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Transmisión

Transmisión

Antecedentes:

1924

De Broglie1924 describió el movimiento de los electrones

De Broglie

describió el movimiento de los electrones

1926

Busch1926 los campos magnéticos con la dimensión y forma apropiada pueden utilizarse como lentes para enfocar

Busch

los campos magnéticos con la dimensión y forma apropiada pueden utilizarse como lentes para enfocar un haz de electrones

1932

Knoll y Ruska1932 Diseñan el primer me con dos lentes

1932 Knoll y Ruska Diseñan el primer me con dos lentes

Diseñan el primer me con dos lentes

Berlín

electromagnéticas de aumento y un haz de electrones

1935

EL PRIMER ME de alta resolución

EL PRIMER ME de alta resolución

1939

Alemania (SIEMENS y AEG)

Alemania (SIEMENS y AEG)

1939 Alemania (SIEMENS y AEG) COMERCIALIZACIÓN.

COMERCIALIZACIÓN.

TIPOS DE ME:

TEM

ME transmsiónTIPOS DE ME: TEM CEM (Conventional EM) CTEM (Conventional TEM) Transmission electron microscope SEM ME de

TIPOS DE ME: TEM ME transmsión CEM (Conventional EM) CTEM (Conventional TEM) Transmission electron microscope SEM

CEM (Conventional EM) CTEM (Conventional TEM)

Transmission electron microscope

SEM

ME de barridoCTEM (Conventional TEM) Transmission electron microscope SEM Scanning electron microscope OTROS TIPOS STEM HVEM

TEM) Transmission electron microscope SEM ME de barrido Scanning electron microscope OTROS TIPOS STEM HVEM

Scanning electron microscope

OTROS TIPOS

STEM

HVEM

Combinación de TEM y SEMbarrido Scanning electron microscope OTROS TIPOS STEM HVEM ME de alto voltaje Scanning transmission electron microscope

microscope OTROS TIPOS STEM HVEM Combinación de TEM y SEM ME de alto voltaje Scanning transmission

ME de alto voltajemicroscope OTROS TIPOS STEM HVEM Combinación de TEM y SEM Scanning transmission electron microscope cortes más

TIPOS STEM HVEM Combinación de TEM y SEM ME de alto voltaje Scanning transmission electron microscope

Scanning transmission electron microscope

cortes más gruesos

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO EN ESENCIA

Fundamentos:

Las radiaciones electromagnéticas poseen una longitud de onda de propagación muy corta.EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO EN ESENCIA Fundamentos: Los electrones se desvían de su trayectoria recta de propagación

Los electrones se desvían de su trayectoria recta de propagación cuando atraviesan un campo magnético circular.poseen una longitud de onda de propagación muy corta. Al producirse un alto vacío los electrones

Al producirse un alto vacío los electrones se desprenden de la fuente luminosa formada por wolframio incandescente.propagación cuando atraviesan un campo magnético circular. Fuente y flujo de electrones La fuente es un

Fuente y flujo de electrones

La fuente es un cátodo constituido por un filamento de wolframio incandescente.por wolframio incandescente. Fuente y flujo de electrones Los electrones son térmicamente arrancados a baja

Los electrones son térmicamente arrancados a baja velocidad.constituido por un filamento de wolframio incandescente. Los electrones son acelerados mediante la creación de un

Los electrones son acelerados mediante la creación de un alto potencial (cilindro de Wehnelt), el cual permite una trayectoria rectilínea de los electrones de muy baja longitud de onda.electrones son térmicamente arrancados a baja velocidad. Los electrones se desvían de su trayectoria al atravesar

Los electrones se desvían de su trayectoria al atravesar un campo electromagnético (lente electromagnética).rectilínea de los electrones de muy baja longitud de onda. La desviación se acentúa al colocar

La desviación se acentúa al colocar varias lentesun campo electromagnético (lente electromagnética). Un haz muy desviado, muy abierto, se recoge en una pantalla

