diluir a 100 ml.

6.3 Solucin tampn de acetato de sodio (pH=5,3)

Disolver 43,5 g de acetato de sodio (CH3COONa x 3 H2O) en agua, ajustar el pH a 5,3

con aproximadamente 5 ml de cido actico glacial y diluir a 250 ml con agua.

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6.4 Solucin de almidn

6.4.1 Determinacin de la masa seca de almidn

Distribuir aproximadamente 2 g de almidn soluble previamente secado al aire, en una capa

fina, en un pesafiltro (5 cm de dimetro y 3 cm de altura) con tapa. Pesar con la exactitud de
( 0,1 mg) y secar por 90 min a 130C. Dejar enfriar el pesafiltro cerrado por 1 h en un
desecador, y pesar nuevamente con la misma exactitud.

6.4.2 Preparacin de la solucin de almidn

Pesar 2,000 g de almidn anhidro en un Erlenmeyer de 250 ml, agregar 90 ml de agua y

mezclar con agitacin. Calentar la suspensin obtenida a ebullicin suave y agitar
constantemente por 3 min. Transferir inmediatamente la solucin caliente a un matraz
aforado de 100 ml. Enfriar rpidamente bajo una corriente de agua a temperatura ambiente.
Aforar con agua destilada y mezclar con agitacin.

NOTAS

1) Preparar la solucin en el momento que se va usar.

2) Usar solamente almidn soluble de manera que su solucin sea tranparente y azl (ver 7.3).

6.5 Solucin stock de yodo

Disolver 11,0 g de yodo dos veces sublimado y 22,0 g de yoduro de potasio en 30 ml a

40 ml de agua y diluir a 500 ml. La solucin stock se puede guardar aproximadamente por
un ao en una botella oscura y cerrada.

6.6 Solucin diluida de yodo

Disolver 20,0 g de yoduro de potasio en agua, agregar 2 ml de solucin stock de yodo y

diluir a 500 ml. Esta solucin de yodo diluida se debe preparar en el momento que se va a
usar y se debe proteger del aire. Cada vez que se use la solucin, se debe cerrar
inmediatamente el matraz.

7 Procedimiento

7.1 Preparacin de la muestra para el ensayo

Para el anlisis utilizar una muestra para ensayo de al menos 200 g.

7.1.1 Miel lquida o cristalizada sin impurezas

Homogeneizar la muestra para ensayo sin calentar evitando la entrada de aire.

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7.1.2 Miel Lquida o cristalizada con impuerezas

Eliminar las impurezas de la miel (como ceras, restos de vegetales o de abejas), a temperatura
ambiente ya sea mediante un tamiz de 0,5 mm o manualmente mediante una esptula.

7.1.3 Miel en paneles

Si el panal est cerrado, primero debe ser desoperculado, a continuacin con ayuda de un
tamiz de 0,5 mm, la miel sin calentar se debe separar completamente del panal.

7.2 Preparacin de la solucin de muestra

Pesar 10,0 g de miel en un vaso de precipitado, disolver completamente sin calentar en 20 ml

de agua y agregar 5 ml de solucin tampn de acetato de sodio. Transferir la solucin a un
matraz aforado que contiene 3 ml de solucin de cloruro de sodio y aforar con agua destilada.

NOTAS

1) Es importante que la miel disuelta sea tamponada antes de estar en contacto con el cloruro de sodio,
debido a que a valores de pH bajo 4,0 en presencia de cloruro de sodio se reduce rpidamente la
actividad de diastasa.

2) Preparar la solucin de muestra antes de la determinacin ya que slo se conserva por unas horas sin que
se altere.

7.3 Estandarizacin de la solucin de almidn/Ajuste al valor azul

Determinar la cantidad de agua que se debe agregar a la mezcla de reaccin de manera

que la absorbancia de la solucin yodo-almidn est en el rango de 0,745 a 0,770.