Un haz muy desviado, muy abierto, se recoge en una pantalla fluoroscópica para poder ser visible al ojo humano.al atravesar un campo electromagnético (lente electromagnética). La desviación se acentúa al colocar varias lentes

Un MET consta fundamentalmente de:

Una columnaUn MET consta fundamentalmente de: Un Sistema de vacío Una fuente de alta tensión eléctrica Un

Un Sistema de vacíoUn MET consta fundamentalmente de: Una columna Una fuente de alta tensión eléctrica Un sistema de

Una fuente de alta tensión eléctricaUn MET consta fundamentalmente de: Una columna Un Sistema de vacío Un sistema de refrigeración Un

Un sistema de refrigeraciónconsta fundamentalmente de: Una columna Un Sistema de vacío Una fuente de alta tensión eléctrica Un

Un control de mandosfundamentalmente de: Una columna Un Sistema de vacío Una fuente de alta tensión eléctrica Un sistema

Una columna Un Sistema de vacío Una fuente de alta tensión eléctrica Un sistema de refrigeración

La COLUMNA consta de:

Fuente de iluminación (cañón de electrones)La COLUMNA consta de: Las lentes El sistema de visualización El diseño básico de la columna

Las lentesconsta de: Fuente de iluminación (cañón de electrones) El sistema de visualización El diseño básico de

El sistema de visualizaciónFuente de iluminación (cañón de electrones) Las lentes El diseño básico de la columna es comparable

El diseño básico de la columna es comparable al microscopio de luz

Comparación entre el diseño de un microscopio de luz y un TEM.

Comparación entre el diseño de un microscopio de luz y un TEM.

El cañón de electrones es un sistema que genera un flujo de electrones con la velocidad y dirección adecuadas. Está formado por:

Un filamento o cátodocon la velocidad y dirección adecuadas. Está formado por: Un ánodo perforado Un cilindro protector (cilindro

Un ánodo perforadola velocidad y dirección adecuadas. Está formado por: Un filamento o cátodo Un cilindro protector (cilindro

Un cilindro protector (cilindro de Wehnelt)flujo de electrones con la velocidad y dirección adecuadas. Está formado por: Un filamento o cátodo

adecuadas. Está formado por: Un filamento o cátodo Un ánodo perforado Un cilindro protector (cilindro de

Filamento (o cátodo) de wolframio (tungsteno) o hexacarburo de lantano:

1. Está conectado a una fuente de alta tensión

2. La diferencia de potencial ánodo-cátodo hace que los electrones adquieran energía

3. Son acelerados hacia el ánodo

4. El cilindro protector tiene la base perforada, garantizando la orientación correcta de los electrones.

hacia el ánodo 4. El cilindro protector tiene la base perforada, garantizando la orientación correcta de

La columna consta de:

Fuente de iluminación (cañón de electrones)La columna consta de: Las lentes El sistema de visualización

Las lentesLa columna consta de: Fuente de iluminación (cañón de electrones) El sistema de visualización

El sistema de visualizaciónLa columna consta de: Fuente de iluminación (cañón de electrones) Las lentes

Las lentes son bobinas electromagnéticas por las que circula corriente eléctrica generando un campo electromagnético.

Las lentes son bobinas electromagnéticas por las que circula corriente eléctrica generando un campo electromagnético.

Los primeros microscopios incluían tres lentes:

CondensadorLos primeros microscopios incluían tres lentes: Objetivos Lente proyectora

ObjetivosLos primeros microscopios incluían tres lentes: Condensador Lente proyectora

Lente proyectoraLos primeros microscopios incluían tres lentes: Condensador Objetivos

Los primeros microscopios incluían tres lentes: Condensador Objetivos Lente proyectora

El inyector de muestra se sitúa entre el condensador y el objetivo

El inyector de muestra se sitúa entre el condensador y el objetivo
El inyector de muestra se sitúa entre el condensador y el objetivo

Los microscopios modernos poseen más lentes:

2 ó más condensadores

2

ó más condensadores

Lentes intermedias

Lentes intermedias

2 ó más lentes proyectoras

2

ó más lentes proyectoras

modernos poseen más lentes: 2 ó más condensadores Lentes intermedias 2 ó más lentes proyectoras

Las lentes intermedia y proyectoras

Se sitúan por debajoLas lentes intermedia y proyectoras Magnifican la imagen obtenida Magnifican aumentos en función del campo magnético

Magnifican la imagen obtenidaLas lentes intermedia y proyectoras Se sitúan por debajo Magnifican aumentos en función del campo magnético

Magnifican aumentos en función del campoLas lentes intermedia y proyectoras Se sitúan por debajo Magnifican la imagen obtenida magnético obtenido

magnético obtenido

Se sitúan por debajo Magnifican la imagen obtenida Magnifican aumentos en función del campo magnético obtenido

Además, existen diafragmas o aperturas de las lentes que son atravesados por el haz de electrones

Además, existen diafragmas o aperturas de las lentes que son atravesados por el haz de electrones
Microscopio electrónico de transmisión

Microscopio electrónico de transmisión

Microscopía electrónica de transmisión

Microscopía electrónica de transmisión
Microscopía electrónica de transmisión

PORTAOBJETOS

Se utilizan rejillas de cobre, níquel o rodio. El haz de electrones no atravesaría el vidrio. Los obstáculos al paso de los electrones:

La propia muestrarodio . El haz de electrones no atravesaría el vidrio. Los obstáculos al paso de los

Entramado de la rejillao rodio . El haz de electrones no atravesaría el vidrio. Los obstáculos al paso de

Portamuestras (rejilla)

Portamuestras (rejilla)

Para visualizar la imagen originada por los electrones es necesario convertir la imagen visible por el ojo humano.

Esta imagen se puede obtener de dos maneras

Visualización directa en una pantalla fluorescenteel ojo humano. Esta imagen se puede obtener de dos maneras Mediante la génesis de una

Mediante la génesis de una imagen fotográfica o digitalizadavisible por el ojo humano. Esta imagen se puede obtener de dos maneras Visualización directa en

Resolución del microscopio electrónico

Poder de resolución: Capacidad de distinguir como dos imágenes distintas dos puntos muy cercanos. Distancia mínima entre dos puntos para que puedan distinguirse:

* Ojo humano: 0,23 mm = 230 mm = 23 X 10 4 nm

* Mic. óptico: 0,23 mm X 1000 = 23 X 10 7 nm

* Mic. Electrón: 0,23 mm X 1000 X 240 = 23 X 240 X 10 7 nm

Resolución del microscopio electrónico

Ecuación de Abbe:

Resolución del microscopio electrónico Ecuación de Abbe: AN puede variarse para disminuir el LR. depende del

AN puede variarse para disminuir el LR. depende del voltaje aplicado, que según la

Ecuación de De Broglie:

de Abbe: AN puede variarse para disminuir el LR. depende del voltaje aplicado, que según la

Al emitirse un haz de electrones puede ocurrir:

1. Transmisión de electrones a través de la muestra

2. Retrodispersión de electrones (electrones primarios)

3. Emisión de electrones de la propia muestra (electrones secundarios)

4. Emisión de otras radiacciones

primarios) 3. Emisión de electrones de la propia muestra (electrones secundarios) 4. Emisión de otras radiacciones

Formación de la imagen

1. Los electrones no dispersados descienden hasta

impactar con la pantalla.