En seis matraces adecuados o tubos de ensayo incorporar agua en secuencia aritmtica

creciente, 20 ml, 21 ml, 22 ml, 23 ml, 24 ml y 25 ml y agregar y 5 ml de solucin de
yodo diluida en cada uno.

Empezar con el primer matraz o tubo de ensayo y agregar 0,5 ml de una mezcla que
contiene 10 ml de agua y 5 ml de solucin diluida de almidn, mezclar bien mediante
agitacin e inmediatamente leer la absorbancia a 660 nm contra un blanco de agua en
una cubeta de 1 cm.

Proceder de la misma manera con los otros tubos de ensayo, hasta obtener una
absorbancia en el rango de 0,745 a 0,770.

La cantidad de agua determinada de esta manera es la dilucin estndar para cada

determinacin realizada con la solucin de almidn.

NOTA - El tiempo transcurrido desde la adicin de la solucin de almidn diluida a la determinacin de la

absorbancia debe ser lo ms constante posible, debido a la variacin del color con el tiempo, tanto en la
estandarizacin como en la determinacin de la actividad de diastasa. En el caso de que en la primera
dilucin (20 ml) se obtenga una absorbancia menor que 0,745 o que en la ltima dilucin (25 ml) la
absorbancia sea mayor que 0,770, el almidn empleado no es adecuado para la determinacin de la
actividad de diastasa por este mtodo.
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7.4 Determinacin

7.4.1 Pipetear 10 ml de la solucin de miel en un matraz de 50 ml y colocarlo en un

bao de agua a 40C 0,2C con un segundo matraz que contiene 10 ml de solucin
de almidn. Despus de 15 min, pipetear 5 ml de la solucin de almidn y agregar a la
solucin de miel, mezclar y comenzar a medir el tiempo. A intervalos peridicos, durante
la primera vez despus de 5 min, retirar alcuotas de 0,5 ml y agregar rpidamente a
5 ml de solucin diluida de yodo. Agregar la cantidad de agua (como se determin en la
estandarizacin de la solucin de almidn), mezclar bien e inmediatamente leer la
absorbancia de cada solucin separada a 660 nm contra un blanco de agua en una celda
de 1 cm

NOTAS

1) Los intervalos de tiempo despus de la primera extraccin desde el matraz de reaccin se debe cronometrar de
tal manera que se obtengan de tres a cuatro valores en un rango de las dos absorbancias 0,456 y 0,155
(rango lineal).

2) En Figura 1 se muestra un ejemplo de en sistema de reaccin para determinar la actividad de diastasa.

3) El mtodo establecido en DIN 10750 utiliza 0,301 como factor de absorbancia.

El cuadro siguiente entrega los valores de intervalos de tiempo:

Absorbancia a t = 5 min Intervalo de tiempo

A >0,658 10 min o ms

0,658> A > 0,523 5 min a 10 min

0,523 > A >0,456 2 min a 5 min

Si la absorbancia a t = 5 min es menor que 0,350 se recomienda que el tiempo de reaccin

para la primera determinacin se reduzca de manera adecuada.

7.4.2 Blanco de reaccin

A 10 ml de la solucin de muestra (ver 7.2) agregar 5 ml de agua y mezclar vigorosamente.

Extraer 0,5 ml de esta solucin y agregar a 5 ml de solucin diluida de yodo. Agregar la
cantidad de agua determinada en la estandarizacin de la solucin de almidn, mezclar bien y
leer la absorbancia a 660 nm contra un blanco de agua en una celda de 1 cm. Si el blanco da
un valor de absorbancia, ste debe ser sustrado de los valores obtenidos en la determinacin
de la solucin de ensayo.

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8 Clculo y expresin de los resultados

8.1 Calcular la actividad diastasa como nmero de diastasa (ND), utilizando la frmula
siguiente:

60 min 0,10 1,0 300

ND = =
tx 0,01 2,0 tx

en que:

tx = tiempo de reaccin, expresado en minutos (min).

Graficar sobre un papel milimetrado los valores de absorbancia de las soluciones de

muestra contra los tiempos de reaccin correspondientes en minutos, previa correccin
del blanco, si es necesario. Trazar la regresin lineal a travs de los puntos de medicin
en el rango de A= 0,155 a 0,456 para determinar el tiempo t x para una absorbancia de
A= 0,235. El tiempo para A= 0,235 se puede calcular tambin a partir de la ecuacin
de regresin y esto se prefiere a la interpolacin grfica.

8.2 El resultado se redondea al 0,1.

9 Precisin del mtodo

La precisin de este mtodo de anlisis fue determinado por anlisis estadstico de

resultados de ensayos interlaboratorios con un nivel de probabilidad de 95% de confianza
(ver Anexo A).

9.1 Repetibilidad, r

La diferencia entre dos resultados de ensayos sucesivos, obtenidos por el mismo operador,
con el mismo equipo bajo condiciones constantes de operacin sobre material de ensayo
idntico, slo en un caso de 20 puede exceder lo indicado en Tabla A.1.

R = -1,424 4 x 10-5 ND2 + 0,024 1 x ND + 0,179 99

9.2 Reproducibilidad, R

La diferencia entre dos resultados de ensayos simples e independientes, obtenidos por

operadores diferentes, que trabajan en laboratorios diferentes, con equipos diferentes, bajo
diferentes condiciones sobre material de ensayo idntico, puede exceder lo indicado en
Tabla A.1 slo en un caso de 20.

R = 0,006 82 x ND2 - 0,237 x ND + 3,490 6

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10 Informe de resultado

El informe de resultados debe incluir, a lo menos, la informacin siguiente:

Nombre y direccin del laboratorio donde se efectuaron los ensayos.

Nombre y direccin del solicitante.

Identificacin de la muestra.

Fecha y sistema de muestreo.

Fecha de recepcin de la muestra.

Fecha y hora de inicio y trmino de ensayo de la muestra.

Identificacin del mtodo utilizado.

Resultados.

Nombre y firma del responsable.

Sistema de calidad del laboratorio, si existe (por ejemplo: ISO 17025).

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Anexo A
(Informativo)

Se realizaron ensayos interlaboratorios en 1992. Los valores siguientes de r y R se

calcularon para nueve mieles con nmero de diastasa ND en el rango entre 7,7 y 37,7.

Tabla A.1

ND 8,7 14,2 16,4 19,5 23,6 24,2 25,5 29,8 37,7

r 0,64 2,15 1,48 0,92 1,20 3,07 1,87 2,06 5,35

R 5,45 9,01 10,40 10,22 12,33 13,93 15,82 15,79 23,68

Las ecuaciones siguientes de correlacin se calcularon a partir de estos datos:

r = -0,721 + 0,126 ND.

R = -0,057 1 + 0,587 ND.

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Anexo B
(Informativo)

Bibliografa

[1] J.E. Schade, G.L. Marsh and J.E. Eckert: Diastase activity and
hydroxymethylfurfural in honey and their usefulness in detecting heat adulteration.
Food Research 23, 446-463 (1958).

[2] H. Hadorn and K. Zrcher: Eine einfache kinetische Methode zur Bestimmung der
Diastasezahl in Honig. Deutsche Lebensmittel Rundschau 68, 209-216 (1972).

[3] J.W. White and F.W. Pairent: Report on the analysis of honey. J. Assoc. off Agric.
Chemists, 42, 341-348 (1959).

[4] DIN-Norm 10750 Bestimmung der Diastase-Aktivitt, (1990).

[5] Codex Alimentarius Standard for honey, Ref. N CL 1993/14-SH, FAO and WHO,
Rome (1993).

[6] S. Bogdanov and P. Lisher, Interlaboratory Trial of the International Honey Commission,
Phadebas and Schade Diastase Determination Methods, Humidity by Refractometry and
Invertase Activity: Report for the participants (1993).

[7] DIN 10750:1995 Untersuchung von Honig - Bestimmung der Diastase Aktivitt.
revisada 2000

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