2. Los electrones dispersados, dependiendo del ángulo,

pueden abandonar el campo de visión

impactar con la pantalla. 2. Los electrones dispersados, dependiendo del ángulo, pueden abandonar el campo de

Preparación de muestras para TEM

ÿ Inclusión y corte fino

ÿ Desintegración y obtención de extensiones

ÿ Réplicas de superficie

muestras para TEM ÿ Inclusión y corte fino ÿ Desintegración y obtención de extensiones ÿ Réplicas

Inclusión y corte

Inclusión y corte
Inclusión y corte

Fijación de la muestra

Fijación física (criofijación)

Inmersión en propano líquido Impacto metálico

Fijación química

Glutaraldehido 2 % Paraformaldehido 6 % Mezclas de fijadores

Post-fijación

Tetróxido de osmio 1 %

química Glutaraldehido 2 % Paraformaldehido 6 % Mezclas de fijadores Post-fijación Tetróxido de osmio 1 %

Inclusión en resina

Lavado

Deshidratación (acetona o metanol)

Aclaramiento (óxido de propileno)

Infiltración

Resinas acrílicas (Lowicryl) Resinas epoxi (Epon)

Confección de los bloques

(óxido de propileno) Infiltración Resinas acrílicas (Lowicryl) Resinas epoxi (Epon) Confección de los bloques

Preparación de rejillas

Realización de cortes con Ultramicrotomo Ultracriotomo

Colocación sobre rejillas

Realización de cortes con Ultramicrotomo Ultracriotomo Colocación sobre rejillas Microscopía Electrónica

Microscopía

Electrónica

Realización de cortes con Ultramicrotomo Ultracriotomo Colocación sobre rejillas Microscopía Electrónica

REALIZACIÓN DE SEMIFINOS: Por ello es frecuente hacer secciones de 0.5 a 1-2 µm de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener áreas más grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtención de las secciones ultrafinas.

suelen tener áreas más grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtención de

REALIZACIÓN DE ULTRAFINOS: Secciones de 10 a 100 nm de grosor con el ultramicrotomo.

REALIZACIÓN DE ULTRAFINOS: Secciones de 10 a 100 nm de grosor con el ultramicrotomo.

Portamuestras (rejilla)

Portamuestras (rejilla)

Película de soporte (Formvar)

Película de soporte (Formvar)

Contraste de los cortes

Acetato de uranilo Lavado Citrato de plomo Lavado Secado

Contraste de los cortes Acetato de uranilo Lavado Citrato de plomo Lavado Secado

Preparación de muestras para TEM

ÿ Inclusión y corte fino

ÿ Desintegración y obtención de extensiones

ÿ Réplicas de superficie

muestras para TEM ÿ Inclusión y corte fino ÿ Desintegración y obtención de extensiones ÿ Réplicas

ESTUDIO DE EXTENSIONES

Deben ser finas para estudiarlas con distintos métodos de contraste.

Son ejemplos:

1. Contraste negativo de extensiones (1955)

2. Sombreado metálico (1946)

Contraste negativo de extensiones

Los pasos a seguir son:

1. Fijación

2. Embeber el material en fase líquida que rodea las partículas

3. Secar: Se forma una película sólida densa a los electrones

el material en fase líquida que rodea las partículas 3. Secar: Se forma una película sólida

Contraste negativo de extensiones

Las partículas se observan claras y rodeadas de material oscuro (efecto contrario). Da un aspecto tridimensional: se resalta el relieve de la muestra

claras y rodeadas de material oscuro (efecto contrario). Da un aspecto tridimensional: se resalta el relieve
claras y rodeadas de material oscuro (efecto contrario). Da un aspecto tridimensional: se resalta el relieve

Contraste negativo de extensiones

Los materiales son sales de metales pesados muy solubles en agua (no precipita) y de pequeño tamaño:

1. Sales de fosfotungstato

2. Sales de Uranilo

3. Sales de Cadmio

4. Sales de Molibdeno

Mitocondria tras un choque hipotónico. Contraste negativo con fosfotungstato

Mitocondria tras un choque hipotónico. Contraste negativo con fosfotungstato

TEM, tinción negativa

TEM, tinción negativa Actina F Bacteriófago T4
TEM, tinción negativa Actina F Bacteriófago T4

Actina F

Bacteriófago T4

TEM, tinción negativa

TEM, tinción negativa ADN y cápside, bacteriófago T4

ADN y cápside, bacteriófago T4

Sombreado metálico

Se usan metales pesados, pero no sus sales.

El metal se evapora sobre su superficie, sólo a un lado de la muestra y queda la sombra del otro lado

pero no sus sales. El metal se evapora sobre su superficie, sólo a un lado de

Sombreado metálico

La imagen que se observa es la de un objeto oscuro junto a una sombra clara.

Se pueden obtener imágenes invertidas.

Puede ser unidireccional (un foco de evaporación) o rotatorio (la estructura queda bien delimitada).

Sombreado metálico

Los metales más usados son:

1. Platino

2. Paladio

3. Iridio

4. Tungsteno

5. Tántalo

Sombreado metálico

Es muy útil para estudiar macromoléculas como:

1. Filamentos

2. Ácidos nucleicos

TEM, sombreado

Miosina

TEM, sombreado Miosina

Virus del Mosaico del Tabaco

TEM, sombreado

Virus del Mosaico del Tabaco TEM, sombreado TEM, tinción negativa

TEM, tinción negativa

Virus del Mosaico del Tabaco TEM, sombreado TEM, tinción negativa

Preparación de muestras para TEM

ÿ Inclusión y corte fino

ÿ Desintegración y obtención de extensiones

ÿ Réplicas de superficie

muestras para TEM ÿ Inclusión y corte fino ÿ Desintegración y obtención de extensiones ÿ Réplicas

Réplicas de superficie

Consiste en la copia de la superficie fina y transparente para su observación al TEM. Se utilizan materiales plásticos.

Consiste en la copia de la superficie fina y transparente para su observación al TEM. Se

Réplicas de superficie

1.Se utilizan materiales plásticos, carbono y materiales similares. Las más resistentes son las plásticas.

2. La separación se hace por medios químicos como disolución, oxidación o digestión de la muestra

son las plásticas. 2. La separación se hace por medios químicos como disolución, oxidación o digestión

Réplicas de superficie

Algunas veces se sombrea antes de recoger la réplica

Réplicas de superficie Algunas veces se sombrea antes de recoger la réplica

Criotécnicas

Su finalidad es reducir los cambios introducidos por protocolos químicos convencionales.

Suelen comenzar por una criofijación

Las ventajas:

1. Se reduce la perdida de componentes solubles (no hay extracción) 2. Se conserva mejor la conformación molecular: FACILIDAD DE DETECTAR ANTIGENOS.

Criotécnicas

Desventajas:

1. No suelen ser de rutina

2. Aparataje especial.

Ejemplos:

1. Criofractura

2. Criograbado.

Criofractura

Criofractura

Criofractura y réplica. Criograbado

1.

Criofijación

2.

Fractura

3.

Sublimación del hielo en vacio

4.

Réplica

5.

Eliminar la muestra biológica

6.

Sombreado

3. Sublimación del hielo en vacio 4. Réplica 5. Eliminar la muestra biológica 6. Sombreado

Criofractura y sombreado

Criofractura y sombreado Célula Vegetal

Célula Vegetal

TEM Criofractura y sombreado

Cloroplasto

TEM Criofractura y sombreado Cloroplasto Unión gap, Miocardiocito

Unión gap, Miocardiocito

TEM Criofractura y sombreado Cloroplasto Unión gap, Miocardiocito

Criofractura y criograbado

Criofractura y criograbado
Criofractura y criograbado
Criofractura y criograbado
Criofractura y criograbado

TEM, criograbado

TEM, criograbado Filamentos de actina

Filamentos de actina

TEM, criograbado

TEM, criograbado Actina y miosina, célula muscular

Actina y miosina, célula muscular

TEM, criograbado

TEM, criograbado cloroplasto

cloroplasto

TEM, criograbado

TEM, criograbado Citoesqueleto, vesículas revestidas
TEM, criograbado Citoesqueleto, vesículas revestidas

Citoesqueleto, vesículas revestidas

Microscopio Electrónico de Alto Voltaje Mayor poder de penetración Muestras más gruesas Reconstrucción

Microscopio Electrónico de Alto Voltaje

Mayor poder de penetración Muestras más gruesas Reconstrucción tridimensional